TANAMAN OBAT DAN SINTESIS METABOLIT SEKUNDER PADA...

TANAMAN OBAT DAN SINTESIS METABOLIT SEKUNDER PADA KULTUR

JARINGAN

Tim Toksikologi dan Tanaman Obat

• Medicinal plants (tanaman obat)

berbagai tanaman yang digunakan dalam terapi herbal dan memiliki aktivitas terapetik

• Tanaman obat menjadi sumber dari obat baru banyak obat modern yang dihasilkan/berasal dari tanaman

• Tanaman digunakan sebagai obat pada beberapa budaya di dunia

Chinese medicine; Ayurveda

• Obat herbal/tradisional masih digunakan oleh 85% populasi di negara berkembang

MEDICINAL PLANTS

Tanaman dengan aktivitas terapetik :

• Allium sativum (garlic)

memperbaiki fungsi pencernaan, pernafasan, saraf, kardiovaskular dan reproduksi

• Aloe vera

konstipasi, obesitas, kondisi inflamasi kulit, hepatomegali, helminthiasis

• Coriandrum sativum (coriander)

infeksi saluran kemih, muntah, dermatitis, gangguan pencernaan, alergi, diuretik

• Curcuma longa (turmeric)

antiinflamsi, antioksidan, antimikroba

• Momodica charantia (bitter melon)

cacingan, gangguan pencernaan, penyakit kulit

• Myristica fragrans (nutmeg)

rasa tidak nyaman pada perut, diare

• Piper nigrum (black pepper)

memperbaiki pencernaan, anthelmintic

TANAMAN OBAT

FITOKIMIA METABOLIT SEKUNDER

• Banyak metabolit sekunder mendapatkan perhatian medis perhatian komersial pharmaceutical product

• Obat yang berasal dari tanaman merepresentasikan nilai pasar yang tinggi

• Di Amerika pada tahun 2002, peresepan obat yang mengandung fitokimia bernilai USD 30 billion

• Paclitaxel (taxol) merupakan salah satu obat yang dihasilkan dari tanaman yang memiliki nilai tinggi antikanker yang awalnya diekstraksi dari tanaman Taxus brevifolia

• Alkaloid diterpene kulit kayu (bark) tanamanTaxus brevifolia, Taxus canadensis, dan Taxus cuspidata

• Sebagai antikanker (kanker payudara, kanker ovarium)

Taxol (Paclitaxel)

Taxus brevifolia

• Diisolasi dari tanaman Papaver somniferum L.

• Sebagai analgesik

Morphine & Codein

• L-3,4-dihydoxyphenylalanine Vicia faba

• Merupakan prekursor untuk alkaloid betalain, melanin

• Merupakan prekursor catecholamines pada hewan

• Berkhasiat untuk penyakit Parkinson

L-DOPA

Papaver somniferum L.

Vicia faba

• Merupakan prekursor untuk sintesis obat steroidal

• Diisolasi dari Dioscorea deltoidea

DIOSGENIN

• Alkaloid Capsicum frutescens

• Berkhasiat :

- digestive stimulant

- gangguan rheumatik

CAPSAICIN

Dioscorea sp.

Capsicum frutescens

• Alkaloid Camptotheca acuminata

• Sebagai antitumor

CAMPTOTHECIN

BERBERINE

• Isokuinolin alkaloid akar Coptis japonica; cortex Phellondendron amurense

• Sebagai antibakteri Phellondendron amurense

Camptotheca acuminata

• Tropan alkaloid daun tanaman Solanaceae, seperti Datura sp., Hyoscyamus, Scopolia sp.

• Sebagai anastetik, antispasmodik

Scopolamine & Hyoscyamine

• Steroidal lakton daun dan akar Withania somnifera

• Khasiat :

- antitumor

- imunosupresan

- antimikroba

Withaferin & Withanolides

Datura sp.

Withania somnifera

• Cardiac glikosida ? Digitalis lanata; Digitalis purpurea

• Sebagai obat jantung

DIGOXIN

• Naphthoquinone Lithospermum erythrorhizon

• Bentuk ester berkhasiat :

- antiinflamasi

- antitumor

SHIKONIN

Digitalis purpurea

Lithospermum erythrorhizon

VINCRISTINE& VINBLASTINE

• Terpenoid indol alkaloid Catharanthus roseus

• Sebagai antikanker

• Diisolasi dari Podophyllum peltatum dan Podophyllum hexandrum

• Sebagai antikanker

PODOPHYLLOTOXIN

Catharantus roseus

Podophyllum peltatum

PRODUKSI METABOLIT SEKUNDER

Kultur jaringan dan sel tanaman sebagai sumber metabolit sekunder

• sumber alternatif dalam produksi metabolit sekunder

• sel tanaman bersifat totipotent secara biosintetik

Dapat mempertahankan informasi genetika secara komplit dapat menghasilkan senyawa-senyawa kimia yang ditemukan di pada tanaman induk

Keuntungan teknologi kultur jaringan :

1. Tidak dipengaruhi oleh variasi musim dan letak geografis, serta faktor lingkungan lainnya

2. Dapat menjamin produksi yang berkelanjutan, dengan kualitas dan hasil yang seragam

3. Memungkinkan untuk menghasilkan senyawa baru yang tidak ditemukan pada tanaman induk

4. Kecepatan dalam produksi

5. Tidak dipengaruhi oleh kepentingan politis

• Jaringan tanaman yang didapatkan secara aseptik dari bagian tanaman tertentu explant dikultur pada/dalam media nutrisi yang sesuai

• Pertumbuhan yang terjadi setelah transfer menghasilkan gumpalan sel yang tidak teratur callus

• Callus gumpalan sel tidak teratur yang tumbuh sebagai bentuk wound healing

CALLUS CULTURE

Regenerasi tunas (shoot) / akar (root) dipengaruhi oleh perbandingan konsentrasi (ratio) auxin-cytokinin

• Kultur yang terdiri dari sel tunggal atau gumpalan sel yang terdispersi dan tumbuh dalam media cair

• Kebanyakan kultur suspensi sel berasal dari kultur callus

kultur callus dalam media cair agitasi suspensi sel sel tunggal/gumpalan sel

• Laju pertumbuhan kultur suspensi sel lebih cepat dibandingkan kultur callus

CELL SUSPENSION CULTURE

• Terdapat beberapa kultur sel tanaman yang dapat menghasilkan metabolit sekunder dengan konsentrasi yang sama atau bahkan lebih besar daripada tanaman utuh

• Akan tetapi masih terdapat masalah terkait produksi metabolit sekunder melalui teknik kultur sel produksi/pendapatan yang rendah

scale up

• Tanaman Coptis japonica mengakumulasi berberine dalam jumlah yang signifikan pada batangnya setelah 4-6 tahun

• Jumlah yang kurang lebih sama dapat dihasilkan setelah 4 minggu menggunakan kultur jaringan

Metode-metode untuk meningkatkan produksi metabolit sekunder melalui teknik kultur jaringan/sel :

• Memilih tanaman induk dengan kandungan metabolit sekunder (yang diinginkan) dalam konsentrasi tinggi kultur callus cell line dengan produksi metabolit sekunder yang paling tinggi

• Kandungan glucosinolate utama pada biji Brassica juncea adalah progoitrin, sedangkan pada biji Brassica oleracea adalah gluconapoleiferin

1. Skrining dan seleksi sel dengan produktivitas tinggi

Brassica oleracea seed

• Aktivitas biokimia yang heterogen dalam suatu populasi sel dapat dieksploitasi untuk mendapatkan cell line dengan produktivitas tinggi

• Cell cloning memberikan suatu cara yang menjanjikan dalam seleksi cell line

• Melalui cell cloning terhadap aggregate (callus) Coptis japonica Matsubara et.al mendapatkan cell line yang tumbuh lebih cepat dan menghasilkan berberine dalam jumlah yang lebih tinggi


Cell Cloning

Coptis japonica

• Merupakan cara lain untuk memaksimalkan produksi dan akumulasi metabolit sekunder


Protoplast fussion

• Strategi mutasi cell line yang memproduksi senyawa metabolit secara berlebihan (overproduction)

• Penggunaan senyawa selektif sebagai pendekatan alternatif dalam seleksi sel yang memiliki produktivitas tinggi

populasi sel dipapar dengan suatu senyawa toxic (cytotoxic) atau stres lingkungan hanya sel yang dapat bertahan yang akan tumbuh


Mutagens

• Contoh senyawa selektif yang dapat digunakan :

- p-Fluorophenylalanine (PFP)

- 5-methyltryptophan

- glyphosate

- biotin

• Manipulasi kondisi pertumbuhan merupakan salah satu pendekatan dasar dalam mengoptimalkan produksi metabolit sekunder oleh kultur sel

• Media kultur sel tanaman, terdiri dari :

- komponen inorganic (macro dan microelements)

- komponen organic (sukrosa)

- phytohormone

2. Manipulasi Nutrisi

• Media kultur sel tanaman yang umum digunakan :

- Murashige and Skoog (MS)

konsentrasi nitrate (NO3-), potassium (K+), dan ammonia (NH4-) yang tinggi

- B5 by Gamborg

konsentrasi nutrisi inorganic pada B5 lebih rendah daripada MS


Jalur metabolisme sekunder dapat dengan mudah dipengaruhi oleh faktor-faktor eksternal, seperti level/konsentrasi nutrisi

a. Gula

- Sukrosa atau glukosa Sumber karbon

- Konsentrasi glukosa memberikan efek pada produktivitas kultur dalam menghasilkan metabolit sekunder

- Konsentrasi optimal berbeda untuk setiap spesies tanaman

akumulasi indol alkaloid pada kultur sel C. roseus paling optimal pada konsentrasi sukrosa 8% w/v (4 - 12% w/v)

konsentrasi sukrosa 5% w/v menurunkan akumulasi anthocyanin pada kultur suspense sel tanaman Aralia cordata 3% w/v lebih optimal


b. Nitrat

- Sebagai sumber nitrogen

- Media kultur jaringan tanaman mengandung nitrat (NO3-) dan ammonium (NH4+) sebagai sumber nitrogen - Rasio ammonium/nitrat berpengaruh terhadap produksi metabolit sekunder

NH4+ NO3- , meningkatkan produksi shikonin dan betacyanins

NH4+ NO3- , meningkatkan produksi berberine dan ubiquinone

- Konsentrasi nitrogen total berpengaruh terhadap produksi metabolit sekunder

Nitrogen total , meningkatkan produksi capsaicin pada Capsicum frutescens, anthraquinones pada Morinda citrifolia

c. Fosfat

- Konsentrasi fosfat yang tinggi meningkatkan pertumbuhan sel, memberi efek negatif pada akumulasi metabolit sekunder - Media kultur dengan konsentrasi fosfat yang rendah meningkatkan/menstimulasi produk (metabolit sekunder) dan/atau konsentrasi enzim yang berperan dalam produksi

fosfat , menstimulasi produksi senyawa fenol pada C. Roseus

menstimulasi produksi nicotin pada Nicotiana tabacum

fosfat , menstimulasi sintesis digitoxin pada Digitalis purpurea

menstimulasi produksi betacyanin pada Chenopodium rubrum

Digitalis purpurea

Chataranthus roseus

d. Growth regulator (phytohormone)

- Hormon pertumbuhan yang biasanya digunakan :

- cytokinin

- 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D) (auxin)

- naphthalene acetic acid (NAA) (auxin)

- indole acetic acid (IAA) (auxin)

- gibberellins

- tipe, konsentrasi auxin atau cytokinin, atau rasio auxin/cytokinin

berpengaruh pada pertumbuhan sel dan produksi metabolit sekunder pada kultur sel tanaman

- Growth regulator (phytohormone) untuk menginduksi jaringan callus dan pertumbuhan cell line

- Setiap spesies tanaman membutuhkan tipe dan konsentrasi phytohormone yang berbeda-beda

- umumnya digunakan pada pada konsentrasi 0.1 - 50 μM

- peningkatan konsentrasi auxin dalam medium menstimulasi dediferenisiasi sel tanaman, pembelahan sel serta pembentukan dan pertumbuhan callus

- menurunkan konsentrasi metabolit sekunder digunakan pada konsetrasi rendah

AUXIN

- 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D) pada kebanyakan kasus menghambat produksi metabolit sekunder

- naphthalene acetic acid (NAA) atau indole acetic acid (IAA):

meningkatkan produksi anthocyanins pada kultur suspense sel tanaman Daucus carota

meningkatkan produksi nicotin pada Nicotiana tabacum

meningkatkan produksi shikonin pada Lithospermum erythrorhizon

Daucus carota

Nicotiana tabacum Lithospermum erythrorhizon

- konsentrasi yang umum digunakan 0.1 - 10 μM

- berperan dalam pembelahan sel serta inisiasi dan pertumbuhan callus

- Efeknya berbeda-beda tergantung pada senyawa metabolit sekunder dan spesies tanaman

menstimulasi pembentukan anthocyanin pada Haplopappus gracilus

menghambat pembentuan anthocyanin pada Populus cell cultures

CYTOKININ

Populus

Haplopappus gracilus

- Gibberelic acid paling umum digunakan pada kultur sel tanaman

- Pertumbuhan callus Taxus cuspidate sangat dibantu oleh penambahan gibberelic acid pada media

- Menekan produksi abthocyanins pada beberapa kultur

Gibberellins

Taxus cuspidate

• Kondisi kultur yang berpengaruh terhadap akumulasi metabolit sekunder antara lain :

- Temperatur

- Pencahayaan

- pH media

- Agitasi dan aerasi

3. Pengoptimalan lingkungan kultur

• Temperatur

- rentang temperature yang umumnya digunakan 17ºC - 25ºC

- temperatur 32ºC optimal untuk pembentukan purpureaglycoside A pada kultur sel tanaman Digitalis lanata

• Pencahayaan

- akumulasi anthocyanin pada kultur sel D. carota distimulasi cahaya

- akumulasi monoterpene pada kultur callus dari tanaman Citrus limon terjadi bila tidak ada cahaya

• pH media

- pH media umumnya pH 5 – 6

• Agitasi dan aerasi

- penting pada produksi skala besar

- konsentrasi oksigen terlarut sebesar 50% memungkingkan produksi alkaloid sebesar 3g/L kultur selama 20 hari pada airlift bioreactor

laju aerasi yang lebih tinggi menurunkan produktivitas alkaloid

- penambahan karbondioksida menstimulasi sintesis monoterpene pada kultur suspensi sel tanaman Muscat grape

penerapan stress kimia atau fisik pada kultur suspensi sel memicu produksi metabolit sekunder yang biasanya tidak diproduksi atau hanya diproduksi dalam konsentrasi rendah

ELISITOR

- Senyawa yang mentimulasi pertahanan (defense) atau respon tanaman terhadap stress.

- Senyawa yang apabila dipaparkan dalam konsentrasi yang rendah pada sel hidup menginisiasi atau meningkatkan biosintesis dari senyawa tertentu (metabolit)

4. Elisitasi (Elicitation)

KLASIFIKASI ELISITOR

Physical elicitors :

- Ultraviolet irradiation

- Salinitas yang tinggi

- Temperatur yang ekstrim

a. Hormon tanaman sebagai elisitor

• Salicylic acid (SA)

- mengatur resistensi / ketahanan tanaman terhadap patogen jamur, bakteri, virus

• Jasmonic acid (JA)

- menginduksi produksi protein-protein yang menyebabkan tanaman resisten terhadap patogen

- elisitasi JA pada kultur sel Hypericum perforatum L meningkatkan akumulasi phenylpropanoid dan naphtodianthrones

b. Elisitor dari karbohidrat

- kombinasi oligosakarida dan methyl jamonate telah digunakan untuk menginduksi phytoalexin pada beras

- Produksi paclitaxel pada kultur suspense sel tanaman Taxus Canadensis meningkat dengan penambahan kombinasi N-acetylchetohexaose dan methyl jamonate

Methyl jamonate elisitor yang berasal dari lemak

- Kombinasi dengan chitopentaose digunakan pada kultur suspense sel tanaman J. chinesis untuk meningkatkan produksi podophyllotoxin

• Pada kebanyakan kasus produk metabolit sekunder yang dihasilkan kultur sel tanaman disimpan dalam vakuola

• Supaya produk tersebut dapat dikeluarkan dari vakuola sel tanaman mempenetrasi dua membrane barrier (plasma membrane, tonoplast) permeabilizing agent

• Contoh permeabilizing agent :

• isopropanol

• dimethylsulfoxide (DMSO)

• chitosan

5. Permeabilisasi (Permeabilization)

• Akumulasi metabolit sekunder yang rendah pada kultur sel tidak selalu diakibatkan oleh kurangnya enzim yang terlibat dalam proses biosintesis

dapat juga disebabkan oleh :

- feedback inhibition

- degradasi enzimatik/non-enzimatik dari senyawa metabolit dalam medium

- volatilitas dari senyawa yang dihasilkan

6. In situ product removal

• Solusi :

menambahkan suata masa padat/cair ke dalam media kultur

artificial site untuk tempat akumulasi senyawa metabolit menarik senyawa metabolit dari media kultur

pemindahan senyawa metabolit ke dalam kompatemen non-biologis dapat meningkatkan produksi total

Contoh bahan yang dapat ditambahkan :

- charcoal

- miglyol

- silica gel RP 8

Penambahan prekursor biosintetik ke dalam medium kultur meningkatkan hasil produk akhir ketika produktifitas terhambat oleh kurangnya prekursor

Contoh : sintesis atropine

Phenylalanine/ Ornithine

Tropine/Tropic acid

Atropine

A

B

7. Penambahan Prekursor

- Penambahan ferulic acid pada kultur Vanilla planifolia

meningkatkan akumulasi vanillin

- Penambahan dihydroquarcetin (naringen) pada Daucus carota

meningkatkan produksi anthocyanin

- Asam amino telah banyak digunakan sebagai precursor metabolit sekunder

ditambahkan pada media suspensi kultur sel untuk memproduksi tropane alkaloid, indole alkaloid, dll

- Phenylalanine precursor rosmarinic acid pada saat ditambahkan pada suspensi kultur Salvia officinalis

7. Penambahan Prekursor

Salvia officinalis

• Bioreaktor suatu perangkat/sistem hasil manufaktur dan rekayasa yang mendukung lingkungan biologis yang aktif

• Bioreaktor suatu wadah/tempat dimana proses kimia terjadi, yang melibatkan organisme atau senyawa-senyawa biokimia aktif yang berasal dari organisme tersebut

• Dalam konteks kultur jaringan,

Bioreaktor suatu perangkat/sistem yang ditujukan untuk menumbuhkan kultur sel atau jaringan

7. Bioreaktor

• Tujuan untuk menghasilkan produksi senyawa metabolit (metabolit sekunder) dalam skala besar scale-up

• Permasalahan dalam proses scale-up menggunakan bioreaktor:

- kultur sel tanaman tidak homogen terdiri dari sel dengan berbagai macam bentuk dan ukuran mengendap

- sel tanaman sensitive terhadap shear stress kematian sel

(lisis sel akibat proses agitasi terhadap media kultur)

- sensitifitas terhadap shear stress proses mixing menjadi tidak efektif

- sel tanaman memerlukan O2 yang lebih sedikit konsentrasi O2 yang tinggi toksik pada sel, aktivitas metabolism

- laju aerasi yang tinggi severe foaming, menyebabkan :

- wall growth phenomenon

- penyumbatan saluran udara

Lanjutan……

• Tipe-tipe bioreaktor :

1. Mechanically agitated bioreactor

- stirred tank reactors with propellers

- rotary drum tank reactor

2. Air driven bioreactors

- bubble column

media nutrisi dicampur (mixed) dan diaerasi mengaplikasikan gelembung udara melalui saluran udara yang terdapat dibawah tangki/tabung

tidak sesuai untuk kultur sel yang densitasnya tinggi

3. Non-agitated bioreactor

- Packed bed sel tanaman diperangkap dalam partikel tertentu sehingga tidak dapat bergerak bersama media cair media cair dialirkan

• Produksi senyawa metabolit sekunder pada umumnya lebih tinggi pada jaringan yang terdiferensiasi Organ Culture

• Produksi senyawa metabolit hanya pada jaringan yang terdiferensiasi

Organ Culture

• Dua organ yang umum digunakan : Tunas (shoot) dan Akar (root)

ORGAN CULTURE

1. Tunas (shoot)

• Seringkali lebih baik dalam menghasilkan metabolit sekunder daripada kultur callus atau suspensi

konsentrasi quinine dihasilkan dalam jumlah yang lebih tinggi pada kultur tunas tanaman Cinchona ledgeriana daripada pada kultur suspensi

cardiac glycoside yang terakumulasi di kultur tunas tanaman Digitalis daripada pada kultur yang tidak terdiferensiasi

• Shoot culture dapat dengan mudah dibuat dengan menghilangkan bagian atas dari biji yang steril dan menempatkannya pada media B5 atau MS

2. Akar (root)

• Hingga saat ini spesies tanaman yang dapat menghasilkan metabolit sekunder melalui kultur akar terbatas

• Waktu tumbuh lama dan susah untuk dipanen Hairy Root Culture

Hairy Root Culture

• Merupakan hasil transformasi genetik oleh Agrobacterium rhizogenes

diinduksi oleh transfer T-DNA dari plasmid Agrobacterium rhizogenes jaringan inang (host tissue) rhizogenesis

• Keuntungan :

- dapat tumbuh dengan cepat tanpa tambahan hormon pertumbuhan (auxin) dari luar

- seringkali tidak membutuhkan inkubasi dibawah penyinaran

- stabil secara genetik produksi metabolit sekunder yang stabil

- menghasilkan senyawa metabolit yang sama dengan tanaman utuh

TERIMA KASIH SELAMAT BELAJAR

TANAMAN OBAT DAN SINTESIS METABOLIT SEKUNDER PADA...

Documents

Transcript of TANAMAN OBAT DAN SINTESIS METABOLIT SEKUNDER PADA...