Teknologi Obat Injeksi Cair

OBAT JANTUNG DENGAN GEN VEGF121

GROUP 3PEMICU 2

MANUFAKTUR INJEKSI CAIR

Anggota: 1. Farha Kamila2. Fildzah Khalisah A3. Muslimah4. Olivia Cesarah5. Rahmalia Puspita

PENDAHULUAN

LATAR BELAKANG• Di Indonesia, pengobatan

penyakit kelainan pembuluh darah jantung atau Iskemia Miokardium yaitu dengan operasi, intervensi gawat darurat, pengobatan berdasarkan penyebab utama dan juga terapi.

• Gen VEGF121 dinilai mampu digunakan dalam pengobatan penyakit Iskemia Miokardium.

TUJUAN• Membuat rancangan pabrikasi

untuk memproduksi Gen VEGF121 di Indonesia, sesuai dengan aturan yang berlaku di Indonesia, yang mana Gen VEGF121 berbentuk cairan injeksi dengan partikel pembawa yaitu adenovirus dan dengan eksipien yang telah ditentukan

University of Indonesia

LAYOUT PABRIK



PREPARASI GEN REKOMBINANAD/PEG/VEGF121

Manufaktur Injeksi Cair

Vektor Adenovirus

Dapat digunakan vektor Adenovirus dengan ligan ataupun tanpa ligan. Penggunaan adenovirus dengan ligan akan mempermudah pengenalan pada permukaan sel target dan meningkatkan afinitas pengikatannya pada sel targer

Gambar 1. Struktur Adenovirus a. Tanpa ligan, b. Dengan ligan(Sumber: Curtis A Machida (2003))


Preparasi Rekombinasi Gen VEGF121 dengan Vektor Adenovirus

• Larutan dan bahan-bahan yang digunakan:1. 130 mM sodium phosphate, pH 7.0, steril.2. 5% sukrosa steril.3. Phosphate buffered saline (PBS), pH 7.0,

steril.4. 0.5 M Ethylene Diamine Tetraacetic Acid

(EDTA), steril.5. Galacto-Star β-galactosidase detection kid

(Tropix/Applied Biosystems, Foster City, CA).

6. Dithiothreitol (DTT) (Boehringer-Mannheim Roche Diagnostics).

7. BCA assay reagents (Pierce, Rockford, IL).8. Tresyl-MPEG-maleimide PEG, MW 5000

(Shearwater Polymers, Huntsville, AL).9. VEGF12110.Traut’s reagent, 2-iminothiolane (Pierce):

disimpan pada ruang gelap dengan suhu 40C. Stabil selama 4 minggu setelah dibuka.

• Larutan dan bahan-bahan yang digunakan:11. OPD peroxidase substrate (Sigma, St. Louis,

MO cat. no. P9187): dilarutkan dalam 20mL air.

12. PD-10 (Sephadex G-25 M) column (Pharmacia, Piscataway, NJ).

13. Thiol & Sulfide quantitation kit (Molecular Probes, Eugene, OR, cat. no. T-6060).

14. Slide-a-lyzer cassette, 10,000MW (Pierce).15. Fractogel BioSec size exclusion resin (EM

Sciences, Gibbstown, NJ) 150 mL (2.6×30 cm) in a XK 26/60 column (Pharmacia).

16. Fractogel DEAE resin, 40–90µm (EM Sciences).

17. Superdex 200 16/60 column (Pharmacia).18. Ad2/CMVβ-gal 4 virus in PBS pH 7.0, 5%

sucrose. Merupakan Adenovirus serotip 2 yaitu vektir adenovirus yang sudah dihilangkan area E1 nyadan digantikan dengan β-galactosidase trasgen, dan masih mengandung area E4.


• Sel dan Media yang digunakan:

1. Media F-12K Kaighn yang sudah dimodifikasi (Invitrogen, Carlsbad, CA).

2. Fetal bovine serum (FBS) (JRH Biosciences, Lenexa, KS).

3. Penicillin G sodium (Invitrogen).

4. Streptomycin sulfate (Invitrogen).

5. 293 sel ginjal embrio manusia.

Preparasi Rekombinasi Gen VEGF121 dengan Vektor Adenovirus

• Taqman Reagens:

1. Zirconia beads (Biospec Products,

Bartlesville, OK): diautoklave di gelas

vial ukuran kecil.

2. DNA lysis buffer: 100 mM pH 8.0 Tris

HCl, 5 mM EDTA, 0.4% sodium

dodecyl sulfate, 200 mMNaCl.

3. 2-mL sterile screw cap tubes

(Axygen, Union City, CA).

4. DEPC water (water treated with

diethylpyrocarbonate to eliminate

RNase/DNase).

5. Primers and probe (IDT, Coralville, IA)


Metode Rekombinasi gen VEGF121 dengan vektor Adenovirus

Penentuan konsentrasi partikel virus (Maizel et al.

1968 (Ref.62))

Preparasi Ad/PEG Kompleks.

Menghilangkan ikatan TMPEG dan purifikasi Ad/PEG

dengan Size Exclution

Chromatography

Generation of an Ad/PEG/VEGF121Co

njugate

Purifikasi Ad/PEG/VEGF121

dengan Ion Exchange

Chromatography

Kultur rekombinan Ad/PEG/VEGF121


Penentuan konsentrasi partikel virus (Maizel et al. 1968

(Ref.62))1. Memasukkan 1μL 10% SDS ke

dalam 100μL virus. Tahap ini akan membuat DNA virus keluar dari kapsidnya.

2. Menyiapkan sample dengan jumlah yang setara dalam PBS 5% sucrose sebagai blank.

3. Inkubasi dalam suhu ruang selama 30 menit.

4. Vortex.5. Melakukan spektroskopi pada

panjang gelombang absorbansi A260, gunakan koefisien kematian partikel 1 O.D. = 1,1 × 1012partikel/mL.

6. 1M larutan akan mengandung 6,02 ×1023 partikel/L.

Preparasi Ad/PEG Kompleks.1. Mencairkan Ad2/CMVβ-gal4 vektor murni

(1x1012 partikel/mL dalam PBS yang mengandung 5% sukrosa), 1:1 (vol:vol) dengan 130 mM sodium phosphate pH 7,0, 5% sukrosa.

2. Memasukkan 1.0, 5.0, atau 10% (wt/vol) tambahan Tresyl-MPEG-maleimide (TMPEG-mal) dalam larutan virus. Untuk 10% reaksi TMPEG tambahkan 5% TMPEG kembali pada setiap selang waktu 30 menit. Langkah ini bertujuan untuk mempresipitasi virus.

3. Inkubasi campuran pada suhu ruang, untuk setiap 1% reaksi PEGylation inkubasi selama 45 menit, 5% PEGylation selama 30 menit dan 10% TMPEG, penambahan 2 x 5% TMPEG setiap 30 menit.

4. Letakkan campuran dalam bak es untuk menghentikan reaksi. Tresyl group pada TMPEG tidak akan bereaksi pada suhu dibawah 40C.


Menghilangkan ikatan TMPEG dan purifikasi Ad/PEG dengan Size Exclution Chromatography1. Menyeimbangkan 150mL BioSec

resin (2.6 × 30 cm) dengan PBS, pH 7,0 pada laju alir 2,0 mL/min, sebelum sample dialirkan.

2. Injeksikan sample ke dalam kolom. Volume sample tidak lebih dari 4.0 mL untuk hasil separasi yang baik.

3. Pantau pada panjang gelombang A260/A280

4. Tambahkan sukrosa untuk mencampai konsentrasi akhir 5%.

1. Asumsikan 1000PEG/virion untuk 1% Ad/PEG, [PEG] = 1000 x[virus], dengan kalkulasi molekular.

2. Dialisis VEGF121 dengan Slide-A-Lyzer cassette secara berlawanan dengan menggunakan 0,1 M sodium phosphate, 0,1M sodium chlorida, 1mM EDTA, pada pH7,5.

3. Menambahkan 1000 molar berlebih VEGF121 kemudian diinkubasi selama 6 jam pada suhu 40C.

Generation of an Ad/PEG/VEGF121Conjugate


Purifikasi Ad/PEG/VEGF121 dengan Ion Exchange Chromatography

1. Menyiapkan 10 mL Fractogel DEAE dalam kolom XK16/60.

2. Menyiapkan DEAE Buffer A: 10mM potasium phosphate, pH 7,5 (1M = 15 gram dibasic, 2 gram monobasic per 1L) yang mengandung 0,15M NaCl, 0,01% Tween-80 (sterile fi ltered).

3. Menyiapkan DEAE Buffer B: 10mM potasium chloride, pH 7,5 yang mengandunga 1M KCl, 1M NaCl, 0,01% Tween-80 (sterile fi ltered).

4. Menyeimbangkan DEAE resin dengan buffer A 2mL/min.

5. Setelah mengalirkan sampel, cuci kolom dengan 1CV buffer A.

6. Gradien dinaikkan untuk 2CV adalah 12.5% buffer B dan 100% buffer B untuk diatas 4CV.

7. Ad/PEG/VEGF121 akan diilusi engan 25% buffer B, setara dengan 0,5M garam.

8. Monitor kolom pada panjang gelombang A260/A280.

9. Terakhir tambahakan 50% sukrosa untuk memperoleh konsentrasi akhir dari fraksi hasil pemisahan sebesar 5%.

1. Ad/PEG/VEGF121 dikultur dalam 293 sel (sel ginjal embrio manusia), dengan penambahan medium nutrisi.

2. Kemudian dimurnikan dengan CsCl berdasarkan prinsip gradien densitas.

3. Kemudian didialisis.4. Lalu disimpan pada suhu -700C.5. Tepat sebelum digunakan, vektor itu

dicairkan atau diencerkan dalam larutan sukrosa 3%.

Kultur rekombinan Ad/PEG/VEGF121



TAHAP PENCAMPURAN


Pencampuran:

didefinisikan sebagai proses di mana dua atau lebih komponen dalam kondisi

campuran terpisah atau kasar diperlakukan sedemikian rupa sehingga

setiap partikel dari salah satu bahan terletak sedekat mungkin dengan partikel

bahan atau komponen lain


Tujuan pencampuran:

• Untuk memastikan bahwa ada keseragaman bentuk • Untuk memulai atau meningkatkan reaksi fisika atau kimia seperti

difusi, disolusi, dll• untuk memperoleh jenis produk berikut.

– Ketika dua atau lebih cairan misibel dicampur bersama-sama, hasilnya dikenal sebagai larutan nyata.

– Ketika dua cairan imisibel dicampur dengan agen pengemulsi, hasilnya dikenal sebagai emulsi.

– Ketika padatan dilarutkan dalam suatu pembawa, hasilnya dikenal sebagai larutan.

– Ketika padat tidak larut dilarutkan dalam suatu pembawa, hasilnya dikenal sebagai suspensi.

– Ketika padatan atau cairan dicampur dengan basis semi padat, hasilnya dikenal sebagai salep atau supositoria.

– Ketika dua atau lebih bahan padat bersama, diperoleh serbuk yang bila diisi ke dalam kapsul dikenal sebagai kapsul dan ketika dikompresi di bawah tekanan tinggi disebut tablet


Klasifikasi Campuran

Positif

• dua atau lebih gas atau cairan misibel dicampur bersama-sama melalui proses difusi

• Jenis bahan ini tidak memberikan masalah dalam pencampuran

Negatif

• ketika padatan tidak terlarut dicampur dengan pembawa untuk membentuk suspensi atau ketika dua cairan tidak saling larut yang dicampur untuk membentuk emulsi

• lebih sulit disiapkan dan memerlukan tingkat pencampuran yang lebih tinggi

Netral

• Banyak produk farmasi seperti pasta, salep, dan serbuk tercampur• Produk tersebut statis dan komponennya tidak memiliki kecenderungan

bercampur secara spontan


Mekanisme campuran

Convective mixing

Shear mixing

Diffusive mixing

• perpindahan sekelompok partikel dalam jumlah besar terjadi dari satu bagian powder bed ke bagian yang lain

• gaya geser terbentuk dalam massa bahan dengan menggunakan agitator arm atau blast of air.

• bahan-bahan miring sehingga gaya gravitasi menyebabkan lapisan atas tergelincir dan difusi partikel individu berlangsung di atas permukaan yang baru dikembangkan


Mixing Guidelines Gunakan waktu yang cukup dalam pencampuran untuk memastikan

bahwa polimer benar-benar terhidrasi sebelum menambahkan komponen formulasi tambahan.

Pencampuran yang berlebihan atau tidak tepat selama dispersi dapat menyebabkan udara terperangkap, variasi viskositas, dan/atau ketidakstabilan formulasi. Udara terperangkap dapat diminimalkan dengan menggunakan variable drive motor. Setelah polimer terdispersi, udara terperangkap dapat diminimalkan dengan reposisi impeller dan mengurangi kecepatan pencampuran. Biarkan dispersi asam untuk melepaskan gelembung udara terperangkap.

Dianjurkan melakukan pengadukan sedang.


Con’tSetiap pencampuran intensitas tinggi yang diperlukan

harus diselesaikan sebelum netralisasi.Hindari pencampuran high shear dengan Waring

blender atau rotor-stator homogenizers. Pencampuran seperti itu dapat menggeser polimer dan menghasilkan kehilangan fungsionalitas permanen.

Jika busa persisten dihasilkan, busa tersebut dapat hilang dengan merusak polimer secara parsial dengan penambahan asam dengan kadar yang sangat rendah sebelum menetralisir dispersi dengan basis yang cocok. Asam klorida atau fosfat memiliki efektivitas sebesar 0,5% dari berat polimer yang digunakan.


Efektifitas penghomogenannya bisa berlainan tergantung dari jenis alat

yang digunakan.

Pengaduk (Mixer) Jenis pengaduk ini bermacam ragamnya tergantung dari banyak volume

cairan, kekentalan dsb. Alat ini mempunyai sifat menghomogenkan dan sekaligus memperkecil

ukuran partikel walaupun efek menghomogenkan cairan lebih dominan.

Homogenizer Alat ini mempunyai karakteristik memperkecil ukuran partikel Pengecilan partikel terjadi karena cara kerja alat ini yaitu dengan

menekan cairan, dipaksa melalui celah yang sempit kemudian dibenturkan ke suatu dinding atau ditumbukkan pada peniti-peniti metal yang ada dalam celah tersebut.

Cara sangat sensititf sehingga bisa didapat diameter pertikel rata-rata kurang dari 1 mikron.



FILLING & SEALING


Filling dan Sealing dengan Filler/Stopper Machine for Vials

• Digunakan untuk pengisisan, pemasangan sumbat, dan crimp capping.

• Pengisian berlangsung otomatis sesuai volum yang sudah ditentukan.

• Setelah dilakukan pengisisan selanjutnya dilakukan pemasangan sumbat dan crimp capping.



STERILISASI


Sterilisasi

• Metode pembuatan sediaan injeksi terdapat dua cara, yaitu cara aseptik dan sterilisasi akhir.

Proses aseptis dilakukan apabila

bahan-bahan yang digunakan tidak tahan terhadap

pemanasan.

Teknik aseptik

sediaan injeksi yang berbahan gen VEGF121


Sterilisasi vial

• Seluruh peralatan dan material tahan panas disterilisasi dengan pemanasan.

Sterilisasi autoklafsuhu 230 0C selama satu

jam

mampu membunuh secara cepat semua

bentuk vegetatif mikroorganisme dalam 1

atau 2 menit



QUALITY CONTROL


Area Quality Control


INCOMING STOCK

• Routine Work Testing

MANUFACTURING

• Conductivity Measurement• Volume Filled• Temperature of Sterility• Environmental Control Test• Visual Inspection

FINISHED PRODUC

T

• Leaker Test• Pyrogen Test• Particulate Test• Sterility Test• Uniformity of Content

LEAKER TEST

DEFINISIFilled and Sealed Ampoules ditaruh dalam ruang vakum

Dicelupkan pada larutan 1% Methylene Blue

Diberikan negative pressure

Jika terjadi kebocoran, warna biru akan masuk karena perbedaan tekanan

PROSEDUR


Leakage (kebocoran) adalah hal yang sering terjadi dalam proses manufaktur kemasan obat

Dikarenakan perbedaan temperatur dan tekanan di tiap unit atau ruangan, maka kemasan mengekspansi

Test dilakukan pada ampoules, karena bahannya dari kaca

PYROGEN TEST

PYROGEN TEST

LAL Test

Rabbit Test


LAL BACTERIAL TEST(Limulus Amebocyte Lysate Test)

• Test yang digunakan untuk mendeteksi keberadaan dan konsentrasi endotoksin bakteri dalam obat-obatan dan produk yang berkonsep biologi.

• Endotoksin adalah sejenis pyrogen yang keberadaannya ada pada dinding sel dari bakteri negative.

• LAL Test yang dilakukan berbentuk gel formation test.

• reagen LAL yaitu Limulus Polyphemus pada inkubasi selama 60 menit pada 37 derajat celcius.

• tes ini adalah hanya dapat mendekteksi bakteri gram negative dan tidak dapat mengukur tingkat endotoksinnya (tes semi-kualitatif).


RABBIT TEST

• Mempunyai objek percobaan kelinci

• Produk manufaktur obat dicobakan pada sekelompok kelinci (5-10 ekor)

• Prosedur tes sebagai berikut:1. Pada sekelompok kelinci yang akan

dicobakan, tidak boleh diberikan makanan pada hari percobaan

2. Kelinci-kelinci diukur temperature nya sebelum percobaan, dicatat.

3. Obat yang ingin diujikan disuntikkan pada pembuluh dekat telinga.

4. Melakukan pengamatan reaksi obat terhadap kelinci setiap 30 menit, 1 jam, 2 jam, dan 3 jam.

5. Jika ternyata memang ada kandungan bakteri di obat tersebut, dimana terjadi kenaikan temperature pada kelinci tersebut.

6. Jika kondisi dari kelinci 80% mengalami kenaikan temperature pada tubuhnya, dapat dipastikan ada kontaminasi bakteri dalam obat


PARTICULATE TEST

• Tes ini dilakukan untuk mendeteksi adanya partikel lain dengan metode pencahayaan yang sangat terang dengan background hitam putih

• Jika adanya partikel lain, maka produk harus dibuang

• Dapat dilakukan oleh human resources maupun device


STERILITY TEST

• Tujuan untuk mendeteksi adanya kontaminasi bakteri pada batch proses sebuah manufaktur

• Metode dibagi menjadi 2 cara:– Membrane Filtration MethodMenggunakan media yaitu fluid thioglycollate medium dan soya-bean casein digest medium.

– Direct Menoculation MethodKarena mikroorganismenya tidak dapat tersaring, maka samoel langsung dideteksi melalui media atau device

• Dapat dilakukan secara product sampling atau keseluruhan manufaktur



PACKAGING & LABELING


PACKAGING DAN LABELING

Packaging & Labeling

Primer Sekunder Tersier

• Packaging primer injeksi cair yang dipiilih berbentuk VIALS

• Berbahan dasar kaca dan penggunaannya harus diambil menggunakan syringe yang akan disuntikkan



Primer • Packaging primer berbentuk

ampoules yang telah diisi pada proses filling

• Proses primer labeling dilakukan pada ampoules oleh unit operasi Shrink Labeler atau Ampoule Labeler

Sekunder• Pemprosesan packaging

sekunder lebih dikenal dengan nama pengepakan. Digunakan packaging boks-boks karton

• Digunakan mesin blister atau cartoning machine (mesin pengepakan otomatis). Mesin jenis ini bisa sekalian melakukan proses labeling.

• Labeling yang dilakukan biasanya nama, tanggal dan kode produksi , dll



Tersier• Digunakan unit operasi

Cardboard Case Packager• Penting untuk melindungi

produk obat pada saat pengiriman jarak jauh.

• Pengemasan tersier ke dalam kardus dilakukan secara manual.


KESIMPULAN

• Secara garis besar, tahapan – tahapan pembuatan obat terapi gen VEGF121 ini adalah persiapan mixing sterilisasi filling/sealing inspeksi labeling dan packaging.

• Untuk sterilisasi bahan gen VEGF121 menggunakan proses aseptic.

• Untuk sterilisasi wadah menggunakan autoklaf.• Kemasan yang digunakan adalah VIALS.


THANK YOU !FOR YOUR ATTENTION

GROUP 3Pemicu 2

Teknologi Obat Injeksi Cair

Engineering

Transcript of Teknologi Obat Injeksi Cair