Tecnicas diagnosticas para Brucelosis Bovina

INDICE

CONSIDERACIONES GENERALES 1

TEST DE COAGULACIN POR GLUTARALDEHIDO

5

TEST DE TURBIDEZ DEL SULFATO DE ZINC MODIFICADO

6

PRUEBA DEL ANTGENO BRUCLICO ACIDIFICADO

9

ELISA-I 11

SEROAGLUTINACIN EN TUBO Y 2-MERCAPTOETANOL

12

ELISA-C 15

POLARIZACIN FLUORESCENTE 16

PRUEBA DEL ANILLO EN LECHE

17

PRECIPITACIN EN GEL DE AGAR

20

REACCIN A LA TUBERCULINA

23

EXTRACTO RESOLUCIN 438/2006 y 115/99

28

PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com

1

Tcnicas serolgicas: consideraciones generales.

Las tcnicas serolgicas permiten la deteccin de anticuerpos especficos contra un

determinado antgeno. Para realizar un diagnstico certero es necesario que el suero con

el cual se trabaja sea de la mejor calidad posible, y una de las caractersticas

fundamentales es que est libre de hemlisis, ya que la presencia de hemoglobina puede

llegar a alterar el resultado de las pruebas.

Con el objeto de obtener suero de excelente calidad, el veterinario que realice la

extraccin de sangre debe tener en cuenta:

- trabajar con material limpio y seco

- las jeringas deben tener mbolo en perfectas condiciones que permitan

un suave deslizamiento

- las agujas de extraccin deben ser de bisel corto, ya que el bisel largo permite la

entrada de aire produciendo hemlisis

- cuando se trabaja con temperaturas ambientales extremas hay que tener la

precaucin de acondicionar las muestras

- identificar cada muestra con nmero, y colocarla en la gradilla siguiendo

siempre el mismo orden

- ubicar las gradillas para su traslado al laboratorio en un recipiente donde no haya

movilidad para obtener una rpida exudacin de suero

-. extraer aproximadamente 10 ml de sangre para que exude unos 4 ml de suero

En el laboratorio se puede esperar la retraccin del cogulo a temperatura ambiente

o a bao Mara a 37 C, para luego centrifugar la muestra 5 minutos a 3000 rpm.

Una vez retrado el cogulo hay que sacar el suero con pipeta Pasteur con mucho

cuidado y es aconsejable dividirlo en alcuotas. Si no se trabaja con el mismo en el da,

hay que refrigerarlo o llevarlo a freezer (solamente se frizar el suero extrado por

medio de centrfuga).

En las pruebas diagnsticas que se hacen en el laboratorio es cotidiano el uso de

pipetas, sobre todo las de Bang, para brucelosis, por eso es importante saber que las

mismas se manejan siempre con el dedo ndice y no con el pulgar, ya que este es

menos sensible.


2

La graduacin de las pipetas es la que indica el nmero de color inscripto en la

parte superior de la misma, y la manera de medir una cantidad se hace enrasando en

cero y luego descargando la cantidad indicada. Ejemplo: para descargar 0.08ml en la

prueba BPA, enraso en cero y descargo hasta 0.08, el resto lo vuelvo a colocar en el

recipiente que contiene el suero.

Medicin de la respuesta inmune humoral: clasificacin de pruebas

Para medir la respuesta inmune humoral se utilizan una serie de pruebas

diagnsticas segn sea la enfermedad que se trate. Una enfermedad puede ser

diagnosticada con una o ms pruebas, pero es importante saber que hay reacciones que

son ms especficas que otras y que hay enfermedades que tienen legislacin sobre el

tipo de diagnstico a realizar.

Antes de comenzar con la clasificacin es necesario tener en claro tres conceptos:

- Sensibilidad: es la capacidad de una prueba para detectar animales enfermos

(verdaderos positivos) en una poblacin enferma.

- Especificidad: es la capacidad de una prueba para detectar animales sanos

(verdaderos negativos) dentro de una poblacin sana.

- Fundamento de una prueba: es aquello que nos permite poder visualizar la

reaccin. Es muy importante que este concepto no se confunda con el objetivo

de la reaccin. Ejemplo: el fundamento de la prueba de Inmunofluorescencia es

el uso de una sustancia fluorescente que nos permite ver la unin del antgeno

con el anticuerpo.

Las reacciones para medir la respuesta inmune humoral se clasifican en:

PRIMARIAS: son aquellas que miden la presencia del complejo antgeno-

anticuerpo.


3

Pruebas inmunoenzimticas

*Elisa: el fundamento es la utilizacin de una enzima que genera una reaccin

colorimtrica.

-indirecto: detecta Ac

-sandwich: detecta Ag

-competicin: detecta Ac

*Western blotting: detecta antgenos mediante la combinacin de

electroforesis proteica con Elisa o radioinmunoensayo.

Pruebas de inmunofluorescencia: se fundamentan en la utilizacin de sustancias

fluorescentes como marcadores.

*Directa: detecta Ag

*Indirecta: detecta Ac

*Citometra de flujo: detecta Ag

Pruebas de Radioinmunoensayo: se fundamentan en la utilizacin de istopos

radioactivos como marcadores

-para deteccin de Ag

-para deteccin de Ac

SECUNDARIAS: son aquellas pruebas que miden una consecuencia de la

formacin del complejo Ag-Ac y dependen de las caractersticas fsicas del

antgeno.

Aglutinacin: el antgeno es particulado, grande. Como los Ac son bivalentes

pueden establecer enlaces cruzados con partculas de Ag como bacterias y

aglomerarse o aglutinarse.


4

-Aglutinacin:-- en placa

-- en tubo

-Aglutinacin pasiva

-Coaglutinacin

-Hemoaglutinacin / inhibicin de la hemoaglutinacin

Precipitacin: el antgeno en este caso es soluble, y en contacto con su Ac

especfico forma complejos que se insolubilizan y precipitan.

-Difusin doble

-Inmunoelectroforesis

-Inmunodifusin radial

-Contrainmunoelectroforesis

Fijacin de complemento: la activacin (fijacin) del complemento por Ac unido a

Ag hace que se generen complejos de ataque de membrana. Si el Ac se une a

glbulos rojos estos se destruyen y sobreviene hemlisis.

TERCIARIAS

Neutralizacin: estimacin de la capacidad de un Ac de neutralizar la actividad

biolgica de un Ag cuando se mezcla con l in vitro.

Proteccin: neutralizacin in vivo. Se utiliza para determinar la capacidad

protectora de un Ac especfico frente a su Ag.


5

TEST DE COAGULACION POR GLUTARALDEHIDO . Fundamento: se basa en la coagulacin de las gammaglobulinas Se utiliza para la deteccin de animales hipogammaglobulinmicos. Las protenas del suero forman un complejo insoluble en presencia de pequeas concentraciones de glutaraldehdo. Materiales: 1) Solucin de glutaraldehdo. La solucin madre se prepara de la siguiente manera: a

4 ml de glutaraldehdo al 25 % agregarle 6 ml de agua destilada; sta debe ser almacenada en frasco color caramelo en heladera no ms de 15 das. Se usa 0,05 ml.

2) Suero de terneros 0,5 ml 3) Tubos de hemlisis. Metodologa: Se utiliza la tcnica de Sandholn. Se extrae sangre de vena yugular a terneros de tres a siete das de edad, se deja coagular y se extrae el suero.

a. Colocar en un tubo de ensayo 0,5 ml de suero.

b. Agregar 0,05 ml de glutaraldehdo al 10 %.

c. Agitar y se dejar una hora a temperatura ambiente (controlar cada 10 minutos). Interpretacin: Cogulo firme de color amarillo que puede tornarse opaco: POSITIVO (ms de 0,6 g

% de gammaglobulina). Sin cogulo: NEGATIVO (menos de 0,4 grs %). Si se forma un gel semislido: INCOMPLETA (entre 0,4 y 0,6 grs %).


6

TEST DE TURBIDEZ DEL SULFATO DE ZINC MODIFICADO

Fundamento

El test de Turbidez del Sulfato de Zinc Modificado (TTSO4ZnM) es un mtodo semicuantitativo que sirve para determinar el nivel de gammaglobulinas sricas y su fundamento est basado en la precipitacin de las mismas.

Los terneros despus de calostrar y hasta los 15 das de vida tienen 1,5 grs % de gammaglobulinas en el suero, valores por debajo del mencionado corresponde a un calostrado incorrecto y los valores mnimos a un no calostrado.

Los potrillos despus de recibir calostro deben tener 0,4 grs % (0,4 grs/100ml) de Ig en el suero, los potrillos que tienen menos de esa cantidad aumentan los riesgos de infeccin. Materiales: 1) Muestra de suero sin hemlisis.

2) Pipetas de 0,1 ml, 1 ml y 5 ml.

3) Agua destilada.

4) Solucin de sulfato de zinc (207 mg en 7 litros de agua destilada a pH neutro, conservada a 4C)

5) Nefelmetro N 1 (0,1 ml de cloruro de bario al 1 % + 9,9 ml de cido sulfrico al

1 %).

6) Nefelmetro N 2 (0,2 ml de cloruro de bario al 1 % + 9,8 ml de cido sulfrico al

1 %).

7) Tubos de ensayo con sus respectivos tapones. Metodologa:

a. La muestra de sangre debe ser extrada por puncin yugular con aguja limpia y seca. Luego se deja reposar a temperatura ambiente hasta la exudacin del suero, debindose descartar si posee algn grado de hemlisis. La prueba debe realizarse en el da, no pudindose utilizar sueros congelados o refrigerados.

b. Tomar un tubo de ensayo (igual al de los nefelmetros) y colocar 1 ml de agua destilada.

c. Agregar 0,1 ml de la muestra de suero.


7

d. Agregar 5 ml de la solucin de sulfato de zinc. e. Homogeneizar la muestra hasta la aparicin de la turbidez homognea, no agitar

violentamente ni formar espuma. f. Comparar la turbidez obtenida con los nefelmetros 1 y 2 (recordar que antes de

utilizar los nefelmetros se los debe homogeneizar bien y adems taparlos en forma correcta. Pueden conservarse 6 meses en heladera).

Interpretacin:

Turbidez menor a la presente en el Nef. 1: Calostrado incorrecto.

Turbidez igual a la presente en el Nef.1: Calostrado incorrecto.

Turbidez intermedia entre Nef.1 y 2: Calostrado incorrecto.

Turbidez igual o mayor al Nef. 2: Calostrado correcto.


8

PLAN DE CONTROL Y ERRADICACIN DE BRUCELOSIS: Resolucin 438/2006. VACUNACIN: a todas las terneras entre 3-8 meses de edad con vacuna Brucella abortus cepa 19. SANEAMIENTO: machos enteros de ms de 6 meses de edad y hembras de ms de 18 meses de edad. -PRUEBAS TAMIZ: BPA (Prueba del Antgeno Bufferado en Placa), ELISA-I (Elisa indirecto)

Prueba sensible: detecta Ig G y M

Se clasifica a los animales como:

NEGATIVOS (-) REACCIONANTES (+)

-PRUEBAS COMPLEMENTARIAS: SAT (Seroaglutinacin en tubo). Detecta Ig G y M.

+ 2-ME (2 mercapto-etanol). Detecta Ig G. FPA (Prueba de la Polarizacin Fluorescente). ELISA-C (Elisa competicin). Se clasifica a los animales como:

NEGATIVOS (+) POSITIVOS (+)

-PRUEBA DEFINITORIA: FC (Fijacin de complemento)

-VIGILANCIA EPIDEMIOLGICA: PAL (Prueba del anillo en leche) Prueba sensible, de rodeo, detecta Ac antibrucelas en leche.

ELISA-I (Elisa indirecto). Se clasifica al establecimiento como:

NEGATIVOS (-) SOSPECHOSOS (+)


9

PRUEBA DEL ANTGENO BRUCLICO ACIDIFICADO (BPA)

Fundamento:

Es una prueba de aglutinacin que se fundamenta en la unin de un Ac a su Ag especfico que se encuentra en estado particulado. En proporciones ptimas, esta unin se manifiesta con la formacin de grumos .

Es una prueba tamiz que se considera como negativa o positiva. A los animales se los clasifica como negativos o reaccionantes respectivamente, debiendo estos ltimos ser sometidos a pruebas complementarias para su diagnstico definitivo.

Es una prueba cualitativa de aglutinacin en placa, que presenta la ventaja de ser realizada en una sola dilucin.

Materiales:

1) Antgeno corpuscular con 10 % de concentracin celular, suspendido en una solucin tope a pH 3,8 y coloreado de azul. 2) Suero problema en perfectas condiciones (sin hemlisis ni contaminacin). 3) Aglutinoscopio con placa de vidrio dividida en cuadrados de 4 x 4 cm. 4) Gotero estandar de antgeno, calibrado para distribuir exactamente 0,03 ml por gota. 5) Pipetas de Bang o automticas. 6) Mezcladores (plstico, acrlico o vidrio). 7) Reloj de laboratorio.

Metodologa:

Previo a la prueba, la placa, el suero y el antgeno deben estar a temperatura ambiente (18 a 26 C) durante 40 minutos. Agitar suavemente el antgeno durante cinco minutos. Si el suero estuviera congelado, descongelarlo y mezclarlo bien, invirtiendo el tubo varias veces.

a. Colocar la placa sobre el aglutinoscopio.

b. Con una pipeta de Bang (o automtica) en posicin de 45 y apoyada sobre la placa de vidrio, depositar 0,08 ml de suero.


10

c. Con el gotero en posicin vertical y a una altura de 3 cm dejar caer una gota de

0,03 ml de antgeno sobre el suero.

d. Mezclar bien el suero con el antgeno abarcando una superficie circular de 3 cm de dimetro.

e. Retirar la placa de vidrio e imprimir dos o tres movimientos en forma rotativa

para homogeneizar la mezcla.

f. Colocar la placa sobre el aglutinoscopio y taparlo, permaneciendo la luz apagada.

g. Efectuar una nueva rotacin pasados los cinco minutos.

h. A los ocho minutos, rotando suavemente la placa, y con la luz encendida,

proceder a la lectura

Interpretacin:

Las reacciones se clasifican en: POSITIVAS: Cuando se forman grumos y el sobrenadante queda transparente. NEGATIVAS: Cuando la mezcla suero-antgeno es homognea y sin grumos.


11

ENZIMOINMUNOENSAYO INDIRECTO (ELISA-I) Fundamento:

El mtodo recomendado por la OIE, validado en Argentina, se basa en el uso del lipopolisacrido liso (LPS-l) de la membrana externa de B. abortus y de un anticuerpo monoclonal anti-IgG1 de bovino conjugado con la enzima peroxidasa. Los anticuerpos contra Brucella presentes en el suero o leche reconocen especificamente epitopes presentes en el LPS-l. Al agregar el conjugado la anti-IgG1 se une al anticuerpo y la enzima libre en presencia del substrato y un cromgeno produce un cambio de color. La intensidad del color est directamente relacionada con la concentracin de anticuerpos presentes en la muestra .


12

PRUEBAS DE SEROAGLUTINACIN EN TUBO Y 2-MERCAPTOETANOL (SAT + 2-ME)

Fundamento:

La prueba de seroaglutinacin en tubos (SAT) o mtodo de Wright tuvo su origen en Inglaterra (Wright, 1.898). Actualmente se emplea cuando se desea conocer el contenido total de anticuerpos bruclicos en el suero, en trminos de Unidades Internacionales por mililitro de suero (UI/ml); pues detecta la presencia de los anticuerpos Ig.M e Ig.G. La prueba del 2-mercaptoetanol (2-ME) se basa en la propiedad de esta sustancia qumica de degradar los anticuerpos Ig.M. Por lo tanto es una prueba selectiva-cuantitativa, que detecta solamente la Ig.G existente en el suero. Tuvo su origen en los EE. UU. (Anderson y col,1.964). Son pruebas complementarias para el diagnstico de la brucelosis bovina y se examinarn por stas tcnicas todos los animales que hayan resultado positivos al BPA.

Las pruebas de 2-ME y SAT deben hacerse en simultneo por lo siguiente:

La prueba del 2-ME da fenmenos de zona*, frecuentemente, con sueros muy positivos. Esto no ocurre con SAT, si el antgeno est en bien elaborado.

La prueba del 2-ME puede resultar negativa, en animales con infeccin reciente, que todava no tienen Ac. Ig.G, pero s Ig.M, en cantidad de 100 UI o ms.

La solucin del 2-ME, pudo haberse alterado (oxidado) y la prueba estara midiendo errneamente inmunoglobulinas, condenando a animales no infectados.

* Fenmeno de zona o prozona: Inhibicin de la aglutinacin a causa de la presencia de concentraciones altas de anticuerpos. Materiales: 1) Antgeno de Wright, estandarizado previamente y mantenido en

concentracin de 4,5 % de Brucellas. 2) Solucin salina fenolada al 5 . 3) Solucin de 2-mercaptoetanol ( 2-ME) 0,1 Molar. 4) Solucin fisiolgica. 5) Suero problema. Preparacin de Solucin Salina Fenolada: Colocar en 955 ml de solucin fisiolgica,5 ml de fenol. Preparacin de Solucin Fisiolgica: Colocar 8,5 grs de cloruro de sodio en agua destilada csp 1.000 ml.

Preparacin de la Solucin de 2-Mercaptoetanol:


13

Agregar a 100 ml de solucin fisiolgica 0,78 ml de 2-mercaptoetanol solucin madre para obtener una solucin 0,1 Molar (el 2-ME tiene un peso molecular de 78,13 grs). Esta solucin es muy sensible a la luz, al calor y al aire, por lo que debe conservarse en frasco color mbar entre 4 y 8 C y descartarla transcurrida una semana. Preparacin del Antgeno para la prueba: Agregar a 98 ml de solucin fisiolgica, 2 ml de antgeno.

6) Tubos de serologa de 13 x 100 mm limpios y secos. 7) Gradillas portatubos. 8) Pipetas de 10 ml graduadas 1/10 o jeringas automticas dosificadoras de 1 ml. 9) Pipetas de Bang, limpias y secas. 10) Estufa o bao mara a 37,5 C. 11) Reloj de laboratorio. Metodologa:

a. Colocar en la gradilla dos hileras de tubos de 13 x 100 mm de cuatro tubos cada una. Una hilera para SAT y la otra para 2-ME.

b. Con una pipeta cargar el suero hasta sobrepasar la graduacin superior. Con una toalla de papel limpiar el extremo de la pipeta, mantenindola en posicin vertical hasta enrasar la graduacin cero. Insertar la pipeta hasta el fondo de los primeros tubos de las dos hileras (de cuatro tubos cada una) y dejar que fluya 0,08 ml de suero en cada uno. Utilizando la misma tcnica se coloca 0,04 ml en los segundos tubos, 0,02 ml en los terceros y 0,01 ml en los cuartos tubos.

c. Con una pipeta o jeringa automtica agregar a cada tubo 1 ml de solucin salina fenolada (en la primer hilera) y 1 ml de solucin de 2-ME (en la segunda hilera); mezclar bien agitando la gradilla.

d. La dilucin del suero en el primer tubo es de 1/25, en el segundo 1/50, en el tercero 1/100 y en el cuarto 1/200.

e. Dejar la gradilla con las mezclas en reposo durante 60 minutos, a temperatura ambiente. Agregar 1 ml de antgeno al 2 % en cada tubo, mezclar bien agitando la gradilla.

f. Poner en la gradilla un tubo sin suero y depositar en l 2 ml de antgeno, sirve de testigo para controlar el antgeno.

g. Incluir un suero que en SAT aglutine con un ttulo de 1/200 o superior y sea negativo a la prueba de 2-ME, sirve de testigo para controlar la solucin de 2-ME.

h. Incubar en estufa a 37,5 C, durante 42 a 48 horas.

Interpretacin: En los das claros, se colocan los tubos frente a la ventana, a la altura de la vista. Si hay poca luz natural se hace la lectura contra un fondo negro opaco, con una fuerte luz que atraviese los tubos.

Las reacciones se clasifican en: POSITIVA: se identifica con el signo (+). Si el lquido de la mezcla suero-antgeno aparece claro y una suave agitacin suspende los grumos sedimentados, sin romperlos.


14

INCOMPLETA: se identifica con el signo (I). Si la mezcla suero-antgeno aparece parcialmente clara y una suave agitacin suspende los grumos sedimentados y algunos se desmenuzan completamente. NEGATIVA: se identifica con el signo (-). Si la mezcla suero-antgeno no aparece clara y una suave agitacin no revela grumos.

Calificacin de los animales:

o Los animales cuyos sueros dan reacciones negativas, se consideran negativos, cualquiera sea la especie.

o Los animales caprinos, porcinos y ovinos, cuyos sueros dan reaccin positiva o incompleta en la dilucin 1/25 y/o superiores se consideran infectados.

o En los bovinos: los machos enteros y las hembras no vacunadas de terneras se consideran infectados cuando sus sueros dan reaccin incompleta o positiva a la dilucin 1/25 y/o superiores.

o Las hembras vacunadas de terneras se consideran infectadas, cuando sus sueros dan reaccin incompleta o positiva, a la prueba de 2-mercaptoetanol, a partir de la dilucin 1/50; sospechosas cuando dan reaccin positiva e incompleta en la dilucin 1/25.

Los sueros de las hembras sospechosas deben examinarse de inmediato por la prueba de fijacin del complemento, de lo contrario, esas hembras debern apartarse en potreros aislados y sern sangradas transcurridas tres a cuatro semanas.

Nota: El lquido del tubo testigo (para el antgeno) puede no aparecer claro y parte del antgeno puede estar sedimentado en el fondo, al agitar el tubo, suavemente, levanta el sedimento y se observa como una tenue columna de humo, que desaparece rpidamente, porque no hay grumos. Un fenmeno similar se observa con muchos sueros negativos (SAT), principalmente si estn contaminados. El fenol es slido (cristales). Para usarlo se licua, colocando el frasco (o mejor, pasando parte de los cristales a otro frasco) en bao mara a 75 - 80 C.


15

ENZIMOINMUNOENSAYO COMPETITIVO (ELISA-C) Fundamento: La tcnica descripta por Gall y Nielsen, validada en Argentina, se basa en el uso del LPS-l de Brucella abortus como antgeno, un anticuerpo monoclonal M84 que reconoce un epitope de la cadena O del LPS-l y un conjugado compuesto por un anticuerpo anti M84 unido a la peroxidasa. Los anticuerpos contra Brucella spp. presentes en el suero compiten con el M84 por su epitope especfico e inhiben la reaccin antgeno-anticuerpo con el monoclonal.

Cuando un suero es negativo el M84 se une a su epitope y al agregar el conjugado la peroxidasa en presencia del sustrato cromgeno produce color. Cuando un suero es positivo el M84 es desplazado por los anticuerpos especficos del suero y el sustrato no encuentra a la enzima por lo que no se desarrolla color.

La prueba detecta todos los isotipos de inmunoglobulinas presentes en el suero. Los bovinos vacunados con cepa 19 producen temporalmente anticuerpos contra el anticuerpo especfico del M84, por lo que slo despus de los cuatro meses de efectuada la vacunacin ELISA-C permite discriminar anticuerpos provenientes de la vacunacin de los especficos de infeccin .


16

POLARIZACIN FLUORESCENTE (FPA) En el curso del ao 2006 se incorporan al Plan Nacional de Brucelosis las tcnicas de ElLISA y FPA por la Resolucin 438/2006 del SENASA. Fundamento: Se produce in vitro una reaccin antgeno-anticuerpo, enfrentando el suero de un animal enfermo de brucelosis con una fraccin de del antgeno de bruecella (cadena O), este complejo forma una masa grande que en suspensin gira mas lentamente . Adems ese antgeno se conjuga con isotiocianato de fluorescena (IFTC) y se hacen incidir distintos haces de luz. El complejo emitir luz con distintos grados de despolarizacin en funcin de su velocidad de rotacin. Metodologa

1- Agregar 10 l de suero problema a 1 ml de buffer. 2- Leer el blanco 3- Agregar 10 l de Antgeno. 4- Incubar 2 minutos 5- Realizar la lectura.

Interpretacin Los resultados son expresados como (unidades de milipolarizacin mP) del suero frente al angeno. SUERO POSITIVO + Ag. con IFTC = luz despolarizada mayor 105 mP. SUERO NEGATIVO + Ag con IFTC = luz despolarizada menor a 94 mP.


17

PRUEBA DEL ANILLO EN LECHE (PAL)

Fundamento: La prueba del anillo en leche detecta la presencia de anticuerpos antibrucelas en leche. Estos anticuerpos reaccionan con el antgeno coloreado de azul formando un complejo antgeno-anticuerpo que se adhiere a la superficie de los glbulos de grasa de la leche ascendiendo con ellos para formar la capa de crema coloreada (anillo). En ausencia de anticuerpos especficos, la capa de crema ser blanca y la columna de leche estar coloreada por las clulas de brucellas teidas (Ag.) que contiene en suspensin. Esta prueba se utiliza como test presuntivo para descubrir rebaos potencialmente infectados en reas de brucelosis. Es empleada en la vigilancia epidemiolgica para controlar las reas libres y poder descubrir los establecimientos en los que se reintroduzca la infeccin. Tienen mayor exactitud en leche de varios animales y no en leche individual. La efectividad de la vigilancia del PAL depende de la frecuencia de las pruebas hechas en el rebao: Una sola prueba: 60 70 % de eficiencia. Repetida a los 90 das: 95 % de eficiencia. Se ha comprobado que la posibilidad de obtener una prueba del anillo en leche positiva mezclando leche de 25 vacas, de las cuales dos son positivas a la seroaglutinacin es de 96 % y cuando hay tres vacas positivas es del 99 %. Materiales: 1) Muestra de leche 2) Antgeno de P.A.L. 3) Pipetas de 1 ml. 4) Tubos de hemlisis 5) Gotero que descargue 0.03 ml. 6) Heladera a 4 grados C 7) Estufa a 37 grados C Metodologa: Toma de muestras:

En el campo: tan pronto se ha llenado el tanque, revolver bien el contenido para que la dispersin de la nata sea homognea, porque el exceso o bien la falta de grasa dificulta la interpretacin de la prueba. En un frasco, que contiene 5 ml de formol al 1 %, colocar 50 ml de leche. Para tomar la leche se utiliza un cucharn metlico, el cual se ha de enjuagar cuidadosamente en agua despus de utilizarlo. Las muestras bien identificadas se transportan refrigeradas hasta el laboratorio evitando que se agiten vigorosamente. Remitir la muestra informando el nmero de vacas que deriven leche al tanque.


18

Tcnica: a. Las muestras deben mantenerse en refrigeracin a temperaturas de 4 a 6 C

hasta que hayan transcurrido no menos de 24 hs. de su recoleccin (preferiblemente 48 a 72 hs.).

b. Una hora antes de ejecutar las pruebas, se llevan a temperatura ambiente tanto la muestra como el antgeno a utilizar.

c. Mezclar la muestra invirtiendo varias veces el recipiente para disponer de uniformidad de nata.

d. Tomar 1 ml de la muestra y colocarlo en un tubo de hemlisis. e. Agregar una gota de antgeno de 0,03 ml, mezclar bien invirtiendo el tubo

varias veces sin que se llegue a formar espuma. No debe quedar antgeno sobre las paredes.

f. Incubar a 37 C durante una hora. Interpretacin:

(-) Anillo de crema blanca, columna de leche azul.

(+) Anillo de crema y columna de leche del mismo color.

(++) Anillo de crema de color mas pronunciado que la columna de leche.

(+++) Anillo de crema color azul oscuro, columna de leche con algo de color.

(++++) Anillo de crema azul oscuro, columna de leche blanca.

Las reacciones se clasifican en negativas o positivas, en cambio los establecimientos se clasifican como negativos o sospechosos, debido a que es una prueba presuntiva en la que no hay evidencias directas de infeccin de animales individualmente.

Por lo expuesto anteriormente se deduce que es una prueba sencilla y de gran efectividad, pero se debe respetar al mximo todas las indicaciones, de lo contrario se obtendrn resultados falsos negativos o falsos positivos.

Falsos negativos:

El exceso o la escasez de crema dificulta la interpretacin de la prueba. La agitacin vigorosa as como el uso de leche homogeneizada dificulta la

realizacin de la prueba. El calentamiento de la leche interfiere en los resultados, por lo tanto la prueba no

se puede realizar con leche pasteurizada, a menos que se le agregue crema de leche sin pasteurizar o que se la diluya con leche fresca de vacas negativas.


19

Falsos positivos:

Cuando la prueba se efecta el mismo da que se ha recolectado la leche se pueden obtener algunos resultados positivos falsos o dudosos.

La leche de calostro puede dar falsos positivos. La leche de vacas con mastitis tambin puede dar falsos positivos o impedir la

interpretacin de la prueba debido a la decoloracin del antgeno. La leche de vacas prximas a secarse pueden dar resultados dudosos o falsos

positivos.


20

PRECIPITACIN EN GEL DE AGAR APLICADA AL DIAGNSTICO DE AIE

Fundamento: Se produce una reaccin de precipitacin cuando un Ag soluble es puesto en contacto con su Ac especfico, y cuando se encuentran en proporciones ptimas, forman una red de complejos inmunes que se insolubilizan y precipitan. Materiales:

1. Agar: en el comercio existen varias marcas de agar para inmunodifusin. Tiene la caracterstica de ser muy purificado (no confundir con el agar bacteriolgico que se utiliza para la fabricacin de medios de cultivos).

2. Buffer: las soluciones de agar al 1 y 2 % utilizadas para la tcnica de

precipitacin se deben preparar en el siguiente buffer: a) Hidrxido de sodio........... 2 grs b) cido brico..................... 9 grs c) Agua destilada c.s.p....1.000 ml d) pH final: 8,6 e) Conservar a 4 C.

3. Material de vidrio: a) Placas de Petri. b) Tubos de ensayo. c) Frascos de vidrio (capacidad 10 ml Ej.: antibiticos). d) Vasos de precipitado de 200 ml. e) Probetas. f) Pipetas de Pasteur.

4. Antgeno: el antgeno liofilizado se conserva a 4 C, pero una vez reconstituido se debe conservar congelado.

5. Suero testigo o control: liofilizado conservar a 4 C, y una vez reconstituido

congelarlo. 6. Suero problema: sueros limpios, sin contaminacin, que deben conservarse hasta

el estudio a 4 C. 7. Cmara Hmeda: es el lugar donde colocaremos las placas a incubar. Consiste en

una caja que cierre correctamente (Ejemplo: una caja de transporte de vacunas) y que en su interior contenga agua en poca cantidad. Esto es para evitar que se deshidrate el agar de la placa impidiendo as la difusin de las protenas a travs de los poros de gel.

8. Sacabocado de bronce.


21

Metodologa:

PREPARACIN DEL AGAR: en cada una de las placas de Petri se deben colocar 5 ml de agar al 2 % y 15 ml de agar al 1 %, por lo tanto en este paso prepararemos las dos soluciones de agar y luego fraccionaremos en frascos de 5 y 15 ml respectivamente para agilizar el manejo posterior. Una forma de preparar cantidades justas para no desperdiciar material es la siguiente:

a. Pesar 1 gr de agar para inmunodufisin y colocarlo en vaso de precipitado. b. Pesar 1 gr de agar y colocarlo en otro vaso de precipitado. c. Agregar al primer vaso 10 ml de buffer fro y al segundo 20 ml. d. Calentar buffer en otro recipiente (aproximadamente 150 ml). e. Una vez disuelto el agar con el buffer fro agregar 40 ml de buffer caliente al

primer vaso, y 80 ml al segundo. As obtenemos en el vaso uno 50 ml de agar al 2 % y en el vaso dos 100 ml de agar al 1 %.

f. Tanto el vaso uno como el dos se colocan a ebullicin a bao Mara. g. Una vez que entran en ebullicin se debe medir el volumen final de cada uno

en una probeta, en caso de faltar solucin por prdida de agua agregar buffer caliente.

h. Los 50 ml con agar al 2 % se distribuyen en frascos con cantidades justas de 5 ml cada uno, y los 100 ml de agar al 1 % se distribuyen en tubos de ensayo en cantidades justas de 15 ml Luego tapar muy bien los frascos y tubos.

i. Una vez distribudo se debe conservar a 4 C. En estas condiciones dura varios meses, luego el agar comienza a deshidratarse, y esto se comprueba porque se desprende de las paredes de vidrio del recipiente que lo contiene.

PREPARACION DE LA PLACA: a. Colocar una caja de Petri limpia y seca en la superficie de la mesada en posicin

horizontal. b. Poner a bao Mara el frasco con 5 ml de agar al 2 %. c. Una vez que el agar se disolvi distribuirlo rpidamente en la placa porque se

puede solidificar antes de terminar la distribucin. Si la temperatura ambiente es baja se recomienda calentar un poco la placa de Petri.

d. Una vez que la primera capa de agar solidific (15 minutos aproximadamente), disolver a bao Mara el tubo con 15 ml de agar al 1%. Una vez disuelto distribuir con cuidado sobre la primera capa.

e. Dejar a temperatura de laboratorio durante 15 a 20 minutos y luego con cuidado colocar en heladera a 4 C como mnimo 40 minutos (las placas en estas condiciones no duran ms de siete das).

f. Luego preceder a perforar la primera capa con un sacabocado. Una vez perforado retirar los trozos de agar con una bomba de vaco o con un alambre.

SIEMBRA: primero debemos sembrar los sueros problema a investigar, luego los sueros testigos o controles y por ltimo el antgeno con la siguiente distribucin. La metodologa de siembra es la siguiente: con una pipeta automtica o de Pasteur limpia y seca, se procede a cargar el primer suero problema, que con mucho cuidado se deposita en el pozo correspondiente hasta llenarlo completamente, tener mucho cuidado en no desbordar el pozo. Con otra pipeta se llena otro pozo con otro suero problema.


22

Posteriormente se siembra con otra pipeta el suero testigo en los pozos correspondientes, y por ltimo con otra pipeta, el antgeno. INCUBACIN: con cuidado se coloca la caja de Petri sin la tapa (para poder manejarla mejor) en la cmara hmeda, luego se coloca la tapa correspondiente en la placa y se cierra la cmara.

Interpretacin: A las 48 hs. se procede a la lectura sobre fondo negro y con incidencia lateral de luz. NEGATIVO: la prueba es negativa cuando no se forma una lnea entre el suero problema y el antgeno. POSITIVO: la prueba es positiva cuando se forma una lnea continua entre el suero problema y el antgeno. DBILMENTE POSITIVO: la lnea control se curva ligeramente hacia el crculo que contiene el antgeno pero no contina formando una lnea completa entre el suero problema y el antgeno. Se recomienda que stas reacciones sean repetidas antes de informar el resultado. FUERTEMENTE POSITIVO: la lnea control se inclina hacia el antgeno antes de que alcance el crculo que tiene el suero problema y se contina con una ancha lnea entre el suero problema y el antgeno. LINEAS INESPECIFICAS: cuando se forman lneas que cruzan la lnea control dentro del crculo que contiene el suero problema.

A. NEGATIVO D. NEGATIVO G. POSITIVO

B. POSITIVO E. FUERTE POSITIVO H. INESP.

C. DEBIL POSITIVO F. POSITIVO I. INESP.


23

REACCIN A LA TUBERCULINA

Fundamento:

Cuando se inyecta en la piel de animales sensibilizados determinados antgenos, puede presentarse en el foco de inyeccin una respuesta inflamatoria que tarda varias horas en instalarse, esa reaccin es de hipersensibilidad tarda, no es transferible de un animal sensibilizado a uno normal con el suero, pero s con el transporte de linfocitos y es por esto, que no hay duda que se debe a clulas. La reaccin de hipersensibilidad tarda es una HIPERSENSIBILIDAD DE TIPO IV y se debe a la interaccin entre el antgeno inyectado y los linfocitos T sensibilizados. Un ejemplo destacado de hipersensibilidad tarda es la reaccin de la tuberculina, respuesta que aparece en un animal tuberculoso en caso de inyeccin intradrmica de tuberculina (Derivado Proteico Purificado a partir de cultivos de Mycobacterium tuberculoso mamfero o aviar en la concentracin de 1 mg./ml) Adems de sta prueba existen otras pruebas cutneas diagnsticas basadas en la hipersensibilidad tarda como: la melitina, para el diagnstico de B. melitensis; la histoplasmina para el diagnstico de Histoplasmosis y la coccidieimina para el diagnstico de Cocciodiomicosis. La Secretara de Agricultura, Ganadera y Pesca de la Repblica Argentina en total acuerdo con el Servicio Nacional de Sanidad Animal y Calidad Agroalimentaria -SENASA- ha dictado la Resolucin N 1.287/93 en la que se establecen las normas y procedimientos del PLAN NACIONAL DE CONTROL Y ERRADICACIN DE LA TUBERCULOSIS BOVINA. Procedimiento para la tuberculinizacin en rodeosProcedimiento para el saneamiento de la Tuberculosis (TBC) en los rodeos In

Introduccin La tuberculosis es una enfermedad crnica en la que debe considerarse al rodeo como una unidad epidemiolgica. No pueden tenerse en cuenta animales enfermos y sanos, sino referirse a la situacin sanitaria de la poblacin como un todo. Las pruebas tuberculnicas negativas no son garanta sanitaria suficiente, si se desconoce el estado sanitario del rodeo del cual proviene el o los animales, excepto cuando los mismos provienen de un rodeo certificado libre, se puede garantizar dicha condicin. Por lo tanto es un instrumento valioso en el control y erradicacin de la TBC bovina y con ese criterio deben manejarse.

Las pruebas tuberculnicas y su interpretacin: La prueba tuberculnica es el procedimiento bsico para reconocer los animales infectados en el rodeo, siendo la va de aplicacin INTRADRMICA la nica aceptada . Dos sern las pruebas tuberculnicas de uso corriente: Prueba ano-caudal de rutina. Prueba cervical simple de saneamiento.


24

Las tuberculinas: Las tuberculinas que se podrn usar para animales son derivado protico purificado de tuberculina bovina (PPD), elaborada con Mycobacterium bovis y la PPD aviar elaborada con una cepa de M. avium. La tuberculina aviar contiene un colorante, el rojo Punceau; la bovina actualmente es incolora, hasta hace algunos aos se usaba el azul de Evans como colorante para distinguirla. Las nicas tuberculinas PPD utilizadas en el pas son las elaboradas por SENASA y las producidas por laboratorios particulares que fueron controladas y aprobadas por ese organismo. Las tuberculinas PPD deben ser transportadas y conservadas en fro (2 8 C) y protegidas de la luz solar directa. Una vez utilizado parte de reactivo debe descartarse el resto si no se va a usar el mismo da. Procedimiento para la aplicacin de las tuberculinas: 1. Instrumental: jeringas, agujas, calibradores. Las jeringas sern de pequeo volumen (1 a 2 ml), graduadas en 0,1 ml. Las agujas sern hipodrmicas, reutilizables conforme a las normas IRAM 9.031/78, calibre 6, longitud de cnula 5 mm, punta tipo b (bisel corto). Podrn utilizarse agujas descartables de similares caractersticas o de mayor longitud de cnula. Para las pruebas tuberculnicas de animales difciles de inmovilizar, como el caso de las razas cebuinas, podrn usarse agujas ms cortas. Los calibradores podrn ser metlicos, plsticos o digitales graduados en mm. 2. Tcnica de aplicacin de la tuberculina: a) Un ayudante debe inmovilizar al animal con una mocheta o con otro medios. b) Se debe usar solo jeringas y agujas sanas. c) En las inoculaciones para la prueba cervical se corta el pelo en la regin a inyectar y se mide el pliegue con un calibrador. d) Si la piel de la tabla del cuello o ano-caudal est sucia, se debe limpiar el lugar de inyeccin evitando el uso de desinfectantes o productos qumicos que irriten la piel. e) Una vez inmovilizado el animal y limpiado el lugar de la inyeccin, se procede a inyectar la aguja en toda su longitud en las capas superficiales de la piel. Se debe tener cuidado de no traspasar la piel con la punta de la aguja, retirar apenas la aguja e inyectar 0,1 ml de tuberculina. Se retira la aguja cuidadosamente si es posible, apretando entre el pulgar y el ndice la regin inyectada para prevenir la prdida de alguna parte, en el lugar inoculado debe aparecer una ppula. f) No utilizar sobrantes de tuberculina de un da para el otro.


25

Tcnica de lectura de las pruebas: Leer despus de las 72 hs. de haber inoculado, en casos de no ser posible se podr hacer la lectura con un margen de ms o menos de 6 hs. Inmovilizar al animal y verificar su identidad, ya sea por el nmero de tatuaje, a fuego u otra identificacin indeleble. Medir el pliegue inoculado con el calibrador y anotar el engrosamiento (comparando con la medida previa del pliegue y la actual y sacando por diferencia el aumento de grosor). Toda reaccin observada en las pruebas tuberculnicas debe ser anotada en un protocolo. El registro de las pruebas es importante para las pruebas ulteriores del mismo rodeo y para la evaluacin del plan de erradicacin en el rea. Seguir las pautas de interpretacin de cada una de las pruebas para clasificar a los animales Prueba tuberculnica de rutina: La prueba tuberculnica bsica operativa o de rutina ser aplicada en el tercio medio del pliegue ano-caudal, a unos 6 cm de la base de la cola y en el centro del pliegue. Interpretacin: El veterinario que realiza la prueba tuberculnica de rutina en un rodeo, tiene que actuar con criterio epidemiolgico, tomando en cuenta la totalidad del rodeo y no interpretar los resultados en base a los animales considerados aisladamente. En la primera prueba, cuando se desconoce si el rebao est infectado o no, se aplicar el siguiente criterio general: POSITIVO: un engrosamiento de la piel de 5 mm o ms. SOSPECHOSO: un engrosamiento de 3 mm. o ms y menos de 5 mm. NEGATIVO: menos de 3 mm. Prueba cervical simple: La sensibilidad de la prueba cervical es superior a la del pliegue ano-caudal, ella se aplica con el fin de obtener una mayor seguridad en la eliminacin de bovinos infectados en rodeos en los que se ha comprobado infeccin. Para la prueba el establecimiento necesita contar con instalaciones adecuadas que aseguren una correcta sujecin de los animales. El lugar de inoculacin es el tercio medio del cuello. Se corta el pelo a mquina o tijera en el lugar de la inyeccin, una rea de unos 5 a 6 cm2, se mide con el calibre el grosor de la piel y se registra en el protocolo. Previa limpieza se aplica la inyeccin con la jeringa de tuberculina. Se inocula intradrmicamente 0,1 ml de PPD bovina (1 mg/ml) y se hace la lectura a las 72 hs. de la inyeccin, midiendo con un calibrador el espesor de la piel. Interpretacin de la prueba cervical simple: POSITIVO: un engrosamiento de la piel de 3 mm o ms. NEGATIVO: un engrosamiento menor de 3 mm.


26

DIAGNOSTICO TUBERCULINICO EN OTRAS ESPECIES Prueba tuberculnica en porcinos: Los animales que se someten a la prueba deben identificante en forma indeleble. Los cerdos son susceptibles a tuberulosis por M. bovis, M. avium y M. tuberculosis, por lo que en la prueba deben usarse las dos tuberculinas (PPD bovis y PPD avium). Se inyecta 0,1 ml de tuberculina bovina y 0,1 ml de tuberculina aviar, con dos jeringas reservadas especficamente para cada una de ellas (la tuberculina bovina se inyecta del lado derecho, y la aviar del lado izquierdo). El lugar de inyeccin intradrmino es la piel de la base de la oreja. Si esta regin estuviera traumatizada o tuviera otro defecto se puede hacer la prueba en los labios de la vulva en la cerda o en conjuncin de piel de mucosa del ano en el macho. La lectura se hace a las 48 hs. y toda reaccin tisular comprobada por palpacin se clasifica como reaccionante, debindose anotar si la misma se debe a la bovina o la aviar. Prueba tuberculnica en aves: Si hay sospecha de tuberculosis y se comprueban lesiones tuberculosas por necropsia, la prueba tuberculnica no es necesaria, ya que todas las aves del criadero deben ser sacrificadas y la repoblacin debe ser hecha con aves procedentes de un criadero libre de la infeccin. Las aves nuevas deben ser puestas sobre un terreno no contaminado. Sin embargo la prueba tuberculnica puede ser til en el comercio de aves y en las que concurren a exposiciones. Las aves con susceptibles solo a Mycobacterium avium por lo que en la prueba se usa exclusivamente la PPD aviar. El reactivo se inyecta va intradrmica en una de las barbillas a razn de 0,05 ml La lectura se hace a las 48 hs. de aplicada la inyeccin y toda edematizacin de la barbilla inoculada se interpreta como POSITIVA. La prueba de tuberculina en equinos: Esta prueba no debe ser aplicada en los equinos. Esta especie animal es hipersensible a la tuberculina y da resultados equvocos. La prueba de tuberculina en perros y gatos: La misma no da resultados fidedignos en stas especies, por ello no se aconseja su empleo. Si hubiera la sospecha clnica de infeccin tuberculosa en individuos de esa especie, los animales deben ser sacrificados; si se comprobaran lesiones tuberculosas, se deber recomendar que los dueos sean sometidos a exmenes mdicos.


27

La prueba de tuberculina en caprinos y ovinos: La tuberculosis en ovinos es muy rara, por lo que la prueba tuberculnica no es practicada. Los caprinos son susceptibles a la tuberculosis y se le puede aplicar satisfactoriamente en el pliegue de la cola o en la tabla del cuello. La tcnica de aplicacin e interpretacin es similar a la de los bovinos.


28

Servicio Nacional de Sanidad y Calidad Agroalimentaria

SANIDAD ANIMAL

Resolucin 438/2006

Adptase el Sistema de Diagnstico Serolgico para el Programa de Control y Erradicacin de la Brucelosis. Tcnicas que lo conforman.

Bs. As., 2/8/2006

EL PRESIDENTE DEL SERVICIO NACIONAL DE SANIDAD Y CALIDAD AGROALIMENTARIA

RESUELVE:

Artculo 1 Adptase el Sistema de Diagnstico Serolgico para el Programa de Control y Erradicacin de la Brucelosis en la REPUBLICA ARGENTINA, conformado por las siguientes tcnicas de diagnstico: BPA (Buffered Plate Antigen) e I-ELISA (ELISA indirecto) como Pruebas Tamiz, y como Pruebas confirmatorias, SAT (Seroaglutinacin en Tubo) y 2-ME (2-Mercaptoetanol), FPA (Polarizacin Fluorescente), C-ELISA (ELISA Competicin) y Fijacin del Complemento; para la Vigilancia Epidemiolgica en leche, las Pruebas PAL (Prueba de Anillo en Leche e I-ELISA (ELISA Indirecto).

Art. 2 Las Pruebas serolgicas mencionadas en el artculo 1 de la presente resolucin, se refieren slo a aquellas tcnicas validadas y cuyos componentes fueron presentados, controlados y aprobados por la Direccin de Laboratorios y Control Tcnico de este Servicio Nacional.

Art. 3 Las Pruebas citadas precedentemente debern ejecutarse e interpretarse conforme al Manual de Procedimientos Tcnicos de Diagnstico de Brucelosis de la Direccin de Laboratorios y Control Tcnico.

Art. 4 Ante resultados divergentes o contradictorios entre distintas pruebas, la de Fijacin del Complemento obrar como prueba de referencia, estableciendo el diagnstico serolgico definitivo.

Art. 5 Los resultados del diagnstico serolgico conforme a lo establecido en el Manual de Procedimientos Tcnicos de Diagnstico de Brucelosis de la Direccin de Laboratorios y Control Tcnico, son un insumo para el diagnstico de la enfermedad en los animales, rodeos y/o establecimientos, los cuales debern interpretarse con criterio epidemiolgico por los Veterinarios Acreditados y de los Servicios Sanitarios Oficiales, para definir las discordancias que puedan presentarse entre el diagnstico serolgico y la situacin epidemiolgica.

Art. 6 Ante casos de discordancia entre la condicin epidemiolgica y los resultados serolgicos, el Veterinario Acreditado podr solicitar ante la Oficina Local de


29

la jurisdiccin correspondiente, la revisin del caso por el epidemilogo asignado al rea o al Programa de Brucelosis del SENASA.

Art. 7 Para que los diagnsticos puedan ser certificados oficialmente, los reactivos, materiales, mtodos, personal e instalaciones que se utilicen en la ejecucin e informacin de los mismos, debern ajustarse a las condiciones establecidas por la Direccin de Laboratorios y Control Tcnico del SERVICIO NACIONAL DE SANIDAD Y CALIDAD AGROALIMENTAR1A.

Art. 8 La Direccin Nacional de Sanidad Animal del mencionado Servicio Nacional podr revisar y modificar el Sistema de Diagnstico aplicado al Programa de Control y Erradicacin, conforme a la evaluacin que surja de su aplicacin en la lucha sanitaria y a la evolucin de la campaa, manteniendo las condiciones prescriptas en el Artculo 3 de la presente resolucin.

Art. 9 Comunquese, publquese, dse a la Direccin Nacional del Registro Oficial y archvese. Jorge N. Amaya.


Tecnicas diagnosticas para Brucelosis Bovina

Documents

Transcript of Tecnicas diagnosticas para Brucelosis Bovina