Real Time PCR

PCR adalah singkatan dari Polymerase Chain Reaction. Jika dialih bahasakan ke

dalam Bahasa Indonesia menjadi reaksi berantai menggunakan aktivitas enzim Polymerase.

PCR merupakan suatu teknik atau metode perbanyakan (replikasi) DNA secara enzimatik

tanpa menggunakan organisme. Dengan teknik ini, orang dapat menghasilkan DNA dalam

jumlah besar dalam waktu singkat sehingga memudahkan berbagai teknik lain yang

menggunakan DNA. Teknik ini dirintis oleh Kary Mullis pada tahun 1983 dan ia memperoleh

hadiah Nobel pada tahun 1994 berkat temuannya tersebut. Penerapan PCR banyak dilakukan

di bidang biokimia dan biologi molekular karena relatif murah dan hanya memerlukan jumlah

sampel yang sangat kecil.

Real Time PCR (qPCR) adalah suatu metoda analisa yang dikembangkan dari reaksi

PCR. Dalam ilmu biologi molekular, Real Time PCR (juga dikenal sebagai quantitative real

time polymerase chain reaction (Q-PCR/qPCR) atau kinetic polymerase chain reaction),

adalah suatu teknik pengerjaan PCR di laboratorium untuk mengamplifikasi (memperbanyak)

sekaligus menghitung (kuantifikasi) jumlah target molekul DNA hasil amplifikasi tersebut.

Real Time PCR memungkinkan dilakukannya deteksi dan kuantifikasi (sebagai nilai absolut

dari hasil perbanyakan DNA atau jumlah relatif setelah dinormalisasi terhadap input DNA

atau gen-gen penormal yang ditambahkan) sekaligus terhadap sekuens spesifik dari sampel

DNA yang dianalisa.

Real Time PCR (qPCR) atau dapat pula disebut kuantitatif PCR real time (qPCR) atau

PCR kinetik adalah teknik laboratorium berdasarkan PCR, yang digunakan untuk

mengamplifikasi dan secara simultan mengukur molekul DNA target. Untuk satu atau lebih

urutan tertentu dalam sampel DNA, Real Time-PCR memungkinkan deteksi dan kuantifikasi

secara bersamaan. Kuantitas yang didapat berupa jumlah salinan mutlak atau jumlah relatif

ketika dinormalisasi untuk DNA yang dimasukkan atau gen normalisasi tambahan.

Pada analisa PCR konvensional deteksi keberadaan DNA dilakukan pada akhir reaksi

dan pengamatan keberadaan DNA hasil amplifikasi dilakukan di gel agarose setelah

dilakukan proses elektroforesis. Sedangkan analisa menggunakan Real Time PCR

memungkinkan untuk dilakukan pengamatan pada saat reaksi berlangsung, keberadaan DNA

hasil amplifikasi dapat diamati pada grafik yang muncul sebagai hasil akumulasi fluoresensi

dari probe (penanda). Pada Real Time PCR pengamatan hasil tidak lagi membutuhkan tahap

elektroforesis, sehingga tidak lagi dibutuhkan gel agarose dan penggunaan Ethidium Bromide

(EtBr) yang merupakan senyawa karsinogenik.

Cara kerja Real Time PCR mengikuti prinsip umum reaksi PCR; utamanya adalah

DNA yang telah diamplifikasi dihitung setelah diakumulasikan dalam reaksi secara real time

sesudah setiap siklus amplifikasi selesai. Terdapat 2 (dua) metode kuantifikasi yang umum

digunakan antara lain :

(1) Menggunakan zat pewarna fluoresensi yang akan terinterkalasi dengan DNA rantai ganda

(dsDNA) misalnya SyBr Green, dan

(2) Probe (penanda) yang berasal dari hasil modifikasi DNA oligonukleotida yang akan

berpendar (flourensensi) ketika terhibridisasi dengan DNA komplemen, misalnya probe

FRET (Hybridisasi) dan probe TaqMan. Dalam setiap pengamatan proses PCR, sinyal

fluoresensi yang dipancarkan akan meningkat secara proporsional setiap siklus PCR telah

berhasil dilakukan sejalan dengan bertambahnya produk DNA (DNA hasil amplifikasi) yang

dihasilkan.   

Prinsip Real Time PCR (qPCR)

PCR adalah suatu molekul perbanyakan DNA secara enzimatik sehingga DNA yang

diperoleh dapat digunakan untuk analisis penelitian. DNA yang jumlahnya sangat sedikit juga

dapat dikarakterisasi dengan metode ini. Saat ini PCR sudah digunakan secara meluas pada

kedokteran forensik, diagnosis genetika, hingga teknik ini banyak digunakan karena cukup

spesifik, efisien, dan memiliki derajat keberhasilan yang tinggi

Real-Time PCR memiliki keunggulan daripada konvensional PCR yaitu pada Real-Time

sistem pengukuran analisis menggunakan molekul probes yang dapat diukur pada tiap siklus

reaksinya, pada konvensional PCR deteksinya memerlukan gel agarosa untuk proses

elektroporesis DNA pada deteksi produk hasil amplifikasi DNA tersebut

Real-Time PCR dapat mendeteksi produk amplifikasi pada tiap siklus pada proses

penggandaan DNA. Pada sistem Real-Time PCR ini terdapat enzim DNA polimerase yang

memiliki aktivitas pada DNA yang memiliki fungsi exonuclease pada rantai DNA 5’ menuju

3’. DNA polimerase ini dapat menguraikan molekul probes yang terikat pada untaian tunggal

DNA sehingga dapat digunakan untuk deteksi amplikon pada target DNA yang spesifik.

Molekul probes ini mengikat oligonukleotida dan akan mengikat sekuen DNA target. Probes

ini terikat pada ujung 5’P dan pada ujung 3’

Molekul probes ini memiliki bagian reporter dye pada ujung 5’ yang dapat mengeluarkan

floresensi sedangkan pada ujung 3’ terdapat quencher yang dapat meredam floresensi pada

reporter dye. Sehingga sebelum reaksi emisi dari reporter dye tidak dapat terbaca pada

detektor

Sekuen DNA Pada Primer hewan

HewanForward primer (F) Reverse primer (R)

ATSekuen (5’-3’) Posisi Sekuen (5’-3’) Posisi

Ayam

CGGTGGCTA

TGAGTGTGA

GG

F:311-292AGCAGTCTGC

CTCATGR:43-58 67 °C

Kalkun

TATGAGGGT

GAGAAGTA

A

F:304-287TAGCAGTATG

CCTCATCACTR:42-61 63 °C

BabiGTTGCTATA

ACGGTAAATF:304-287

TAGGCATCTG

CCTAATCTTGR:37-56 60 °C

SapiGGACGTATC

CTATAAATF:323-307

GGAATCTGCC

TAATCCTAR:38-55 57 °C

Biri-BiriATGCTGTGG

CTATTGTCF:305-289

CCTAGGCATTT

GCTTAATTTTAR:31-52 60 °C

DAFTAR PUSTAKA

Gibson, U.E.M., Heid, CA & Williams, M.P. (1996) A novel method for real ime quantitative RT-PCR. Genome Research, 6, 986-995

Heid, C.A., Stevens, J., Livak, K.J. & Williams, M.P. (1996) Real Time quantitative PCR, Genome Research 6, 995-1001