Pengamatan genetik dari metabolisme Asam Trikarboksilat selama Siklus Hidup Plasmodium falciparum

PROSEDUR PERCOBAAN

Gene KO Protokol WT D10 dan NF54 P. falciparum parasit transfected dengan masing-masing konstruk KO dan dikenai pilihan positif dan negatif. Penghapusan gen target yang dimediasi melalui ganda Crossover rekombinasi. Metabolit Pelabelan dan HPLC-MS tidak terinfeksi sel darah merah dari darah heparinized yang mengendap melalui 65% Percoll untuk menghapus retikulosit terkontaminasi apapun, trombosit, dan sel-sel darah putih sebelum parasit kultur. Budaya parasit Mycoplasma bebas yang erat disinkronisasi dan berkembang tahap akhir trofozoit, dan sel darah merah yang terinfeksi diisolasi dengan kepadatan sentrifugasi menggunakan langkah gradien Percoll (35%, 60%, dan 65%). Puri parasit fi ed (akhir trofozoit ke skizon tahap) yang incu- tertahan dengan media label untuk 4 jam. Semua isotop yang digunakan dalam penelitian ini (U-13C glutamin, glukosa U-13C, dan 2-13C-glukosa) yang 99% murni dan dibeli dari Cambridge Isotop Laboratories. Ekstrak metabolit metanol dikeringkan di bawah aliran gas N2 dan dilarutkan dalam 200 ml (empat kali volume ekstraksi asli) dari HPLC- kelas H2O. Resolusi tinggi Data MS dikumpulkan pada fi Thermo Ilmiah c Exactive spektrometer massa dalam mode negatif menggunakan ion-pasangan C18 tography chroma- mengikuti metode yang dipublikasikan sebelumnya (Lu et al., 2010). Data metabolit dianalisis menggunakan MAVEN (Melamud et al., 2010), dan isotopomersdikoreksi untuk alami 13C menggunakan metode didirikan (Fanetal. 2014) .Data dari teknik replikasi dibuat rata- rata, lalu melaporkan kesalahan di ulangan biologi. Semua nilai p dihitung dengan uji t dua sisi. Data mentah untuk semua metabolit yang disediakan pada Tabel S5 (untuk U-13C glutamin label dari tipe liar dan garis KO) dan Tabel S6 (untuk beberapa isotop stabil pelabelan dari tipe liar dan karena garis KO).

REVIEW

Dengan menggabungkan manipulasi genetik dan analisis metabolisme secara rinci belum pernah terjadi sebelumnya, penelitian ini secara signifikan menjelaskan pemahaman kami metabolisme TCA dalam parasit malaria dalam tubuh manusia, P. falciparum. Derivasi dari 11 baris KO juga menyediakan sumber daya untuk penyelidikan masa depan konsekuensi biologis dari gangguan siklus TCA. Studi juga mengungkapkan beberapa temuan kunci, termasuk : 1. Siklus TCA tidak penting untuk kelangsungan hidup parasit dalam tahap darah aseksual tetapi diperlukan untuk transmisi parasit 2. Metabolisme TCA dapat memanfaatkan sumber karbon yang berbeda dan mengubah jalur yang fluxes ketika ux fl normal terganggu3. Plastisitas metabolik ini sangat penting bagi parasit untuk memenuhi kebutuhan bioenergi di beberapa tahapan siklus hidup yang kompleks mereka. Parasit malaria memiliki siklus TCA oksidatif kanonik dengan mayoritas TCA fluks dalam tahap darah aseksual fl karena dari glutamin yang diturunkan a-ketoglutarat untuk malat (Angka 1, 2, dan 6). Di luar pengamatan ini, kami menunjukkan bahwa mitokondria parasit dapat mengubah uxes fl metabolisme melalui jalur alternatif ketika satu rute pemanfaatan karbon diblokir. Plastisitas metabolik ini digambarkan oleh pengamatan kami pemanfaatan substrat di galur mutan kurang berbagai enzim siklus TCA (Angka 3, 6, dan S4). Sebagian besar jalur TCA KO menunjukkan signifikan elevasi fi kan dalam pemanfaatannya dari glycolytically berasal karbon dalam reaksi TCA tersisa. Dalam kasus ekstrim dari penghapusan KDH, yang pra- ventilasi parasit dari menggunakan glutamin sebagai sumber karbon untuk reaksi TCA, parasit mengeluarkan glutamat yang diturunkan glukosa ke dalam media.

Data morfologi ditunjukkan dengan melanjutkan dari glutamat ke Malate seperti pada WT , di DKDH parasit, itu hasil dari malat yang diturunkan glukosa untuk glutamat, memanfaatkan MQO untuk IDH segmen siklus. Plastisitas metabolik ini memungkinkan berbagai sumber karbon untuk memberi makan siklus TCA di berbagai kali dalam komplikasi- siklus hidup berdedikasi parasit. Penelitian sebelumnya di parasit Apicomplexan terkait, Toxoplasma gondii , memberikan bukti untuk asam-aminobutyric g (GABA) shunt, di mana suksinat yang dihasilkan langsung dari-ketoglutarat melalui aksi GABA a- ketoglutarat aminotransferase, dekarboksilase asam glutamat, dan SUC- cinic semialdehid dehidrogenase en- zymes. Dengan ekstensi, telah diusulkan bahwa shunt GABA yang sama mungkin juga beroperasi di P. falciparum, meskipun gen yang mengkode semua enzim yang diperlukan untuk shunt tidak dapat dideteksi dalam P. falciparum genom. Namun, kami menemukan bahwa tingkat +4 suksinat dalam parasit DKDH label dengan U-13C glutamin sangat rendah, yang tidak akan diharapkan jika GABA shunt yang kuat adalah untuk memotong reaksi KDH untuk memberi makan TCA hilir reaksi. Mengingat kurangnya bukti untuk enzim GABA shunt di P. falciparum, kami mengusulkan bahwa rendahnya tingkat +4 suksinat di garis DKDH kemungkinan produk dari luas dilestarikan-tergantung ketoglutarat sebuah oksigenase, yang menghasilkan nate succi- melalui dekarboksilasi besi dan tergantung oksigen dari-ketoglutarat. Enzim ini melaksanakan berbagai hidroksilasi protein dan histon demethyla- reaksi tion, dan pengkodean gen mereka yang ditemukan di P. falciparum genom (misalnya, lisin-spesifik histone demethylase 1, PF3D7_1211600, dan JmjC domain yang mengandung protein, PF3D7_0809900). Pada tahap darah aseksual, parasit yang sangat tahan terhadap gangguan metabolisme TCA; enam dari delapan TCA enzim siklus dapat dihapus tanpa cacat pertumbuhan terdeteksi. Dengan tidak adanya redundansi, data ini menunjukkan bahwa balik penuh siklus TCA tidak penting dalam tahap darah aseksual. Metabolisme TCA secara bertahap darah meluas ke jalur tergantung TCA. Misalnya, pemberian suksinil-CoA melalui siklus TCA ke jalur biosintesis heme tidak penting untuk darah-tahap P. falciparum. Itu mengejutkan untuk mengamati bahwa gangguan siklus TCA pada langkah KDH tidak memiliki efek yang signifikan pada diferensiasi seksual dan pembentukan gamet .

Penelitian sebelumnya telah menunjukkan enzim TCA di gametosit menunjukkan pentingnya fungsional dari siklus TCA di gametocytogenesis. Namun, hasil kami dengan garis DKDH menunjukkan bahwa balik lengkap dari siklus TCA tidak penting untuk diferensiasi seksual. Sebaliknya, garis parasit kurang aconitase gagal menghasilkan gametosit matang dan gamet .Hasil memberikan bukti genetik untuk con fi rm pentingnya aconitase di gametocytogenesis.

Kebutuhan spesifik untuk aconitase untuk pengembangan gametocyte kemudian mungkin karena sebagai berikut:

1. Aconitase diperlukan untuk produksi NADPH mitokondria, yang sangat penting untuk menjaga keseimbangan redoks mitokondria dan pertahanan terhadap kerusakan oksidatif dan mempertahankan zymes tergantung NADPH biosintesis en- dan

2. Aconitase mengkonversi sitrat untuk metabolit hilir, mencegah akumulasi sitrat ke tingkat tially beracun materi bagi. Fakta bahwa tahap aseksual Daco dan DIDH parasit tidak terpengaruh mungkin menunjukkan bahwa siklus hidup 48-jam adalah tidak memadai untuk menghasilkan efek mematikan, sedangkan 7-10 hari diperlukan untuk hasil pematangan gametocyte di formulasi akurat dari kerusakan luar ambang tolerabilitas dalam parasit Daco. Berbeda sekali dengan tahap darah aseksual, pengembangan parasit dalam nyamuk benar-benar menghambat oleh gangguan siklus TCA . Hasil ini jelas menetapkan perlunya evolusi untuk pemeliharaan TCA cycle oleh P. falciparum, karena penghambatan transmisi melalui nyamuk akan membuat parasit punah. Pengamatan ini juga menunjukkan saklar utama dalam fungsi mitokondria sebagai transisi parasit dari vertebrata untuk tuan invertebrata. The ookinete motil harus bertahan hidup di luar sel inang selama 24 jam dan menyerang epitel midgut nyamuk. Sedangkan parasit tahap darah-dapat berkembang melalui tingkat substrat asi gener- dari hanya dua molekul ATP per glukosa melalui glikolisis, kelangsungan hidup nyamuk dapat menempatkan nilai yang jauh lebih besar pada pembangkit energi yang lebih ekonomis melalui oksidatif fosforilasi didukung oleh TCA siklus. Pada baris DKDH, masukan dari TCA diturunkan elektron ke rantai transpor elektron mitokondria akan secara signifikan berkurang, sehingga mengurangi mitokondria oksidatif efisiensi, berpotensi menyebabkan parasit untuk menangkap karena energi insufisiensi. Pengamatan pembangunan tahap nyamuk yang rusak oleh P. berghei dengan KO gen dari SDH, NADH dehidrogenase, dan BCKDH juga memberikan dukungan untuk argumen ini . Menariknya, kami menemukan bahwa dua dari enzim siklus TCA, FH dan MQO, bisa notbe evenin tahap darah aseksual genetik ablated. Ketidakmampuan untuk mengganggu gen MQO mengejutkan, karena kami sebelumnya telah menunjukkan bahwa aktivitas biokimia enzim dapat fungsional terganggu di yDHOD parasit transgenik. Salah satu alasan yang mungkin bisa menjadi fungsi struktural non-enzimatik penting dari MQO di Biogenesis mitokondria. Penafsiran ini dukungan porting oleh pengamatan bahwa MQO kekal antara semua parasit apicomplexan, termasuk spesies Cryptosporidium, yang telah kehilangan semua protein rantai transpor elektron mitokondria lainnya. Esensialitas dari FH, di sisi lain, dapat dijelaskan oleh perannya dalam siklus fumarat melayani purin penyelamatan jalur. Parasit Plasmodium tidak dapat mensintesis purin dan sepenuhnya bergantung pada jalur purin penyelamatan. Dua enzim penting dalam jalur ini adalah thetase sindrom adenylosuccinate dan liase adenylosuccinate. Enzim ini memanfaatkan aspartat dan menghasilkan fumarat dalam proses konversi inosin monofosfat untuk AMP. Mitokondria FH bisa mengkonversi fumarat berasal dari purin penyelamatan ke malat dalam mitokondria, yang dapat diangkut ke sitosol dan diubah kembali ke aspartat melalui reaksi berurutan dengan dehidrogenase malat dan aspartat aminotransferase. Fakta bahwa kita benar-benar dapat menghilangkan TCA diturunkan malat di beberapa lini KO menunjukkan bahwa peran FH dalam siklus TCA adalah dibuang. Esensialitas dari FH Oleh karena itu, kemungkinan terkait dengan persyaratan jalur purin penyelamatan. Sangat menarik untuk dicatat bahwa dua enzim mitokondria penting untuk kelangsungan hidup parasit dalam tahap darah, DHOD dan FH, muncul untuk melayani biosintesis pirimidin dan purin penyelamatan, masing-masing menemukan bahwa PEPC bisa tersingkir tetapi hanya ketika parasit disediakan dengan malat atau fumarat dalam medium. Para penulis ini menyarankan bahwa PEPC merupakan enzim kunci dalam P. falciparum metabolisme karbon pusat dengan memberikan karbon anaplerotic untuk siklus TCA. Namun, garis Daco, DCS, dan DIDH kami tumbuh normal meskipun ketidakmampuan mereka untuk incorpo- tingkat karbon anaplerotic dari glukosa menjadi reaksi TCA hilir. Selain itu, kelangsungan hidup parasit DIDH menunjukkan bahwa produksi NADPH mitokondria mungkin tidak penting dalam tahap darah aseksual. Akibatnya, kita atribut esensial dari PEPC faktor selain pemeliharaan siklus TCA. Analisis dari atovakuon-diperlakukan yDHOD transgenik terungkap lain metabolik yang tak terduga fi nding: tate oxaloace- ini jelas tidak diangkut ke dalam mitokondria, tapi malat adalah (Angka 4 dan S5). Hal ini mengejutkan mengingat bahwa parasit mitokondria dicarboxylate-tricarboxylate pembawa (PfDTC) secara efisien transportasi oksaloasetat in vitro. Tidak adanya 2 dan +5 sitrat, meskipun tingkat normal aspartat (diamati sebagai pengganti untuk oksaloasetat), berpendapat bahwa PfDTC tidak mengimpor oksaloasetat ke chondrion mito- in vivo (Angka 4 dan S5). Data dari garis DKDH / DIDH diperlakukan dengan atovaquone juga mendukung argumen ini (Figure S5); sinyal residu (+2 +5 dan sitrat) kemungkinan besar karena efek tertunda atovaquone, yang ditambahkan concur- rently dengan 13C-glukosa dengan budaya selama pelabelan 4-jam. Pengamatan ini juga menjelaskan kecenderungan parasit untuk mensekresi malat ketika menggunakan glutamin sebagai sumber karbon untuk metabolisme TCA. Secara khusus, mitokondria a-ketoglutarat / transportasi malat dapat inheren terkait melalui aksi dari antiporter (mungkin PfDTC). Itu menarik untuk dicatat bahwa, setelah pengobatan atovakuon, tingkat +3 suksinat akumulasi ke tingkat yang jauh lebih tinggi di-D10 parasit WT ketika diberi label dengan glukosa U-13C (Gambar S5). Karena masukan dari glukosa ke dalam siklus TCA terhambat di bawah kondisi ini, salah satu sumber potensial dari +3 suksinat bisa menjadi reaksi kebalikan dari SDH yang mengurangi fumarat untuk suksinat. Aktivitas reduktase Fumarat diusulkan oleh studi sebelumnya (Takashima et al., 2001). Pada titik ini, sifat dari donor elektron untuk reaksi ini masih belum jelas, tetapi bisa menjadi tingkat tinggi ubiquinol yang akan menumpuk pada penghambatan kompleks sitokrom BC1. Demonstrasi kami bahwa atovaquone obat antimalaria elim- inated masukan karbon anaplerotic dari glukosa menjadi TCA meta bolism berimplikasi pada ampuh efficacy elektron mitokondria inhibitor rantai transpor dalam memblokir transmisi parasit ke nyamuk. Permintaan yang lebih besar untuk kontribusi mitokondria untuk bioen- ergetics dalam tahap serangga akan membuat rantai transpor elektron mitokondria, dan siklus TCA yang bilangan prima. Hasil kami menunjukkan bahwa mitokondria inhibitor rantai transpor elektron tidak hanya mempengaruhi respirasi parasit tetapi juga mengganggu siklus TCA (Figures4 dan S5).Alasan kemungkinan untuk sensitivitas indah dari pengembangan tahap nyamuk parasit terkena di host mamalia untuk elektron mitokondria rantai transpor inhibitor. Sedangkan hasil kami jelas membantah potensi inhibitor siklus TCA sebagai obat antimalaria mengarah, karena mereka tidak mungkin untuk menghambat pertumbuhan parasit darah-tahap, senyawa tersebut bisa melayani agen transmisi-blocking sebagai ampuh. Satu TCA enzim siklus dengan potensi untuk menjadi target obat yang menarik adalah FH, penghambatan yang akan efektif pada vertebrata dan invertebrata tahap parasit. Selektif senyawa beracun dapat dibayangkan karena parasit memiliki tipe I FeS tergantung FH, yang secara substansial berbeda dari enzim tipe II manusia (Woods et al., 1988). Singkatnya, penelitian ini menggambarkan analisis yang komprehensif fungsi siklus TCA dalam parasit manusia P. falciparum. Parasit malaria mempertahankan siklus TCA oksidatif dengan utama fluks disediakan oleh glutamin. Dalam Daco asites-partai pematangan gametosit dicegah, mungkin karena akumulasi kerusakan yang berkaitan dengan hilangnya produksi NADPH mitokondria dan / atau tingkat tinggi sitrat. Pada baris DKDH, parasit darah-tahap metabolisme glukosa menjadi glutamat, sedangkan parasit serangga-tahap gagal untuk bertahan hidup. Senyawa menargetkan rantai transpor elektron mitokondria, seperti atovakuon, benar-benar memblokir fluks metabolit melalui siklus TCA. Penelitian kami juga mengungkapkan bahwa parasit memiliki metabolisme karbon fleksibel, yang mungkin penting untuk membuat transisi antara lingkungan yang berbeda ditemui selama siklus hidup. Selain itu, ketersediaan 11 baris KO berbeda dijelaskan di sini menyediakan sumber daya penting untuk menyelidiki konsekuensi biologis mengganggu siklus TCA dalam berbagai kondisi, seperti pembatasan nutrisi, di P. falciparum.KESIMPULANObat antimalaria baru sangat dibutuhkan untuk bentuk resistan terhadap obat dari parasit malaria Plasmodium falciparum. Transpor elektron mitokondria adalah target dari kedua antimalaria, dan yang baru. Di sini, kita menggambarkan 11 genetik knockout (KO) baris yang menghapus enam dari delapan mitokondria asam trikarboksilat (TCA) enzim siklus. Meskipun semua KO TCA tumbuh normal secara bertahap darah aseksual, rute metabolik defisiensi dihentikan siklus hidup pro- gression di tahap-tahap selanjutnya. Secara khusus, aconitase KO parasit ditangkap sebagai gametosit akhir, sedangkan-ketoglutarat-de dehidrogenase fi sien parasit gagal mengembangkan ookista dalam nyamuk. Analisis spektrometri massa dari TCA parasit mutan 13C-isotop berlabel menunjukkan bahwa P. falciparum memiliki fleksibilitas dalam metabolisme TCA. Fleksibilitas ini terwujud melalui perubahan jalur dan melalui diubah pertukaran substrat antara sitosol dan kolam mitokondria. Penelitian ini menunjukkan bahwa plastisitas metabolisme mitokondria sangat penting untuk pengembangan parasit.