1. PENDAHULUANSalah satu topic yang dibahas permasalahan lingkungan hidup adalah mengenai dampak dari perubahan lingkungan akibat adanya industrialiasi massif. Hal ini berimplikasi munculnya polutan-polutan yang membahayakan lingkungan, hewan, tumbuh-tumbuhan dan manusia yang hidup di sekitarnya. Polutan ini bisa berbentuk benda padat, cair, gas, bahkan radiasi. Salah satu dampak yang sangat berbahaya adalah mempengaruhi kondisi fisik manusia mulai dari permukaan kulit hingga struktur molekul terkecil seperti DNA. Perubahan-perubahan yang terjadi pada DNA bisa mengarah kepada mutasi bahkan kecacatan yang diturunkan ke generasi berikutnya. Untuk mendeteksi perubahan atau kerusakan yang terjadi pada struktur DNA manusia tidaklah mudah, butuh metode dan alat yang baik untuk bisa membaca hal tersebut.Oleh karena itu dipilih penelitian yang dilakukan oleh Rogers dkk. (2001). Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui penggunaan alat Biosensor Serat Optik untuk mendeteksi adanya kerusakan DNA pada manusia. Metode yang digunakan adalah menggunakan biosensor cepat dan sensitif untuk mendeteksi kerusakan oksidatif DNA akibat paparan-radiasi atau paparan-kimiawi (biosensor hibridisasi). Hasil penelitian menunjukan bahwa penggunaan model biosensor hibridisasi mampu mendeteksi kerusakan oksidatif DNA akibat paparan-radiasi dan paparan-kimiawi, penggunaannya mendapatkan hasil lebih cepat (sekitar 2 jam) dan lebih mudah dibandingan teknik elektroforesis atau teknik kromatografi untuk mengukur kerusakan oksidatif. Penggunaan biosensor ini juga secara signifikan lebih sensitif untuk mengionisasi radiasi dibandingkan teknik biosensor lainnya.

2. RINGKASAN JURNALPenelitian ini dilakukan oleh Kim R. Rogers, Alma Apostol, Steen, J. Madsenb, dan Charles W. Spencer dengan judul Fiber optic biosensor for detection of DNA damage. Hasil penelitian ini diterbitkan dalam jurnal Analytica Chimica Acta Vol. 444 halaman 5160 pada tanggal 12 Oktober 2001.2.1. Latar BelakangSalah satu tujuan untuk mengurangi ketidakpastian dalam mengukur paparan terhadap manusia dan ekosistem adalah dengan mengenali karakter polutan berbahaya yang mungkin mengkontaminasi lingkungan tersebut. Hambatan yang ada adalah dalam proses pengambilan sampel dan analisis laboratorium pada lingkungan tercemar dan sampel biologis membutuhkan waktu tidak cepat dan biaya yang mahal, hal ini berakibat jumlah sampel menjadi terbatas. Penggunaan indicator penelitian yang cepat dan tidak mahal untuk mengukur potensi paparan yang berhubungan dengan target biologis seperti DNA lebih menguntungkan untuk proses pengukuran paparan.Kerusakan oksidatif pada asam nukleat dapat menimbulkan efek yang serius pada sel-sel eukariot, misal menyebabkan apoptosis atau transformasi maligna. Bermacam-macam sumber polutan kimia dan radiasi bisa menjadi penyebab kerusakan DNA seluler. Oleh karena itu, penelitian deteksi bahan kimia penyebab kerusakan oksidatif DNA menjadi perhatian penting untuk dapat mengukur proses paparannya.Beberapa metode telah digunakan untuk mengukur potensiasi genotoksik dari substansi kimia. Lebih spesifik, metode yang digunakan untuk mengukur kerusakan oksidatif DNA akibat radiasi ion atau paparan kimiawi antara lain elektroforesis, elektroforesis kapiler, dan HPLC, sebagaimana juga penggunaan teknik optikal, akustik dan elektromagnetik. Teknik-teknik ini sangat sensitif dan cocok digunakan dalam analisis laboratorium kerusakan oksidatif (biasanya pada pemecahan single-strand) pada DNA terbuka atau DNA terisolasi dari organisme yang terpapar. Akan tetapi, karena teknik ini membutuhkan denaturasi alkalin yang diikuti pemecahan bentuk double- dan single-strand, dibutuhkan waktu yang lama dan biaya yang mahal. Konsekuensinya, diperlukan metode baru yang lebih cepat dan lebih murah untuk pengukuran sampel lingkungan yang berpotensi menyebabkan efek genotoksik.2.2. Tujuan PenelitianPenelitian ini bertujuan mencoba metode deteksi kerusakan oksidatif DNA baru yang cepat dan murah serta sensitif dengan menggunakan biosensor pada paparan radiasi atau paparan kimiawi.2.3. Metode Penelitian2.3.1. Tempat dan Waktu PenelitianPenelitian ini dikerjakan bertempat di National Exposure Research Laboratory, Las Vegas, Nevada, USA. Waktu penelitian tidak diketahui.2.3.2. Material dan Instrumentasi2.3.2.1. Material dan Penyanggaa. Penyanggai. PBS (Na2HPO4 10mM; NaCl 100mM; pH 7,4)ii. 2x SSC (Na3C6H5O7 300mM; NaCl 30 mM; pH 7,0)iii. PerfectHybTM (Sigma)b. Asam nukleati. Oligonucleotida dari Life Technologiesa) Captured: biotin-GGG GAT CGA AGA CGA TCA GAT ACC GTC GTA GTC TTA ACb) Reported: BodipyTM-GTT AAG ACT TCG ACG GTA TCT GAT CGT GTT CGA TCC CCii. Streptavidin (SA)iii. Succinimidyl-4-maleimidobutyrate (GMBS), iv. Mercaptopropyltriethoxysilane (MTS)v. 3-Morpholinosydnonimine (SIN-1)2.3.2.2. Instrumeni. Fluorimeter serat optikii. 635 nm laser diodeiii. Detektor fotodiodaiv. Heating chamber PCR System 9700v. Probe temperaturvi. Monitor sistemvii. Software Analyte 2000viii. Software ExcelTM2.3.3. Metode Pengumpulan DataPrinsip kerja optic pada penelitian ini melibatkan fluorosensi reflektan internal menyeluruh menggunakan format serat meruncing (tapered). Secara singkat, saat sinar disebarkan ke serat, sebuah gelombang cepat meningkatkan ikatan penangkap fluorosens ke permukaan serat. Hal ini muncul karena gelombang cepat tadi meluruh secara eksponensial dengan jarak yang ada dari permukaan serat membuat radius eksitasinya melebar sekitar 100 nm ke medium penyangga (buffer). Sebagian probe emisi (BDP 635/650) ditangkap dan disebarkan kembali melewati serat ke arah detector. Demikian, dengan pengecualian ikatan non-spesifik dari oligonukleotida berlabel, hanya urutan terlapor (reported sequence) yang terhibridisasi untuk urutan tertangkap (capture sequence) bergerak yang terdeteksi.Kerusakan akibat radiasi dihasilkan dari paparan probe oligonukleotida label-BDP terhadap emesi energy tinggi (misal sinar-X dengan kekuatan 6 meV) dari akselerator linier. Dosis yang digunakan bervariasi antara 20 hingga 1000 cGy. Hasil spectrum fluorosensi direkam sebelum dan sesudah terkena paparan ion radiasi dengan spektrofluorometer (Perkin-Elmer LS-50). Untuk kerusakan oksidatif akibat kimiawi, oligonukleotida label-BDP dipaparkan dengan SIN-1 selama 60 menit dengan konsentrasi antara 250 M hingga 3.0 mM. Reaksinya berhenti dengan pemberian mannitol (45 mM).Proses hibridisasi memiliki urutan sebagai berikut:1) Serat terlapisi SA diinkubasi selama 2 jam untuk mendapatkan oligonukleotida tangkap terbiotinilasi pada 50 nM dalam 2x penyangga SSC.2) Setelah immobilisasi oligonukleotida tangkap terbiotinilasi pada serat terlapis streptavidin, serat optic dipasang dalam aliran sel yang dikontrol suhunya.3) Oligonukleotida tangkap terbiotinilasi lalu dicuci dengan 15 ml 2x penyangga SSC.4) Untaian komplementer fluorosensi berlabel (50 nM dalam HB) kemudian muncul saat prosedur penghentian aliran dan diinkubasi sekitar 10 menit dalam suhu ruangan.5) Setelah respon stabil hibridisasi direkam, penyangga hibridisasi tadi di ganti kembali ke 2x penyangga SSC.6) Serat diamati kembali hingga kondisi benar-benar stabil (sekitar 2 menit).7) Untuk penggunaan analisis kurva pencairan, penyangga hibridisasi berisi reporter tadi dibiarkan dalam sel aliran.8) Temperatur dalam sel meningkat dari 25 ke 74oC, dengan rerata 3,6oC/menit, kemudian turun kembali ke 30oC. 9) Reporter terlabel kemudian diurai kembali dari permukaan serat dengan menukar penyangga 2x SSC ke 10 mM NaOH (diinkubasi selama 2 menit) diikuti dengan pemberian 15 ml penyangga 2x SSC.10) Oligonukleotida reporter dapat dihibridisasi kembali untuk menangkap serat berlapis oligonukleotida.11) Menggunakan protocol penguraian ini, 10 sampel bisa di-run dalam serat yang sama. Kontrol positif (misal, DNA tidak rusak) di-run pada tiap serat.2.3.4. Metode AnalisisWalaupun intensitas sinyal awal pada control percobaan bervariasi akan tetapi dalan setiap run terpisah untuk serat yang sama atau antara run awal untuk serat yang berbeda, hasil perubahan kurva dissosiasi temperatur terdapat kemiripan. Untuk menghitung diferensiasi intensitas sinyal diantara percobaan, nilai sinyal dinormalkan dihitung dengan cara berikut:

NS = S0 St

dimana NS adalah sinyal dinormalkan, S0 sinyal saat waktu 0, dan St saat sinyal pada watu t. Kemiringan (slopes) dihitung dengan least square regression dan diubah dalam bentuk persentase dari kemiringan untuk percobaan pertama atau control dari tiap serat.2.4. Hasil Penelitian2.4.1. Hibridisasi urutan reporter ke urutan reporter ter-immobilisasiPenambahan oligonukleotida reporter label-Bodipy (613 ng/ml) ke serat capture terlapis-oligonukleotida menghasilkan peningkatan fluorosensi yang signifikan. Peningkatan sinyal, indikasi hibridisasi, mencapai kondisi stabil dalam waktu 5 menit. Perubahan penyangga menghasilkan penurunan sementara tingkat fluorosensi yang diikuti dengan sinyal yang stabil. Kondisi sinyal stabil ini disebabkan oleh perubahan pH dan kekuatan ionic antara penyangga HB dan penyangga pencuci. Perubahan penyangga diketahui mempengaruhi kedua hibridisasi dan hasil kuantum dari warna fluorosensi.2.4.2. Profil peleburan dan pendinginanSetelah kondisi stabil hibridisasi tercapai dengan terbentuknya oligonukleotida reporter, temperatur dari aliran sel meningkat linier hingga 70oC kemudian turun ke 30oC. Indikasi pemisahan ikatan dipengaruhi temperatur (yakni, peleburan), sinyal fluorosensi turun diikuti peningkatan temperatur pada level sekitar 60oC. Kemudian, saat temperatur bergerak turun, sinyal mengalami kenaikan sebagai indikasi re-hibridisasi (pendinginan) dari urutan reporter ke urutan capture terimmobilisasi.Untuk menilai efek dari temperatur terhadap warna fluorosensi dari reporter, spectrum fluorosensi dari reporter direkam dalam cairan dengan suhu 25 dan 80oC. Temperatur tidak menunjukkan efek terhadap spectrum.Teknik biosensor hibridisasi-terlapor memakai berbagai transduser dan mekanisme reporter. Ada beberapa reporter oligonukleotida dengan teknik biosensor ini, salah satunya melibatkan biosensor mikroelektroda yang menggunakan enzim oligonukleotida reporter. Walaupun ada beberapa perbedaan pada teknik biosensor dengan teknik mikroelektroda, namun pada hasil profil peleburan, termasuk bentuk slight upward bow pada kurva peleburan, adalah cukup mirip.2.4.3. Efek ion radiasi pada profil peleburanUntuk menilai setiap efek langsung dari radiasi pada fluorosensi karakter warna oligonukleotida, spectrum fluorosensi dari control dan dosis tertinggi sampel direkam dalam cairan. Kedua spectrum terlihat mirip dengan error percobaan hibridisasi yang diamati disebabkan adanya perubahan hibridisasi akibat kerusakan oksidatif dari bentuk DNA oligonukleotida reporter. Hasil pengamatan memperlihatkan nilai miring ternormalisasi dari kurva peleburan mengindikasikan paparan oligonukleotida reporter meningkatkan dosis ion radiasi. Ion radiasi diketahui mampu menghasilkan bermacam kerusakan DNA termasuk alterasi basa dan pemecahan ikatan. Perubahan ini dapat dilihat pada transisi rendah temperatur (peleburan).Walaupun banyak teknik biosensor yang mempelajari aplikasi hibridisasi, namun masih sedikit yang diketahui tentang pengukuran kerusakan DNA dan aplikasi potensial untuk mendeteksi genotoksin kimia. Ada beberapa metode yang cukup sensitif untuk menilai kerusakan DNA dan deteksi genotoksin, seperti metode elektroforesis kapiler, penilaian fluorosensi differensial, dan elektroforensis sel tunggal, namun metode tersebut sangat kompleks, menghabiskan banyak waktu dan kurang sesuai digunakan dalam metode analisis di lapangan.2.4.4. Efek kerusakan akibat paparan-kimiawi pada profil peleburanBiosensor hibridisasi juga sensitif digunakan pada deteksi kerusakan oksidatif akibat efek paparan kimiawi pada oligonukleotida reporter. SIN-1 secara spontan mengurai sistem cairan untuk membentuk nitrit oksida dan superoksida yang berlanjut membentuk peroksinitrit dan radikal hidroksil. Bentuk-bentuk radikal ini dianggap bertanggungjawab untuk SIN-1 menginduksi kerusakan oksidatif dari DNA terisolasi. Pengaruh SIN-1 ini mirip dengan tipe kerusakan oksidatif yang disebabkan oleh paparan radiasi.

3. PEMBAHASANHasil penelitian di atas dengan menggunakan teknik biosensor serat optic hibridisasi mampu mendeteksi dan mengukur kerusakan oksidatif DNA, baik akibat paparan radiasi maupun kimiawi. Penggunaan aplikasi biosensor serat optic model hibridisasi ini sangat potensial digunakan dalam biologi molekuler. Biosensor ini belum banyak digunakan dalam mendeteksi atau mengukur kerusakan DNA, namun, beberapa kemiripan dalam karakteristik yang tampak pada hasil penelitian sangat mendukung untuk bisa diaplikasikan. Konsekuensinya, sangat dimungkinkan kemampuan mengukur kerusakan DNA yang dilaporkan dalam penelitian teknik biosensor ini dapat digunakan dalam teknik-teknik biosensor yang sebelumnya.Untuk penelitian ke depannya, sangat dimungkinkan mencoba teknik biosensor hibridisasi ini untuk mendeteksi kerusakan-kerusakan DNA pada sel-sel kanker. Pengukuran kerusakan DNA pada sel kanker diharapkan bisa menentukan lebih cepat stadium kanker, sehingga secara medis bisa lebih tepat menentukan jenis pengobatan dan prognosis pasien.

4. PENUTUP4.1. KesimpulanTeknik biosensor model hibridisasi mampu mendeteksi kerusakan oksidatif DNA akibat paparan radiasi dan kimiawi. Penilaiannya dapat dihasilkan dengan cepat (sekitar 2 jam) dan lebih simple dalam penggunaannya dibandingkan dengan model elektroforesis atau kromatografi. Penilai biosensor ini juga secara signifikasi sensitif untuk ion radiasi dibandingkan penilai biosensor lainnya.4.2. SaranSebagai penelitian lanjutan dimungkinkan mencoba teknik biosensor hibridisasi ini untuk mendeteksi kerusakan-kerusakan DNA pada sel-sel kanker. Pengukuran kerusakan DNA pada sel kanker diharapkan bisa menentukan lebih cepat stadium kanker, sehingga secara medis bisa lebih tepat menentukan jenis pengobatan dan prognosis pasien.5