STABILITAS KONFORMASI QUADRUPLE MUTAN p53 …... · memberikan akses bagi penulis melakukan...

perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id

commit to user

i

STABILITAS KONFORMASI QUADRUPLE MUTAN p53

M133L/V203A/N239Y/N268D DAN PENGARUH PRIMA-1

TERHADAP WILD TYPE P53

Disusun oleh :

ANITA KUSUMA DEWI

M0303018

SKRIPSI

Diajukan untuk memenuhi sebagian

persyaratan mendapatkan gelar Sarjana Sains Kimia

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN

ALAM

UNIVERSITAS SEBELAS MARET

SURAKARTA

Februari, 2011


commit to user

ii


commit to user

iii

PERNYATAAN

Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi saya yang berjudul ―STABILITAS

KONFORMASI QUADRUPLE MUTAN p53 M133L/V203A/N239Y/N268D

DAN PENGARUH PRIMA-1 TERHADAP WILD TYPE P53 ‖ belum pernah

diajukan untuk memperoleh gelar kesarjanaan di suatu perguruan tinggi, dan

sepanjang pengetahuan saya juga belum pernah ditulis atau dipublikasikan oleh

orang lain, kecuali yang secara tertulis diacu dalam naskah ini dan disebutkan

dalam daftar pustaka.

Surakarta, Februari 2011

ANITA KUSUMA DEWI


commit to user

iv

STABILITAS KONFORMASI QUADRUPLE MUTAN p53

M133L/V203A/N239Y/N268D DAN PENGARUH PRIMA-1

TERHADAP WILD TYPE P53

ANITA KUSUMA DEWI

Jurusan Kimia. Fakultas MIPA. Universitas Sebelas Maret.

ABSTRAK

Quadruple mutan p53 M133L/V203A/N239Y/N268D mampu

meningkatkan stabilitas termodinamika ikatan residu-residu yang mengalami

mutasi [Joerger, A. C., Allen, M.D., and Fersht, A. R., 2004, J. Biochem., 279: pp.

1291-1296]. Selain itu, struktur kristalografi sinar-x quadruple mutan ini mirip

dengan struktur wild type p53 ( kode PDB : wt-p53). Kemiripan struktur ini

melandasi studi dinamika konformasinya. Studi tersebut telah dilakukan dengan

menggunakan simulasi dinamika molekuler. Dinamika konformasi quadruple

mutan (kode PDB : QMT) mengungkap adanya pergeseran struktur yang

ditunjukkan oleh perubahan nilai RMSD selama simulasi 5ns berlangsung.

Pergeseran ini terutama disebabkan oleh fluktuasi pada loop L2 dan loop S7-S8.

Fluktuasi pada loop S7-S8 lebih signifikan dibanding dengan loop L2. Selain itu,

dinamika konformasi residu-residu penting p53 untuk berikatan dengan DNA

(yaitu lysin 120 dan arginin 248) tidak dapat membedakan quadruple mutan dan

wild type p53. Simulasi dinamika molekuler ini juga dapat menunjukkan pengaruh

PRIMA-1 terhadap wild type p53. Berdasarkan hasil dockingnya, PRIMA-1 tidak

cukup spesifik berinteraksi pada wild type p53. PRIMA-1 cukup stabil menempel

pada wild type p53 di area β-sandwich. Keberadaan PRIMA-1 memberikan

dinamika konformasi yang berbeda antara wild type p53 kompleks dan

tunggalnya. Perbedaannya terletak pada residu histidin 116, glysin 245, dan

arginin 248. Menariknya lagi residu 186 yang terletak jauh dari penempelan

PRIMA-1 juga mengalami pergeseran.

Kata kunci : dinamika molekul, mutan p53 QMT, PRIMA-1.


commit to user

v

QUADRUPLE MUTAN P53 AND THE EFFECTS OF PRIMA-1

AGAINST WILD TYPE P53

ANITA KUSUMA DEWI

Department of Chemistry. Faculty of Mathematics and Natural Sciences. Sebelas

Maret University.

ABSTRACT

M133L/V203A/N239Y/N268D quadruple mutant p53 was able to

increase the thermodynamic stability of mutated residue bonds [Joerger, A. C.,

Allen, M.D., and Fersht, A. R., 2004, J. Biochem., 279: pp. 1291-1296]. In

additions, x-ray crystallography structure of quadruple mutant similar to the wild

type structure ( PDB code: wt-p53). This similarity was underlying to study its

conformational dynamics. The study was done by means molecular dynamics

simulations. Conformational dynamics of quadruple mutant (PDB code: QMT)

reveal a shifted structure which was demonstrated by RMSD value changes

during 5ns of simulation. This shift was mainly caused fluctuations in L2 loops

and S7-S8 loops. the last was showing more significant fluctuations. In additions,

conformational dynamics of p53 important residues for DNA binding (i.e lysine

120 and arginine 248) could not distinguish quadruple mutant and wild type p53.

This molecular dynamic simulation can also show effects of PRIMA-1 against

wild type p53. According to its docking results, PRIMA-1 was not specific

enough to interact in wild type p53. PRIMA-1 was quite stable against wild type

p53 in β-sandwich area. The existence of PRIMA-1 distinguished conformational

dynamics between un-complex and complex wild type p53. The discrepancy was

located at residues of histidine 116, glycine 245, and arginine 248. Interestingly,

residue of 186 which is far from PRIMA-1 binding site, was also shifted due to

the bind.

Key words : molecular dynamic, mutant p53 QMT, PRIMA-1.


commit to user

vi

MOTTO

Setiap kenikmatan akan lebih terasa manakala kita tahu bagaimana rasa pahit.

Untuk itu syukuri setiap pahit yang terasa hari ini untuk nikmat esok hari.

(Anita Kusuma Dewi)

Sebuah kegagalan bisa jadi sebuah keberhasilan menemukan hal baru asal kita

mampu melihat sisi positifnya. (Fajar R. Wibowo)

Sabar dan Syukurlah niscaya Allah akan menambah nikmatmu setiap hari

(Suami tercinta)

Kebenaran bukan untuk dipaksakan tetapi diakui keberadaannya

(Achdiat Kartamihardja)

You do not really understand something unless you can explain it to your

grandmother (Albert Einstein)


commit to user

vii

PERSEMBAHAN

Untuk Allah Yang Maha Cerdas, Maha Bijaksana, dan Maha Segalanya

Untuk Bapak dan Ibu yan paling pengertian

Untuk adik-adikku tersayang

Untuk suami tercinta yang selalu sabar dan support

Dan untuk my baby EZA M.I. AL BARRA…


commit to user

viii

KATA PENGANTAR

Segala puji dan segenap syukur bagi Allah SWT yang telah menunjukkan

jalan yang indah bagi penulis sehingga skripsi ini dapat penulis selesaikan dengan

baik sebagai salah satu persyaratan dalam memperoleh gelar sarjana sains Jurusan

Kimia Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Sebelas

Maret Surakarta. Atas segala karuniaNya pulalah penulis menyadari bahwa segala

sesuatu memiliki proses dan waktunya masing-masing.

Dalam menyusun skripsi ini penulis menemui berbagai hambatan dan

permasalahan yang beragam. Namun, atas bimbingan, kritikan, saran, dan

dorongan semangat yang bermanfaat dari berbagai pihak, semua hambatan dan

permasalahan tersebut dapat penulis atasi dengan baik. Oleh karena itu, penulis

ingin menyampaikan terima kasih kepada pihak-pihak yang telah membantu

penulis, yaitu sebagai berikut.

1. Prof. Drs. Sutarno, M.Sc. Ph.D. selaku dekan Fakultas Matematika dan Ilmu

Pengetahuan Alam Universitas Sebelas Maret Surakarta.

2. Prof. Drs. Sentot Budi Rahardjo, Ph.D., selaku ketua Jurusan Kimia Fakultas

Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Sebelas Maret Surakarta.

3. Soerya Dewi Marliyana, M.Si., selaku pembimbing akademik yang dengan

sabar telah membimbing penulis dalam penyelesaian studi di Jurusan Kimia.

4. Dr. rer. nat. Fajar R. Wibowo, M.Si., selaku dosen pembimbing I, yang

dengan penuh kesabaran dan ketulusan membimbing penulis dari titik nol,

membuka mata penulis bahwa segala sesuatu itu memiliki berbagai

kemungkinan dengan alasannya masing-masing.

5. Yuniawan Hidayat, M.Si., selaku dosen pembimbing II, yang dengan

ketulusan membimbing penulis mengenai cara penulisan yang baik dan sesuai

aturan. Atas bimbingan beliau pulalah penulis mendapatkan dorongan

semangat untuk menyelesaikan skripsi ini dengan efektif.

6. I.F. Nurcahyo, M. Si. selaku ketua laboratorium Kimia Dasar yang telah

memberikan akses bagi penulis melakukan penelitian di laboratorium Kimia

Dasar bagian Komputasi Kimia.


commit to user

ix

7. Bapak Ibu dosen dan seluruh staf jurusan Kimia yang telah memberikan

fasilitas dan pelayanan yang baik bagi penulis.

8. Teman-teman Kimia berbagai generasi yang menjadi kawan di medan juang.

9. Semua pihak yang tidak dapat penulis tuliskan satu per satu yang telah

memberikan bantuannya.

Penulis menyadari bahwa penelitian dan penyusunan skripsi yang penulis

lakukan masih jauh dari sempurna sehingga membutuhkan saran dan kritik yang

membangun dari para pembaca. Namun, lepas dari semua itu, semoga para

pembaca mendapatkan manfaat setelah membaca skripsi ini.

Surakarta, Februari 2011

Penulis


commit to user

x

DAFTAR ISI

Halaman

HALAMAN JUDUL ............................................................................................ i

HALAMAN PENGESAHAN .............................................................................. ii

HALAMAN PERNYATAAN ............................................................................. iii

HALAMAN ABSTRAK ...................................................................................... iv

HALAMAN ABSTRACT ................................................................................... v

HALAMAN MOTTO ......................................................................................... vi

HALAMAN PERSEMBAHAN ......................................................................... vii

KATA PENGANTAR ......................................................................................... viii

DAFTAR ISI ........................................................................................................ x

DAFTAR TABEL ................................................................................................ xiii

DAFTAR GAMBAR ........................................................................................... xiv

DAFTAR LAMPIRAN ....................................................................................... xvii

BAB I PENDAHULUAN .................................................................................... 1

A. Latar Belakang ..................................................................................... 1

B. Perumusan Masalah ............................................................................. 2

1. Identifikasi Masalah ........................................................................ 2

2. Batasan Masalah ............................................................................ 3

3. Rumusan Masalah ........................................................................... 4

C. Tujuan Penelitian ................................................................................. 4

D. Manfaat Penelitian ............................................................................... 4

BAB II LANDASAN TEORI .............................................................................. 5

A. Tinjauan Pustaka ................................................................................. 5

1. Kanker ............................................................................................. 5

2. Gen Supressor Tumor .................................................................... 5

3. Mutasi p53 ...................................................................................... 8

4. Mutan quadruple M133L/V203A/N239Y/N268D ......................... 9

5. PRIMA-1 … .................................................................................... 10

6. Simulasi Kimia ............................................................................... 11


commit to user

xi

7. Simulasi Dinamika Molekuler (DM) .............................................. 12

8. AMBER7 (Assisted Model Building with Energy Refinement) ....... 14

a. Antechamber .............................................................................. 14

b. Parmchk. .................................................................................... 14

c. LEaP. .......................................................................................... 14

d. Sander (Simulated Annealing with NMR-derived Energy

Restraints) .................................................................................. 15

e. Ptraj dan Carnal ........................................................................ 15

9. Root Mean Square Deviation (RMSD) ........................................... 15

10. B-factor .......................................................................................... 16

11. Struktur Protein dan Sudut Dihedral Backbone Protein ................. 16

B. Kerangka Pemikiran ............................................................................ 19

C. Hipotesis .............................................................................................. 20

BAB III METODOLOGI PENELITIAN............................................................. 21

A. Waktu dan Tempat Penelitian ............................................................. 21

B. Alat dan Bahan yang Dibutuhkan ........................................................ 21

1. Alat .................................................................................................. 21

2. Bahan .............................................................................................. 21

C. Prosedur Penelitian…………………………………………..……. ... 21

1. Parameterisasi PRIMA-1 ................................................................. 21

2. Penentuan Koordinat Awal Sistem ................................................. 22

3. Minimisasi Sistem ........................................................................... 22

4. Equilibrasi Sistem ........................................................................... 22

5. Simulasi Sistem ............................................................................... 23

D. Teknik Pengumpulan dan Analisis Data ............................................. 23

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN ............................................................. 24

A. Parameterisasi PRIMA-1...................................................................... 24

B. Hasil Simulasi ..................................................................................... 24

1. Perbandingan perilaku wild type p53 (wt-p53) dan quadruple

mutan M133L/V203A/N239Y/N268D .......................................... 24


commit to user

xii

a. Residu Lisin 120 dan Arginin 248 ...................................... 27

b. Residu Arginin 181, Asam Aspartat 186, dan Glysin 226 .. 30

2. Perilaku PRIMA-1 pada wild type p53 (wt-p53) ............................ 34

BAB V KESIMPULAN DAN SARAN ............................................................... 46

DAFTAR PUSTAKA. ......................................................................................... 47

LAMPIRAN-LAMPIRAN .................................................................................. 51


commit to user

xiii

DAFTAR TABEL

Tabel 1. Ringkasan Karakteristik Pergerakan dalam Protein. ............................. 13

Tabel 2. Kode Atom, Tipe Atom, dan Muatan PRIMA-1 yang Diperoleh

dengan RESP ......................................................................................... 24


commit to user

xiv

DAFTAR GAMBAR

Gambar 1. Skema struktur p53 ........................................................................ 6

Gambar 2. Distribusi elemen dan skema ribbon struktur sekunder p53 .......... 7

Gambar 3. Siklus sel ......................................................................................... 8

Gambar 4. Superposisi bentuk stereo dari backbone wt-p53 tanpa DNA, wt-

p53 dengan DNA dan quadruple mutan p53 .................................. 9

Gambar 5. Hasil docking PRIMA-1 pada wt-p53 dan QMT ........................... 10

Gambar 6. Struktur PRIMA-1 ........................................................................... 10

Gambar 7. Struktur Umum Asam Amino ........................................................ 17

Gambar 8. 20 asam amino protein yang dikelompokkan menurut gugus

fungsinya ........................................................................................ 17

Gambar 9. Beberapa struktur protein ................................................................ 18

Gambar 10. Sudut dihedral psi dan phi pada backbone protein ........................ 19

Gambar 11. Struktur PRIMA-1 Terparameterisasi ............................................ 24

Gambar 12. Perbandingan profil RMSD (Å) terhadap waktu (ps) hasil

simulasi DM untuk quadruple mutan QMT_1 (simulasi QMT

yang pertama), QMT_2 (simulasi QMT yang kedua), dan wild

type p53 ......................................................................................... 26

Gambar 13. Perbandingan profil B-factor (Å2) terhadap nomor residu untuk

quadruple mutan QMT_1, QMT_2, rerata QMT_1 dan QMT_2

dan wild type p53 . .......................................................................... 26

Gambar 14. Grafik fluktuasi sudut dihedral Psi (ψ) dan Phi (Ф) residu 118-

123 (melibatkan residu lisin 120) dan perbedaan posisi sudut

dihedral selama simulasi. ................................................................ 28

Gambar 15. Grafik fluktuasi sudut dihedral Psi (ψ) dan Phi (Ф) residu 244-

248 (melibatkan residu arginin 248) dan perbedaan posisi sudut

dihedral selama simulasi ................................................................ 30

Gambar 16. Perbandingan struktur hasil kristalografi sinar-x wt-p53 dan

QMT dalam bentuk stereo dari backbone wild type-p53 tanpa

DNA, wild type p53 dengan DNA dan quadruple mutan p53 ......... 31


commit to user

xv

Gambar 17. Profil sudut dihedral Psi (ψ) dan Phi (Ф) residu 179-181, residu

184-188, dan residu 225-230 ......................................................... 33

Gambar 18. Perubahan sudut dihedral selama simulasi backbone residu asam

amino 185-187 ................................................................................ 34

Gambar 19. Perbandingan profil RMSD (Å) terhadap waktu (ps) hasil

simulasi DM untuk wild type p53 wt-p53 dan kompleks p53

dengan PRIMA_1 ............................................................................ 35

Gambar 20. Perbandingan profil B-factor (Å2) terhadap nomor residu hasil

simulasi DM untuk wild type p53 wt-p53 dan kompleks wt-p53

dengan PRIMA-1 ............................................................................. 36

Gambar 21. Perbandingan posisi PRIMA-1 pada p53 selama simulasi .............. 37

Gambar 22. Posisi PRIMA-1 terhadap dua residu yang diperkirakan mampu

membentuk ikatan hidrogen antara keduanya berturut-turut .......... 38

Gambar 23. Profil sudut dihedral Psi (ψ) dan Phi (Ф) residu 114-118

komplekss p53 dengan PRIMA-1 dan perbedaan posisinya

selama simulasi ............................................................................... 39

Gambar 24. Posisi PRIMA-1 terhadap wt-p53 dengan beberapa residu

terdekatnya valin 178, ileusin 157, arginin 248, dan glysin 245. ... 40

Gambar 25. Dinamika perubahan sudut torsi terhadap waktu antara

komplekss p53 dengan PRIMA-1 dengan pembanding wt-p53

sudut Ф dan ψ untuk rentang residu 242-246 yang memuat residu

245 dan rentang residu 244-248 ...................................................... 41

Gambar 26. Dinamika posisi kompleks p53 dengan PRIMA-1 dihimpitkan

dengan wt-p53 sebagai untuk residu 244-249 selama simulasi ..... 42

Gambar 27. Dinamika perubahan sudut torsi terhadap waktu antara

komplekss p53 dengan PRIMA-1 dengan pembanding wt-p53

sudut Ф dan ψ untuk rentang residu 183-187 ................................. 43

Gambar 28. Dinamika posisi komplekss p53 dengan PRIMA-1 dihimpitkan

dengan wt-p53 sebagai pembanding residu 183-187 selama

simulasi ........................................................................................... 44


commit to user

xvi

Gambar 29. Gambar keadaan sistem secara umum pada saat penentuan

koordinat awal, minimisasi, equilibrasi, dan simulasi. A, B, C,

dan D berturut-turut adalah keadaan sistem pada saat awal,

setelah disimulasi, setelah diequilibrasi, dan setelah simulasi

berjalan. Warna hitam adalah sistem yaitu protein p53 dan warna

biru adalah molekul air. .................................................................. 51

Gambar 30. Densitas, volume, energi total, dan temperatur sistem selama

proses 500 ps equilibrasi dan 7000 ps simulasi. Dari atas ke

bawah masing-masing adalah grafik densitas, volume, energi

total, dan temperatur sistem saat equilibrasi (A) dan simulasi (B).

Grafik berwarna hitam, merah, hijau, dan kuning berturut-turut

adalah wt-p53, QMT_1, QMT_2, dan wt-p53 yang berinteraksi

dengan PRIMA-1 ............................................................................. 52


commit to user

xvii

DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran 1. Gambaran Sistem Secara Umum pada Saat Penentuan Koordinat

Awal, Minimisasi, Equilibrasi, dan Simulasi ................................. 51

Lampiran 2. Densitas, Volume, Energi Total, dan Temperatur Sistem Selama

Proses 500 ps Equilibrasi da n 7000 ps Simulasi ............................ 52

Lampiran 3. Glosarium ........................................................................................ 53


commit to user

1

BAB I

PENDAHULUAN

A. Latar Belakang

Kanker telah lama menjadi masalah utama dalam bidang kedokteran dan

menjadi fokus penelitian untuk mencari penyebab, mekanisme, sampai cara

pengobatannya. Sofyan (2002) menyebutkan ―kebanyakan kanker bisa disebabkan

oleh salah satu atau lebih dari tiga kategori gen; onkogen, gen yang mengatur

replikasi atau perbaikan DNA , dan gen suppressor tumor. Salah satu produk gen

suppressor tumor dikenal dengan nama p53.

Protein p53 bekerja mencegah replikasi DNA yang rusak dengan

memperbaiki kerusakan yang ada. Protein ini mampu menginduksi kematian sel

terprogram (apoptosis) jika upaya perbaikan tidak dapat dilakukan (Murray et al.,

1998). Adanya mutasi p53 dapat mengakibatkan disfungsi p53. Mutasi p53

menurut Vousden dan Lu (2002) terjadi 95% pada domain inti. Sebanyak 40%

diantaranya ditemukan pada enam hotspot (Arg 175, Gly 245, Arg 248, Arg 249,

Arg 273, dan Arg 282 (Wright dan Lim, 2007).

Banyak studi struktur dasar mutasi p53 dilakukan untuk mengetahui

pengaruh mutasi terhadap stabilitas molekul secara keseluruhan dan perubahan

struktur lokal p53 berikatan dengan DNA. Kebanyakan studi ini melibatkan

quadruple mutan (QMT) p53 M133L/V203A/N239Y/N268D (Joerger et al.,

2006). Joerger dkk (2004) menyatakan quadruple mutan ini sangat stabil

(superstable mutan) pada sistem kristalnya, sedangkan kebanyakan mutasi lain

meyebabkan penurunan stabilitas termodinamika ikatan masing-masing residu

yang mengalami mutasi. Selain itu, kristalografi sinar-x menunjukkan perpaduan

QMT p53 ini hanya mengubah sedikit struktur lokalnya tanpa merubah struktur

global p53 (inti β-Sandwich dan surface ikatan dengan DNA). Melalui fakta diatas

QMT p53 ini dapat dikatakan memiliki kemiripan struktur dengan p53 normalmya

(wild type p53).

Kemiripan struktur QMT p53 dengan wild type p53 (wt-p53) sejalan

dengan studi pengembalian fungsi p53 termutasi yang dilakukan oleh Bykov dkk


commit to user

2

(2002b). Penelitian tersebut menemukan cara pengembalian fungsi p53 termutasi

dengan mengatur konformasi mutan p53 menyerupai wild typenya. Pengaturan

konformasi p53 dilakukan dengan menempelkan molekul kecil atau peptida

pendek pada mutan p53. Peptida pendek yang digunakan adalah PRIMA-1 (p53

Reactivation and Induction Massive Apoptosis). Menindaklanjuti penelitian

Bykov dkk (2002a), Warsino (2008) melakukan docking (penempelan ligan pada

makromolekul protein) antara PRIMA-1 dengan QMT p53 dan wt-p53. Hasil

docking menunjukkan situs potensial PRIMA-1 menempel pada QMT p53 dan wt-

p53. Posisi PRIMA-1 yang paling potensial ditemukan pada area yang sama yaitu

terletak pada daerah loop. Kedua posisi tersebut menghasilkan besar energi

docking yang relatif sama. PRIMA-1 dikatakan tidak cukup spesifik berinteraksi

pada wt-p53 dan QMT p53 karena beda energi saat dilakukan docking awal dan

lanjutan kurang dari 2 kkal/mol sebagai batas residual error autodock (Morris et

al., 1998).

Kemiripan struktur QMT p53 dan wt-p53, serta ketidakspesifikan

PRIMA-1 menempel pada wt-p53 mendorong studi dinamika molekul QMT p53

dan wt-p53 serta dinamika molekul PRIMA-1 menempel pada wt-p53. Sebuah

metode yang sangat tepat untuk mengamati dinamika molekul level atomik adalah

simulasi dinamika molekuler (DM). Simulasi DM cukup baik dalam menentukan

kontribusi dominan terjadinya fluktuasi atomik suatu protein (Pikkemaat et al.,

2002). Ada beberapa karakter dinamika molekul yang dapat diamati melalui

simulasi DM diantaranya adalah; fleksibilitas docking ligan, alur difusi temporal,

konformasi sisi aktif, spesifitas ikatan, transisi allosteric, dll. Tambahan informasi

hasil simulasi DM ini diharapkan dapat menunjang studi karakteristik dinamika

molekul QMT p53 dan wt-p53.

B. Perumusan Masalah

1. Identifikasi Masalah

Sebagian besar kanker pada manusia disebabkan oleh mutasi p53

(Sofyan, 2000). Mutasi p53 95% terjadi pada domain intinya (Vousden et al.,

2002), dan 40% diantaranya ditemukan pada enam hotspot 175, 245, 248, 249,


commit to user

3

273, dan 282 (Wright, 2007). Banyak studi tentang struktur dasar mutasi p53 yang

melibatkan quadruple mutan M133L/V203A/N239Y/N268D (Joerger et al., 2006)

karena mutan ini dikatakan sangat stabil (superstable mutan) pada kondisi kristal

(Joerger et al., 2004). Selain itu, struktur kristal QMT p53 ini memiliki kemiripan

dengan wt-p53.

Kemiripan struktur QMT dan wt-p53 sejalan dengan hasil docking

PRIMA-1 pada wt-p53 dan QMT. PRIMA-1 menempel pada posisi yang sama

dengan energi yang relatif sama. Namun pengamatan terhadap dinamika molekul

QMT p53 dan wt-p53 serta pengaruh PRIMA-1 terhadap keduanya belum

diketahui. Oleh karena itu simulasi DM dapat dilakukan untuk mengamati lebih

lanjut dinamika molekul QMT dan wt-p53 serta pengaruh PRIMA-1 terhadap

dinamika molekul keduanya.

Ada beberapa karakter dinamika molekul yang dapat dipilih. Beberapa

diantaranya adalah; fleksibilitas docking ligan, alur difusi temporal, konformasi

sisi aktif, spesifitas ikatan, transisi allosteric, dll. Selain pemilihan karakter

langkah berikutnya adalah memilih program simulasi Dinamika Molekuler (DM)

yang sesuai. Berbagai program simulasi DM yang populer seperti AMBER

(Assisted Model Building with Energy Refinement), CHARMM (Chemistry at

HARvard Macromolecular Mechanics), Tinker, GROMOS (Groningen Molecular

Simulation), dan NAMD (NAnoscale Molecular Dynamics) dapat digunakan untuk

perbaikan molekul (Esposito et al., 2006).

2. Batasan Masalah

Simulasi Dinamika Molekuler (DM) terhadap karakter dinamika

konformasi dilakukan untuk tiga sistem. Ketiga sistem tersebut antara lain; mutan

p53 yang memuat quadruple mutan M133L/V203A/N239Y/N268D, wild type

p53, serta kompleks PRIMA-1 dengan wild type p53. Pemilihan kompleks hanya

untuk PRIMA-1 dengan wild type p53 saja terutama karena kemiripan struktur

yang dimiliki oleh wt-p53 dan QMT p53, serta posisi interaksi PRIMA-1 yang

sama sebagaimana hasil penelitian Warsino (2008). Seluruh protein diambil dari

RSCB Protein Data Bank file.


commit to user

4

Simulasi Dinamika Molekuler dilakukan dengan menggunakan program

AMBER7 karena program ini cukup baik untuk simulasi biomolekul protein dan

memiliki kemampuan untuk menggabungkan lebih dari satu force field. Simulasi

dilakukan dalam eksplisit solven dengan sistem periodik jangka waktu 9ns untuk

wild type p53 serta 5ns untuk quadruple mutan p53 dan kompleks PRIMA-1

dengan wt-p53.

3. Rumusan Masalah

a. Bagaimana perbandingan dinamika konformasi wild type p53 dan quadruple

mutan M133L/V203A/N239Y/N268D tanpa ligan PRIMA-1?

b. Apakah terdapat kesamaan karakteristik umum dinamika konformasi wt-p53

dan QMT p53?

c. Bagaimana dinamika konformasi kompleks PRIMA-1 dengan wild type p53?

C. Tujuan Penelitian

1. Mengetahui perbandingan dinamika konformasi wild type p53 pada manusia

dan quadruple mutan M133L/V203A/N239Y/N268D.

2. Mengetahui apakah terdapat kesamaan umum dinamika konformasi wt-p53 dan

QMT p53.

3. Mengetahui dinamika konformasi kompleks PRIMA-1 dengan wild type p53.

D. Manfaat Penelitian

1. Memberikan informasi tentang dinamika konformasi molekul quadruple mutan

p53 M133L/V203A/N239Y/N268D dengan dinamika konformasi molekul wt-

p53 wt-p53 sebagai pembandingnya.

2. Dengan mengetahui perbandingan dinamika konformasi kompleks PRIMA-1

dengan wt-p53 dan QMT p53 akan memberikan sumbangan bagi ilmu

kesehatan dalam terapi kanker berkaitan dengan selektifitas PRIMA-1 terhadap

target mutasi diluar hotspot.


commit to user

5

BAB II

LANDASAN TEORI

A. TINJAUAN PUSTAKA

1. Kanker

Kanker merupakan penyakit yang ditandai dengan pembelahan sel yang

tidak terkendali menjadi sel-sel yang mampu menyerang jaringan biologis

lainnya, baik yang bersebelahan (invasi), atau dengan migrasi sel ke tempat yang

jauh (metastase) (Murray et al., 1998). Mengenai penyebab kanker, Sofyan (2002)

menyebutkan ―kebanyakan kanker bisa disebabkan oleh salah satu atau lebih dari

tiga kategori gen; onkogen, gen yang mengatur replikasi atau perbaikan DNA , dan

gen suppressor tumor―.

Pertumbuhan kanker diawali dengan mutasi berangkai. Mutasi tersebut

terjadi pada gen penekan tumor dilanjutkan dengan mutasi pada gen yang

berfungsi untuk memperbaiki kerusakan DNA (DNA repair gene). Mutasi pada

protoonkogen dapat mengaktifkan onkogen dan menonaktifkan gen penekan

tumor. Beberapa faktor hereditas dapat meningkatkan perubahan mutasi penyebab

kanker, mencakup aktivasi onkogen atau penghambat gen penekan tumor. Fungsi

berbagai gen penekan tumor dan onkogen dapat diganggu pada tahapan berbeda

pertumbuhan tumor (Hadi dan Nurlalila, 2008).

2. Gen Supressor Tumor - p53

Dari ribuan jumlah gen dalam tubuh manusia, secara umum dibagi

menjadi dua kelompok utama yakni onkogen dan gen penekan tumor atau gen

supressor tumor (Syaifudin, 2007). Onkogen adalah versi mutan dari gen normal,

yang memicu pertumbuhan sel. Gen pada sel normal yang dapat berubah menjadi

onkogen aktif akibat mutasi, disebut protoonkogen.

Gen supressor tumor merupakan gen penekan keganasan kanker. Gen ini

mengkode salah satu produk protein p53 yang merupakan phosphoprotein dengan

berat molekul 53kDa (Murray et al., 1998). Protein p53 terdiri dari 393 asam

amino yang terbagi dalam beberapa domain struktur dan fungsinya. Berikut

pembagian domain struktur dan fungsi p53; terminal N terdiri dari Residu 1-42


commit to user

6

sebagai domain terminal amino yang dibutuhkan untuk aktivitas transaktivasi dan

residu 61-94 yang kaya prolin, domain inti residu 102-292 yang dibutuhkan

untuk berikatan dengan DNA, terminal C residu 301-393 terdiri dari domain

oligomerisasi (residu 342-355) dan domain regulator terminal karboksil (residu

363-393), yang disajikan dalam gambar 1 dibawah.

Gambar 1.Skema struktur p53 dengan Arg 175, Gly 245, Arg 248, Arg 249, Arg

273, dan Arg 282 dilaporkan menjadi mutasi hotspot dalam berbagai

penyakit kanker (Bai et al., 2006).

Struktur domain inti p53 terdiri dari dua anti parallel β-sheet dengan

empat dan lima rantai yang membentuk β-sandwich dan terbagi dalam dua loop

besar yaitu loop L2 dan L3 dalam satu loop besar dan daerah loop-sheet-helix

dengan distribusi berbagai residu asam amino sebagaimana tampak dalam gambar

2A dan terlihat lebih jelas dalam bentuk pitanya gambar 2B.


commit to user

7

Gambar 2.Struktur p53.A, distribusi elemen-elemen struktur sekunder wild type

p53 dan mutan quadruple M133L/V203A/N239Y/N268D yang

disimbolkan huruf-huruf yang mewakili asam amino (tabel1), empat

titik mutasi ditunjukkan dengan warna yang berbeda.B, skema ribbon

struktur protein p53 dengan β-Sandwich dan dua loop besarnya (Joerger

et al., 2004).

Protein p53 memiliki peranan penting dalam siklus sel manusia. Tahapan

siklus sel (gambar 3) manusia dijelaskan sebagai berikut; terdiri dari keadaan

istirahat (fase G0), pertumbuhan sel dan persiapan kromosom untuk replikasi

(fase G1). Siklus dilanjutkan dengan sintesis DNA (fase S) dan diikuti dengan

persiapan pemisahan sel (fase G2). Siklus disempurnakan dengan mitosis (fase M)

hingga dihasilkan sel-sel belahan yang baru (Enten et al., 2005).

Pada tahapan siklus sel tersebut protein p53 memiliki tiga fungsi utama

yaitu bekerja sebagai aktivator transkripsional dengan mengatur gen tertentu yang

terlibat dalam pembelahan sel, bekerja sebagai kontrol checkpoint G1 siklus sel

bagi kerusakan DNA. Saat terjadi kerusakan yang berlebih dapat meningkatkan

aktivitas dengan menghambat pembelahan sel dan memberikan waktu untuk

perbaikan agar tidak terjadi replikasi DNA yang rusak. Perbaikan DNA dilakukan

dengan menyisipkan mutasi permanen ke dalam genom. Fungsi yang ketiga

adalah p53 berpatisipasi dalam mengawali apoptosis (Murray et al., 1998).


commit to user

8

Apoptosis merupakan bentuk kematian sel terprogram yang diperlukan dalam

perkembangan sel, dan dikendalikan oleh berbagai gen (Kresno, 2002).

Gambar 3.Siklus Sel (Mitchison, 1997)

3. Mutasi p53

Mutasi p53 ditemukan pada kurang lebih 50% sel kanker manusia

(Bykov et al., 2002). Sebanyak 90% mutasi p53 terjadi pada domain inti dan 40%

dari seluruh mutasi yang terjadi ditemukan pada enam hotspots (175, 245, 248,

249, 273, dan 282) (Wright dan Lim, 2007), dan yang lain terjadi diluar hotspot.

Berdasarkan dampak struktur domain inti yang berikatan dengan DNA,

Hainaut et al (1997) mengelompokkan mutasi p53 dalam tiga kelas yaitu mutasi

kelas I mempengaruhi residu yang berikatan dengan DNA (Arg 248 dan Arg 273)

dengan menggangu titik kontak residu-residu tersebut untuk berikatan dengan

DNA. Mutasi kelas II domain inti mempengaruhi residu-residu yang penting untuk

orientasi permukaan ikatan DNA (Arg 175, Gly 245, Arg 249, dan Arg 282 yang

terdapat dalam area penghubung scaffold dan permukaan ikatan DNA) terhadap

fleksibilatas protein p53, sedangkan mutasi kelas III mempengaruhi struktur

tersier domain inti dan memberikan sifat fungsional protein yang berbeda.

Pengembalian fungsi p53 termutasi tidak dapat dilakukan dengan

penambahan konsentrasi p53 melainkan dengan mengatur konformasi dari p53

termutasi sehingga menyerupai wild type p53 (Protein p53 yang tidak mengalami

mutasi), melalui penempelan molekul kecil atau peptida pendek pada p53

termutasi. Molekul peptida pendek yang digunakan salah satunya adalah PRIMA-


commit to user

9

1 (p53 Reaktivation and Induction Massive Apoptosis ) (Bykov et al., 2002a).

Studi tentang pemahaman struktur dasar mutasi domain inti p53 yang dilakukan

oleh Joerger et al (2006) selalu disertai mutan quadruple

M133L/V203A/N239Y/N268D.

4. Mutan Quadruple M133L/V203A/N239Y/N268D

Hasil kristalografi sinar-X dalam penelitian Joerger et al (2004)

menunjukkan bahwa mutan ini dikategorikan sebagai superstable mutan dengan

hanya sedikit perubahan struktur lokal tanpa merubah struktur global (inti β-

Sandwich dan permukaan yang berikatan dengan DNA) protein p53 sehingga

menyerupai bentuk wild type-nya sebagaimana ditunjukkan gambar 4. Studi ini

menunjukkan salah satu dampak struktural mutasi yaitu terbentuknya celah besar

untuk akses air atau celah internal hidrofobik tanpa perubahan struktur tapi

menyebabkan penurunan stabilitas termodinamika.

Gambar 4. Superposisi bentuk stereo dari backbone wt-p53 tanpa DNA(rantai

A,biru), wt-p53 dengan DNA(rantai B, jingga) dan quadruple mutan

p53(hitam) (Joerger et al., 2004).

Studi reaktivasi p53 dengan ligan PRIMA-1 telah dilakukan oleh

Warsino (2008) menggunakan metode Docking. Metode Docking dilakukan pada

wild type p53 (wt-p53) manusia (kode PDB:wt-p53) dan tikus, serta beberapa

mutan p53 yakni mutasi pada hotspot 245, mutasi pada 273, serta mutasi diluar

hotspot (kode PDB:QMT). Molekul QMT adalah p53 termutasi melibatkan

quadruple mutan M133L/V203A/N239Y/N268D.

Pada gambar 5 ditunjukkan situs potensial PRIMA-1 menempel pada

wt-p53 dan QMT. Kedua situs penempelan terletak pada area yang sama yaitu


commit to user

10

pada daerah inti β-sandwich dengan energi docking yang relatif sama sebesar -

6,24 kkal/mol untuk wt-p53 dan -5,92 kkal/mol untuk QMT. PRIMA-1 dikatakan

tidak cukup spesifik berinteraksi pada wt-p53 dan QMT karena beda energi saat

dilakukan docking awal dan lanjutan kurang dari 2 kkal/mol (dibawah residual

error autodock) (Morris et al., 1998).

Gambar 5. Hasil docking PRIMA-1 pada wt-p53 (kiri) dan QMT (kanan). Situs

penempelan PRIMA-1 dengan energi terendah masing-masing

ditunjukkan dengan simbol S.R. Kedua situs potensial tersebut

terletak pada daerah yang sama.

5. PRIMA-1

PRIMA-1 (p53 Reaktivation and Induction Massive Apoptosis) atau

disebut dengan 2,2-bis(Hydroxymethyl)-1-azabicyclo[2.2.2}octane-3-one,

memiliki sebuah gugus karbonil, atom N, dan dua gugus OH. PRIMA-1

(Gambar6) memiliki sifat fisik: Kristal putih dengan m.p. 142-144°C, rumus

molekul C9H15NO, dan berat molekul 185.2 (Bykov et al., 2002b).

Gambar 6. Struktur PRIMA-1 ( Bykov et al., 2002b)


commit to user

11

6. Simulasi Kimia

Sebelum adanya komputer, percobaan untuk melihat interaksi antar

partikel dilakukan dengan model fisika sederhana yang dilakukan oleh Bernal

pada tahun 1962 yaitu dengan mengikat beberapa bola karet menggunakan

pengikat dengan variasi panjang pengikat, kemudian mengamati interaksi yang

terjadi antar bola karet setiap 5 menit sekali. Beberapa percobaan terus

dikembangkan hingga tahun 1998, penghargaan nobel diberikan kepada Walter

Kohn dan John Pople karena mengaplikasikan mekanika kuantum dalam

memecahkan masalah struktur dan reaksi kimia dari molekul kecil (Becker et al.,

2001). Mulai dari eksperimen sederhana, studi simulasi kimia menggunakan

bantuan komputer, yang disebut dengan teknik simulasi kimia terus

dikembangkan sampai saat ini.

Metode simulasi komputer memudahkan kita untuk mempelajari

beberapa sistem dan memprediksikan sifat-sifatnya dengan penggunaan teknik

yang mempertimbangkan replikasi yang kecil dari sistem makroskopik dengan

sejumlah atom atau molekul yang dapat diatur. Simulasi menghasilkan suatu

konfigurasi yang representatif dari replikasi yang kecil ini dalam beberapa cara

yang nilai akurat dari sifat-sifat struktural dan termodinamiknya dapat diperoleh

dengan sejumlah komputasi yang mungkin mudah dikerjakan. Teknik simulasi

juga memungkinkan perilaku bergantung-waktu dari sistem atomik dan molekuler

untuk didekati, menyediakan suatu gambaran yang detail dari cara di mana sistem

berubah dari satu konformasi atau konfigurasi ke yang lain. Teknik simulasi juga

digunakan secara luas dalam beberapa prosedur eksperimental, seperti pendekatan

struktur protein dari kristalografi sinar X (Leach, 2001).

Menurut Leach (2001) ada dua jenis teknik simulasi yang umum dalam

pemodelan molekuler adalah metode Dinamika Molekuler (DM) dan Monte Carlo

(MC). Simulasi DM dan Monte Carlo berbeda dalam berbagai hal. Perbedaan

signifikan adalah dalam hal DM menyediakan informasi mengenai

ketergantungan waktu sifat-sifat sistem sedangkan konfigurasi successive Monte

Carlo dibuat seakan-akan tidak ada hubungan waktu.


commit to user

12

Dalam simulasi Monte Carlo pengeluaran dari tiap-tiap percobaan

pergerakan hanya tergantung pada immediate predecessor, sedangkan DM

memungkinkan untuk memprediksikan konfigurasi sistem di setiap waktu di

waktu yang akan datang atau waktu-waktu yang sudah terlewati.

DM memiliki kontribusi energi kinetik terhadap total energi sedangkan

dalam simulasi Monte Carlo total energi ditentukan secara langsung dari fungsi

energi potensial (Leach, 2001). Simulasi DM dari beberapa makromolekul biologi

yang menarik seperti DNA dan kompleks DNA-protein telah terbukti menjadi cara

tepat memahami lebih dalam struktur dan sifat-sifat dinamikanya (Wibowo et al.,

2005).

7. Simulasi Dinamika Molekuler (DM)

Simulasi dinamika molekuler merupakan metodologi untuk model

mikroskopis secara detil dalam skala atomic dengan mengamati proses

ketergantungan waktu sistem molekuler dan secara numeric memecahkan

persamaan gerak hukum Newton. Hasilnya adalah suatu trajektori yang

menspesifikkan bagaimana posisi dan kecepatan partikel di dalam sistem

bervariasi sesuai waktu. Trajektori dihasilkan dengan menyelesaikan persamaan

diferensial yang diwujudkan dalam Hukum Newton 2 (F = ma):

(2.7.1)

Persamaan tersebut menggambarkan pergerakan partikel yang bermassa mi

sepanjang satu koordinat (xi) dengan Fxi merupakan gaya pada partikel dalam arah

tersebut (Leach, 2001).

Terdapat empat tahap utama dalam simulasi DM. Pertama penentuan

koordinat awal berkaitan dengan penggunaan solven dan pemilihan kotak

simulasi. Penggunaan solven dalam simulasi DM dapat dilakukan dengan eksplisit

solven maupun implisit solven. Partikel eksplisit solven seperti TIP3P umum

digunakan dalam simulasi biomolekuler (Becker dan Watanabe., 2001). Setelah

menemukan konfigurasi awal sistem, fase penyeimbangan dilakukan untuk

memperoleh sistem yang stabil. Atom-atom makromolekul dan pelarut di

sekitarnya yang mengalami fase relaksasi biasanya menghabiskan 10 atau 100 ps

i

ixim

F

dt

xd

2

2


commit to user

13

sebelum sistem mencapai keadaan stasioner.

Sifat-sifat termodinamik seperti temperatur, energi, dan densitas dipantau

sampai nilainya stabil. Segmen non-stasioner awal dari trajektori akan dibuang

dalam penghitungan sifat-sifat kesetimbangan. Sebelum melakukan simulasi DM,

sistem harus diseimbangkan dengan kontrol volume, tekanan, dan temperatur

untuk menyesuaikan misalnya densitas pelarut untuk nilai eksperimental dan

temperatur sistem untuk temperatur yang dipilih.

Setelah penyeimbangan, fase produksi dimulai, yang akan memproduksi

hasil simulasi aktual dengan simulasi DM berdurasi sekitar 1 ns. Pada dasarnya,

protokol yang sama seperti pada saat tahap akhir penyeimbangan dapat

digunakan. Simulasi DM dapat diteruskan sampai diperoleh konfigurasi

molekuler yang memuaskan. Jalannya produksi DM ditampilkan berada pada

kondisi jumlah partikel (N), volume (V), dan energi (E) konstan yang mewakili

ensembel mikrokanonikal NVE dan memungkinkan pengamatan molekul yang

berinteraksi dengan lingkungannya selama interval waktu yang telah ditentukan

sebelumnya, biasanya dalam orde nanosekon (Molinelli, 2004).

Makromolekul (protein) memiliki range karakteristik pergerakan yang

berbeda-beda.Tipe pergerakan makromolekul menggunakan metode DM menurut

Becker Watanabe (2001) dapat dilihat pada tabel dibawah ini:

Tabel 1. Ringkasan Karakteristik Pergerakan dalam Protein

No Tipe Pergerakan Contoh aplikasi Skala waktu dan

amplitudo

1.

2.

Pergerakan lokal

Fluktuasi atomik

Pergerakan side chain

Pergerakan Skala

Medium

Pergerakan loop

Pergerakan Terminal-

arm

Pergerakan bidang

Fleksibilitas

docking ligan

Alur difusi temporal

Adaptasi

konformasi sisi

aktif

Spesifitas ikatan

Femtosecond (fs) -

picosecond (ps) (10-15

-

10-12

s); kurang dari 1Ǻ.

Nanosecond(ns) -

microseconds(µs)

(10-9

-10-6

s); 1-5 Ǻ.


commit to user

14

3.

4.

rigid

Pergerakan Skala

Besar

Pergerakan domain

Pergerakan sub-unit

Pergerakan Global

Transisi Helix-coil

Asosiasi subunit

folding/unfolding

Transisi allosteric

Pergerakan Hinge-

bending

Aktivasi hormon

Fungsionalitas

protein

Microseconds (µs)-

milliseconds (ms)

(10-6

-10-3

s); 5-10 Ǻ.

Milliseconds (ms) - jam

(10-3

- 104s); lebih dari

10 Ǻ.

8. Assisted Model Building with Energy Refinement (AMBER7)

(Case et al., 2002)

DM memiliki beberapa software utama, antara lain AMBER, CHARMM,

dan GROMOS. AMBER (Assisted Model Building and Energy Refinement)

merupakan kelompok medan gaya untuk biomolekul DM. Paket program

AMBER7 terdiri dari 60 program yang beberapa di antaranya dideskripsikan

sebagai berikut:

a. Antechamber

Antechamber merupakan program yang mengotomatisasi proses

pengembangan deskriptor-deskriptor force field khususnya untuk molekul-

molekul organik. Antechamber dihidupkan dari masing-masing arsip PDB

(format PDB), arsip (‗prepin’) baru dengan format yang dapat dibaca dalam

LEaP untuk digunakan dalam pemodelan molekuler. Deskripsi force field yang

dibuat dirancang untuk sesuai dengan force field Amber yang biasa.

b. Parmchk

Parmchk dibaca dalam suatu arsip ‗ac’ atau arsip input ‗prep’

sebagaimana suatu arsip force field. Parameter menuliskan arsip ‗frcmod’

untuk parameter-parameter yang hilang.


commit to user

15

c. LEaP

Leap adalah suatu program berbasis X-windows yang disediakan untuk

pembuatan model dasar dan koordinat AMBER dan pembuatan arsip input

parameter/topologi. Program tersebut meliputi editor molekuler yang

memungkinkan pembuatan residu dan memanipulasi molekul.

d. Sander (Simulated Annealing with NMR-derived Energy Restraints)

Sander adalah program utama yang digunakan untuk simulasi DM.

Program ini merelaksasi struktur dengan memindahkan atom-atom secara

iteratif menurunkan gradien energi sampai gradien rata-rata yang cukup

diperoleh. Porsi DM membentuk konfigurasi sistem dengan menggabungkan

persamaan Newtonian tentang gerak. DM akan melakukan sampling ruang

konfigurasional yang lebih banyak daripada minimisasi dan akan

memungkinkan struktur untuk melewati halangan energi potensial yang kecil.

Konfigurasi dapat disimpan pada interval tetap selama simulasi untuk analisis

lebih lanjut, dan perhitungan energi bebas dasar menggunakan integrasi

termodinamik dapat dilaksanakan.

e. Ptraj dan Carnal

Ptraj dan Carnal merupakan program-program untuk menganalisa

trajektori-trajektori DM, menghitung (misalnya Root Mean Square deviation

dari struktur referen), analisis ikatan hidrogen, fungsi korelasi waktu, perilaku

difusional, dan sebagainya (Molinelli, 2004).

1) RMSD (Root Mean Square Deviation)

Pengukuran kesamaan diperlukan untuk perbandingan kuantitatif

suatu struktur dengan lainnya. Kesamaan struktur biasanya diukur dengan

root mean square deviation (RMSD) antara dua konformasi (Becker dan

Watanabe., 2001).

RMSD menyediakan informasi apakah konformasi telah mencapai

suatu keadaan yang stasioner. Deviasi masing-masing frame terhadap

frame pertama dalam trajektori dihitung. Harga ini sangat berguna dalam

mendekati sejauh mana struktur bergeser selama simulasi DM berjalan

(Molinelli, 2004).


commit to user

16

Jarak RMS antara konformasi i dan konformasi j dari suatu

molekul didefinisikan sebagai

𝑑𝑖𝑗 = 1

𝑁 𝐫𝑘

(𝑖)− 𝐫𝑘

(𝑗 ) 𝑁

𝑘=1 1/2

(2.8.1)

Di mana N adalah jumlah atom, k adalah indeks atom, dan r(i)k, r(ij)k adalah

koordinat Cartesian dari atom k dalam konformasi i dan j. Harga minimum

dari persamaan di atas diperoleh dengan superposisi optimal dari dua

struktur (Becker, 2001).

2) B-factor

B-factor adalah ukuran termal dari ketidaktentuan (luasan densitas

elektron) untuk struktur sebagai factor fluktuasi suatu molekul. B-factor ini

ditetapkan terhadap tiap-tiap atom dan dapat dihitung untuk tiap-tiap

residu asam amino. Pergerakan termal paling besar biasanya ditemukan

pada rantai samping dan loop (Esposito et al., 2006).

B-factor kristalografik dapat digunakan sebagai indikator mobilitas

konformasional atau fleksibilitas protein. Analisis distribusi B-factor telah

digunakan lebih awal untuk menganalisa karakteristik struktural dan

fungsional protein (Kumar et al., 2009)

Fluktuasi atomik simulasi dapat diperkirakan dengan B-factor yang

persamaannya sebagai berikut.

𝐵𝑖 = 8𝜋2

3< ∆𝑟𝑖 >2 (2.8.2)

Di mana Δri adalah akar pangkat dua fluktuasi posisional atom (Karjiban,

et al., 2009).

3) Struktur Protein dan Sudut Dihedral Backbone Protein

David (2001) dalam buku Lehninger Principles of Biochemistry

menjelaskan tentang protein. Protein adalah molekul besar yang

komplekss, yang terdapat dalam semua sel. Pada dasarnya protein disusun

oleh suatu rangkaian unit asam amino dengan struktur umum sebagai

berikut:


commit to user

17

Gambar 7. Struktur umum Asam Amino dengan gugus R berbeda untuk

masing-masing asam amino (David et al., 2001)

Dua puluh macam asam amino telah teridentifikasi dan dikelompokkan

sesuai dengan gugus R-nya sebagaimana ditunjukkan gambar 8.

Gambar 8. 20 asam amino protein yang dikelompokkan menurut gugus

fungsinya (David et al., 2001)

Struktur protein menurut Jeremy (2007) terbagi dalam empat

kategori, yaitu: struktur primer, sekunder, tertier, dan quartener

sebagaimana ditunjukkan gambar 9.


commit to user

18

Gambar 9. Beberapa struktur protein berturut-turut dari kiri ke kanan

adalah struktur primer, sekunder, tertier, dan quartener

(Jeremy et al., 2007).

Struktur primer protein adalah beberapa asam amino yang dihubungkan

oleh ikatan peptida membentuk rantai polipepetida. Struktur sekunder

protein yaitu rantai polipeptida yang dapat membentuk lipatan beberapa

struktur regular seperti alpha helix, beta sheet, serta turn dan loop.

Struktur tertier protein sendiri umumnya protein yang larut dalam air

dan melipat dalam struktur yang padat dengan inti nonpolar. Struktur

quartener disebut juga dengan protein multisubunit.

Dalam masalah prediksi struktur sekunder protein, inputnya adalah

urutan dan outputnya adalah struktur yang diprediksikan (yang juga

disebut konformasi, yang merupakan kombinasi dari alfa heliks, beta

sheet, dan loop). Suatu protein yang khusus mengandung sekitar 32% alfa

heliks, 21% beta sheet, dan 47% loop atau struktur non regular (Branden

dan Tooze, 1991).

Gambar 10 menunjukkan suatu unit peptida. Polipeptida adalah

suatu struktur tak bercabang dari sejumlah urutan asam amino yang terikat

melalui ikatan-ikatan peptida. Satu unit asam amino dalam rantai

polipeptida disebut residu. Rantai polipeptida dimulai pada ujung amino

dan berakhir pada ujung karboksilnya (Branden dan Tooze, 1991).


commit to user

19

Gambar 10. Sudut dihedral psi (ψ) dan phi (Ф) pada backbone protein

(Arjunan et al., 2001).

Phi adalah sudut rotasi di sekitar ikatan N–C sedangkan psi

merupakan sudut rotasi di sekitar ikatan C–C. Rotasi-rotasi menentukan

masing-masing struktur protein (seperti alfa heliks, beta sheet, atau loop).

Asam-asam amino yang berada di bagian dalam molekul protein adalah

asam-asam amino golongan hidrofobik sedangkan asam-asam amino yang

bersifat polar berada di permukaan protein dan biasanya memiliki urutan

dan konformasi asam-asam amino yang sama, sehingga memiliki fungsi

dan sifat-sifat yang sama pula (Arjunan et al., 2001).

Konfigurasi backbone protein sepenuhnya ditentukan oleh

spesifikasi sudut dihedral Ф dan ψ. Korelasi sudut dihedral dalam protein

asli dan terdenaturasi sangat penting karena mengandung sumber utama

informasi dalam folding dan stabilitas protein (Keskin, 2004).

B. Kerangka Pemikiran

Studi tentang struktur dasar mutasi hotspot seringkali menyertakan

quadruple mutan M133L/V203A/N239Y/N268D. Struktur QMT p53 sering

digunakan karena dinyatakan sebagai superstable mutan dan memiliki kemiripan

dengan struktur normal p53. Berdasarkan kemiripan struktur dan stabilitas

struktur yang tinggi, kedua molekul diduga memiliki dinamika konformasi yang

sama. Hal ini berkaitan erat dengan fungsi p53 normal dalam berikatan dengan

DNA. Permasalahan yang muncul disini adalah apakah benar kedua molekul

tersebut tidak berbeda nyata satu sama lain.


commit to user

20

Studi tentang penempelan PRIMA-1 pada wt-p53 dan QMT (Docking)

telah dilakukan oleh Warsino (2008). Cara ini terbukti dapat merubah konformasi

mutan p53 menyerupai p53 normal. Namun docking yang telah dilakukan

terhadap wt-p53 dan QMT p53 dikatakan tidak spesifik. Ketidakspesifikan

penempelan PRIMA-1 ditandai dengan ditemukannya situs penempelan yang

sama antara keduanya dan menghasilkan energi docking yang hampir sama antara

keduanya sebelum dan sesudah docking lanjutan. Permasalahan yang muncul

disini adalah belum ada pengamatan dinamika konformasi penempelan PRIMA-1

pada wt-p53 dan QMT p53 untuk menunjukkan kespesifikan penempelan PRIMA-

1.

Permasalahan ada tidaknya perbedaan yang nyata antara molekul wt-p53

dan QMT p53, serta karakter kespesifikan PRIMA-1 menempel pada wt-p53 dan

QMT p53 dapat diselesaikan dengan melihat dinamika konformasi wt-p53, QMT

p53, dan kompleks PRIMA-1 dengan wt-p53 saja dengan asumsi ada kemiripan

struktur antara wt-p53 dengan QMT p53. Pengamatan dinamika konformasi

ketiga molekul tersebut dilakukan dengan simulasi dinamika molekuler (DM)

program AMBER7 kurun waktu 5-9 ns.

C. Hipotesis

1. Dinamika konformasi QMT p53 tidak berbeda nyata dengan wt-p53 dengan

asumsi adanya kemiripan struktur QMT p53 dan wt-p53.

2. Keberadaan PRIMA-1 pada wt-p53 di situs energi terendah memberikan

pengaruh terhadap stabilitas konformasinya.


commit to user

21

BAB III

METODOLOGI PENELITIAN

A. Waktu dan Tempat Penelitian

Penelitian dilakukan pada bulan Agustus 2009 sampai Desember 2009,

bertempat di Laboratorium Kimia Dasar bagian Komputasi Kimia jurusan Kimia

FMIPA UNS.

B. Alat dan Bahan yang Dibutuhkan

1. Alat

Seperangkat komputer dengan spesifikasi : CPU berprosesor AMD Athlon

(tm) 64 X2 Dual Core Processor 5200+, 2.60 GHz, RAM 4 GB, dan harddisk

2x250 GB. Perangkat lunak berupa program AMBER7 (Case, et al., 2002),

program Molden (Klinsky et al., 2002), MATLAB7 (MathWorks, 2004),

CHIMERA (Pettersen et al., 2004), dan VMD (Humphrey et al., 1996).

2. Bahan

Struktur p53 wild type pada manusia kode PDB = 1GZH (Derbyshire et al.,

2002), quadruple mutan M133L/V203A/N239Y/N268D kode PDB = 1UOL

(Joerger et al., 2004), dan PRIMA-1.

C. Prosedur Penelitian

1. Parameterisasi PRIMA-1

Parameterisasi PRIMA-1 dilakukan dengan mengambil terlebih dahulu

struktur PRIMA-1 teroptimasi dari hasil penelitian Warsino (2008). Densitas

elektron (Electrostatic Potensial/ESP) dihitung dengan GAUSSIAN98 (Frisch et

al., 1995) metode ab initio pada level teori HF dan basis set 6-31G*. Populasi

elektron dihitung dengan metode Mulliken. Arsip log yang dihasilkan kemudian

diolah dengan program Antechamber dan parmchk dalam AMBER7 di mana di

dalamnya terdapat RESP untuk metode penghitungannya. Hasilnya berupa arsip

prep dan arsip frcmod sebagai template dan parameter ligan PRIMA-1 yang akan

digunakan dalam proses selanjutnya.


commit to user

22

2. Penentuan Koordinat Awal Sistem

Simulasi dilakukan terhadap tiga sistem yaitu wt-p53, QMT, dan kompleks

PRIMA-1 dengan wt-p53. Sistem QMT dilakukan sebanyak dua kali untuk

memperoleh probabilitas kondisi yang lain. Pada semua sistem ion Cl- sebagai

counterion ditambahkan menggunakan modul XLEAP dalam AMBER7. Sistem

kemudian disolvasi dengan penambahan eksplisit solvent berupa model air TIP3P

(Jorgensen, et al., 1983) yang berupa sekumpulan molekul air yang berbentuk

kotak yang melingkupi sistem dengan jarak antara sistem dan model air sebesar

12 Ǻ. Setelah itu, sistem tersebut disimpan dalam format arsip pdb (urutan atom

dan posisinya), arsip prmtop (topologi sistem), dan arsip prmcrd (parameter

sistem) yang nantinya akan digunakan dalam proses minimisasi, penyeimbangan,

dan simulasi.

3. Minimisasi Sistem

Agar proses solvasi sempurna (yaitu jarak model air dekat dengan sistem),

maka dilakukan minimisasi. Minimisasi sistem dilakukan sebanyak 500 step di

mana tiap 100 step besarnya penahanan harmonik pada makromolekul dan

counterion diubah. Pada 100 step pertama, besarnya penahanan harmonik pada

makromolekul dan counterion adalah sama-sama sebesar 25 kcal/mol-1

A-2

. Pada

100 step 2, besarnya penahanan harmonik pada makromolekul tetap 25 kcal/mol-

1A

-2 dan pada counterion hanya sebesar 20 kcal/mol

-1A

-2. Pada 100 step ketiga,

besarnya penahanan harmonik pada makromolekul adalah 20 kcal/mol-1

A-2

dan

pada counterion hanya 15 kcal/mol-1

A-2

. Pada step keempat, besarnya penahanan

harmonik pada makromolekul adalah 15 kcal/mol-1

A-2

dan pada counterion hanya

sebesar 10 kcal/mol-1

A-2

. Pada step kelima, besarnya penahanan harmonik pada

makromolekul adalah 10 kcal/mol-1

A-2

dan pada counterion hanya sebesar 5

kcal/mol-1

A-2

. Minimisasi ini akhirnya dilakukan tanpa adanya restraints.

4. Equilibrasi Sistem

Penyeimbangan dilakukan dengan pemanasan bertahap 50-300 K (sesuai

suhu sistem yang sebenarnya) selama 200 ps di mana makromolekul dan posisi-

posisi ion dijaga konstan dengan penahanan harmonik (harmonic restraint) 25

kcal/mol-1

A-2

. Penahanan harmonik berkurang 5 kcal/mol-1

A-2

setiap 5 ps selama


commit to user

23

25 ps berikutnya, hingga akhirnya kesetimbangan akan berlangsung tanpa adanya

penahanan. Untuk meningkatkan dan menjaga temperatur sistem pada 300 K

digunakan algoritma Berendsen (Berendsen et al., 1984).

5. Simulasi Sistem

Simulasi dijalankan pada temperatur konstan 300 K, tekanan 1 atm, 2 fs

time step, SHAKE constraints 0,00005 Ǻ (mengabaikan vibrasi yang melibatkan

atom hidrogen), nonbonded cutoff 9 Ǻ, dan 0,00001 untuk prosedur particle-mesh

Ewald (PME) (Kawata et al., 2001) yang digunakan untuk menangani interaksi

elektrostatik yang jangkauannya jauh (long-range electrostatic interactions).

Informasi struktural dikumpulkan setiap 500 step (1 ps).

D. Teknik Pengumpulan dan Analisis Data

Data yang berupa trajektori hasil simulasi DM diolah dengan perangkat

analisis yang terdapat dalam program AMBER7 (ptraj) dan program MATLAB7.

Pengamatan awal dilakukan terhadap perubahan nilai RMSDnya. Faktor fluktuasi

penyebab perubahan nilai RMSD dapat dicari melalui profil B-factornya.

Program CHIMERA dan VMD digunakan untuk menampilkan data secara visual.

Khususnya dinamika konformasi yang terjadi.


commit to user

24

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Parameterisasi PRIMA-1

Fungsi parameterisasi PRIMA-1 adalah mendapatkan parameter-

parameter PRIMA-1 yang diperlukan dalam proses minimisasi, equilibrasi, dan

simulasi. Struktur PRIMA-1 diambil dari hasil penelitian Warsino (2008)

sedangkan koordinat atom wt-p53 diambil dari data pdb (kode pdb : wt-p53).

Koordinat hidrogen ditambahkan dengan program XLEAP dalam AMBER7.

Muatan digambarkan sebagai RESP (Restrained ElectroStatic Potensial) dihitung

dengan GAUSSIAN98 pada level teori HF/6-31G*. Hasil parameterisasi PRIMA-1

disajikan pada gambar 11 dan tabel 2 berikut.

Gambar 11. Struktur PRIMA-1

Terparameterisasi

Tabel 2. Kode atom, tipe atom, dan

muatan PRIMA-1 yang

diperoleh dengan RESP.

Kode atom Tipe

atom

Muatan

O1=O2 OH -0.652

H12=H15 HO 0.441

C8=C9 CT 0.096

H10=H11=H13=H14 H1 0.079

C5 CT 0.073

C1 C 0.601

O3 O -0.581

C2 CT 0.029

H5 HC 0.011

C3=C7 CT -0.115

C4=C6 CT -0.007

H1=H2=H6=H7 H1 0.094

N1 NT -0.552

H3=H4=H8=H9 HC 0.050

B. Hasil Simulasi

1. Perbandingan perilaku wild type p53 (wt-p53) dan quadruple mutan

M133L/V203A/N239Y/N268D (QMT)

Setelah minimisasi dan equilibrasi dilakukan, wt-p53 disimulasikan

selama 9 ns sedangkan QMT disimulasikan dua kali masing-masing selama 5 ns.

Hasil simulasi diolah dengan program analisis ptraj. Analisis yang pertama


commit to user

25

dilakukan adalah pengamatan pergesaran posisi rata-rata molekul tiap waktu

terhadap posisi awalnya yang disebut dengan RMSD (Root Mean Square

Deviation).

Hasil simulasi DM berupa profil RMSD total wt-p53, QMT_1 (simulasi

QMT yang pertama), dan QMT_2 (simulasi QMT yang kedua) ditunjukkan oleh

gambar 12. Gambar tersebut menujukkan ketiga sistem sama-sama bergeser naik

dari 1Å ke kisaran 2,3Å diawal simulasi hingga 800 ps. Hal ini menunjukkan

ketiga sistem tersebut masih mengalami tahap equilibrasi artinya masih mencari

posisi stabil sebelum simulasi. Pada saat 1-2 ns perbedaan pergeseran posisi mulai

terjadi antara wt-p53 dan QMT_2 dengan QMT_1. Baik wt-p53 dan QMT_2

keduanya turun dulu baru naik, sedangkan QMT_1 naik dulu baru turun.

Gambaran ini menunjukkan posisi wt-p53 pada saat tersebut bisa dicapai oleh

QMT_2 tetapi QMT_1 tidak bisa.

Rentang waktu berikutnya antara 2-3 ns ketiga sistem bertemu pada

jarak yang sama. Setelah 3 ns QMT_1 sempat naik lagi tapi kembali turun dan

stabil pada jarak 2,5Å hampir sama dengan profil wt-p53 yang naik dulu tapi

kembali lagi dan stabil pada jarak 2,5Å.

Profil QMT_2 relatif terus naik perlahan hingga akhir simulasi namun

jika dibandingkan dengan profil wt-p53 kenaikan QMT_2 masih mendekati wt-

p53 diarea 2,5Å. Pada pertengahan hingga akhir simulasi profil RMSD ketiga

sistem stabil pada jarak yang sama, meski pada rentang waktu 1-2 ns ada

perbedaan pergeseran posisi ketiganya. Perbedaan posisi yang terjadi pada ketiga

sistem berkaitan dengan faktor fluktuasi atomik rata-rata ketiga sistem tersebut.

Oleh karena itu dilakukan analisis ptraj B-factor ketiga sistem untuk menjelaskan

lebih lanjut karakter dinamika ketiga molekul tersebut.


commit to user

26

Gambar 12.Perbandingan profil RMSD (Å) terhadap waktu (ps) hasil simulasi

DM untuk quadruple mutan QMT_1 (garis merah), QMT_2(garis

biru), dan wild type p53 wt-p53 (garis hitam).

Hasil simulasi DM yang telah dilakukan untuk QMT dan wt-p53

menunjukkan profil B-factor yang relatif sama meski masih ada fluktuasi yang

lebih tingi untuk QMT. Jika dibandingkan dengan wt-p53 fluktuasi QMT lebih

tinggi pada beberapa residu yang memang lebih fluktuatif dibanding yang lain.

Pada gambar 13 dibawah nilai B-factor QMT hasil simulasi DM menunjukkan

nilai yang lebih tinggi pada daerah tertentu (residu 120, 181, 186, 226, dan 248).

Gambar 13.Perbandingan profil B-factor (Å2) terhadap nomor residu untuk

quadruple mutan QMT_1 (garis merah), QMT_2 (garis biru), rerata

QMT_1 dan QMT_2 (orange) dan wild type p53 wt-p53 (garis hitam).

Perulangan simulasi DM untuk QMT dilakukan untuk memastikan

fluktuasi QMT. Hasil simulasi ternyata menunjukkan profil B-factor yang berbeda

120

181

186

248

226

RMSD

(Å)

Waktu (ps)


commit to user

27

meski dilakukan pada rentang waktu yang sama yaitu 5ns. B-factor QMT_2 yang

ditunjukkan gambar 13 secara keseluruhan tampak lebih mendekati wt-p53 dari

pada B-factor QMT_1 meskipun masih ada beberapa residu yang lebih fluktuatif

(120, 186, dan 248).

Perbedaan profil fluktuasi QMT ini hanya menunjukkan probabilitas

dinamika molekulnya dimana suatu keadaan bisa dicapai seperti QMT_1

sedangkan keadaan yang lain bisa saja dicapai seperti QMT_2. Bahkan hasil rata-

rata B-factor keduanya tidak jauh berbeda dan sangat mendekati wt-p53

sebagaimana ditunjukkan oleh garis orange pada gambar 13. Oleh karena itu

untuk mengamati lebih dalam perbedaan profil B-factor yang ada berbeda nyata

atau tidak dilakukan analisis sudut dihedral Ф (phi) dan ψ (psi) backbone residu

yang penting untuk berikatan dengan DNA dan residu lain yang berbeda cukup

signifikan.

a. Residu Lisin 120 dan Arginin 248

Baik QMT_1 maupun QMT_2 keduanya menunjukkan fluktuasi pada

residu 120 dan 248 yang penting untuk berikatan dengan DNA. Residu 120

adalah asam amino lisin yang merupakan bagian dari loop L1 (Wong et al., 1999)

dan berikatan hidrogen dengan O6 dan N7 dari basa Gua 8 dalam major groove

(lekukan besar) DNA, sedangkan arginin 248 berikatan dengan minor groove DNA

(Wright, 2007).

Pada residu lisin 120 profil B-factor QMT tampak sedikit lebih fluktuatif

dari wt-p53. Faktor fluktuasi berasal dari kontribusi fluktuatif sudut torsi phi (Ф4)

yaitu backbone C120:N121:CA121:C121 dari residu lisin 120 dan serin 121 baik

untuk QMT_1 maupun QMT_2. Ada fluktuasi sudut sebesar 50° pada kisaran

1,5ns hingga akhir simulasi namun masih dominan pada sudut -50° yaitu posisi

yang sama dengan wt-p53. Selain itu ada juga perubahan sudut torsi ψ5 backbone

N121:CA121:C121:N122 dari residu serin 121 dan valin 122 sebagaimana

ditunjukkan pada gambar 14A. Perubahan sudut dihedral Ф4 dan ψ5 ini

menyebabkan fluktuasi rantai samping lisin 120 selama simulasi sebagaimana

tampak pada hasil snapshot gambar 14B. Meski tampak fluktuatif namun posisi


commit to user

28

rantai samping wt-p53 masih dominan dapat dicapai oleh QMT_1 atau QMT_2.

Posisi yang sama kita lihat dapat terjadi saat 1,5 ns; 2,5 ns; dan 4 ns.

A

B

Gambar 14. Profil perbandingan fluktuasi sudut dihedral Psi (ψ) pada baris bawah

dan Phi (Ф) pada baris atas residu 118-123 (melibatkan residu lisin

120) antara wt-p53, QMT_1, dan QMT_2 berturut-turut ditunjukkan

dengan warna hitam, merah, dan biru, A. Grafik fluktuasi sudut

dihedral terhadap waktu yang fluktuatif pada Ф4 memuat residu 120

dan 121 dan ψ5 yang memuat residu 121 dan 122. B. Posisi sudut

dihedral selama simulasi dengan backbone residu lisin 120 dan serin

121 digambarkan sebagai stik dan bola sedangkan rantai samping lisin

120 digambarkan sebagai stik.

Lain halnya dengan residu 248, baik wt-p53 dan QMT keduanya

memiliki tingkat fluktuasi yang hampir sama berdasarkan profil B-factornya

namun terdapat perbedaan yang signifikan pada profil sudut torsinya.Perbedaan

terjadi pada sudut dihedral Ф3 yaitu backbone C246:N247:CA247:C247 dari

residu 246 (metionin) dan 247 (asparagin) serta ψ4 backbone

N247:CA247:C247:N248 yang memuat residu 247 (asparagin) dan 248 (arginin)

masing-masing sebesar 100°. Meski berbeda tapi menunjukkan garis yang stabil

dari awal hingga akhir simulasi. Perbedaan ini menjelaskan satu kondisi yang

0 ns 1,5ns 2,5ns

4 ns 5 ns


commit to user

29

berbeda dapat dicapai wt-p53 dan QMT stabil dari awal hingga akhir simulasi 5

ns sehingga dapat dikatakan stabil secara termodinamika sebagaimana

ditunjukkan gambar 15A.

Pada gambar 15B kita melihat adanya perubahan cukup signifikan saat 1

dan 2 ns. Backbone wt-p53 residu 244-246 berubah dari loop menjadi sheet

sedangkan QMT tetap pada struktur loop. Saat 3 ns sheet wt-p53 244-245 berubah

menjadi loop kembali tak lama kemudian berubah kembali saat 4 ns. Gambar 14B

memang menunjukkan fluktuasi konformasi backbone 244-245 tetapi profil grafik

torsi Ф1, Ф2, ψ1, dan ψ2 tampak stabil. Hal ini menunjukkan konformasi sheet

protein sama dengan konformasi loopnya.

Pada backbone residu 246-248 gambar 15A tampak adanya perubahan

sudut permanen sebesar 100°. Perubahan ini nampak pada gambar 15B dimana

kedua molekul QMT menekuk dengan besar sudut yang tetap selama simulasi dan

wt-p53pun menekuk dengan besar sudut yang berbeda dari QMT konstan selama

simulasi. Pergeseran rantai samping arginin 248 terjadi sejak 1 ns tapi hanya

berfluktuasi lalu kembali lagi berhimpit diakhir simulasi.


commit to user

30

A

B

Gambar 15. Profil perbandingan fluktuasi sudut dihedral Psi (ψ) dan Phi (Ф)

residu 244-248 (melibatkan residu arginin 248) antara wt-p53, QMT_1,

dan QMT_2 berturut-turut ditunjukkan dengan warna hitam, merah, dan

biru, A. Grafik fluktuasi sudut dihedral terhadap waktu yang fluktuatif

pada Ф3 memuat residu 246 dan 247 serta ψ4 yang memuat residu 247

dan 248. B. Perubahan sudut dihedral selama simulasi dengan backbone

residu 244-249 digambarkan sebagai ribbon sedangkan rantai samping

arginin 248 digambarkan sebagai stik.

Berdasarkan hasil simulasi kedua residu tersebut dapat disimpulkan

quadruple mutan ini tidak berpengaruh signifikan terhadap residu lisin 120 dan

arginin 248. Quadruple mutan ini bisa membuat residu lisin 120 lebih fluktuatif

namun masih dominan pada posisi yang sama dengan wt-p53. Pada residu 248

quadruple mutan ini memang memberikan perubahan signifikan untuk rantai

utamanya namun tidak signifikan karena masih pada posisi yang berdekatan

dengan wt-p53.

b. Residu Arginin 181, Asam Aspartat 186, dan Glysin 226

Pengamatan berikutnya dilakukan pada residu-residu yang lebih

fluktuatif ditandai dengan nilai puncak B-factor yang lebih tinggi dibanding yang

0 ns 1 ns 2 ns 3 ns 4 ns 5 ns


commit to user

31

lain, yaitu daerah residu 181,186, dan 226. Pada dasarnya daerah yang sangat

fluktuatif dari hasil simulasi DM sama dengan hasil kristalografi sinar-x nya yaitu

adanya perbedaan struktur pada daerah loop L1, loop L2, loop L3, dan paling

signifikan terjadi pada loop putaran strand S7 dan S8 (gambar 16); dimana,

residu 181 dan 186 pada loop L2, serta residu 226 terdapat pada loop putaran

S7-S8.

Gambar 16.Perbandingan struktur hasil kristalografi sinar-x wt-p53 dan QMT

dalam bentuk stereo dari backbone wild type-p53 tanpa DNA (rantai

A,biru), wild type p53 dengan DNA(rantai B, jingga) dan quadruple

mutan p53(hitam) setelah dihimpitkan (Joerger,et al, 2004).

Sudut dihedral psi(ψ) dan phi (Ф) untuk backbone residu-residu

fluktuatif pada gambar 17 menunjukkan adanya banyak kontribusi perubahan

sudut dihedral terhadap nilai B-factor residu-residu tersebut. Pada gambar 17A

kita melihat perbedaan profil Ф1 backbone C179:N180:CA180:C180 untuk

QMT_1 dan QMT_2 dibandingkan dengan wt-p53. Meskipun torsi Ф1 dari

QMT_1 dan QMT_2 saling berbeda satu sama lain namun masing-masing kondisi

masih dapat dicapai oleh wt-p53 pada satu waktu tertentu. Sehingga perbedaan

yang ditunjukkan pada dasarnya tidak cukup nyata antara wt-p53 dan QMT.

Lain halnya dengan rentang residu 184-188 pada gambar 17B. Profil torsi

QMT_1 dan QMT_2 untuk Ф2 backbone C184:N185:CA185:C185 dan ψ3

backbone N185:CA185:C185:N186 nampak berbeda dibandingkan dengan wt-

p53. Profil torsi Ф2 untuk QMT_2 saat kisaran 4 ns masih bisa dicapai oleh wt-

p53 akan tetapi kondisi QMT_1 tidak bisa. Kondisi QMT_1 baru bisa dicapai wt-

p53 saat mendekati 5 ns.


commit to user

32

Perubahan yang cukup signifikan terjadi pada ψ3 residu serin 185 dan

asam aspartat 186. Backbone kedua residu tersebut mengalami perubahan sudut

hampir 200○ sejak 500 ps hingga 4500 ps. Backbone tersebut sempat kembali

pada kondisi wt-p53 sejenak lalu berubah lagi hingga akhir simulasi. Perubahan

sudut backbone tampak jelas pada gambar 18. Gambar 18 menunjukkan ada

tekukan besar residu serin 185 dan asam aspartat 186 untuk QMT_2 berangsur-

angsur selama simulasi. Sedangkan untuk QMT_1 sendiri sempat ada perubahan

mendekati arah perubahan QMT_2 namun masih dominan pada kondisi wt-p53

yaitu pada sudut 100○.

Residu 226 adalah residu yang sangat fluktuatif ditandai dengan nilai B-

factor paling tinggi dibanding yang lain. Residu ini terletak pada loop putaran S7

dan S8 yang sangat fleksibel. Perbedaan yang nyata antara wt-p53 dan QMT juga

terlihat dari hasil kristalografi sinar-x (gambar 16). Berdasarkan hasil simualsi

DM (gambar 17C) fluktuasi pada residu 226 terjadi karena kontribusi perubahan

torsi residu 225-230 itu sendiri. Meski demikian perubahan tersebut masih

dikategorikan stabil secara kinetika dimana satu kondisi tidak dapat dicapai oleh

mutan namun pada saat tertentu bisa kembali lagi dicapai oleh mutan mengikuti

kondisi wild type nya.


commit to user

33

A

Ф1

Ф2

Ф3

Ф4

Ψ1

Ψ2

Ψ3

Ψ4

B

Ф1

Ф2

Ф3

Ф4

Ψ1

Ψ2

Ψ3

Ψ4

C

Ф1

Ф2

Ф3

Ф4

Ф5

Ψ1

Ψ2

Ψ3

Ψ4

Ψ5

Gambar17. Profil sudut dihedral Psi (ψ) dan Phi (Ф), A. Residu 179-181, B.

Residu 184-188, C. Residu 225-230

Hasil pengamatan dinamika molekul wt-p53, QMT_1, dan QMT_2

menunjukkan bahwa ketiga residu fluktuatifnya memiliki karakter fluktuasi yang


commit to user

34

sama secara umum artinya kondisi wt-p53 sebagai pembanding masih dapat

dicapai oleh quadruple mutan meski ada perbedaan namun secara umum dominan

sama dengan wt-p53.

0ns

1ns

2ns

3ns

4ns

5ns

Gambar18. Perubahan sudut dihedral selama simulasi 0-5ns dengan backbone

residu asam amino 185-187 berturut-turut dari atas ke bawah

digambarkan sebagai ribbon sedangkan rantai sampingnya

digambarkan sebagai stik.

Dengan asumsi quadruple mutan tidak berpengaruh cukup signifikan

terhadap residu penting p53 berikatan DNA (lisin 120, glysin 245, arginin 248,

dan arginin 273) dan adanya kesamaan ketiga karakter dinamika konformasi

molekul residu fluktuatif, maka dapat dikatakan quadruple mutan

M133L/V203A/N239Y/N268D QMT tidak berbeda nyata dengan wild type p53

wt-p53. Akan tetapi perlu adanya studi lebih lanjut mengenai interaksi quadruple

mutan M133L/V203A/N239Y/N268D dengan DNA khususnya pada residu 120,

245 dan 248.

2. Perilaku PRIMA-1 pada wild type p53 (wt-p53)

Dengan asumsi bahwa wt-p53 dan QMT tidak berbeda nyata maka

pengamatan dinamika interaksi PRIMA-1 hanya dilakukan pada wt-p53 saja.


commit to user

35

Setelah parameterisasi selesai diperoleh, dilakukan penempelan PRIMA-1 pada

wt-p53 dengan XLEAP AMBER7 kemudian minimisasi, equilibrasi dan

selanjutnya simulasi selama 5ns sebagaimana molekul wt-p53 dan QMT tanpa

PRIMA-1 sebelumnya.

Hasil simulasi kemudian diolah dengan analisis ptraj. Analisis yang

pertama dilakukan adalah pengamatan perubahan posisi RMSD wt-p53 dengan

kompleks. Penambahan PRIMA-1 pada wt-p53 memberikan efek perubahan

posisi RMSD jika dibandingkan dengan wt-p53 tunggal. Hal ini terjadi karena ada

penambahan berat molekul PRIMA-1. Meski demikian jika diamati lebih lanjut

dapat dilihat bahwa karakter perubahan posisi yang terjadi antara wt-p53 tunggal

dan kompleks relatif sama sebagaimana ditunjukkan gambar 19 dibawah. Jika

RMSD wt-p53 mulai stabil pada 2.5Å setelah 3 ns, pada interaksinya dengan

PRIMA-1 profil RMSD juga mulai stabil pada posisi 2.5Å setelah 4500ps. Untuk

itu perlu adanya simulasi lanjutan untuk kedua molekul tersebut diatas 5 ns guna

mengamati lebih lanjut perubahan posisi kedua molekul tersebut hingga mencapai

posisi stabilnya.

Gambar 19.Perbandingan profil RMSD (Å) terhadap waktu (ps) hasil simulasi

DM untuk wild type p53 wt-p53 (garis hitam) dan kompleks p53

dengan PRIMA-1.

Pengamatan terhadap salah satu karakter dinamika molekul yaitu

fluktuasi molekul dapat dilihat dari profil B-factor nya sebagaimana ditunjukkan

gambar 20 dibawah. Adanya PRIMA-1 tampak meningkatkan nilai B-factor

beberapa residu asam amino wt-p53 menjadi lebih fluktuatif sedangkan pada

RMSD

(Å)

Waktu (ps)


commit to user

36

residu asam amino yang tingkat fluktuasinya relatif tinggi saat tanpa PRIMA-1

dengan adanya PRIMA-1 justru tidak terpengaruh. Dari grafik dibawah tampak

bahwa nilai B-factor menjadi lebih tinggi pada residu 116, 186, 245, dan 248

setelah ada penempelan PRIMA-1. Fluktuasi yang terjadi pada residu 116 yang

terletak di daerah loop L1 tidak mempengaruhi residu penting p53 untuk berikatan

dengan DNA pada residu 120 terbukti dengan tidak adanya perbedaan profil B-

factor pada residu tersebut. Residu asam aspartat 186 yang terletak di loop L2

tampak mengalami perubahan sangat signifikan kurang lebih sebesar 300 Å2

bahkan lebih tinggi dari QMT. Selain itu dua residu penting p53 berikatan dengan

DNA yang juga mengalami perubahan nilai B-factor adalah residu 245 dan 248.

Melalui pengamatan terhadap torsi residu fluktuatif dapat diketahui karakter

dinamika komplekss p53 dengan PRIMA_1 lebih lanjut.

Gambar 20.Perbandingan profil B-factor (Å2) terhadap nomor residu hasil

simulasi DM untuk wild type p53 wt-p53 (garis hitam) dan komplekss

wt-p53 dengan PRIMA-1.

Berdasarkan hasil docking yang dilakukan Warsino (2008) penempelan

PRIMA-1 pada situs dengan energi docking terendah, yaitu pada daerah inti β-

sandwich dikatakan tidak spesifik berinteraksi dengan DNA artinya bahwa

PRIMA-1 tidak cukup berpengaruh terhadap wt-p53 karena perubahan energi

docking awal dan lanjutannya tidak lebih dari 2 kkal/mol. Melalui hasil simulasi

DM PRIMA-1 tampak cukup stabil menempel pada situs tersebut sebagaimana

ditunjukkan pada gambar 21A dibawah. Dari awal hingga akhir simulasi 5 ns

116

186

248

245


commit to user

37

PRIMA-1 stabil berikatan dengan p53 pada area β-sandwich yaitu daerah inti p53

antara residu leusin 111, arsinin 268, dan phenylalanine 270 yang ditunjukkan

gambar 21B.

A

0ns 1ns 2ns

3ns 4ns 5ns

B

Gambar 21. Perbandingan posisi PRIMA-1 pada p53 selama simulasi. A.PRIMA-

1 (digambarkan sebagai spherical magenta) yang berinteraksi

dengan p53 (digambarkan sebagai pita hijau) di situs energy

terendah hasil docking Warsino (2008) selama simulasi 0-5ns, B.

PRIMA-1 (digambarkan sebagai stik magenta) yang menempel pada

p53 (digambarkan sebagai pita abu gelap) di area β-sandwich antara

leusin 111 (hijau gelap), asparagine 268 (hijau muda), dan

phenylalanine 270 (ungu).


commit to user

38

Dengan mengukur jarak antar atom tertentu yang diperkirakan akan

membentuk ikatan hydrogen antara PRIMA_1 dengan residu 111 dan 268

sebagaimana ditunjukkan pada gambar 22, tampak bahwa kemungkinan

terbentuknya ikatan hidrogen lebih besar terjadi antara PRIMA-1 dengan leusin

111 dengan asumsi bahwa jarak ikatan atom H residu 111 dengan O3 PRIMA-1

relatif stabil pada 2Å meski kadang kala terjadi fluktuasi pada waktu tertentu

namun akan kembali lagi pada posisi 2Å. Sedangkan untuk residu arsinin 268

dengan PRIMA-1 kemungkinan terbentuknya ikatan hydrogen lebih kecil karena

jarak atom H1D2 residu 268 dengan O3 PRIMA-1 dominan pada 4Å (melewati

jarak maksimal ikatan hydrogen 2-2,5Å) namun pada satu waktu tertentu kisaran

1-2 ns dan 3-4 ns ikatan hydrogen kemungkinan bisa saja terbentuk.

A B

C

Gambar 22. Posisi PRIMA-1 terhadap dua residu yang diperkirakan mampu

membentuk ikatan hydrogen antara keduanya berturut-turut A dan B

adalah leusin 111 dan asparagine 268. C.menunjukkan jarak atom

yang terlibat dalam bentuk grafik jarak ikatan (Å) terhadap waktu

(ps) dimana jarak atom H residu 111 dengan O3 PRIMA-1

ditunjukkan oleh garis merah muda dan jarak atom H1D2 residu 268

dengan O3 PRIMA-1 ditunjukkan oleh garis coklat.

H1D2

O3

H

O3


commit to user

39

Penempelan PRIMA-1 antara residu leusin 111 dan arsinin 268

memberikan pengaruh terhadap perubahan torsi rentang residu 114-118

sebagaimana ditunjukkan grafik gambar 23A. PRIMA-1 yang diperkirakan

mampu berikatan hydrogen dengan leusin 111 menggeser rantai utama

disebelahnya yaitu residu 114-118 (phenilalanine-leusin-histidin-serin-glysin)

sehingga menjadi lebih fluktuatif dibanding wt-p53 saat tanpa PRIMA-1. Pada 1-2

ns PRIMA-1 menarik residu-residu tersebut sedangkan pada 3-5 ns mulai

mendorong residu tersebut menjauhi PRIMA-1 sebagaimana tampak pada gambar

23B dibawah.

A

Ф1

Ф2

Ф3

Ф4

Ψ1

Ψ2

Ψ3

Ψ4

B

Gambar 23. A.Profil sudut dihedral Psi (ψ) dan Phi (Ф) residu 114-118 dimana

kompleks p53 dengan PRIMA-1 ditunjukkan sebagai garis hijau dan

wt-p53 ditunjukkan sebagai garis hitam, dan B.Posisi kompleks p53


commit to user

40

dengan PRIMA-1 yang ditunjukkan sebagai pita hijau terhadap wt-p53

sebagai pita hitam berturut-turut dari kiri ke kanan diambil saat

1,2,3,4,dan 5 ns.

Selain residu 114-118 keberadaan PRIMA-1 juga mempengaruhi residu

glysin 245 dan arginin 248 yang penting berikatan DNA dengan adanya

pergeseran rantai utama residu isoleusin 251 yang cukup besar. Pergeseran ini

kemungkinan terjadi karena pengaruh pergeseran rantai utama valin 272 dengan

asumsi jarak rantai samping valin 272 dan isoleusin 251 yang berdekatan ikut

terpengaruh manakala ada pergeseran rantai utama valin 272. Pergeseran rantai

utama valin 251 itu sendiri bisa jadi dipengaruhi oleh adanya PRIMA-1.

Visualisasinya dapat dilihat dari hasil snapshot gambar 24 dibawah.

Gambar 24. Posisi PRIMA-1 yang ditunjukkan sebagai spherical merah terhadap

wt-p53 yang ditunjukkan sebagai pita merah muda dan kompleks p53

yang ditunjukkan sebagai pita hijau dengan beberapa residu

terdekatnya nomor 1, 2, 3, dan 4 berturut-turut adalah valin 272,

isoleusin 251, arginin 248, dan glysin 245 yang ditunjukkan sebagai

stik.

Oleh karena itu adanya PRIMA-1 dikatakan dapat mempengaruhi residu

glysin 245 dan arginin 248 dengan merubah sudut torsi sekitarnya. Hal ini nampak

pada gambar 25A untuk residu glysin 245 dengan adanya perubahan sudut torsi

Ф4 residu 245-246 sebesar 50○

pada kisaran 1,5ns sampai dengan 3,5 ns

kemudian kembali lagi dan bertahan selama 1 ns lalu berfluktuasi kembali.

Begitupula dengan residu arginin 248 pada gambar 25B dibawah nampak adanya

1

2 3

4


commit to user

41

perubahan sudut torsi Ф2 untuk residu 245-246 sebesar 50○ dan Ф3 untuk residu

246-247 sebesar 100○ pada 2,5 ns dan bertahan sampai akhir simulasi, serta

sempat terjadi sedikit perubahan torsi ψ3 residu 246-247 sebesar 50○

namun

kembali perlahan ke arah wt-p53. Perubahan ψ4 cukup signifikan terjadi sebesar

100○ mulai 2,5 ns sampai akhir simulasi.

A

B

Gambar 25. Dinamika perubahan sudut torsi terhadap waktu antara kompleks p53

dengan PRIMA-1 yang ditunjukkan oleh garis hijau dengan

pembanding wt-p53 yang ditunjukkan sebagai garis hitam untuk baris

atas merupakan sudut Ф berturut-turut dari kiri ke kanan Ф1, Ф2, Ф3,

dan Ф4 sedangkan baris bawah adalah sudut ψ berturut-turut dari kiri

ke kanan ψ1, ψ2 , ψ3, dan ψ4 untuk A. Rentang residu 242-246 yang

memuat residu 245, dan B. Rentang residu 244-248.


commit to user

42

Dari hasil snapshot residu 244-249 gambar 26 dapat dilihat pada 1ns mulai ada

pergeseran glysin 245 kompleks p53 dengan wt-p53 dan perubahan konformasi

glysin 245 wt-p53 dari loop ke sheet yang bertahan hingga 2ns kembali lagi pada

3ns ke konformasi loopnya dan muncul lagi pada 4 ns namun kembali lagi pada

konformasi loopnya di akhir simulasi. Dengan membandingkan konformasi glysin

245 untuk kompleks maupun tunggalnya, p53 tunggal lebih fluktuatif mengalami

perubahan konformasi dibandingkan kompleksnya yang terus dalam bentuk

loopnya dari awal hingga akhir simulasinya. Perubahan yag cukup signifikan

terjadi pada 3ns karena perubahan sudut torsi residu 246-248 sebagaimana

dijelaskan pada gambar 25B diatas hingga akhir simulasi 5ns.

Gambar 26. Dinamika posisi kompleks p53 dengan PRIMA-1 yang ditunjukkan

oleh pita hijau yang dihimpitkan dengan wt-p53 sebagai pembanding

ditunjukkan sebagai pita merah muda residu 244-249 selama 5 ns.

Atom masing-masing residu ditunjukkan sebagai wire dan atom residu

248 sendiri ditunjukkan sebagai stik sedangkan residu 245

ditunjukkan sebagai pita orange.

PRIMA-1 juga mempengaruhi asam aspartat 186 yang terletak di loop L2

menjadi lebih fluktuatif dilihat dari profil b-factor gambar 20 diatas. Faktor

fluktuasi yang mempengaruhi adalah perubahan sudut torsi pada rentang residu

0ns 1ns 2ns 3ns

4ns 5ns


commit to user

43

serin 183, as.aspartat 184, serin 185, as.aspartat 186, dan glysin 187 sebagaimana

ditunjukkan gambar 27 dibawah. Ditemukan perubahan Ф2 residu 184-185

sebesar 100○

saat 2ns berangsur berkurang 50○ hingga akhir simulasi. Akan tetapi

kondisi inipun masih bisa dicapai oleh wt-p53 sebagaimana tampak dalam gambar

pada saat 4-4,5ns. Perubahan Ф3 residu 185-186 terjadi sebesar 100○ saat 2-2,5ns

kemudian kembali lagi hingga akhir simulasi. Lain halnya dengan perubahan ψ3

residu 185-186 sebesar 150○ saat 2,5ns hingga akhir simulasi yang tidak dapat

dicapai oleh wt-p53.

Gambar 27. Dinamika perubahan sudut torsi terhadap waktu antara kompleks p53

dengan PRIMA-1 yang ditunjukkan oleh garis hijau dengan

pembanding wt-p53 yang ditunjukkan sebagai garis hitam untuk baris

atas merupakan sudut Ф berturut-turut dari kiri ke kanan Ф1, Ф2, Ф3,

dan Ф4 sedangkan baris bawah adalah sudut ψ berturut-turut dari kiri

ke kanan ψ1, ψ2 , ψ3, dan ψ4 untuk rentang residu 183-187.

Visualisasi perubahan sudut torsinya dapat dilihat pada gambar 28

dibawah. Mulai 2ns sudah ada perputaran rantai utama 185 sebagaimana telah

dijelaskan diatas karena perubahan sudut Ф2 residu 184-185. Perputaran ini

nampak bertahan hingga akhir simulasi menyebabkan perbedaan posisi rantai

utama yang cukup signifikan terjadi bahkan mulai 4ns hingga akhir simulasi juga

terdapat perubahan konformasi dari loop menjadi sheet residu 183-184. Meskipun

letak PRIMA-1 yang berikatan dengan p53 pada area β-sandwich cukup jauh dari


commit to user

44

residu 186 berbeda dengan residu lain 116, 245, dan 248 yang relatif lebih dekat,

PRIMA-1 memberikan pengaruh terhadap perubahan signifikan residu asam

aspartat 186 yang terletak di area loop L2 p53. Namun belum diketahui pengaruh

perubahan signifikan residu ini terhadap fungsi p53 dalam berikatan dengan DNA

atau terhadap monomer p53 yang lain dalam bentuk tetramer p53 untuk berikatan

dengan DNA.

Gambar28. Dinamika posisi kompleks p53 dengan PRIMA-1 yang ditunjukkan

oleh pita hijau yang dihimpitkan dengan wt-p53 sebagai

pembanding ditunjukkan sebagai pita merah muda residu 183-187

selama 5 ns. Atom residu selain 186 ditunjukkan sebagai wire

sedangkan atom residu 186 ditunjukkan sebagai stik.

Secara keseluruhan PRIMA-1 cukup stabil menempel pada p53 di area β-

sandwich dan spesifik berinteraksi p53 dengan asumsi adanya perubahan yang

cukup permanen yang terjadi pada residu sekitar penempelan (116, 245, dan 248)

dan residu yang jauh dari situs penempelan PRIMA-1. Untuk itu perlu adanya

studi lebih lanjut mengenai interaksi PRIMA-1 dengan p53 pada situs yang sama

terlebih dalam kaitanya dengan interaksi DNA.

0ns 1ns 2ns

3ns 4ns 5ns


commit to user

45

Studi terhadap struktur protein paling mudah dilakukan dengan cara

mengkristalkannya. Begitu pula studi mutan p53 penyebab kanker. Kristalisasi

terhadap mutan p53 sulit dilakukan karena mutan p53 sangat tidak stabil. QMT

yang menyertai mutan p53 mampu menstabilkan struktur mutan p53 sehingga

dapat dikristalkan.

Simulasi DM terhadap dinamika konformasi quadruple mutan p53

menunjukkan tidak ada perbedaan yang nyata dengan karakter dinamika

konformasi wild typenya. Selain itu, dinamika konformasinya juga tidak

menunjukkan perubahan signifikan pada residu lisin 120 dan arginin 248 yang

penting berikatan dengan DNA. Oleh karena itu penggunaan quadruple mutan p53

dalam berbagai studi kanker yang melibatkan quadruple mutan ini bisa

digunakan. Sedangkan untuk penempelan ligan PRIMA-1 yang umum digunakan

sebagai salah satu cara reaktivasi mutan p53 dalam studi terapi kanker

memerlukan kajian ulang, karena berdasarkan hasil pengamatan dinamika

konformasinya pada wild type p53 menunjukkan adanya perubahan konformasi

yang cukup signifikan pada residu yang penting untuk berikatan dengan DNA

yaitu glysin 245 dan arginin 248.


commit to user

46

BAB V

KESIMPULAN DAN SARAN

A. Kesimpulan

1. Quadruple mutan QMT tidak berpengaruh signifikan terhadap residu penting

p53 berinteraksi dengan DNA khususnya lisin 120 dan arginin 248. Adanya

quadruple mutan ini juga memiliki kesamaan karakter dinamika konformasi

residu fluktuatifnya dengan wt-p53. Oleh karena itu QMT dikatakan tidak

berbeda nyata dengan wt-p53.

2. PRIMA-1 cukup stabil menempel pada p53 di area β-sandwich dan spesifik

berinteraksi p53 dengan asumsi adanya perubahan yang cukup signifikan

terjadi pada residu sekitar penempelan (116, 245, dan 248) dan residu yang

jauh dari situs penempelan PRIMA-1 (186).

B. Saran

Meskipun wt-p53 dan QMT telah diketahui tidak berbeda nyata, namun

perlu adanya studi lanjut dinamika konformasi kompleks PRIMA-1 dengan QMT

karena PRIMA-1 juga menempel pada posisi yang sama dengan mutasi N268D.

Penelitian lanjutan sebaiknya dilakukan dengan rentang waktu yang lebih panjang

karena pada rentang waktu 5 ns belum diperoleh RMSD QMT yang cukup lama

stabil.


commit to user

47

DAFTAR PUSTAKA

Arjunan, S. N. V., Deris, S., and Illias, R. M. D., 2001, Prediction of Protein

Secondary Structure. Jurnal Teknologi, 35, page : 81–90.

Bai, L. and Zhu, W., 2006, p53: Structure, Function and Therapeutic

Applications, Journal of Cancer Molecules Vol. 2, No. 4, Hal. 141-153.

Becker, O. M., 2001, Computational Biochemistry and Biophysics, Chapter 4.

Marcel Dekker, Inc, New York

Becker, O. M. and Watanabe, M., 2001, Computational Biochemistry and

Biophysics, Chapter 3, Marcel Dekker, Inc, New York.

Berendsen, H. J. C., Postma, J. P. M., van Gunsteren, W. F., DiNola, A. & Haak,

J. R., 1984, Molecular Dynamics with Coupling to An External Bath, The

J. Chem. Phys, 81, 3684-3690.

Branden C., and J. Tooze., 1991, Introduction to Protein Structure, Garland

Publishing, Inc. 3–29.

Bykov, V. J. N., Issaeva, N., Selivanova, G., and Wiman, K. G., 2002a, Mutant

p53-Dependent Growth Suppression Distinguishes PRIMA-1 From Known

Anticancer Drugs: A Statistical Analysis of Information In The National

Cancer Institute Database, Carcinogenesis, Vol. 23, No. 12, Hal. 2011–

2018.

Bykov, V. J. N., Issaeva, N., Shilov, A., Hultcrantz, M., Pugacheva, E., 2002b,

Restoration of the Tumor Suppresor Function to Mutant p53 by A Low-

Molecular Weight Compound, Nat. Med., Vol. 8, No. 3, Hal. 282 – 288.

Case, D. A., Pearlman, D. A., Caldwell, J. W., Cheatham, T. E. III, Wang, J., et

al., 2002, AMBER7, University of California, San Fransisco.

Derbyshire, D., Basu, B., Serpel, L., Joo, W., date,T., Iwabuchi, K., and Doherty,

A., 2002, Crystal Structure of Human 53BP1 BRCT Domains Bound to

p53 Tumour Suppressor, EMBO J., 21: pp. 3868.

Enten, J. and Monson, M., 2005, DNA Cell Cycle Analysis with 4′, 6-Diamidino-

2-Phenylindole (DAPI) or Propidium Iodide (PI) Nuclear Stains, Cellular

Analysis Business Center, Beckman Coulter, Miami.


commit to user

48

Esposito, E. X., Tobi, D., and Madura, J. D., 2006, Reviews In Computational

Chemistry, Vol. 22, Chapter 2, Page: 57&133, JohnWiley&Sons, New

Jersey.

Frisch M. J., Trucks G. W., Schlegel H. B., Scuseria G. E., Robb M. A., et al.,

1995, Gaussian98 (Revision A.1), Gaussian, Inc., Pittsburgh PA.

Hadi, M dan Nurlaila, I., 2008, Pemodelan Nonlinier Reaksi Difusi Pertumbuhan

Kanker, Diakses 18 Oktober 2008 dari

http://www.nano.lipi.go.id/utama.cgi?cetakartikel&1203647897.

Hainaut P., Montesano R. , Wild C.P., 1997, Hepatocellular carcinoma:from gene

to public health, J Natl cancer Inst, Vol.9, No.2, 148-153

Humphrey, W., Dalke, A., and Schulten, K., 1996, VMD—Visual Molecular

Dynamics, J. Mol. Graphics 14, 33–38 (1996).

Joerger, A. C., Ang, H.C., and Fersht, A. R., 2006, Structural Basis for

Understanding Oncogenic p53 Mutantion and Designing Rescue Drugs,

Proc. Nat. Acad. Sci., 103: pp. 15056–15061.

Joerger, A. C., Allen, M.D., and Fersht, A. R., 2004, Crystal Structure of a

Superstable Mutant of Human p53 Core Domain, The Journal of

Biochemistry., 279: pp. 1291-1296.

Jorgensen, W. L., Chandrasekhar, J., Madura, J. D., Impey, R. W., and Klein, M.

L., 1983, Comparison of Simple Potential Functions for Simulating Liquid

Water, J. Chem. Phys., 79, 926-935.

Karjiban, R. A., Rahman, M. B. A., Basri, B., Salleh, A. B. Jacobs, D. et al., 2009,

Molecular Dynamics Study of the Structure, Flexibility and Dynamics of

Thermostable L1 Lipase at High Temperatures, Protein J. 28:14–23.

Kawata, M. and Nagashima, U., 2001, Particle Mesh Ewald Method For Three-

Dimensional Systems With Two-Dimensional Periodicity, Chemical

Physics Letters Volume 340, Issues 1-2.Pages: 165-172.

Keskin, O., Yuret, D., Gursoy, A., Turkay, M., and Erman, B., 2004,

Relationships Between Amino Acid Sequence and Backbone Torsion

Angle Preferences, Proteins 00:000–000.

http://www.nano.lipi.go.id/utama.cgi?cetakartikel&1203647897


commit to user

49

Klinsky A., Weib–Greiler P., Buchbauer G., et al., 2000, Ab Initio Molecular

Electrostatic Potential Grid Maps for Quantitative Similarity Calculations

of Organic Compounds, Journal of Molecular Modelling, Vol.6, 425-432.

Kumar, A. and Krishnaswamy, S., 2009, Structural Analysis of Outer Membrane

Beta-Stranded Porins Using B-factor, School of Biotechnology, Madurai

Kamaraj University, Madurai, Tamilnadu India: Poster.

Leach, A. R., 2001, Molecular Modelling, Principles and Applications, Chapter 6

and 7, Prentice-Hall, USA, pp. : 303, 307, 353, 367.

MathWorks, Inc., 2004, Natick, Massachusetts, USA.

Molinelli, A., 2004, Molecularly Imprinted Polymers : Towards a Rational

Understanding of Biomimetic Materials, Georgia Institute of Technology,

Georgia.

Morris, G. M., Goodsell, D.S., Huey, R., 1998, Automated Docking Using a

Lamarckian Genetic Algorithm and an Empirical Binding Free Energy

Function, Journal of Computational Chemistry, Vol. 19, No. 14, 1639-

1662.

Murray, R. K., Granner, D. K., Mayes, P. A., and Rodwell, V. W., 1998, Harpers

Biochemistry, 62: 779-800, Prentice-Hall International, USA.

Pettersen, E. F., Goddard, T. D., Huang, C. C., Couch, G. S., Greenblatt, D. M., et

al., 2004, UCSF Chimera - A Visualization Sistem for Exploratory

Research and Analysis., J. Comput. Chem., 25: pp. 1605–12.

Pikkemaat M.G., Linssen A.B.M., Berendsen H.J.C., et al., 2002, Molecular

dynamics simulations as a tool for improving protein stability, oxford

journals, Vol.15, No.3, p185-192

Sofyan, R., 2002, Terapi Kanker pada Tingkat Molekuler, Cermin Dunia

Kedokteran, 127: pp 5-10, Pusat Penelitian dan Pengembangan Teknologi

Nuklir Batan, Jakarta.

Syaifudin M., 2007, Gen Penekan Tumor p53, kanker, dan radiasi pengion,

Buletin Alara, Vol. 8, No.3, 119-128

Vousden, K.H. and Lu, X., 2002, Nat Rev Cancer,Vol.2, No.8, 594-604


commit to user

50

Warsino, 2008, Interaksi Spesifik PRIMA-1 dengan p53 Untuk Kemoterapi

Kanker Melalui Reaktivasi p53 Termutasi, Jurusan Kimia Universitas

Sebelas Maret Surakarta, Surakarta: Skripsi.

Wibowo, F. R., 2005, Indirect Readout Mechanism is Conducted by DNA

Hydration and DNA Backbone Conformations. Leopold-Franzens-

University of Innsbruck, Austria: Dissertation.

Wright, J. D. and Lim, C., 2007, Mechanism of DNA–Binding Loss Upon Single-

Point Mutation in p53, J. Biosci., 32(5): 827–839.


commit to user

51

LAMPIRAN-LAMPIRAN

Lampiran 1. Gambaran Sistem Secara Umum pada Saat Penentuan Koordinat

Awal, Minimisasi, Equilibrasi, dan Simulasi.

Gambar 29. Gambar keadaan sistem secara umum pada saat penentuan koordinat

awal, minimisasi, equilibrasi, dan simulasi. A, B, C, dan D berturut-

turut adalah keadaan sistem pada saat awal, setelah disimulasi,

setelah diequilibrasi, dan setelah simulasi berjalan. Warna hitam

adalah sistem yaitu protein p53 dan warna biru adalah molekul air.

A

C

B

D


commit to user

52

Lampiran 2. Densitas, Volume, Energi Total, dan Temperatur Sistem Selama

Proses 500 ps Equilibrasi dan 7000 ps Simulasi.

Gambar 30. Densitas, volume, energi total, dan temperatur sistem selama proses

500 ps equilibrasi dan 7000 ps simulasi. Dari atas ke bawah masing-

masing adalah grafik densitas, volume, energi total, dan temperatur

sistem saat equilibrasi (A) dan simulasi (B). Grafik berwarna hitam,

merah, hijau, dan kuning berturut-turut adalah wt-p53, QMT_1,

QMT_2, dan wt-p53 yang berinteraksi dengan PRIMA-1.

A B


commit to user

53

Lampiran 3. Glosarium

Alur Difusi Temporal

AMBER

Apoptosis

B-factor

CHARMM

Checkpoint

Counterion

Error Autodock

Folding

Force Field

Gen suppressor tumor

GROMOS

Helix

Hotspot

Immediate predecessor

Loop

NAMD

Onkogen

:

:

:

:

:

:

:

:

:

:

:

:

:

:

:

:

:

Gerakan berpindah suatu zat dari bagian yang

berkonsentrasi tinggi ke bagian berkonsentrasi

rendah pada waktu tertentu.

Assisted Model Building with Energy Refinement

Mekanisme biologi yang merupakan salah satu

jenis kematian sel terprogram untuk membuang sel

yang sudah tidak diperlukan oleh tubuh.

Ukuran termal dari ketidaktentuan (luasan densitas

elektron) untuk struktur sebagai factor fluktuasi

suatu molekul.

Chemistry at HARvard Macromolecular Mechanics

Titik pengontrolan yang kritis dimana sinyal

berhenti dan sinyal terus dapat mengatur siklus.

Ion pusat yang menahan molekul.

Referensi kesalahan pada program autodock.

Pelipatan protein.

Medan gaya di sekitar molekul yang menjaga

molekul tersebut pada posisi tertentu.

Gen penekan tumor

Grӧningen Molecular Simulation

Struktur tiga dimensi lokal dari berbagai pada

protein yang distabilkan oleh ikatan hidrogen

berupa pilinan rantai asam amino berbentuk seperti

spiral.

Residu asam amino yang sering mengalami mutasi.

Konfigurasi sebelumnya.

Struktur protein yang terbentuk dari deret lurus

beberapa residu asam amino.

NAnoscale Molecular Dynamics

Gen yang termodifikasi sehingga meningkatkan


commit to user

54

Protein p53

Protoonkogen

Quadruple Mutan

Reaktivasi

Root Mean Square

Deviation

Sheet

Topologi

Tinker

Transisi Allosteric

Wild Type p53

Β-sandwich

:

:

:

:

:

:

:

:

:

:

keganasan sel tumor.

Phosphoprotein dengan berat molekul 53 KDa yang

berperan menjaga sel dari mutasi genetik akibat

kerusakan DNA.

Gen normal yang dapat menjadi onkogen bila

mengalami mutasi.

Protein p53 yang mengalami mutasi pada empat

residu asam amino pada motif yang dipertahankan.

Pengaktifan kembali mutan p53 menjadi p53

normal.

Pergesaran posisi rata-rata molekul tiap waktu

terhadap posisi sebelumnya.

Struktur tiga dimensi lokal dari berbagai pada

protein yang distabilkan oleh ikatan hidrogen atau

tiol berupa lembaran-lembaran lebar.

Peta semua partikel dalam ruang simulasi.

Program pemodelan molekul untuk dinamika

molekuler dan mekanika molekuler dengan

beberapa fitur khusus biopolimer.

Perubahan struktur dan fungsi protein.

P53 normal yang tidak mengalami mutasi.

Struktur protein yang dibentuk dari sheet anti

parallel sehingga menyerupai sandwich.

STABILITAS KONFORMASI QUADRUPLE MUTAN p53 …... · memberikan akses bagi penulis melakukan...

Documents

Transcript of STABILITAS KONFORMASI QUADRUPLE MUTAN p53 …... · memberikan akses bagi penulis melakukan...