A. Spektrofotometer UV-Vis dan Kegunaan Dalam Bidang Mikrobiologi

Spektrofotometri

Spektrofotometri adalah ilmu yang mempelajari tentang penggunaan

spektrofotometer. Spektriofotometer adalah alat yang terdiri dari spektrofotometer dan

fotometer. Spektofotometer adalah alat yang digunakan untuk mengukur energi secara

relative jika energi tersebut ditransmisikan, direfleksikan, atau diemisikan sebagai fungsi dari

panjang gelombang. Spektrofotometer menghasilkan sinar dari spectrum dengan panjang

gelombang tertentu, dan fotometer adalah alat pengukur intensitas cahaya yang

ditransmisikan atau yang diabsorpsi.

     Spektrofotometer sesuai dengan namanya adalah alat yang terdiri dari

spektrometer dan fotometer. Spektrometer menghasilkan sinar dari spektrum dengan panjang

gelombang tertentu dan fotometer adalah alat pengukur intensitas cahaya yang ditransmisikan

atau yang diabsorpsi. Jadi spektrofotometer digunakan untuk mengukur energi secara relatif

jika energi tersebut ditransmisikan, direfleksikan atau diemisikan sebagai fungsi dari panjang

gelombang. Kelebihan spektrofotometer dibandingkan fotometer adalah panjang gelombang

dari sinar putih lebih dapat terseleksi dan ini diperoleh dengan alat pengurai seperti prisma,

grating ataupun celah optis. Pada fotometer filter, sinar dengan panjang gelombang yang

diinginkan diperoleh dengan berbagai filter dari berbagai warna yang mempunyai spesifikasi

melewatkan trayek panjang gelombang tertentu. Pada fotometer filter, tidak mungkin

diperoleh panjang gelombang yang benar-benar monokromatis, melainkan suatu trayek

panjang gelombang 30-40 nm. Sedangkan pada spektrofotometer, panjang gelombang yang

benar-benar terseleksi dapat diperoleh dengan bantuan alat pengurai cahaya seperti prisma.

Suatu spektrofotometer tersusun dari sumber spektrum tampak yang kontinyu,

monokromator, sel pengabsorpsi untuk larutan sampel atau blangko dan suatu alat untuk

mengukur perbedaan absorpsi antara sampel dan blangko ataupun pembanding (Khopkar

SM,1990).

Mikrobiologi Dan Virologi 1

Spektrofotometer UV-Vis

Spektrofotometri UV-Vis adalah anggota teknik analisis spektroskopik yang memakai

sumber REM (radiasi elektromagnetik) ultraviolet dekat (190-380 nm) dan sinar tampak

(380-780 nm) dengan memakai instrumen spektrofotometer. Spektrofotometri UV-Vis

melibatkan energi elektronik yang cukup besar pada molekul yang dianalisis, sehingga

spektrofotometri UV-Vis lebih banyak dipakai untuk analisis kuantitatif dibandingkan

kualitatif.

Spektroskopi UV/VIS merupakan metode penting yang mapan, andal dan akurat.

Dengan menggunakan spektroskopi UV/VIS, substansi tak dikenal dapat diidentifikasi dan

konsentrasi substansi yang dikenal dapat ditentukan. Pelarut untuk spektroskopi UV harus

memiliki sifat pelarut yang baik dan memancarkan sinar UV dalam rentang UV yang luas.

Spektrofotometer Uv-Vis adalah alat yang digunakan untuk mengukur transmitansi,

reflektansi dan absorbsi dari cuplikan sebagai fungsi dari panjang gelombang.

Spektrofotometer sesuai dengan namanya merupakan alat yang terdiri dari spektrometer dan

fotometer. Spektrometer menghasilkan sinar dari spektrum dengan panjang gelombang

tertentu dan fotometer adalah alat pengukur intensitas cahaya yang ditransmisikan atau yang

diabsorbsi. Jadi spektrofotometer digunakan untuk mengukur energi cahaya secara relatif jika

energi tersebut ditransmisikan, direfleksikan atau diemisikan sebagai fungsi dari panjang

gelombang. Suatu spektrofotometer tersusun dari sumber spektrum sinar tampak yang

sinambung dan monokromatis. Sel pengabsorbsi untuk mengukur perbedaan absorbsi antara

cuplikan dengan blanko ataupun pembanding.

Mikrobiologi Dan Virologi 2

Spektrofotometer Uv-Vis merupakan spektrofotometer yang digunakan untuk

pengukuran didaerah ultra violet dan didaerah tampak. Semua metode spektrofotometri

berdasarkan pada serapan sinar oleh senyawa yang ditentukan, sinar yang digunakan adalah

sinar yang semonokromatis mungkin.

Spektrofotometer UV-Vis (Ultra Violet-Visible) adalah salah satu dari sekian banyak

instrumen yang biasa digunakan dalam menganalisa suatu senyawa kimia. Spektrofotometer

umum digunakan karena kemampuannya dalam menganalisa begitu banyak senyawa kimia

serta kepraktisannya dalam hal preparasi sampel apabila dibandingkan dengan beberapa

metode analisa.

Spektrofotometri UV/Vis melibatkan energi elektronik yang cukup besar pada

molekul yang dianalisis, sehingga spetrofotometer UV/Vis lebih banyak dpakai ntuk analisis

kuantitatif dibanding kualitatif.

Spektrofotometri UV-vis adalah pengukuran serapan cahaya di daerah ultraviolet

(200–350 nm) dan sinar tampak (350 – 800 nm) oleh suatu senyawa. Serapan cahaya uv atau

cahaya tampak mengakibatkan transisi elektronik, yaitu promosi elektron-elektron dari orbital

keadaan dasar yang berenergi rendah ke orbital keadaan tereksitasi berenergi lebih tinggi.

Absorbsi

Absorbsi cahaya UV-Vis mengakibatkan transisi elektronik, yaitu promosi electron-

electron dari orbital keadaan dasar yang berenergi rendah ke orbital keadaan tereksitasi

berenergi lebih tinggi. Energi yang terserap kemudian terbuang sebagai cahaya atau

tersalurkan dalam reaksi kimia. Absorbsi cahaya tampak dan radiasi ultraviolet meningkatkan

energi elektronik sebuah molekul, artinya energi yang disumbangkan oleh foton-foton

memungkinkan electron-electron itu mengatasi kekangan inti dan pindah ke luar ke orbital

baru yag lebih tinggi energinya. Semua molekul dapat menyerap radiasi dalam daerah UV-

tampak karena mereka mengandung electron, baik sekutu maupun menyendiri, yang dapat

dieksitasi ke tingkat energi yang lebih tinggi.

Absorbsi untuk transisi electron seharusnya tampak pada panjang gelombang diskrit

sebagai suatu spectrum garis atau peak tajam namun ternyata berbeda. Spektrum UV maupun

tampak terdiri dari pita absorbsi, lebar pada daerah panjang gelombang yang lebar. Ini

disebabkan terbaginya keadaan dasar dan keadaan eksitasi sebuah molekul dalam subtingkat-

subtingkat rotasi dan vibrasi. Transisi elektronik dapat terjadi dari subtingkat apa saja dari

keadaan dasar ke subtingkat apa saja dari keadaan eksitasi. Karena berbagi transisi ini

Mikrobiologi Dan Virologi 3

berbeda energi sedikit sekali, maka panjang gelombang absorpsinya juga berbeda sedikit dan

menimbulkan pita lebar yang tampak dalam spectrum itu.

Absorptivitas (a) merupakan suatu konstanta yang tidak tergantung pada konsentrasi,

tebal kuvet dan intensitas radiasi yang mengenai larutan sampel. Absorptivitas tergantung

pada suhu, pelarut, struktur molekul, dan panjang gelombang radiasi. Satuan a ditentukan

oleh satuan-satuan b dan c. Jika satuan c dalam molar (M) maka absorptivitas disebut dengan

absorptivitas molar dan disimbolkan dengan ε dengan satuan M  -1cm-1 atau liter.mol-1cm-1.

Jika c dinyatakan dalam persen berat/volume (g/100mL) maka absorptivitas dapat ditulis

dengan E1%1cmA1%

1cm (Gandjar dan Rohman, 2007).

Cara kerja spektrofotometer

Cara kerja spektrofotometer secara singkat adalah sebagai berikut. Tempatkan larutan

pembanding, misalnya blangko dalam sel pertama sedangkan larutan yang akan dianalisis

pada sel kedua. Kemudian pilih foto sel yang cocok 200nm-650nm (650nm-1100nm) agar

daerah λ yang diperlukan dapat terliputi. Dengan ruang foto sel dalam keadaan tertutup “nol”

galvanometer didapat dengan menggunakan tombol dark-current. Pilih h yang diinginkan,

buka fotosel dan lewatkan berkas cahaya pada blangko dan “nol” galvanometer didapat

dengan memutar tombol sensitivitas. Dengan menggunakan tombol transmitansi, kemudian

atur besarnya pada 100%. Lewatkan berkas cahaya pada larutan sampel yang akan dianalisis.

Skala absorbansi menunjukkan absorbansi larutan sampel.

Keuntungan Spektrofotometer

 Keuntungan dari spektrofotometer adalah yang pertama penggunaannya luas, dapat

digunakan untuk senyawa anorganik, organik dan biokimia yang diabsorpsi di daerah ultra

lembayung atau daerah tampak. Kedua sensitivitasnya tinggi, batas deteksi untuk

mengabsorpsi pada jarak 10-4 sampai 10-5 M. Jarak ini dapat diperpanjang menjadi 10-6

sampai 10-7 M dengan prosedur modifikasi yang pasti. Ketiga selektivitasnya sedang sampai

tinggi, jika panjang gelombang dapat ditemukan dimana analit mengabsorpsi sendiri,

persiapan pemisahan menjadi tidak perlu. Keempat, ketelitiannya baik, kesalahan relatif pada

konsentrasi yang ditemui dengan tipe spektrofotometer UV-Vis ada pada jarak dari 1%

sampai 5%. Kesalahan tersebut dapat diperkecil hingga beberapa puluh persen dengan

perlakuan yang khusus. Dan yang terakhir mudah, spektrofotometer mengukur dengan mudah

dan kinerjanya cepat dengan instrumen modern, daerah pembacaannya otomatis (Skoog, DA,

1996).

Mikrobiologi Dan Virologi 4

Komponen-komponen Pada spektrofotometer

Yang pertama adalah sumber cahaya, Sebagai sumber cahaya pada spektrofotometer,

haruslah memiliki pancaran radiasi yang stabil dan intensitasnya tinggi.Sumber energi cahaya

yang biasa untuk daerah tampak, ultraviolet dekat, dan inframerah dekat adalah sebuah lampu

pijar dengan kawat rambut terbuat dari wolfram (tungsten). Lampu ini mirip dengan bola

lampu pijar biasa, daerah panjanggelombang ( λ) adalah 350 – 2200 nanometer (nm). sumber

cahaya ini digunakan untuk radiasi kontinyu:

·         Untuk

daerah UV

dan daerah

tampak

·         Lampu

wolfram

(lampu

pijar)

menghasilkan

Tabel 4.

Spektrum

Tampak

dan Warna-warna Komplementer

Mikrobiologi Dan Virologi 5

Warna Intervalλ Intervalν

Red 625 to 740 nm 480 to 405 THz

Orange 590 to 625 nm 510 to 480 THz

Yellow 565 to 590 nm 530 to 510 THz

Green 520 to 565 nm 580 to 530 THz

Cyan 500 to 520 nm 600 to 580 THz

Blue 430 to 500 nm 700 to 600 THz

Violet 380 to 430 nm 790 to 700 THz

Panjang gelombang

(nm)

Warna Warna

Komplementer

400 – 435 Lembayung (violet) Kuning-hijau

435 – 480 Biru Kuning

480 – 490 Hijau-biru Jingga

490 – 500 Biru-hijau Merah

500 – 560 Hijau Ungu (purple)

560 – 580 Kuning-hijau Lembayung (violet)

580 – 595 Kuning Biru

595 – 610 Jingga Hijau-biru

610 – 750 Merah Biru-hijau

Tabel 5. Spektrum cahaya tampak

Hal kedua yang diperlukan adalah pembaur cahaya yang kerennya disebut

monokromator yang di video memberikan sinar pelangi, karena dari sana lah kemudian kita

bisa memilih panjang gelombang yang diinginka/diperlukan. Pada video yang diperlihatkan

sinar tampak atau untuk spektro visible, tapi untuk UV pun kerjanya sama, hanya saja tidak

akan terlihat oleh mata kita.

Hal ketiga adalah tempat sampel atau kuvet, pada praktikum tempat meletakan kuvet

ada dua karena alat yang dipakai tipe double beam, disanalah kita menyimpan sample dan

yang satu lagi untuk blanko. Pada pengukuran di daerah sinar tampak digunakan kuvet kaca

dan daerah UV digunakan kuvet kuarsa serta kristal garam untuk daerah IR.

Keempat adalah detektor atau pembaca cahaya yang diteruskan oleh sampel, disini

terjadi pengubahan data sinar menjadi angka yang akan ditampilkan pada reader (komputer).

Komponen lain yang nampak penting adalah cermin-cermin dan tentunya slit (celah kecil)

untuk membuat sinar terfokus dan tidak membaur tentunya, jadi satu hal penting dalam

pekerjaan dengan spektrofotometer Uv-Vis adalah harus dihindari adanya cahaya yang masuk

ke dalam alat, biasanya pada saat menutup tenpat kuvet, karena bila ada cahaya lain otomatis

jumlah cahaya yang diukur menjadi bertambah.

Tipe Instrumen Spektrofotometer

Pada umumnya terdapat dua tipe instrumen spektrofotometer, yaitu single-beam dan

double-beam. gambar Single-beam instrument dan Double-beam instrument

1.   Single-beam instrument

Mikrobiologi Dan Virologi 6

Single-beam instrument dapat digunakan untuk kuantitatif dengan mengukur

absorbansi pada panjang gelombang tunggal. Single-beam instrument mempunyai beberapa

keuntungan yaitu sederhana, harganya murah, dan mengurangi biaya yang ada merupakan

keuntungan yang nyata. Beberapa instrumen menghasilkan single-beam instrument untuk

pengukuran sinar ultra violet dan sinar tampak. Panjang gelombang paling rendah adalah 190

sampai 210 nm dan paling tinggi adalah 800 sampai 1000 nm (Skoog, DA, 1996).

2.   Double-beam instrument

Double-beam dibuat untuk digunakan pada panjang gelombang 190 sampai 750 nm.

Double-beam instrument dimana mempunyai dua sinar yang dibentuk oleh potongan cermin

yang berbentuk V yang disebut pemecah sinar. Sinar pertama melewati larutan blangko dan

sinar kedua secara serentak melewati sampel, mencocokkan foto detektor yang keluar

menjelaskan perbandingan yang ditetapkan secara elektronik dan ditunjukkan oleh alat

pembaca (Skoog, DA, 1996)

B. Blanko Yang Digunakan Dalam Dilusi

Dalam pengamatan dilusi, blanko yang digunakan adalah medium cair atau bahan

yang mana bahan nanti itulah yang dijadikan sebaagai perbandingannya.

Blanko disini merupakan perbandingan suatu sampel satu dengan sampel yang satu

lagi. Dalam praktikum yang digunakan adalah suspensi dari bahan medium cair yaitu nutrient

broth (blanko). Yang mana nutrient broth ini akan dibandingkan dengan suspensi bakteri uji

(Escherichia coli).

Dalam praktikum uji daya kerja antimikroba dengan metode dilusi, ada beberapa cara

kerja dalam menentukan blanko tersebut, diantaranya yaitu:

1. Ambil 3 ml media nutrient broth (NB) menggunakan pipet dan masukkan kedalam

tabung reaksi yang telah diberi tanda konsentrasi antibiotic (yang mana NB ini

sebagai blanko atau sebagai perbandingan nanti)

2. Setelah melakukan proses media NB kemudian diinkubasi pada suhu 37 oC selama 24

jam

3. Ada atau tidak adanya pertumbuhan bakteri diamati yang ditandai dengan terjadinya

kekeruhan diukur dengan menggunakan spectroskopi UV pada panjang gelombang

maksimum 580 nm. Catat transmitan yang dihasilkan dan dihitung KHM (konsentrasi

hambat minimum).

4. Hasil pengamatan dicatat pada lembar kerja.

Mikrobiologi Dan Virologi 7

Dapat disimpulkan bahwa pada hasil pengamatan blanko (dibandingkan) dengan suspensi

(Escherichia coli) dan medium cair nutrient broth (NB) tersebut.

Mikrobiologi Dan Virologi 8