i

KEMAMPUAN PERKEMBANGAN EMBRIO SAPI BALI HASIL

KRIOPRESERVASI DENGAN PENGGUNAAN

KRIOPROTEKTAN ETILEN GLIKOL

ASRI PUSFITA

I111 13 060

FAKULTAS PETERNAKAN

UNIVERSITAS HASANUDDIN

MAKASSAR

2017

SKRIPSI

ii

KEMAMPUAN PERKEMBANGAN EMBRIO SAPI BALI HASIL

KRIOPRESERVASI DENGAN PENGGUNAAN

KRIOPROTEKTAN ETILEN GLIKOL

ASRI PUSFITA

I111 13 060

Sebagai Salah Satu Syarat untuk Memperoleh Gelar Sarjana

pada Fakultas Peternakan Universitas Hasanuddin

FAKULTAS PETERNAKAN

UNIVERSITAS HASANUDDIN

MAKASSAR

2017

SKRIPSI

iii

PERNYATAAN KEASLIAN

1. Yang bertanda tangan dibawah ini:

Nama : Asri Pusfita

NIM : I111 13 060

Menyatakan dengan sebenarnya bahwa:

a. Karya skripsi yang saya tulis adalah asli

b. Apabila sebagian atau seluruhnya dari karya skripsi, terutama dalam Bab

Hasil dan Pembahasan tidak asli atau plagiasi maka bersedia dibatalkan

dikarenakan sanksi akademik yang berlaku

2. Demikian pernyataan keaslian ini dibuat untuk dapat dipergunakan sepenuhnya.

Makassar. Agustus 2017

TTD

Asri Pusfita

iv

HALAMAN PENGESAHAN

Judul Penelitian : Kemampuan Perkembangan Embrio Sapi Bali Hasil

Kriopreservasi dengan Penggunaan Krioprotektan

Etilen Glikol

Nama : Asri Pusfita

No. Pokok : I11113 060

Program Studi : Peternakan

Fakultas : Peternakan

Skripsi ini telah diperiksa dan disetujui oleh :

Pembimbing Utama

Prof. Dr. Ir. Herry Sonjaya DEA. DES

NIP. 19570129 198003 1 001

Dekan Fakultas Peternakan

Prof. Dr. Ir. H. Sudirman Baco, M.Sc

NIP. 19641231 198903 1 025

Pembimbing Anggota

Prof. Dr. Ir. Ambo Ako, M.Sc

NIP. 196412311989031026

Ketua Program Studi Peternakan

Prof. Dr. drh. Hj. Ratmawati Malaka, M.Sc.

NIP. 19640712198911 2 002

Tanggal Lulus: 2017

v

ABSTRAK

ASRI PUSFITA (I111 13 060). Kemampuan Perkembangan Embrio Sapi Bali

Hasil Kriopreservasi dengan Penggunaan Krioprotektan Etilen Glikol. Dibawah

bimbingan HERRY SONJAYA sebagai pembimbing utama dan AMBO AKO

sebagai pembimbing anggota.

Selama proses pembekuan embrio terjadi cekaman dingin yang dapat

menyebabkan terjadinya kerusakan sel embryo dan dampaknya menyebabkan

embrio mati. Oleh karena itu penelitian ini bertujuan untuk mengetahui pengaruh

penggunaan krioprotektan Etilen Glikol selama pembekuan terhadap tingkat

pemulihan setelah kriopreservasi dan perkembangan embrio sapi Bali setelah

kultur kembali. Prosedur penelitian dimulai dari pengambilan ovarium di RPH,

dilanjutkan dengan koleksi dan seleksi oosit. Oosit kemudian dimaturasi selama

24 jam, difertilisasi 5-6 jam, dan dikultur 48 jam. Setelah menjadi embrio

dilakukan kriopreservasi dengan Etilen Glikol selama 48 jam. Embrio beku

kemudian dithawing dan dikultur kembali selama 24 jam untuk melihat viabilitas.

Penelitian ini menggunakan Rancangan Acak lengkap (RAL) dengan 4 perlakuan

yaitu penambahan krioprotektan Etilen Glikol 0%, 10%, 20%, dan 30% dengan 4

kali ulangan. Hasil penelitian menunjukkan bahwa perlakuan Etilen Glikol

berpengaruh sangat nyata terhadap tingkat pemulihan dan perkembangan embrio

setelah kultur kembali. Tingkat pemulihan embrio setelah kriopreservasi dan

jumlah embrio hidup setelah kultur kembali (viabilitas) sangat nyata lebih rendah

pada kontrol dibanding yang diberi perlakuan Etilen Glikol. Namun ketiga

perlakuan menghasilkan hasil yang sama. Dapat disimpulkan bahwa Etilen Glikol

dapat mencegah kerusakan embrio setelah kriopreservasi.

Kata Kunci: Embrio Sapi Bali, Etilen Gikol, Recovery, viabilitas

.

vi

ABSTRACT

ASRI PUSFITA (I111 13 060) The ability of Embryo Development of Bali cows

Cryopreserved using Ethylene Glycol as Cryprotectant. Guided by HERRY SONJAYA

as the primary supervisor and AMBO AKO as supervisor members.

During the process of freezing the embryo occurs cold stress that can cause

damage to embryo cells and its impact causes the embryo to die. There fore, this study

aimed to determine the effect of ethylene glycol cryoprotectant during the freezing on

recovery rate after cryopreservation and the embryo development of Bali Cow’s after re-

culture. Procedure of this study started from, collection of ovarian from slaughtered

house, continued with the collected and selected of the oocytes. Those oocytes were

maturated for 24 hours, fertilized 5-6 hours, and cultured 48 hours. The embryos were

cryopreserved using ethylene glycol for 48 hours. Freezed embryos were thawed and re-

cultured for 24 hours to determine their viability. This study was designed using

Completely Randomized Design (CRD) with four treatments addition of Ethylene Glycol

of 0%, 10%, 20%, and 30% with four replication. The results of this study slowed that

treatment of Ethylene Glycol had significant effect on recovery and development of

embryos after cultured. Recovery rate of the embryos after cryopreservation and the

number of embryos life (viability) after re-cultured had significantly lower in control

group in comparison to those embryos treated with Ethylene Glycol, however the last

three treated groups resulted in similar viabilities. It can be concluded that Ethylene

Glycol could prevent embryo damage after cryopreservation.

Key words: Embryo of Bali Cows, Ethylene Glycol, Recovery rate, Viability

vii

KATA PENGANTAR

Bismillahirahmanirahim…..

Assalamualaikum warahmatullahi wabarakatuh

Puji syukur kita panjatkan kehadirat Allah SWT, karena rahmat dan

hidayah-Nya sehingga Tugas Akhir/Skripsi ini dapat diselesaikan dengan tepat

waktu. Skripsi dengan judul “Kemampuan Perkembangan Embrio Sapi Bali Hasil

Kriopreservasi dengan Penggunaan Krioprotektan Etilen Glikol” Sebagai Salah

Satu Syarat untuk memperoleh Gelar Sarjana pada Fakultas Peternakan

Universitas Hasanuddin, Makassar.

Ucapan terima kasih dan penghargaan setinggi-tingginya penulis

hanturkan dengan rasa hormat kepada:

1. Prof. Dr. Ir. H. Herry Sonjaya DEA. DES selaku Pembimbing Utama, dan

Prof. Dr. Ir. Ambo Ako, M.Sc selaku Pembimbing Anggota, atas segala

bantuan dan keikhlasannya untuk memberikan bimbingan, nasehat dan

saran-saran sejak awal penelitian sampai selesainya skripsi ini.

2. Secara khusus penulis mengucapkan terima kasih yang sebesar-besarnya

dengan segenap cinta dan hormat kepada ayahanda Misrianto dan ibunda

Sukini atas segala doa, motivasi dan kasih sayang serta materi yang

diberikan kepada penulis dan saudara-saudara saya Suhariadi, ST, Tri

Hengki SulakSono, Indra Sarwanto, dan Dirga Budi Setiawan yang

senantiasa membantu, memberi candatawa dan memberikan motivasi untuk

selalu lebih semangat.

3. Prof. Dr. Ir. H. Sudirman Baco, M.Sc., Prof. Dr. Ir. Rr. Sri Rachma A.

viii

Bugiwati, M.Sc., dan Dr. Muh. Ihsan A. Dagong, S.Pt, M.Si selaku dosen

pembahas yang telah memberikan saran-saran dan masukan untuk

perbaikan skripsi ini.

4. Dr. Aslina Asnawi, S.Pt. M.Si selaku Penasehat Akademik yang telah

memberikan bantuan dan motivasi kepada penulis.

5. Prof. Dr. Ir. H. Sudirman Baco, M.Sc selaku Dekan Fakultas Peternakan

dan seluruh Staf Pengawai Fakultas Peternakan, terima kasih atas segala

bantuan kepada penulis selama menjadi mahasiswa.

6. Prof. Dr. drh. Hj. Ratmawati Malaka, M.Sc selaku Ketua Program Studi

Peternakan, terima kasih atas segala bantuan kepada penulis

7. Dr. Hasbi, S.Pt. M.Si selaku pembimbing Laboratorium penulis

melaksanakan penelitian.

8. Semua dosen-dosen Fakultas Peternakan Universitas Hasanuddin yang

telah memberikan ilmunya kepada penulis.

9. Sahabat-sahabat “PETERNAKAN B” hayu Fitryani, Hilma Utami Putri,

Andi Musdalifa Bakri, Hamdana Darsan, Arda Runita, Syahidah, Nursanti,

Saharia, Nurhikmawati, Nita Kurnia Puti, Asri Puspita, Andi Irma Eka

Lestari, Khasrima Mulya Utari, Sari Putri, Abeng Daisuri, Ummy Kalsum,

Nurhasnah, Tri Wahyuni, Indah Sari Nur Utami, Nabila Chaerunnisa,

Ahmad syakir, Dwi Suprapto, Abd. Rahman, Insan Putra Pratama, Wahyu,

Gede Suamba, Aprianto Mandala Putra, Fulki Alen, Muhammad

Nurhidayat, Misbahuddin, Muh. Kasim, Ardianto, Sofyan Basri, Jamal

Heri, Haidil Kunang, Amir Mirzad terima kasih yang setinggi-tingginya

serta penghargaan yang sebesar-besarnya atas segala cinta, pengorbanan,

ix

bantuan, pengertian, candatawa serta kebersamaan selama ini, waktu yang

dilalui sungguh merupakan pengalaman hidup yang berharga dan tak

mungkin untuk terlupakan dan terima kasih telah memberiku sedikit tempat

dihatimu untuk menjadikanku sahabat dan teriring dengan doa semoga

rekan dan sahabatku sukses selalu.

10. Yaumul Firman, SP., Besse Gusna, S,Pt., Ulvianti Diansari, SH., Siti

Rahmini, Nursanti, Siti Nur Arni, dan Nurhasanah, terima kasih atas

motivasi dan segala kebaikan serta bantuan yang kalian berikan kepada

penulis.

11. Kepada sahabat ”TEAM PKL” Andi Nurul Airin Arif, Arda Runita, dan

Sari Putri, terima kasih atas kerja samanya, segala kebaikan serta bantuan

yang kalian barikan kepada penulis selama penelitian.

12. Kepada sahabat “ TEAM PENELITIAN” Dewi Sartika, Hilma Utami Putri,

Hikmayani Iskandar, Andi Nurul airin Arif, Nawawi, dan M. Nasrullah,

terima kasih atas segala kebaikan serta bantuan yang kalian berikan kepada

penulis selama penelitian.

13. Sahabat-Sahabat “HIMAJATI-MAKASSAR’’ terima kasih atas motivasi

dan candatawa selama penulis menjadi anggota HIMAJATI.

14. Teman-teman HIMAPROTEK UH, terima kasih atas ilmu, pembelajaran,

nasehat-nasehat kebersamaan, kebaikan, amanah yang kalian berikan

selama penulis berorganisasi.

15. Terima kasih sebesar-besarnya kepada Mama Caya, Dg, Sai, Aming dan

ibu Salma atas bantuannya kepada penulis.

16. Sahabat-sahabat teman seperjuangan, teman angkatan LARFA’13, terima

x

kasih atas motivasi dan segala kebaikan serta bantuan yang kalian berikan

kepada penulis.

17. Teman-teman “ KKN Desa Pattalasang” Nadia Anggraeni f, Ratih Sagita

W, A. Purwanti, Nurul Hidayah, Nurul Muhlisah, NurWalyana Sawal,

Fatun Munir, Saldi, Ismail, Rista, Elma Nabila, dan Nurul Riska dan teman-

teman sekecamatan Pattalasang Kabupaten Gowa.

28. Jajaran Pemerintahan Desa Pattalasang Kecamatan Pattalasang Kabupaten

Gowa, terima kasih telah memberi banyak bantuan penulis pada saat KKN.

21. Semua Pihak yang tidak dapat penulis sebut satu persatu, terima kasih

banyak atas segala bantuannya.

Penulis menyadari bahwa penyusunan skripsi ini masih terdapat

kekurangan dan kesalahan. Penulis mengharapkan kritikan dan saran yang bersifat

membangun demi kesempurnaan skripsi ini.

Makassar, Agustus 2017

Asri Pusfita

xi

DAFTAR ISI

HALAMAN SAMPUL ................................................................................. i

HALAMAN JUDUL .................................................................................... ii

PERNYATAAN KEASLIAN ...................................................................... iii

HALAMAN PENGESAHAN ...................................................................... iv

ABSTRAK .................................................................................................... v

ABSTRACT .................................................................................................. vi

KATA PENGANTAR .................................................................................. vii

DAFTAR ISI ................................................................................................. xii

DAFTAR TABEL ........................................................................................ xiv

DAFTAR GAMBAR .................................................................................... xv

DAFTAR LAMPIRAN ................................................................................ xvi

PENDAHULUAN ......................................................................................... 1

TINJAUAN PUSTAKA

Folikulogenesis ....................................................................................... 3

Oogenesis ................................................................................................ 4

Spermatogenesis ..................................................................................... 6

Fertilisasi in Vitro ................................................................................... 8

Produksi Embrio in Vitro ........................................................................ 9

Kriopreservasi ......................................................................................... 11

Krioprotektan Etilen Glikol .................................................................... 13

METODE PENELITIAN

Waktu dan Tempat .................................................................................. 16

Materi Penelitian ..................................................................................... 16

Rancangan Penelitian .............................................................................. 16

Prosedur Penelitian ................................................................................. 17

Parameter yang Diamati .......................................................................... 20

Analisa Data ............................................................................................ 21

Halaman

xii

HASIL DAN PEMBAHASAN

Proses Maturasi Oosit Sampai Fertilisasi ..................................................... 22

Perkembangan Embrio Hasil Kriopreservasi dan Viabilitas Embrio...... 25

KESIMPULAN DAN SARAN

Kesimpulan ............................................................................................. 28

Saran ....................................................................................................... 28

DAFTAR PUSTAKA ................................................................................... 29

RIWAYAT HIDUP

xiii

DAFTAR TABEL

No. Teks

1. Total dan Persentase Oosit Sebelum dan sesudah maturasi, dan Total Produksi

Embrio pada kelompok Perlakuan .......................................................................... 24

2. Embrio yang Pulih setelah Kriopreservasi dengan Etilen Glikol dan Embrio

Hidup setelah Kultur kembali ................................................................................ 25

Halaman

xiv

DAFTAR GAMBAR

No. Teks Halaman

1. Proses Oogenesis ................................................................................... 5

2. Proses Spermatogenesis ........................................................................ 7

3. Diagram Alir Prosedur Penelitian ......................................................... 17

4. Proses Perubahan Oosit ......................................................................... 22

5. Perkembangan Embrio .......................................................................... 23

xv

DAFTAR LAMPIRAN

No. Teks

1. Komposisi Media Maturaso Oosit Secara In Vitro. ............................................... 33

2. Komposisi Media Fertilisasi Secara In Vitro. ........................................................ 33

3. Komposisi Media Kultur Secara In Vitro. ............................................................. 33

4. Data Jumlah Embrio Terhadap Kriopreservasi dengan Krioprotektan EG Secara

In Vitro ................................................................................................................ 35

5. Data Jumlah Embrio Terhadap Kriopreservasi dengan Krioprotektan EG Secara

In Vitro Hasil Transformasi Arcsin ............................................. 36

6. Analisis Ragam Recoverry Embrio In Vitro. ......................................................... 37

7. Analisis Ragam viabilitas Embrio In Vitro ............................................................ 38

8. Dokumentasi ......................................................................................................... 39

Halaman

1

PENDAHULUAN

Teknologi kriopreservasi gamet banyak dikembangkan pada berbagai spesies

hewan dan manusia. Teknik kriopreservasi gamet merupakan suatu cara untuk

menyimpan gamet dalam bentuk beku yang bertujuan untuk menyimpan,

pemeliharaan, menjamin dan mempertahankan kelangsungan hidup sel gamet

(Djuwita, 2001). Penggunaan teknik kriopreservasi gamet dapat juga digunakan juga

untuk penyimpanan embrio hasil fertilisasi in vitro serta kelebihan embrio hasil

produksi in vivo. Teknologi ini juga memungkinkan penyimpanan embrio dalam

jangka waktu yang relatif lama sehingga bisa dimanfaatkan dalam waktu kapan saja

dan dimana saja.

Beberapa faktor yang mempengaruhi daya hidup embrio beku diantaranya

teknik pembekuan, jenis pengencer, dan konsentrasi krioprotektan yang digunakan.

Embrio beku yang berkualitas tinggi, membutuhkan medium yang mampu

mempertahankan kualitas embrio selama proses pendinginan, pembekuan, maupun

saat thawing. Penggunaan bahan pengencer umumnya diikuti dengan penambahan

zat krioprotektan untuk melindungi embrio dari efek yang mematikan yaitu terjadinya

proses kristalisasi cairan baik intraseluler maupun extraseluler selama proses

pembekuan.

Krioprotektan dapat melindungi sel pada saat kriopreservasi embrio. Proses

kristalisasi pada masa pembekuan tergantung dari jenis dan konsentrasi krioprotektan

yang dipakai. Dari beberapa penelitian tentang kriopreservasi embrio, diketahui ada

bermacam-macam krioprotektan yang dapat dipergunakan untuk kriopreservasi

2

embrio, namun demikian telah diketahui bahwa etilen glikol (EG) merupakan

krioprotektan yang mudah didapatkan ditoko kimia dan harga untuk EG juga relative

murah. Menurut Gordon (1994), EG mempunyai efek toksik yang lebih rendah

dibandingkan krioprotektan yang lain. Kemampuan hidup post thawing dari embrio

yang dibekukan dapat menggunakan krioprotektan EG. Oleh karena itu, perlu

mengevaluasi akhir kriopreservasi dari EG pada embrio sapi Bali in vitro. Penelitian

ini dilakukan untuk mengetahui pengaruh penambahan Etilen Glikol sebagai

krioprotektan selama proses pembekuan dalam mempertahankan viabilitas embrio

sapi Bali.

Selama proses pembekuan embrio terjadi cekaman dingin yang dapat

menyebabkan terjadinya kristalisasi cairan intraseluler maupun extraseluler dan

dampaknya menyebabkan embrio mengkerut atau mati. Untuk mencegah proses

kristalisasi pada saat kriopreservasi diperlukan krioprotektan seperti EG sehingga

embrio bisa hidup kembali pada saat pencairan kembali. Informasi tentang

konsentrasi penambahan EG untuk pembekuan embrio sapi Bali sangat terbatas. Oleh

karena itu perlu penelitian pengaruh EG dalam mempertahankan daya hidup embrio

sapi Bali selama pembekuan.

Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengetahui pengaruh penggunaan

krioprotektan Etilen Glikol selama pembekuan terhadap tingkat pemulihan setelah

kriopreservasi dan perkembangan embrio sapi Bali setelah kultur kembali.

Kegunaan penelitian adalah sebagai salah satu sumber informasi sebagai data

awal bagi peneliti selanjutnya untuk pembekuan embrio sapi Bali.

3

TINJAUAN PUSTAKA

Folikulogenesis

Folikulogenesis adalah proses pematangan folikel pada korteks ovarium yang

tersusun dari sel somatik padat dan mengandung oosit imatur. Proses ini

menggambarkan perubahan dari folikel primordial kecil menjadi folikel preovulasi

besar. Peran utama pematangan folikel adalah untuk mendukung oogenesis yang pada

akhirnya menghasilkan oosit (Speroff et al., 2010). Sejak lahir, pada ovarium terdapat

sejumlah folikel primordial imatur yang mengandung oosit primer yang juga imatur.

Folikel primordial mengalami perubahan karakter histologis dan fisiologis dimana

akan terbentuk baik folikel tersier maupun folikel antral. Proses ini bergantung pada

berbagai jenis hormon yang menyebabkan kecepatan folikulogenesis dan oogenesis

yang berakhir adanya ovulasi atau sebaliknya atresia folikel.

Berdasarkan perubahan morfologisnya, folikel diklasifikasikan

dalam 3 kelompok yaitu folikel primer, folikel sekunder dan folikel tersier atau

Degraaf. Folikel primer terdiri dari oosit yang dikelilingi oleh selapis sel epitel

sedangkan sel teka belum terbentuk, sebagian besar folikel primer tersebut akan

mengalami regresi atau tetap tidak berkembang sama sekali. Lapisan sel-sel yang

mengelilingi folikel primer disebut stratum granulosum atau lapisan granulosa. Telur

berada pada satu sisi folikel dalam gundukan sel-sel granulosa yang disebut kumulus

oophorus dan lapisan sel granulose yang langsung menyelubungi sel telur disebut

korona radiata (Partodiharjo, 1980). Tingkat kedua adalah folikel sekunder yang

mengandung oosit dalam volume maksimal dan letaknya eksentrik atau agak ke

pinggir seperti pada folikel primer. Sel-sel granulose terdiri dari 6-12 lapis sel.Pada

4

folikel sekunder ovum sudah dilengkapi zona pelusida yang bergerak menuju korteks

(Yatim, 1994). Stadium terakhir adalah perkembangan folikel tersier, yang juga

disebut folikel de graaf. Sel-sel folikel yang melengkapi oogonia akan membentuk

antrum atau membentuk ruangan yang berisi cairan. Ruangan ini dikelilingi oleh sel-

sel yang disebut membran granulosa.

Pengelompokan folikel berdasarkan ukuran diameternya terbagi menjadi tiga

kelompok yaitu dilakukan oleh tiga kelompok folikel tersebut adalah folikel ukuran

kecil (2-3 mm), folikel ukuran sedang (3,1 – 5 mm), folikel ukuran besar (>5 mm)

(Crozet et al., 1995).

Oogenesis

Oogenesis adalah proses pembentukan sel telur (ovum) di dalam ovarium.

Oogenesis dimulai dengan pembentukan bakal sel-sel telur yang disebut oogonia.

Pertumbuhan oosit antara lain berupa peningkatan diameter oosit, pertambahan

ukuran dari organel-organel, dan disertai dengan perubahan atau perkembangan pada

inti dan sitoplasma (Telfer dan Sharpley, 2008).

Proses oogenesis Gambar 1 terdiri dari beberapa tahap yaitu oogonium

mengalami pembelahan mitosis berubah menjadi oosit primer. Oosit primer

melakukan meiosis (tahap I), yang menghasilkan dua sel anak yang ukurannya tidak

sama. Sel anak yang lebih besar adalah oosit sekunder yang bersifat haploid (n).

Ukurannya lebih besar dari yang lain karena berisi lebih banyak sitoplasma dari oosit

primer yang lain. Sel anak yang lebih kecil disebut badan kutub (polar body) pertama

yang kemudian membelah lagi (Sonjaya et al., 2016).

5

Gambar 1. Proses Oogenesis (Telfer dan Sharpley, 2008).

Setelah folikel matang maka folikel akan pecah dan oosit sekunder ditangkap

fimbrie lalu menuju ke tuba fallopi. Apabila oosit sekunder dibuahi oleh sel sperma

(fertilisasi), maka akan mengalami pembelahan meiosis yang kedua, begitu pula

dengan badan polar pertama membelah menjadi dua badan polar kedua yang akhirnya

mengalami degenerasi. Selama pembelahan meiosis kedua, oosit sekunder menjadi

bersifat haploid (n) dengan 30 kromosom dan selanjutnya disebut dengan oosit

(Campbell et al., 2000).

Perkembangan oosit terdiri dari tiga tahap yaitu proliferasi, pertumbuhan, dan

pematangan. Pada tahap proliferasi terjadi proses mitosis oogonium menjadi beberapa

oogonia yang terjadi pada saat pralahir atau sesaat setelah lahir kemudian oogonia

berdiferensiasi menjadi oosit primer. Inti oosit pada tahap ini disebut Germinal

Vesicle (GV) yang ditandai dengan adanya membran inti yang utuh dan nucleus yang

6

jelas. Selanjutnya oosit akan memasuki tahap pertumbuhan dan pematangan yang

berlangsung bersamaan dengan proses perkembangan folikel (Campbell et al., 2000).

Pada sapi proses maturasi inti secara in vivo membutuhkan waktu selama ± 24

jam (Gordon, 1994). Pematangan ini meliputi berbagai perubahan kronologi tahapan

meiosis (Gordon, 2003). Proses pematangan inti berhubungan dengan aktivitas

sintesis RNA, ditandai dengan perubahan inti dari fase diploten ke metaphase II.

Membran inti akan mengadakan penyatuan dengan vesicle membentuk Germinal

Vesicle (GV) dan kemudian akan mengalami pelepasan membran inti membentuk

Germinal Vesicle Break Down (GVBD). Setelah GVBD terjadi, kromosom

dibungkus oleh mikrotubulus dan mikrofilamen yang sangat mempengaruhi

keberhasilan pembelahan meiosis. Oosit yang telah mengalami GVBD selanjutnya

akan mencapai tahap metaphase I (MI). Pada oosit sapi, metaphase I terjadi setelah

12-14 jam inkubasi dan diikuti oleh tahap anaphase (AI) dan telophase (TI) yang

berlangsung relatife singkat (14-18 jam) setelah masa inkubasi (Chohan, and Hunter,

2003). Tahap metaphase II (MII) akan terjadi dan ditandai dengan terbentuknya

badan kutub I dan oosit yang sudah matang siap untuk difertilisasi (Pawshe, et al.,

1994).

Spermatogenesis

Spermatogenesis adalah proses pertumbuhan dan perubahan dari

spermatogonia sampai spermatozoa yang meliputi tiga fase. Fase pertama meliputi

spermatositogenesis, yaitu spermatogonium membelah secara mitosis menghasilkan

generasi sel baru yang nantinya akan menghasilkan spermatosit primer. Fase kedua

meliputi meiosis I, yaitu spermatosit primer mengalami dua kali pembelahan secara

7

berurutan dengan mereduksi sampai setengah jumlah kromosom dan jumlah DNA per

sel, menghasilkan spermatosit sekunder, spermatosit sekunder mengalami meiosis II

menghasilkan spermatid. Fase ketiga meliputi spermiogenesis, yaitu spermatid

mengalami proses sitodiferensiasi, menghasilkan spermatozoa (Junqueira et al.,

2007).

Hasil akhir spermatogenesis gambar 2 adalah spermatozoa dewasa.

Strukturnya menyerupai kecebong kecil dengan panjang 0,06 mm. Spermatozoa

terdiri atas empat bagian yaitu kepala, leher, tubuh dan ekor. Salah satu bagian yang

penting daristruktur spermatozoa adalah akrosom. Akrosom adalah bagian dari kepala

spermatozoa yang berasal dari nukleus yang mengalami kondensasi dan elongasi.

Akrosom mengandung enzim hidrolitik seperti hyalurinidase, neuraminidase

danprotease. Enzim-enzim ini berfungsi untuk menembus corona radiata dan zona

pellucida di sekeliling sel telur. Proses pengeluaran enzim ini disebut reaksi

akrosom,yang juga menandai langkah pertama terjadinya fertilisasi. Pada bagian leher

banyak mitokondria yang tersusun spiral (Junqueira et al., 2007).

Gambar 2. Proses Spermatogenesis (Shier et al., 2003).

8

Mitokondria beragregasi pada bagian proximal flagellum, sehingga bagian ini

tampak menebal. Pengumpulan mitokondria pada leher spermatozoa sangat penting

dalam pergerakan sel dan konsumsi energi yang tinggi. Ekor atau disebut juga dengan

flagellum spermatozoa terdiri dari beberapa mikrotubuli yang dilingkupi oleh

membran sel yang memanjang. Ekor sperma yang memanjang dapat dibagi menjadi

tiga bagian (tengah, utama dan ujung), menyebabkan gerak maju spermatozoa dengan

gelombang dua kali yang dimulai didaerah implantasi ekor kepala dan berjalan kearah

distal (Shier et al., 2003).

Fertilisasi In Vitro

Fertilisasi in vitro (FIV) adalah pembuahan sel telur oleh spermatozoa di luar

uterus yang direkayasa oleh manusia (Sukra, 2000). Teknik ini terdiri dari beberapa

langkah yaitu koleksi oosit, maturasi oosit, koleksi spermatozoa, kapasitasi

spermatozoa, fertilisasi dan pembiakan embrio secara in vitro (Susilowati et al., 1998;

Fibrianto et al., 2000).

Dalam usaha pengembangbiakan ternak, masalah infertilitas merupakan faktor

penghambat yang perlu diatasi dengan beberapa cara diantaranya dengan inseminasi

buatan, FIV dan transfer embrio. Terapi yang akan dilakukan harus berdasarkan

pertimbangan ekonomis, sehingga teknik terapi ini dapat dipakai untuk meningkatkan

kapasitasi reproduksi bibit ternak unggul dan mengatasi pemborosan sel-sel gamet

yang melimpah. Selain itu teknik FIV dan transfer embrio pada hewan dapat dipakai

sebagai uji biologis (Supriatna dan Pasaribu, 1992).

FIV sangat bermanfaat dalam mempelajari proses fertilisasi dan membantu

pengembangan metode praktis untuk pencangkokan embrio dari induk unggul ke

9

induk yang kurang unggul. Fungsi induk yang kurang baik dapat sebagai tempat

perkembangan anak yang berpotensi tinggi. Perkembangan pengetahuan semacam ini

sangat membantu penelitian di bidang genetika dan fisiologi (Salisbury dan

VanDenmark, 1985). Keberhasilan fertilisasi in vitro akan menghasilkan embrio

dengan kualitas tinggi dan dalam jumlah yang besar. Hal tersebut menurut Saito, et

al. (1994), tergantung pada pemilihan kondisi kultur yang optimal pada maturasi

oosit sampai sel telur mengalami meiosis pada metafase II.

Teknologi FIV sangat menguntungkan, antara lain dalam peningkatan mutu

genetik, pembekuan embrio sehingga dapat diperdagangkan dari suatu negara ke

negara lain, dan pengembangan teknologi perekayasaan, seperti penentuan jenis

kelamin embrio (embryo sexing), penyayatan embrio menjadi dua atau lebih (embryo

splitting) (Sukra, 2000).

Salah satu penerapan dari teknik fertilisasi in vitro pada mencit adalah untuk

mendapatkan jumlah yang banyak dari tingkat pembelahan awal embrio yang

berkembang secara lebih bersamaan. Kegunaan lain adalah untuk menghasilkan

keturunan dari mencit tanpa melalui perkawinan dan dapat menghasilkan keturunan

yang banyak pada saat bersamaan (Hogan et al., 1986).

Produksi Embrio In Vitro

Produksi embrio in vitro adalah proses produksi untuk menghasilkan atau

pengembangbiakan sel telur dan spermatozoa menjadi zigot dan berkembang menjadi

embrio diluar tubuh ternak (Ball dan Peters, 2007).

Masuknya sperma ke dalam sel telur menyebabkan terjadinya rangkaian

perubahan yang cepat yaitu penyelesaian pembelahan meiosis, penyatuan pronukleus

10

jantan dan betina serta gerakan kompleks dari zat-zat dalam sitoplasma telur, laju

konsumsi oksigen dan sintesis protein dalam telur spesies tertentu meningkat. Segera

setelah fertilisasi, di dalam embrio mulai ada sel-sel yang memisahkan diri dan terjadi

pembelahan sel yang berturut-turut (Villee et al., 1988, Salisbury dan Vandemark,

1985). Dalam tingkat ini embrio mengalami pembelahan menjadi sel-sel yang

ukurannya berangsur-angsur mengecil sampai ukurun tertentu. Tiap sel yang

terbentuk disebut blastomer (Sagi, 1999).

Pembelahan sel embrio terjadi secara mitosis, sehingga setiap sel embrio

mengandung kromosom diploid (2n) yang setengahnya berasal dari spermatozoa dan

setengahnya lagi berasal dari ovum. Pembelahan dimulai dari inti dan diteruskan ke

sitoplasma. Ovum yang telah dibuahi mengalami pembelahan pertama membentuk

embrio 2 sel. Embrio 2 sel segera membelah lagi menjadi embrio 4 sel. Pembelahan

terus berlanjut hingga embrio menjadi 8 sel, 16 sel, 32 sel (Toelihere, 1979; Salisbury

dan Vandemark, 1985).

Pada tingkatan embrio 16 sampai 32 sel, sel-sel berkumpul menjadi satu

kelompok di dalam zona pelusida. Isi sel di dalam zona pelusida berbentuk seperti

bola yang padat. Embrio tersebut dikenal sebagai morula. Cairan mulai menumpuk di

dalam ruang-ruang interseluler dan terbentuk suatu rongga bagian dalam yang disebut

blastocoele. Rongga tersebut semakin lama semakin besar dan berisi cairan. Embrio

tahap ini disebut blastosis ( Toelihere, 1979).

Embriogenesis adalah proses pembentukan dan perkembangan embrio. Proses

ini merupakan tahapan perkembangan sel setelah mengalami pembuahan atau

fertilisasi. Embriogenesis meliputi pembelahan sel dan pengaturan di tingkat sel. Sel

11

pada embriogenesis disebut sebagai sel embriogenik (Alberio et al., 2001).

Perkembangan embrio terjadi mulai dari proses fertilisasi antara oosit dengan

spermatozoa. Oosit yang diperoleh dari hasil ovulasi secara alami atau melalui

maturasi secara in vitro adalah dalam kondisi matang (siap untuk dibuahi) (Jones,

2007).

Menurut Meo et al. (2005), tahapan pertumbuhan dan perkembangan embrio

dibedakan menjadi 2 tahap yaitu :

1. Fase Fertilisasi adalah pertemuan antara sel sperma dengan sel ovum dan akan

menghasilkan zigot.

2. Fase Embrionik yaitu fase pertumbuhan dan perkembangan makhluk

hidup selama masa embrio yang diawali dengan peristiwa fertilisasi sampai

dengan terbentuknya janin di dalam tubuh induk betina.

Secara umum, sel embriogenik tumbuh dan berkembang melalui beberapa

fase, antara lain (Alberio et al., 2001) :

1. Sel tunggal (yang telah dibuahi)

2. Blastomer

3. Blastula

4. Gastrula

5. Neurula

6. Embrio / Janin

Kriopreservasi

Teknik kriopreservasi merupakan suatu teknik penyimpanan sel hewan,

tumbuhan ataupun materi genetika lain (termasuk semen) dalam keadaan beku

melalui reduksi aktivitas metabolisme tanpa mempengaruhi organel-organel di dalam

12

sel sehingga fungsi fisiologis, biologis, dan morfologis tetap ada (Watson, 2000).

Teknik kriopreservasi merupakan teknik penyimpanan yang dilakukan pada suhu

yang sangat rendah (-196 0C) dalam nitrogen cair (Boediono, 2003). Teknik

kriopreservasi pada berbagai sel, jaringan, dan organ telah banyak dilakukan,

demikian juga dengan kriopreservasi embrio (Rimayanti, 2005).

Kerusakan sel yang terjadi pada saat kriopreservasi embrio adalah

terbentuknya kristal es baik ekstraseluler maupun intraseluler. Hal ini disebabkan

oleh elektrolit yang menumpuk akan merusak dinding sel sehingga pada waktu

pencairan kembali permeabilitas membran plasma akan menurun dan sel akan mati.

Pembentukan kristal es kemungkinan berkaitan dengan perubahan tekanan osmotik

dalam fraksi yang tidak mengalami pembekuan (Watson, 2000).

Proses kriopreservasi oosit pada mamalia sampai saat ini dilakukan dengan

dua cara yang berbeda yaitu pembekuan lambat (slow rate freezing) dan vitrifikasi

(rapid freezing). Slow rate freezing merupakan cara penyimpanan oosit dalam

keadaan beku pada temperatur rendah dengan meminimalkan pembentukan kristal es

intraselular, sedangkan vitrifikasi tanpa adanya pembentukan kristal es sebagai

penyebab utama kerusakan intraselular (Lieberman et al., 2002).

Menurut Toelihere (1979), setiap teknik kriopreservasi mempunyai kelebihan

dan kekurangan. Kelebihan dari kriopreservasi secara umum adalah:

1) Bahan atau materi dapat disimpan dalam waktu tidak terbatas.

2) Dapat dikoleksi setiap saat.

3) Dapat digunakan kapan saja bila dibutuhkan.

4) Melestarikan plasma nutfah yang mendekati kepunahan.

13

5) Tidak perlu mengimpor atau memelihara pejantan-pejantan unggul.

6) Tidak membutuhkan ruangan yang besar karena tabung nitrogen cair cukup

memadai untuk menyimpan bahan dalam ragam dan jumlah yang banyak.

7) Tidak menyebabkan perubahan material genetik yang disimpan.

Sementara itu, kekurangannya adalah:

1) Biaya pelaksanaan cukup mahal.

2) Memerlukan tenaga yang terampil dan berpengalaman.

3) Nitrogen cair perlu tersedia secara kontinyu.

Krioprotektan Etilen Glikol

Krioprotektan ialah zat kimia nonelektrolit yang berperan dalam mengurangi

pengaruh mematikan selama pembekuan baik berupa pengaruh larutan maupun

adanya pembentukan kristal es sehingga viabilitas sel dapat dipertahankan (Chen et

al., 2005). Penambahan krioprotektan bertujuan untuk memelihara keutuhan

membran dan meningkatkan potensial osmotik media sehingga cairan di dalam sel

mengalir keluar dan terjadi dehidrasi. Kemampuan proteksi krioprotektan terhadap

membran sel merupakan indikasi dari interaksi yang berjalan baik antara

krioprotektan dan membran sel. Interaksi ini dapat mengurangi kerusakan membran

sel pada saat terjadi perubahan keadaan dari relatif cair ke struktur relatif padat dan

juga pada saat kembali ke struktur yang relatif cair selama proses pencairan

(Kostaman dan Setioko, 2011).

Penggunaan krioprotektan baik pada saat pra-pembekuan dan pasca thawing

(pencairan kembali) yang bertahap juga melibatkan proses pembekuan bertahap

dengan menekankan pentingnya proses seeding. Proses seeding dimaksudkan untuk

14

menginisiasi pembentukan kristal es sebagai inti es dengan menurunkan temperatur

sebagian larutan agar dehidrasi terjadi dan menekan pelepasan energi panas yang

berlebihan dari fusi kristal es. Inisiasi secara mendadak ini dilakukan pada temperatur

sedikit di bawah titik beku larutan, sehingga dapat mencegah membesarnya derajat

supercooling atau memperpendek selang supercooling. Tanpa perlakuan seeding, inti

es akan terbentuk secara spontan pada temperatur -10 oC sampai -15 oC (fenomena

supercooling) yang disertai dengan pelepasan fusi panas, sehingga temperatur hampir

mencapai titik bekunya kembali. Kondisi ini akan menimbulkan suatu fluktuasi

temperatur yang cukup besar (Kostaman dan Setioko, 2011).

Etilen Glikol (EG) merupakan cairan jenuh, tidak berwarna, tidak berbau, dan

larut sempurna dalam air dan merupakan salah satu bahan kimia sebagai bahan baku

yang jumlahnya belum mencukupi kebutuhan industri di Indonesia. EG berfungsi

sebagai bahan industri antara lain adalah sebagai bahan baku tambahan pembuatan

tinta, kosmetik, pembuatan cat, dan bahan anti beku (Kusumadewi, 2005).

Menurut laporan Gordon (1994), EG efektif digunakan sebagai krioprotektan

untuk kriopreservansi embrio dan diaplikasikan pula pada kriopreservasi oosit. Berat

molekul EG yang rendah (62,07) memberikan efek yang menguntungkan berupa

permeabilitas yang lebih tinggi. Beberapa peneliti juga mengatakan bahwa kelebihan

EG sebagai krioprotektan adalah karena toksisitasnya yang rendah.

Penelitian Hochi et al. (1996), menunjukkan bahwa tingkat fertilisasi in vitro

embrio sapi dalam larutan EG (Etilen Glikol) 40% menunjukkan tingkat poliploid

yang cukup tinggi yaitu 44,9%. bahwa proses vitrifikasi mengakibatkan perubahan

15

beberapa struktur oosit seperti zona pelusida, membrane plasma dan butir-butir

korteks yang berperan didalam proses pencegahan polispermi.

Penggunaan konsentrasi EG 30% dan waktu pemaparan 5 menit cukup

memadai untuk vitrifikasi sel telur domba (Djuwita et al. 2001), sel telur dan embrio

mencit, EG mempunyai kemampuan masuk dan keluar sel yang lebih cepat

dibandingkan dengan gliserol. (Mohamad et al., 2000).

Diungkapkan oleh Nowshari et al. (1994), bahwa waktu pemaparan,

konsentrasi krioprotektan dan prosedur pencairan kembali mempengaruhi

kemampuan fertilitas dari embrio dan perkembangan sampai pada tahap blastosis.

Menurut Voelkel dan Hu (1992), EG memiliki permeabilitas terhadap sel

embrio yang lebih baik daripada gliserol, viabilitas embrio beku lebih tinggi

dibekukan dengan larutan EG (70%) dari pada dengan gliserol (30%), karena berat

molekul etilen glikol lebih kecil dibandingkan dengan gliserol. Sedangkan menurut

Szell et al. (1989), bahwa permeabilitas embrio domba dan sapi terhadap EG dan

propilen glikol lebih baik daripada terhadap gliserol. Toksisitas etilen glikol lebih

kecil jika dibandingkan dengan gliserol sehingga mempengaruhi ketahanan hidup

embrio yang lebih tinggi

16

METODE PENELITIAN

Waktu dan Tempat

Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Maret hingga April 2017, di

Laboratorium Fertilisasi dan Produksi In Vitro Embrio, Pusat Kegiatan Penelitian,

Universitas Hasanuddin, Makassar.

Materi Penelitian

Alat yang digunakan adalah incubator, mikroskop (ZEISS, image A2 : Axio

Cam HRc), Syringe (10 ml), scalpel, petri dish, gelas kimia, labu enlemeyer, freezer,

timbangan analitik, kaca objek, kaca penutup, pipet tetes, mikropipet, cawan petri dan

gunting bedah.

Bahan yang digunakan adalah ovarium sapi Bali yang diperoleh dari Rumah

Potong Hewan (RPH) Tamangapa, Kota Makassar, provinsi Sulawesi Selatan. Bahan-

bahan yang digunakan antara lain medium transportasi ovarium, medium in vitro

fertilization (IVF), medium in vitro culture (IVC), medium in vitro maturation

(IVM), alcohol 70 % tissue, mineral oil (Sigma Chemical Co. St. Louis MO, USA),

Kcl 0,7% enzim hyaluronidase (Sigma, USA) 0,25%, dan krioprotektan Etilen Glikol.

Rancangan Penelitian

Rancangan penelitian menggunakan metode eksperimental laboratorium

berdasarkan Rancangan Acak lengkap (RAL) yaitu dengan 4 perlakuan dan 4 kali

ulangan sebagai perlakuan adalah sebagai berikut:

A. Kontrol 0% Etilen Glikol + 100% phosphate buffered saline (PBS)

B. 10% Etilen Glikol + 90% phosphate buffered saline (PBS)

C. 20% Etilen Glikol + 80% phosphate buffered saline (PBS)

D. 30% Etilen Glikol + 70% phosphate buffered saline (PBS)

17

Prosedur Penelitian

Secara garis besar prosedur penelitian disajikan pada Gambar 3.

Gambar 3: Diagram Alir Prosedur Penelitian

Koleksi Ovarium di RPH (Rumah

Pemotongan Hewan)

Pencacahan Ovarium seleksi Oosit

Proses Fertilisasi IVF (in vitro

fertilization)

Embrio

Kriopreservasi

Thawing

Kultur IVC (in vitro culture)

Kultur Embrio yang telah dithawing

Embrio Hidup

Sperma

Beku

Kapasitasi Sperma

Maturasi in Vitro

Penambahan krioprotektan EG (0%,10%,20% dan 30% pada medium

kriopreservasi Evaluasi pemulihan Embrio setelah kriopreservasi

S

e

b

e

l

u

m

P

e

r

l

a

k

u

a

n

p

e

r

l

a

k

u

a

n Evaluasi Embrio

18

Prosedur penelitian yaitu sebagai berikut:

1. Koleksi oosit.

Ovarium sapi segar dikumpulkan di rumah potong hewan dan dibawa ke

laboratorium menggunakan larutan NaCl 0,9%. Koleksi oosit dilakukan dengan

menyayat/mencacah folikel yang ada di permukaan ovarium hingga oosit keluar

dengan media PBS (Phosphate Buffered Serum). Selanjutnya oosit diseleksi

menggunakan mikroskop. Kemudian ditampung dalam petri dish yang berisi

media phosphate buffered saline (PBS).

2. Seleksi dengan Koleksi

Oosit hasil koleksi dicuci dalam medium koleksi yang terdiri atas

PBS(Phosphate Buffered Serum) ditambah 10% Serum masing-masing dua kali,

selanjutnya dilakukan seleksi berdasarkan grade A, grade B, dan grade C.

maturasi dalam tissue culture medium (TCM) ditambahkan FBS (Fetal Bovine

Serum) 10%, 10 IU/ml pregnant mare serum gonadotrophin (PMSG), 10

IU/mlhuman chorionic gonadotrophin (HCG) dan 50 μg/ml Gentamycin.

3. Pematangan oosit in vitro.

Oosit yang terseleksi dan telah melalui dua kali pencucian dengan beberapa

media, pematangan oosit dilakukan dalam medium maturasi (tissue culture

medium (TCM) ditambahkan FBS (Fetal Bovine Serum) 10%, 10 IU/ml pregnant

mare serum gonadotrophin (PMSG), 10 IU/mlhuman chorionic gonadotrophin

(HCG) dan 50 μg/ml Gentamycin), dengan membuat empat tetesan (drop) pada

petri dish (50 μL/drop) dan ditutup dengan mineral oil 9 agar tidak terjadi

penguapan) dalam inkubator, temperature 38,5 0C selama 24 jam.

19

4. Fertilisasi

Setelah pematangan inti Oosit, kemudian disiapkan medium fertilisasi

(Suzuku et al., 2000). Spermatozoa disiapkan dalam bentuk drop dalam cawan

petri dan ditutup dengan mineral oil (agar tidak terjadi penguapan).. Oosit yang

telah dicuci dalam medium fertilisasi sebanyak dua kali kemudian dipindahkan

kedalam drop spermatozoa dan diinkubasi selama 5-6 jam dalam inkubator CO2

5%, suhu 380C.

5. Kultur

Zigot hasil fertilisasi kemudian dipindahkan dalam drop 50 μl medium kultur

yang ditambahkan 5 mg/ml BSA, 2,5% FBS dan ditutup mineral oil, selanjutnya

dikultur dalam inkubator 5% CO2, suhu 38,8° C selama 48 jam (Meo et al.,

2005). Hasil kultur ini memproduksi embrio yang siap untuk dibekukan (

kriopreservasi).

6. Kriopreservasi

Pembekuan embrio dilakukan setelah kultur 48 jam. Kemudian embrio yang

sudah membelah dilakukan pembekuan dengan media kriopreservasi yang

ditambahkan Etilen Glikol dengan konsentrasi 0% (kontrol), 10%, 20%, dan 30%.

Kemudian selanjutnya dibekukan dalam nitrogen cair selama 48 jam.

7. Thawing dan Kultur

Setelah dikriopresrvasi selama 48 jam kemudian dilakukan pencairan kembali

(thawing) selama 20 detik dalam air hangat dengan suhu 37oC. Selanjutnya

dilakukan pengamatan dan dilakukan kultur kembali dengan media kultur selama

24 jam di dalam inkubator CO2 5% dengan suhu 38,5oC.

20

8. Evaluasi

Setelah kultur kembali dengan media kultur selama 24 jam dilakukan

evaluasi embrio.

Parameter yang diamati

Parameter yang diamati pada penelitian ini adalah sebagai berikut:

1. Recovery embrio

Recovery embrio adalah kemampuan embrio kembali dalam keadaan

semula setelah kriopreservasi. Pengamatan yang dilakukan yaitu dengan

pengamatan embrio setelah thawing yang dilihat menggunakan mikroskop

dengan melihat setiap embrio yang masih hidup ditunjukkan dengan bentuk

sel sama dengan sebelum kriopreservasi (Gambar 5A) dan dilakukan

perhitungan dengan menghitung jumlah embrio yang masih hidup dari jumlah

embrio yang dikriopreservasi disetiap perlakuan

x 100

2. Viabilitas embrio

Viabilitas embrio adalah kemampuan perkembangan embrio selama

dikultur setelah dibekukan. Pengamatan terhadap viabilitas embrio dilakukan

setelah embrio dikultur selama 24 jam yang ditunjukkan dengan sel yang

membelah pada saat dikultur. Penilaian kelangsungan hidup didasarkan pada

keadaan morfologis tahapan perkembangan embrio

x 100

21

Analisis Data

Data perkembangan embrio sebelum dianalisis terlebih dahulu dilakukan

Transformasi Arcsin untuk penyebaran data secara distribusi normal,

selanjutnya data di analisis ragam menggunakan model matematis sebagai berikut:

Yij = μ + ᴛi + ɛij

Keterangan :

Yij= Hasil pengamatan dari tingkat perkembangan embrio dengan konsentrasi Etilen

Glikol ke-i dengan ulangan ke-j

μ = Rata-rata pengamatan

ᴛi = Pengaruh konsentrasi Etilen Glikol ke-i

ɛ = Pengaruh galat percobaan dari perlakuan ke-i dan ulangan ke-j

Untuk mengetahui perbedaan antar perlakuan dilakukan uji beda nyata jujur (list

significant diferent).

22

HASIL DAN PEMBAHASAN

Proses Maturasi Oosit sampai Fertilisasi

Data hasil pengamatan oosit sapi bali mulai dari sebelum maturasi hingga

sebelum fertilisasi dapat dilihat pada Gambar 4.

d

a b c

Gambar 4. Proses perubahan oosit A Sebelum Maturasi, B Setelah Maturasi, dan C

Sebelum Fertilissi inti sel oosit (a); sel-sel kumulus oophorus masih

menyatu (b); sel-sel kumulus sudah terlihat mekar dari bentuk semula (c);

sel-sel kumulus di kurangi (d).

Oosit sebelum maturasi (4A) mempunyai ciri berikut: inti oosit kelihatan

jelas (4a), sel-sel kumulus yang mengelilingi masih terlihat mengumpul dengan

warna yang agak gelap (4b). Oosit yang akan dimaturasi diseleksi dahulu agar

dapat termaturasi dengan baik. Gambar 4B adalah gambar oosit setelah maturasi.

Perbedaan antara sebelum maturasi dan setelah maturasi yaitu terlihat sangat jelas

bentuk sel-sel kumulusnya. Oosit setelah maturasi sel kumulusnya tampak sudah

mekar/ merenggang dari bentuk mulanya (Gambar 4Bc)

Maturasi dapat terjadi secara in vivo maupun in vitro. Maturasi secara in

vitro dilakukan agar diperoleh oosit primer yang berkembang menjadi oosit

sekunder. Oosit sekunder tersebut akan melakukan proses pembelahan meiosis

C

23

dengan normal dan sempurna, sehingga dihasilkan sel telur yang siap dibuahi oleh

spermatozoa dan dapat berkembang menjadi embrio dengan kualitas yang baik.

Proses maturasi oosit primer perlu dilakukan sebelum terjadinya fertilisasi oleh

spermatozoa dengan tujuan

untuk meningkatkan angka keberhasilan fertilisasi (Fatchiyah et al., 2000).

Gambar 4C yaitu oosit sebelum proses fertilisasi yang dicirikan oleh sel-sel

kumulus yang mengelilingi berkurang dibanding setelah maturasi. Apabila banyak

sel-sel kumulus yang mengelilingi maka menyebabkan sperma sulit untuk menuju

inti sel oosit, yang mengakibatkan oosit tdak terfertilisasi.

Setelah proses fertilisasi terbentuk zigot dan dikultur selama 24 jam hingga

terbentuk embrio terlihat dalam Gambar 5.

a

Gambar 5. Perkembangan embrio yang dicirikan dengan pembelahan embrio menjadi beberapa sel

setelah kultur 48 jam sebelum kriopreservasi (A) dan kultur kembali selama 24 jam

setelah kriopreservasi 48 jam (B).

Gambar 5Aa,b menunjukkan embrio sebelum kriopreservasi morfologinya

cukup jelas, dimana sel-sel embrio nampak dengan jelas sekat-sekat antara sel yang

satu dengan sel yang lainya. setelah di kriopreservasi Gambar 5Bc sekat-sekat

pembelahan tidak terlalu jelas seperti gambar 5Aa dan embrio yang dikultur kembali

selama 24 jam setelah kriopreservasi bentuk embrio tidak begitu jelas (Gambar 5Cd).

C

h

a

si

l

a

n

a

li

si

s

r

a

g

a

m

(

L

a

m

p

ir

a

n

5

)

p

e

A

e

rr

E

E

D

B

24

Metode kultur in vitro embrio pada umumnya menggunakan media yang telah

diketahui komposisinya. Penambahan serum dalam media kultur dapat membantu

pertumbuhan embrio sampai tahap morulla dan blastosis secara in vitro (Kaiin dan

Tappa, 1994).

Data hasil pengamatan oosit mulai dari maturasi hingga terbentuknya embrio

sebelum dan sesudah kriopreservasi dapat dilihat pada Tabel 1.

Tabel 1. Total dan Persentase Oosit Sebelum dan sesudah maturasi, dan Total

Produksi Embrio pada kelompok Perlakuan

Perlakuan

Σ Oosit

Sebelum

Maturasi

Σ Oosit Setelah

Maturasi

(%)

Σ Produksi Embrio in

vitro

0% 41 100 21 (55,26)

10% 36 100 16 (50,00)

20% 36 100 20 (57,14)

30% 42 100 22 (57,89)

Keterangan: Angka dalam kurung adalah persentase

Tabel 1 merupakan data sebelum kriopreseravasi, untuk menghasilkan embrio

yang akan diberi perlakuan. Daya hidup oosit dari sebelum maturasi dan setelah

maturasi menunjukkan angka yang tinggi yaitu 100%. Hal ini karena oosit yang

digunakan oosit kualitas baik. Peranan sel kumulus oophorus dalam maturasi oosit

sangat mendukung pematangan oosit (Fatchiyah et al., 2000). Kumulus oophorus

berperan sebagai penghubung antara sel-sel stratum granulosum dengan oosit dan

memungkinkan pemindahan molekul dari populasi sel-sel granulosa ke oosit (Putro,

1993).

Oosit yang matang dilakukan pembuahan dengan spernma kemudian

dikultur selama 24 jam menghasilkan tingkat embrio yang dihasilkan sekitar 50% -

57,89%. Hal ini disebabkan pada proses fertilisasi terdapat oosit yang tidak dibuahi

oleh sel spermatozoa, sel spermatozoa kurang bagus kualitasnya. Tingkat fertilisasi

25

spermatozoa pada oosit sapi yang memiliki sel-sel kumulus lengkap 78% dan

kejadian polispermi sebesar 8%. (Bilodeau dan Panich, 2002).

Perkembangan Embrio Hasil Kriopreservasi dan Viabilitas Embrio

Data hasil pengamatan embrio yang pulih setelah kriopreservasi dengan Etilen

Glikol dan embrio hidup setelah kultur dapat dilihat pada Tabel 2.

Tabel 2. Embrio yang Pulih setelah Kriopreservasi dengan Etilen Glikol dan Embrio

Hidup setelah Kultur kembali

Perlakuan

Σ Embrio

Sebelum

Kriopreservasi

Pulih

( Recoverry)

Hidup setelah Kultur

kembali (Viabilitas)

0% 21 9 (42,86)a 5 (23,80)a

10% 16 15 (93,75)b 13 (81,25)b

20% 20 20 (100,00)b 16 (80,00)b

30% 22 20 (90,91)b 17 (61,81)b

Keterangan: Angka dalam kurung adalah persentase

Berdasarkan hasil analisis ragam (Lampiran 5) perlakuan penambahan

krioprotektan Etilen Glikol (EG) berpengaruh nyata terhadap tingkat pemulihan

embrio (recovery rate) setelah kriopreservasi (P< 002) dan terhadap perkembangan

embrio setelah dikultur kembali (viabilitas) (P< 035). Hasil uji lanjutan (BNT)

menunjukkan bahwa tingkat pemulihan embrio pada kontrol (krioprotektan Etilen

Glikol 0%) sangat nyata (P< 0,01) lebih rendah dibandingkan dengan tingkat

pemulihan embrio pada konsentrasi EG 10%, 20% dan 30%. Hal ini disebabkn

pengaruh penambahan krioprotektan EG yaitu mampu memelihara keutuhan

membran dan meningkatkan potensi osmotik pada media. Hal ini sesuai dengan

laporan Gordon (1994), yang menyatakan EG efektif digunakan sebagai

26

krioprotektan untuk kriopreservasi embrio dan diaplikasikan pula pada kriopreservasi

oosit. Berat molekul EG yang rendah (62,07) memberikan efek yang menguntungkan

berupa permeabilitas yang lebih tinggi.

Krioprotektan dapat melindungi sel selama proses kriopreservasi. Derajat

proteksi dari bahan krioprotektan terhadap proses kristalisasi pada masa pembekuan

tergantung dari jenis dan konsentrasi krioprotektan yang dipakai serta lama paparan

(Kasai, 2002).

Penggunaan konsentrasi EG 30% dan waktu pemaparan 5 menit cukup

memadai untuk kriopreservasi sel telur domba (Djuwita et al. 2001), sel telur dan

embrio mencit, EG mempunyai kemampuan masuk dan keluar sel yang lebih cepat

dibandingkan dengan gliserol. (Mohamad et al., 2000).

Tingkat perkembangan embrio setelah dikultur kembali (viabilitas) pada

konsentrasi penggunaan krioprotektan Etilen Glikol 0% sangat nyata (P< 0,01) lebih

rendah dibandingkan dengan tingkat pemulihan embrio pada konsentrasi 10%, 20%

dan 30%. Hal ini mungkin disebabkan oleh dampak residu Etilen Glikol pada saat

kriopreservasi yang mungkin menyebabkan perlukaan pada sel akibat efek toksik dari

konsentrasi krioprotektan dan stress karena perubahan suhu yang ekstrim. Menurut

Lane et al. (1999), salah satu alasan kecenderungan penurunan nilai viabilitas selama

24 jam kultur in vitro setelah kriopreservasi disebabkan karena embrio mamalia pada

setiap tahap perkembangan yang berbeda, memiliki mekanisme tersendiri dan

kemampuan yang relatif berbeda dalam menyerap krioprotektan, serta mencapai

tingkat dehidrasi sempurna selama proses penyerapan larutan.

27

Kecenderungan penurunan daya hidup zigot setelah kriopreservasi dapat

disebabkan pula oleh kerusakan fisik akibat pembentukan kristal es selama

pembekuan, efek toksik krioprotektan dan stress osmotik selama pengeluaran

krioprotektan (Nowshari dan Brem 2001).

Pada dosis EG 30% tingkat viabilitas embrio setelah di kultur kembali

cenderung menurun disbanding dosis 10 dan 20 %, hal ini diuga disebabkan

toksisitas krioprotektan (Kasai, 1996). Faktor lain penyebab tidak berkembangnya

embrio mungkin disebabkan konsentrasi glukosa dalam medium kultur in vitro yang

kurang sesuai untuk setiap tahap perkembangan embrio (Kasai, 1996). Pada

umumnya embrio yang dihasilkan melalui fertilisasi in vitro atau mulai dikultur pada

tahap zigot dalam medium kultur akan mengalami hambatan perkembangan embrio

tahap awal (Djuwita et al., 2000).

28

PENUTUP

Kesimpulan

1. Penambahan krioprotektan Etilen Glikol pada medium kriopeservasi dengan

konsentrasi 10 sampai 30% dapat mempertahankan tingkat pulih embrio dan

tingkat perkembangan embrio setelah dikultur kembali yang lebih tinggi

dibandingkan dengan kontrol

2. Penggunaan Etilen Glikol untuk krioprervasi cukup dengan dosis 10%.

Saran

Sebaiknya dosis untuk penggunaan kriprotektan Etilen Glikol dalam

penggunaanys untuk kriopreservasi embrio disarankan tidak lebih dari 10%.

29

DAFTAR PUSTAKA

Alberio, R., V. Zakhartchenko, J. Motlik, and E. Wolf E. 2001. Mammalian oocyte

activation: Lessons from the sperm and implication for nuclear transfer. Int. J.

Dev. Biol. 45:797-809.

Ball, P. J. H., and A. R. Peters. 2007. Reproduction In Cattle Third Edition. Blacwell

Publishing Ltd. UK.

Boediono, A, K. Mohamad, Y. Rusiyantono, I. Djuwita, dan Y. Sukra. 2003. Kloning

embrio dengan pembuatan kembar identik melalui rekayasa embrio dan

pembekuan dngan metode vitrifikasi. Lab. Embriologi FKH IPB.

Bilodeau-Goeseels, S., and P. Panich. 2002. Effects of oocyte quality on development

and transcriptional activity in early bovine embryos. Anim. Reprod. Sci.

71:143-155.

Campbell, N.A., J. B. Reece, and L. G. Mitchel. 2000. Biologi. Erlangga. Jakarta.

Chen, S.U., Y.R. Lien, H.F. Chen, L.J. Chang, Y.Y. Tsai and Y.S. Yang. 2005.

Observational clinical follow-up of oocyte cryopreservation using a slow-

freezing method with 1,2-propanediol plus sucrose followed by ICSI. Human

Reprod. 20: 1975 – 1980.

Chohan, K. R., and Hunter A. G. 2003. Meiotic competence of bovine fetal oocytes

following in vitro maturation.Anim. Reprod. Sci. 76:43-51.

Crozet, N., Ali A., and M. P. Dubos. 1995. Developmental competence of goat

oocytes from follicles of different size categories following maturation,

fertilization and culture in vitro. Reprod. Fertil. 103(2):293-298.

Djuwita, I., L. Amalia, Widjiati, dan K. Mohamad. 2000. Efek Konsentrasi Glukosa

dalam Medium Dengan dan Tanpa Fosfat terhadap Perkembangan Embrio

Preimplantasi Mencit secara In vitro. Media Veteriner. 7 (1): 9-12.

Djuwita, I . 2001. Kajian Morfologis dan fungsi Biologis Oosit Domba setelah

Kriopreservasi dengan Metode Vitrifikasi. Disertasi. Sekolah pasca sarjana

institute pertanian Bogor. Bogor. Hal 104.

Fatchiyah, F.G. Ciptadi, M.S. Djati dan S. Wahyuningsih. 2000. Penambahan FB dan

EGS pada Media Kultur Maturasi In Vitro (IVM) Oosit Kambing Lokal PE.

Natural. J. 4 (3): 52-55.

30

Fibrianto, Y.H., D.L. Kusindarta dan S. Soebagyo. 2000. Penggunaan Serum

Inaktivasi dari Rumah Potong Hewan pada Media Fertilisasi In Vitro.

Mediagama. 2: 1-6.

Gordon, I. 1994. Laboratory Production of Cattle Embryos. Cab international.

Cambridge.

Gordon, I. R. 2003. Laboratory Production of Cattle Embryos.CABI Publishing;

Wallingford UK.

Hochi, S., K. Kimura, K. Ito, and M. Hirabayashi. 1996. Effect of nuclear stages

during invitro maturation on the survival of bovine oocytes following

vitrification. Theriogenology. 46:345. (Abstr).

Hogan, B., C. Frank and L. Elizabeth. 1986. Manipulating The Mouse Embryo A

Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory. USA.

Jones, K.T. 2007. Intracellular calcium in the fertilization and development of

mammalian eggs.Proc. Aust. Phys. Soc. 38:35-41

Junqueira L. C., J, Carneiro, O. K. Robert. 2007. Histologi Dasar edisi ke-8. Jakarta

(ID): EGC.

Kaiin, E.M. dan B. Tappa. 1994. perkembangan embrio in vitro mencapai hatched

blastosis pada kondisi media yang berbeda. Prosiding Seminar Hasil Penelitian

Bioteknologi II. Puslitbang Bioteknologi LIPI. Bogor.

Kasai, M. 1996. Simple and Efficient Methods for Vitrification of Mammalian

Embryos. Animal Reproduction Sciences 42 : 67-75.

Kasai, M. 2002. Advances in the cryopreservation of mammalian oocytes and

embryos: Development of ultrarapid vitrification. Rev.1:1-

9.http:www/blackwellsynergy.com/links/doi/10.1046/j.1445781.2002.00004.

Kostaman, T. dan A.R. Setioko. 2011. Perkembangan penelitian teknik kriopreservasi

untuk penyimpanan semen unggas. Balai Penelitian Ternak, Bogor. Hal 145-

152.

Kusumadewi, I. 2005. Prarancangan Pabrik Etilen Glikol dari Etilen Oksida dan Air

dengan Proses Hidrosi non Katalistik Kapasitas 110.000Ton/tahun. Hal 1-21

Lane M, BD. Bavister, Lyons EA, and Forest KT. 1999. Container-less vitrification

of mammalian oocytes and embryos. Nat Biot 17:1234-1236

Liebermann, J., F. Nawroth and F. Isachenko. 2002. Potential importance of

vitrification in reproductive medicine. Biol. Reprod. 67: 71-80.

31

Meo, S.C., W. Yamazaki, C.L.V. Leal, J.A. de Oliveira, and J.M. Garcia. 2005. Use

of strontium for bovine oocyte activation. Theriogenology.63:2089-2102.

Mohamad, K., E. Rumiyati, F. Sari, N. Liyanah, dan I. Djuwita. 2000. Kriopreservasi

oosit pronukleus dan embrio mencit dengan metode vitrifikasi. Abstrak

Seminar Nasional Biologi XVI. Bandung

Nowshari, M.A., P.L. Nayudu, and J.K. Hodges. 1994. Effect of Cryoprotectant

Concentration, Equili bration Time and Thawing Procedure on Survival and

Development of Rapid Frozen Thawed Mature Mouse Oocytes.

Theriogenology. 42 : 1193-1204.

Nowshari MA, and Brem G. 2001. Effect of freezing rate and exposure time to

cryoprotectan on the development of mouse pronuclear stage embryos. Hum

Reprod 16:2368-2373.

Partodihardjo, S. 1980. Ilmu Reproduksi Hewan. Mutiara. Jakarta.

Pawshe, C. H., K. B. C. Appa Rao, S. K. Jain, and S. M. Totey. 1994. Biochemical

studies on goat oocytes timing of nuclear progresian, effect of protein

inhibitor and pattern of polypeptide synthesis during in vitro maturation.

Theriogenology. 42(2):307-320.

Putro, P.P. 1993. Petunjuk Laboratorium Fertilisasi In Vitro. Pusat Antar Universitas

Bioteknologi. UGM. Yogyakarta.

Rimayanti. 2005. Pengaruh Proses Vitrifikasi dengan Krioprotektan Etilen Glikol

Terhadap Daya Hidup Oosit Sapi. Department of Reproduction and Obstetric ,

Faculty of Veterinary Medicine, Airlangga University. 28- 31.

Sagi, M. 1999. Embriologi Perbandingan pada Vertebrata. Fajar Offset. Yogyakarta.

Saito, N., K. Imal, and M. Tomizawa. 1994. Effect of sugars-addition on the survival

of vitrified bovine blastocist produced in vitro . Theriogenology 41:1053-1060

.

Salisbury, G.W. dan N.L. VanDemark. 1985. Fisiologi Reproduksi dan Inseminasi

Buatan Pada Sapi (diterjemahkan oleh R. Djanuar). UGM Press. Yogyakarta.

Shier, D., J. Butler, and R. Lewis. 2003. Hole’s Essential of Human Anatomy and

Physiology. 8thed. New York, USA: McGraw Hill. 498-508.

Sonjaya, H., M. Amin, Hasbi, L. Rahim. 2016. Pengaruh waktu maturasi oosit

terhadap keberhasilan produksi embrio sapi bali secara in vitro. Seminar

Nasional Biotek 4. Universtas Gadjah Mada.

Speroff, L. Fritz, M. A. Lippincot Williams, and Wilkin. 2010. Clinical Gynecologic

Endocrinology and Infertility. USA: 749-857

32

Sukra,Y. 2000. Wawasan Ilmu Pengetahuan Embrio Benih Masa Depan. Direktorat

Jendral Pendidikan Tinggi Departemen Pendidikan Nasional. Jakarta.

Supriatna, I. dan F.H. Pasaribu. 1992. In Vitro Fertilisasi, Transfer Embrio dan

Pembekuan Embrio. Depdikbud. Dirjen. Pend. Tinggi, Pusat Antar

Universitas Biotek. IPB. Bogor.

Susilowati, T., S.B. Sumitro, M.S. Djati, G. Ciptadi. and B. Permono. 1998.

Optimalisasi Maturasi Oosit secara In Vitro dengan Kombinasi Konsentrasi

Serum dan Hormon pada TCM 199. Natural. J. 2 (1): 16-23.

Suzuki,K., B. Erikson, H. Shimizu, I. Nagai, H. Rodhiguez Martinez. 2000. Effect of

hyaluron on monospermic penetration of porcine oocyte fertilized in vitro int

Androl. 23:13-21.

Szell, A., J . N . Shelton, and K. Szel. 1989. Osmotic characteristics sheep and

cattle embryos. Cryobiology; 26: 297 -301 .

Telfer, D. J., and R. S. Sharpley. 2008. Tourisme and Development in The

Development in The USA and Canada by Routledge, 270 Madison Ave, New

York.

Toelihere, M.R. 1979. Fisiologi Reproduksi Pada Ternak. penerbit Angkasa.

Bandung.

Villee, C.A., F.W. Warren and D.B. Robert. 1988. Zoologi Umum (diterjemahkan

oleh Nawangsari Sugiri). Jilid 1. Erlangga. Jakarta.

Voelkel, S.A. and Y . X . Hu. 1992. Use of ethylene glycol as a

cryoprotectant for bovine embryos allowing direct transfer of frozen-

thawed embryos to recipient females. Theriogenology. 37: 687-697.

Watson, P.F. 2000. The causes of reduced fertility with cryopreserved semen.

Anim. Reprod. Sci. 60 – 61: 481 – 492.

Yatim W, 1994. Reproduksi dan Embriologi. Penerbit Tarsito. Bandung.

33

Lampiran 1. Komposisi Media Maturasi Oosit Secara In Vitro

No Nama Bahan Volume

1 TCM-199 1800 µl

2 Serum FBS (fetal bovine serum) 200 µl

3 PMSG (pregnant mare serum gonadotropin) 20 µl

4 hCG (human chorionic gonadotropin) 20 µl

5 Gentamycin 4 µl

Lampiran 2. Komposisi Media Fertilisasi Secara In Vitro

No Nama Bahan Volume

1 Ultra pure water 50 ml

2 NaCl (natrium/sodium chloride) 0,2629 gram

3 KCL (kalium chloride) 0,0447 gram

4 NaHCo3 (natrium bicarbonate) 0,1050 gram

5 NaH2PO4 (natrium dihydrogen phosphate monohydrate) 0,0030 gram

6 MgSO4 7H2O (magnesium sulfat-heptahydrate) 0,0061 gram

7 Sodium lactate 60% syrup 0,095 ml

8 Hepes 0,1191 gram

9 CaCl2 2H2O (calcium chloride_dihydrate) 0,0588 gram

10 Sodium pyruvate 0,0110 gram

11 Caffeine anhydrous 0,0194 gram

12 BSA (fatty acid free) fraksi V 0,2500 gram

13 Gentamycin 10 µl

Lampiran 3. Komposisi Media Kultur Secara In Vitro

A-solution

Nama Bahan Volume

NaCl 2.1763 g 4.3526 g 6.7031 g

KCl 0.0750 g 0.1500 g 0.2311 g

Na-pyruvate 0.0143 g 0.2086 g 0.0440 g

naHCO2 0.7145 g 1.4293 g 2.2011 g

Phenol red 0.6578 g 1.3157 g 2.0262 g

Ultra Pure Water Up to 250

mL

Up to 500 mL Up to 770 mL

34

B. Solution

Bahan Jumlah

Hemicalcium

laetate

0.2998 g 0.5996 g 0.7495 g 1.499 g

Ultra Pure Water 100 ml 200 ml 250 ml 500 ml

CR1aa medium

Bahan Jumlah Keterangan

A-Solution 76 ml -

B-Solution 20 ml -

BME Essensial amino acids 2 ml Sigma ; BME amino acids solution

50xB6766

MEM Non Essensial amino acids 1 ml Sigma ;MEM non- essensial amino

acids 100x m7145

L-Glutamic Acids 0,0146 g Sigma ;G-1251

Bovine Serum Albumin 0,3 g Sigma ; A-7030

Antibiotik

(penicillin-streptomycin)

1 ml/ 100 ml Sigma ; P4333-100 ml

Penicillin ; 10 000 IU

Streptomycin ; 10 mg/ml

++ FBS 10% 10 ml Gibco FBS ; 26140-079

35

Lampiran 4. Data Jumlah Embrio Terhadap Kriopreservasi dengan

Krioprotektan EG Secara in vitro (%)

Perlakuan Ulangan Jumlah embrio

Recocerry rate Viabilitas

0%

1 0 0

2 333,32 16,67

3 66,66 33,33

4 71,42 42,86

10%

1 100 66,66

2 100 66,66

3 100 100

4 85,71 87,71

20%

1 100 66,66

2 100 80

3 100 75

4 100 87,5

30%

1 80 60

2 83,37 66,66

3 100 100

4 100 81,5

36

Lampiran 5. Data Jumlah Embrio Terhadap Kriopreservasi dengan

Krioprotektan EG Secara in vitro Hasil Transformasi Arcsin

Perlakuan Ulangan jumlah embrio

Recocerry rat Viabilitas

0%

1 0 0

2 35,24 24,04

3 54,70 35,24

4 57,67 40,86

10%

1 90,00 54,70

2 90,00 54,70

3 90,00 90,00

4 67,78 67,78

20%

1 90,00 54,70

2 90,00 63,44

3 90,00 60

4 90,00 69,30

30%

1 63,44 50,77

2 65,88 54,70

3 90,00 90,00

4 90,00 64,52

37

Lampiran 6. Analisis Ragam Recoverry Embrio In vitro

Tests of Between-Subjects Effects

Dependent Variable: Pulih

Source

Type III Sum of

Squares df Mean Square F Sig.

Corrected Model 6956.027a 3 2318.676 8.895 .002

Intercept 83334.699 1 83334.699 319.700 .000

Perlakuan 6956.027 3 2318.676 8.895 .002

Error 3127.987 12 260.666

Total 93418.713 16

Corrected Total 10084.014 15

a. R Squared = .690 (Adjusted R Squared = .612)

Multiple Comparisons

Dependent Variable: Pulih

LSD

(I) Perlakuan (J) Perlakuan

Mean Difference

(I-J) Std. Error Sig.

95% Confidence Interval

Lower Bound Upper Bound

1.00 2.00 -47.5425* 11.41634 .001 -72.4166 -22.6684

3.00 -53.0975* 11.41634 .001 -77.9716 -28.2234

4.00 -40.4275* 11.41634 .004 -65.3016 -15.5534

2.00 1.00 47.5425* 11.41634 .001 22.6684 72.4166

3.00 -5.5550 11.41634 .635 -30.4291 19.3191

4.00 7.1150 11.41634 .545 -17.7591 31.9891

3.00 1.00 53.0975* 11.41634 .001 28.2234 77.9716

2.00 5.5550 11.41634 .635 -19.3191 30.4291

4.00 12.6700 11.41634 .289 -12.2041 37.5441

4.00 1.00 40.4275* 11.41634 .004 15.5534 65.3016

2.00 -7.1150 11.41634 .545 -31.9891 17.7591

3.00 -12.6700 11.41634 .289 -37.5441 12.2041

Based on observed means.

The error term is Mean Square(Error) = 260.666.

*. The mean difference is significant at the .05 level.

Lampiran 7. Analisis Ragam Viabilitas Embrio In vitro

38

Tests of Between-Subjects Effects

Dependent Variable: Viabilitas01

Source

Type III Sum of

Squares df Mean Square F Sig.

Corrected Model 4737.292a 3 1579.097 6.622 .007

Intercept 47846.094 1 47846.094 200.656 .000

Perlakuan 4737.292 3 1579.097 6.622 .007

Error 2861.385 12 238.449

Total 55444.770 16

Corrected Total 7598.676 15

a. R Squared = .623 (Adjusted R Squared = .529)

Multiple Comparisons

Dependent Variable: Viabilitas01

LSD

(I) Perlakuan (J) Perlakuan

Mean Difference

(I-J) Std. Error Sig.

95% Confidence Interval

Lower Bound Upper Bound

1.00 2.00 -41.7600* 10.91899 .002 -65.5504 -17.9696

3.00 -36.8750* 10.91899 .005 -60.6654 -13.0846

4.00 -39.9625* 10.91899 .003 -63.7529 -16.1721

2.00 1.00 41.7600* 10.91899 .002 17.9696 65.5504

3.00 4.8850 10.91899 .663 -18.9054 28.6754

4.00 1.7975 10.91899 .872 -21.9929 25.5879

3.00 1.00 36.8750* 10.91899 .005 13.0846 60.6654

2.00 -4.8850 10.91899 .663 -28.6754 18.9054

4.00 -3.0875 10.91899 .782 -26.8779 20.7029

4.00 1.00 39.9625* 10.91899 .003 16.1721 63.7529

2.00 -1.7975 10.91899 .872 -25.5879 21.9929

3.00 3.0875 10.91899 .782 -20.7029 26.8779

Based on observed means.

The error term is Mean Square(Error) = 238.449.

*. The mean difference is significant at the .05 level.

39

Lampiran 8. Dokumentasi Penelitian

Ovarium sapi bali Oosit setelah di fertilisasi

Embrio umur 48 jam Kriopreservasi embrio dengan straw

Proses pengamatan oosit Mikropipet dan tip

Bahan untuk medium maturasi Bahan untuk medium fertilisasi

40

Timbangan analitik Stirrer

Centrifuge Kontainer penyimpanan sperma beku

Pipet yang dimodifikasi Bunsen untuk memodifikasi pipet

Scalpel, pinset dan gunting bedah Minitube

41

Oven untuk sterilisasi kering Inkubator

Bahan untuk fiksasi Bahan untuk pewarnaan

Tissu dan alkohol 70% untuk sterilisasi Disk maturasi dan fertilisasi

42

Media transport NaCl 0.9% Syringe filter

Mikroskop stereo Mikroskop inverted

43

RIWAYAT HIDUP

ASRI PUSFITA lahir di Luwu Timur, pada tanggal 26

Agustus 1994 sebagai anak kedua dari lima bersaudara dan

juga sebagai satu-satunya anak perempuan dari lima

bersaudara dari pasangan Bapak Misrianto dan Ibu Sukini.

Jenjang pendidikan formal yang pernah di tempuh yakni

Sekolah Dasar (SD) di SD Negeri 155 Karya Mukti Luwu

Timur lulus pada tahun 2007, dan setelah lulus pada tahun

2007, penulis melanjutkan Sekolah Tingkat Menengah Pertama (SMP) di SMP

Negeri 1 kalaena dan lulus pada tahun 2010 dan setelah lulus pada tahun 2010.

Kemudian melanjutkan Sekolah Menengah Atas (SMA) di SMA Negeri 1

Kalaena dan lulus pada tahun 2013. Setelah menyelesaikan Sekolah Menengah

Atas, penulis diterima di Perguruan Tinggi Negeri (PTN) melalui Jalur Seleksi

Nasional Masuk Perguruan Negeri (SNMPTN) di Fakultas Peternakan,

Universitas Hasanuddin, Makassar. Sekarang sedang menempuh pendidikan SI di

Fakultas Peternakan Universitas Hasanuddin, Makassar. Organisasi yang pernah

diikuti selama menjadi mahasiswa di Universitas Hasanuddin, jurusan peternakan

yaitu Himpunan Mahasiswa Produksi Ternak (HIMAPROTEK-UNHAS) dan

menjabat sebagai anggota dari biro dana kesejahteraan. Di luar kampus penulis

juga mengikuti Organisasi yaitu himpunan Himpunan Mahasiswa Jawa Timur

(HIMAJATI-Makassar) dan menjabat sebagai koordinator minat dan bakat.

Penulis pernah juga mengikuti unit kegiatan mahasiswa Praja Muda Karana

Universitas Hasannudin (UKM-PRAMUKA) bidang Drum Corps, memilih

sebagai pemain CG ( colour Gate ).