TES JURNAL 6

PENGHITUNGAN JUMLAH MIKROBA DENGAN RUANG HITUNG

1. Apakah tujuan percobaan kali ini ?

- Mahasiswa mampu melakukan pengamatan mikroba pada alat hemasitometer dengan

bantuan mikroskop.

- Mahasiswa mampu melakukan perhitungan jumlah mikroba dengan menggunakan ruang

hitung.

2. Apa yang Anda ketahui mengenai perhitungan jumlah bakteri ?

Penghitungan jumlah bakteri hidup terbagi atas dua, yaitu secara (tidak langsung)

Misalnya perhitungan pengurangan jumlah substrat dan secara langsung. Penghitungan

mikroba secara langsung antara lain:

1. Plate Count (hitungan cawan)

Plate count / viable count didasarkan pada asumsi bahwa setiap sel

mikroorganisme hidup dalam suspensi akan tumbuh menjadi satu koloni setelah

ditumbuhkan dalam media pertumbuhan dan lingkungan yang sesuai. Setelah

diinkubasi, jumlah koloni yang tumbuh dihitung dan merupakan perkiraan atau

dugaan dari jumlah mikroorganisme dalam suspensi tersebut.

2. Turbidimetri

Turbidimetri merupakan metode yang cepat untuk menghitung jumlah bakteri

dalam suatu larutan menggunakan spektrofotometer. Bakteri menyerap cahaya

sebanding dengan volume total sel (ditentukan oleh ukuran dan jumlah). Ketika

mikroba bertambah jumlahnya atau semakin besar ukurannya dalam biakan cair,

terjadi peningkatan kekeruhan dalam biakan. Kekeruhan dapat disebut optical

density (absorbsi cahaya, biasanya diukur pada panjang gelombang 520 nm – 700

nm). Untuk mikroba tertentu, kurva standar dapat memperlihatkan jumlah

organisme/ml (ditentukan dengan metode hitungan cawan) hingga pengukuran

optical density (ditentukan dengan spektrofotometer).

3. Hemasitometer

Hemasitometer adalah metode perhitungan secara mikroskopis. Ruang hitung

terdiri dari 9 kotak besar dengan luas 1 mm². Satu kotak besar di tengah, dibagi

menjadi 25 kotak sedang dengan panjang 0,05 mm. Satu kotak sedang dibagi lagi

menjadi 16 kotak kecil. Dengan demikian satu kotak besar tersebut berisi 400 kotak

kecil. Tebal dari ruang hitung ini adalah 0,1 mm. Sel bakteri yang tersuspensi akan

memenuhi volume ruang hitung tersebut sehingga jumlah bakteri per satuan volume

dapat diketahui.

3. Apa yang Anda ketahui mengenai Hemasitometer ?

Hemasitometer adalah suatu alat yang dapat digunakan untuk melakukan perhitungan

sel secara cepat dan dapat digunakan untuk konsentrasi sel yang rendah. Hemasitometer

pada mulanya diperuntukkan untuk menghitung sel darah, yang ditemukan oleh Louis-

Charles Malassez.

Penghitungan konsentrasi sel pada hemasitometer ini bergantung

pada volume dibawah coverslip. Pada chamber terdapat 16 persegi besar yang memiliki

persegi-persegi kecil di dalamnya, di mana sisi persegi kecil besarnya 0,05 mm. Jika di atas

bagian yang diasah tadi diletakkan sebuah kaca penutup, maka akan terbentuk ruangan yang

tingginya 0,1 mm. Sehingga volume dari satu persegi kecil adalah 0,05*0,05*0,1 mm3=25.10-

5 mm3.

Kelebihan perhitungan sel dengan menggunakan hemasitometer adalah dapat

menghitung jumlah sel yang hidup maupun yang mati, tergantung dari pewarna yang

digunakan. Misalnya, bila pewarna trypan blue dicampukan ke dalam larutan sel maka sel

yang hidup tidak akan berwarna dan sel yang mati akan berwarna biru. Kelebihan lainnya

adalah morfologi sel dapat diamati, dapat mengevaluasi homogenitas dan data

mendeteksi kontaminasi.(id.wikipedia.org)

Hemasitometer yang akan digunakan dalam percobaan adalah tipe Neubauer-Improved.

4. Apa saja kelemahan dan kelebihan dari metode perhitungan bakteri secara

langsung ?

Keuntungan metode ini ialah pelaksanaannya cepat dan tidak memerlukan

banyak peralatan. Namun mempunyai kelemahan sebagai berikut:

Sel-sel mikroba yang telah mati tidak dapat dibedakan dari sel yang hidup.

Karena itu keduanya terhitung. Dengan kata lain hasil yang diperoleh ialah

jumlah total sel yang ada di dalam populasi. Pada beberapa macam sel eukariotik,

penambahan zat warna tertentu (misalnya biru metilen sebanyak 0,1 %) pada

sampel yang akan dihitung dapat membedakan sel hidup dari sel mati. Pada sel

khamir misalnya baik sel hidup maupun sel mati akan menyerap biru metilen

namun hanya sel hidup mampu mereduksi zat warna tersebut secara enzimatik

menjadi tidak berwarna; jadi sel-sel mati akan tampak biru.

Sel-sel yang berukuran kecil sukar dilihat di bawah mikroskop, seperti bakteri

karena ketebalan hemasitometer tidak memungkinkan digunakannya lensa

obyektif celup minyak, sehingga kalau tidak teliti tidak terhitung. Hal ini

biasanya diatasi dengan cara mewarnai sel sehingga menjadi lebih mudah dilihat.

Untuk mempertinggi ketelitian, jumlah sel di dalam suspensi harus cukup tinggi,

minimal untuk bakteri 106

selmL . Hal ini disebabkan dalam setiap bidang pandang

yang diamati harus terdapat sejumlah sel yang dapat dihitung

Tidak dapat digunakan untuk menghitung sel mikroba di dalam bahan yang

banyak mengandung debris atau ekstrak makanan, karena hal tersebut akan

mengganggu dalam perhitungan sel.

Kelemahan lain adalah sulitnya menghitung sel yang berukuran sangat kecil

seperti bakteri karena ketebalan hemasitometer tidak memungkinkan digunakannya

lensa obyektif celup minyak. Hal ini biasanya diatasi dengan cara mewarnai sel

sehingga menjadi lebih mudah dilihat. Kadang-kadang sel cenderung bergerombol

sehingga sukar membedakan sel-sel individu. Cara mengatasinya ialah mencerai-

beraikan gerombolan sel-sel tersebut dengan menambahkan bahan anti gumpal

seperti dinatrium etilen diamin tetraasetat dan Tween 80 sebanyak 0,1 %.

5. Bagaiman cara menghitung sel mikroorganisme dengan ruang hitung ?

Karena letak mikroorganisme tidak beraturan maka perlu dilakukan perjanjian supaya

tidak terjadi perhitungan dua kali, yaitu :

Sel-sel pada sisi kanan dan bawah tidak dihitung pada kotak yang sedang

diamati/dihitung.

Sel-sel pada sisi kiri dan atas tetap dihitung pada kotak yang sedang

diamati/dihitung.

6. Bagaiman metode perhitungan untuk percobaan kali ini ?

Prinsip dari perhitungan Petroff-Hauser yaitu melakukan perhitungan dengan

pertolongan kotak-kotak skala, di mana dalam setiap ukuran skala seluas 1 mm2

terdapat 25 buah kotak besar dengan luas 0,04 mm2, dan setiap kotak besar terdiri dari

16 kotak kecil. Alat haemocytometer  digunakan di bawah mikroskop, sisinya

mempunyai ukuran 0,05 mm. Sedangkan satu kotak sedang berukuran nilai 0,2 mm.

Dan tebal nya adalah 0,1 mm. Jumlah sel per mL sampel dapat dihitung sebagai

berikut:

Jumlah sel dalam 25 kotak besar = Jumlah sel per kotak besar × 25 kotak

Jumlah sel per mm3 sampel = Jumlah sel dalam 25 kotak besar ×

10 ,02

Jumlah sel per ml sampel = Jumlah sel per mm3 sampel × 103

= Jumlah sel per kotak besar × 25 kotak×

10 .02

×103

Jumlah sel per ml sampel = Jumlah sel per kotak besar × 25 kotak × 50 × 103

Misalnya : didapatkan jumlah mikroba yang mau dihitung 12 sel mikroba, maka jumlah

sel per ml sampel adalah: 12 × 1,25 × 106 = 1,5 × 107.

7. Apa tujuan dilakukannya scrub pada NA miring yang berisi biakan dan tujuan

penggunaan air steril ?

Hal ini dimaksudkan agar spora Aspergillus niger dapat lepas dan tersuspensi dalam air

steril.

Penggunaaan air steril untuk membuat suspensi spora dimaksudkan agar tidak terdapat

mikrooba lain yang terlarut dalam suspensi. Tersuspensinya spora dalam air steril

ditandai dengan berubahnya warna air steril dari jernih menjadi keruh.

8. Apa tujuan dilakukannya pembersihan hemasitometer menggunakan alkohol

Sebelum dilakukan pengamatan, terlebih dahulu harus dibersihkan hemasitometer dan

cover glass dengan menggunakan alkohol. Hal ini dimaksudkan agar hemasitometer

bersih dari debu dan kuman yang dapat mengganggu perhitungan.

9. Mengapa setelah membilas, hemasitometer tidak boleh dilap dengan menggunakan

tisu biasa ?

Setelah dibilas dengan alkohol, hemasitometer dikeringkan dengan menggunakan tisu

lensa. Pada saat pengeringan, tisu lensa tidak boleh digosok-gosokkan pada permukaan

Jumlah sel per mL sampel = Jumlah sel per kotak besar × 1,25 × 106

hemasitometer. Hal ini bertujuan agar garis-garis yang terdapat pada hemasitometer tidak

hilang.

10. Setelah dilakukan 2 hal di atas, apa lagi yang harus dilakukan sebelum pengamatan

?

Permukaan lensa objektif dan lensa okuler pada mikroskop harus dibersihkan terlebih

dahulu dengan menggunakan tisu lensa. Hal ini bertujuan untuk membersihkan debu dan

kotoran yang dapat mengganggu proses penghitungan mikroba.

11. Berpakah besar pengamatan yang digunakan untuk pengamatan pada

hemasitometer ?

400 kali

12. Apa sebenarnya tujuan dilakukan pengenceran ?

Pengenceran ini dilakukan untuk memenuhi syarat penghitungan statistik, yaitu jumlah

mikroba yang dihitung tidak boleh lebih dari 100 dengan demikian, kesalahan

penghitungan dapat diminimalkan.

13. Langkah Kerja !

a. Dituangkan air steril sebanyak 5 mL pada media agar miring yang telah ditumbuhi

koloni Aspergilus niger hingga seluruh bagian media agar miring yang ditumbuhi koloni

terbasahi.

b. Digaruk (scrubbing) koloni Aspergilus niger pada media agar miring yang telah

terbasahi dengan menggunakan kawat ose hingga air steril dalam tabung terlihat keruh.

c. Dibersihkan permukaan ruang hitung (hemasitometer) dengan secarik kertas lensa yang

telah dibasahi dengan setetes air suling. Dibersihkan juga kaca tutup ruang hitung sampai

tidak lagi tertinggal sisa-sisa minyak pada permukaannya.

d. Diambil suspensi Aspergilus niger secukupnya dengan menggunakan pipet tetes dan

diletakkan pada tepi kaca tutup, maka dengan sendirinya tetesan tersebut akan mengalir

ke bawah kaca tutup dan mengisi ruang hitung.

e. Ditutup ruang hitung dengan kaca penutup dan diletakkan di atas pentas mikroskop

dengan hati-hati

f. Diamati jumlah sel kapang dengan obyektif 400 kali.

g. Dilakukan perhitungan jumlah sel kapang dalam 5 persegi besar (80 persegi kecil)

sebanyak dua kali (duplo), yaitu pada bagian atas dan bawah hemasitometer. Jika jumlah

sel kapang dalam 1 persegi kecil > 10 sel dan dalam 1 persegi besar > 100 sel, maka

suspensi kapang perlu diencerkan.

h. Pengenceran 1:10 dilakukan dengan cara 1 mL suspensi Aspergilus niger diambil dengan

menggunakan pipet ukur 1 mL dan diletakkan pada labu takar 10 mL. Kemudian,

ditambahkan air steril hingga batas labu takar dan digoyang hingga suspensi kapang

homogen.

i. Langkah 4 sampai 7 diulangi.

j. Dihitung jumlah rata-rata sel kapang dari dua kali perhitungan tersebut.