Kuliah V.

Kondisi Lingkungan Pertumbuhan Mikroba

m.K. Dasar Teknologi Mikrobial

TIN 232 2(2-0)TIN 232 2(2-0)

Departemen Teknologi Industri Pertanian – FATETA IPB2012

• Lingkungan fisik pertumbuhan mikroba mencakup : suhu pH air (aw) tekanan osmotik efek mekanis (agitasi)

• Pertumbuhan mikroba yang optimal membutuhkan kondisi fisik yang sesuai

Kebutuhan lingkungan fisik setiap mikroba beragam, penting diketahui untuk berbagai kegunaan : penumbuhan & pencegahan pertumbuhan mikroba

SUHU• Pertumbuhan merupakan hasil dari serangkaian reaksi

biokimia yang sangat dipengaruhi oleh suhu suhu berpengaruh terhadap efisiensi konversi substrat menjadi biomassa sel Persamaan Arrhenius : μ = A e - Ea/RT

μ = laju pertumbuhan spesifik A = tetapan Arrhenius Ea = energi aktivasi (untuk pertumbuhan mikroba : 50 -70 kJ/mol) R = tetapan gas T = suhu absolut (K)

ln μ berbanding terbalik thd 1/T dg gradien negatif Kurva linier hanya pada sebagian selang suhu pertumbuhan ada suhu optimum pertumbuhan ln μ

1/TSuhu Opt

Bagaimana pengaruh suhu ?

• Pengaruh suhu terhadap protein

• Pengaruh suhu terhadap membran sel dan organel yang mengandung lipida– Bila terlalu rendah, membran menjadi kaku dan

rapuh – Bila terlalu tinggi, membran menjadi terlalu lunak

sehingga tak dapat menahan sel atau organel

• Di atas suhu optimum untuk pertumbuhan : laju pertumbuhan menurun, disebabkan oleh

meningkatnya laju kematian akibat terjadinya denaturasi protein, membran sitoplasma tak bisa bekerja, yang berakhir dengan terjadi lisis termal pada sel.

• Di bawah suhu minimum terjadi penggumpalan membran sel yg mengganggu

proses transpor substrat, sehingga pertumbuhan terganggu

Umumnya suhu optimum lebih dekat ke suhu maksimum dibandingkan suhu minimum pertumbuhan

Effect of temperature on growth

http://www.slideshare.net/jakkaas/cultivation-of-microorganism-21-0411

• Daya tahan mikroba terhadap suhu berbeda-beda penting pada teknik inaktivasi (pasteurisasi/sterilisasi) Contoh : - sel vegetatif kebanyakan bakteri & kapang mati pada suhu sekitar 600C selama 15-20 menit - Spora khamir & kapang mati diatas suhu 800C - Spora bakteri (Bacillus dan Clostridium) membutuhkan

1210C selama 15-20 menit (dg pasteurisasi 700C spora tidak mati)

SELANG SUHU PERTUMBUHAN (OC) MIKROBA

Tipe Mikroba Min Opt MaksPsikofilik : - Pseudomonas - Flavobacterium - AlcaligenesMesofilik :-Lactobacillus lactis-Escherichia coliTermofilik :- Bacillus stearothermophylus- Archeobacteria- Thermococcus celer

-5 – 0

10-20

25-45

5-15

30-40

45-60

15-20

40-45

60-80

Suhu untuk laju pertumbuhan minimum, optimum dan maksimum disebut : Suhu Kardinal

Temperature

Figure 6.1

Microbial growth at high temperatures :• Thermophiles• Hyperthermophiles

Biotechnological applications:

• Major advantages for industrial & biotechnologicalprocesses which run more rapidly & efficiently at highertemperatures

• Enzymes from thermophiles & hyperthermophiles cancatalyse reactions at high temperatures; more stablethan enzymes from mesophiles Example – heat stable DNA polymerase fromthermophile Thermus aquaticus – used in PCR reactions

http://www.unisanet.unisa.edu.au/Information/12936info/08%20Pod%20Micro%20week%203%20part%201%20-%20environ%20&%20nutrition.pdf

pH• pH mempengaruhi fungsi membran/ permeabilitas sel, aktivitas

enzim dan komponen sel lainnya Contoh : pH dapat menggumpalkan protein pada titik isoelektrik (muatan

gugus amino dan karboksil bebas saling menetralkan, sehingga molekul bermuatan nol)

• Pada kultivasi mikroba, pH cenderung mengalami perubahan. Contoh : - Penggunaan garam ammonium pH cenderung menurun

- Penggunaan nitrat dan komponen amino organik pH cenderung meningkat.

- pH juga dipengaruhi oleh terbentuknya produk, contohnya asam-asam organik menyebabkan penurunan pH

• Klasifikasi mikroba berdasarkan pH pertumbuhan

Mikroba Min Opt MaksBakteriKhamirKapang

3-52-31-2

6.5-7.54.5-5.54.5-5.5

8-107-87-8

Untuk mendapatkan pertumbuhan yang optimum, pH harus dikontrol selama kultivasi : menggunakan buffer atau penambahan asam atau basa

Pengaturan pH dapat untuk mencegah kontaminasi mikroba yang tak diinginkan

http://www.textbookofbacteriology.net/nutgro_4.html

• Most human pathogens are neutrophiles• Lactobacillus spp – (normal flora of gut) example of acidophile• Vibrio cholerae – example of alkaliphile

AlkaliphileAlkaliphile

pH• Organisms sensitive to changes in acidity because H+

and OH- interfere with H bonding in proteins and nucleic acids

• Most bacteria and protozoa grow best in a narrow range around neutral pH (6.5-7.5) – these organisms are called neutrophiles

• Other bacteria and fungi are acidophiles – grow best in acidic habitats– Acidic waste products can help preserve foods by

preventing further microbial growth• Alkaliphiles live in alkaline soils and water up to pH 11.5

www.dmacc.edu/.../Bio732-Chapter%206-...

• Air penting untuk sel, karena 80 % bobot sel adalah air, juga sebagai reaktan (pada reaksi hidrolisis) dan merupakan produk (hasil reduksi oksigen pada Rantai Transpor Elektron)

• aw : air dalam substrat yang dapat digunakan untuk pertumbuhan mikroba perbandingan antara tekanan uap larutan (Ps) dengan tekanan uap air murni (Pw) pada suhu yang sama aw = Ps / Pw

• Aw penting diketahui pada kultivasi substrat padat (solid substrate cultivation)

AIR (aw)

• Water availability depends on water content PLUS concentration of solutes (eg salts, sugars) – dissolved substances have an affinity for water so water associated with solutes is less available to organisms

Physical Effects of Water• Microbes require water to dissolve enzymes and

nutrients required in metabolism• Water is important reactant in many metabolic reactions• Most cells die in absence of water

– Some have cell walls that retain water– Endospores and cysts cease most metabolic activity in

a dry environment for years• Two physical effects of water

– Osmotic pressure– Hydrostatic pressure

www.dmacc.edu/.../Bio732-Chapter%206-...

http://www.fao.org/docrep/t0685e/T0685E04.htm

• Setiap mikroba mempunyai aw optimum, minimum dan maksimum untuk pertumbuhannya. Contoh :

- bakteri : mendekati aw = 1 (tumbuh baik pada konsentrasi gula atau garam rendah) aw minimum = 0,95 - bakteri halofilik (tahan garam) aw = 0,75 - bakteri xerofilik aw = 0,65

- Kapang : aw lebih rendah dari khamir dan bakteri (untuk mencegah pertumbuhannya aw = 0,62)

- Khamir : aw minimum = 0,88 – 0,94, kecuali yg osmofilik aw = 0,78

penting diketahui untuk teknik pencegahan kerusakan bahan oleh mikroba (pada pengawetan )

• Osmosis : gerakan air dari potensial air lebih tinggi ke potensial air lebih rendah melewati membran permeabel selektif sampai dicapai keseimbangan dinamis

TEKANAN OSMOTIK

Bagaimana Osmosis Bekerja ?

• Larutan Isotonik. Solut dan pelarut (air) di bagian dalam dan luar sel sama

konsentrasinya, sehingga terjadi perpindahan substansi ke dalam dan keluar sel yang sama.

• Larutan Hipertonik. Plasmolisis Sel berada pada lingkungan yang konsentrasi solutnya lebih

besar dari pada di dalam sel, sehingga air di dalam sel akan keluar karena osmosis, akibatnya sel mengkerut (dikenal pula sebagai “crenation”)

• Larutan Hipotonik Plasmoptisis Air di bagian luar sel lebih banyak dan di dalam sel solut lebih

banyak, sehingga air akan masuk ke dalam sel karena osmosis yang mengakibatkan sel menjadi pecah (disebut pula sebagai lisis)

• Media yang paling cocok untuk pertumbuhan mikroba adalah media yang isotonik terhadap isi sel mikroba

Larutan hipertonik : air keluar sel terjadi plasmolisis (dehidrasi) & sel mengkerut Contoh : larutan garam atau gula pekat Larutan hipotonik : air masuk ke dalam sel, membengkak terjadi plasmoptisis (sel pecah=lisis)

Effect of different solutions on blood cells

Figure 6.4http://www.slideshare.net/jakkaas/cultivation-of-microorganism-21-0411

EFEK TEKANAN OSMOTIKISOTONIK HIPERTONIK

Klasifikasi Contoh Kons NaCl (%)Nonhalofil Spirillum serpens

E. coli0,0 -10,0 - 4

Bakteri laut Alteromonas haloplanktis

Pseudomonas marina

0,2 – 50,1 – 5

Halofil moderat Micrococcus halodenitrificans

Pediococcus halofilus

2,3 – 20,50,0 – 20

Halofil ekstrim Halobacterium salinarium

Sarcina morrhuae

12 – 36 (jenuh) 5 – 36 (jenuh)

Toleransi Osmotik Beberapa Bakteri

• Tekanan geser (shear stress) akibat adanya pengadukan (agitasi) pada bioreaktor berpengaruh terhadap laju pertumbuhan & viabilitas sel

• Kebanyakan mikroba membutuhkan lingkungan cair, karena tergantung pada transpor substrat terlarut dan nutrien melewati membran sel

• Pengadukan pada Bioreaktor tangki teraduk (STR) transpor substrat lebih cepat dan daerah dg masukan energi terbesar adalah pada daerah ujung impeler

Kasus : Mikroba berfilamen (kapang) sensitif terhadap tekanan geser (shear stress) untuk mencegah sel rusak digunakan kecepatan agitasi rendah, yang mengakibatkan masukan oksigen rendah bioreaktor air-lift (pengadukan nonmekanis dg udara)

EFEK MEKANIS (Agitasi)

Bioreaktor Tangki Teraduk (STR) Bioreaktor “Air-lift”

http://shahiribrahim.blogspot.com/2009_02_01_archive.html

(Impeller)

Skema Umum Proses Kultivasi

Biorektor

Pengembangan Inokulum

Kultur Stok

LabuKocok

BioreaktorInokulum

Sterilisasi Media

Formulasi Media

Bahan Baku Media

Cairan Fermentasi

Biomassa

PemisahanSel

SupernatanBebas Sel

Ekstraksi Produk

Pemurnian Produk

Pengemasan produk

PenangananLimbah Cair

URUTAN PEKERJAAN DALAM KULTIVASI

1. Penyiapan Mikroba :- Penyegaran (jika isolat dari media agar miring- Perlu penumbuhan jika dari keadaan pengawetan khusus,

Misal : ampul liofilisasi (pengawetan dengan pengeringan beku)- Perbanyakan sel untuk inokulum (propagasi) sekaligus

untuk adaptasi media kultivasi (ada yang tidak bisa langsung dari agar miring)

2. Penyiapan Media- Kenali komposisi media yang sesuai dengan tujuan kultivasi- perlu tahu cara penyiapannya, contoh jika terdapat sumber

protein dan karbohidrat dalam komposisi media yang akan digunakan, maka pisahkan pada saat sterilisasi (mencegah terjadinya reaksi “browning”)

ampul liofilisasi

Media Agar Miring Media Cair

3. Perakitan bioreaktor dan sterilisasi - Pasang asesoris bioreaktor, tutup lubang yang menjadi peluang kontaminasi dengan aluminium foil - Sterilisasi dalam otoklaf 1210C selama 15-20 menit - Biarkan pada suhu ruangan, sebelum digunakan

4. Inokulasi secara aseptik - perhatikan port/lubang untuk inokulasi pada bioreaktor - selalu gunakan bantuan desinfektan (alkohol) untuk

mengaseptiskan lingkungan - setelah alkohol kering, baru dekatkan api bunsen pada

lubang inokulasi

Cara Inokulasi secara aseptik - perlahan bukalah lubang (port) inokulasi - tuang inokulum mikroba secara hati-hati

- usap lubang dengan kapas beralkohol (hati-hati dengan api bunsen)

- tutupkan penutup lubang setelah lebih dahulu difiksasi di atas api bunsen

STERILISASISterilisasi merupakan metode/cara yang dapat diterapkan untuk membunuh atau menyingkirkan mikroba kontaminan, yang dilakukan pada : - Media - Bioreaktor dan asesorisnya - Bahan yang ditambahkan pada mekanisme pengontrolan (asam, basa,

antibusa, udara)

• Sterilisasi yang umum digunakan adalah pemanasan , penggunaan bahan kimia (hydrogen peroxide, peracetic acid, glutaraldehyde dan o-phthalaldehyde.) atau filtrasi membran (untuk bahan yang tak tahan panas spt protein; udara dll)

• Metode sterilisasi dengan pemanasan:- panas basah (uap) otoklaf- panas kering (oven)

Cara sterilisasi yang dipilih tergantung pada kondisi bahan/media serta peralatan yang akan disterilisasi

Autoclave

Membran Filter

5. Kultivasi Apabila kultivasi berjalan dengan baik, maka substrat dikonsumsi oleh sel sel tumbuh dan produk dibentuk

6. Sampling dan Pemanenan - Sampling dilakukan pada waktu-waktu tertentu dan dilakukan analisis sesuai kebutuhan - Pemanenan dilakukan dengan menghentikan proses kultivasi dan dilanjutkan dengan penanganan lebih lanjut cairan kultivasi - Bioreaktor perlu disterilisasi sebelum dicuci, agar mikroba tidak mencemari lingkungan

7. Analisis Data Hasil Kultivasi - Data mentah dihitung (diolah secara Statistik, kalau memang direncanakan dari awal penelitian) - Pengeplotan kurva atau histogram - Penghitungan parameter kinetika (μmaks, Yp/s, Yx/s, Yp/x, produktivitas dll) - Evaluasi & pembahasan hasil penelitian

1. Media kultivasi seringkali merupakan komponen biaya produksi terbesar pada bioindustri, usaha-usaha apa yang dapat dilakukan agar dapat menekan biaya produksi tersebut ?

2. Uraikan manfaat pengetahuan mengenai pengaruh kondisi lingkungan terhadap pertumbuhan mikroba pada bioindustri (produksi suatu senyawa) atau pengolahan pangan (pengawetan pangan)

?