1 | P r o t o k o l   i n   v i t r o   C C R C   

CANCER CHEMOPREVENTION RESEARCH CENTER (CCRC) FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS GADJAH MADA

PROTOKOL IN VITRO

NO. JENIS PROTOKOL SUMBER TGL. DIBUAT

1 PERSIAPAN KERJA IN VITRO DI LABORATORIUM

2 PEMBUATAN MEDIA KULTUR LENGKAP (MK) 28/02/08

3 MENUMBUHKAN SEL DARI TANGKI NITROGEN CAIR (CELL THAWING)

4 MENYIMPAN SEL DI TANGKI NITROGEN CAIR (CRYOPRESERVATION)

5 GANTI MEDIA

6 PANEN SEL

7 SUBKULTUR

8 PENGHITUNGAN SEL

9 PREPARASI SAMPEL

10 UJI SITOTOKSIK METODE MTT ATCC

11 UJI APOPTOSIS METODE DOUBLE STAINING

12 UJI IMUNOSITOKIMIA

13 UJI KOMBINASI SAMPEL (COMBINATORIAL ASSAY)

14 FLOWCYTOMETRY

15 TRANSFEKSI PLASMID

16 KLONING SEL

17 WESTERN BLOT

Disetujui oleh Diperiksa oleh Dibuat oleh Tanggal: Dr. Edy Meiyanto, M.Si., Apt.

Tanggal: Riris Istighfari Jenie, M.Si., Apt.

Tanggal: Endah Puji Septisetyani

 

2 | P r o t o k o l   i n   v i t r o   C C R C   

PROTOKOL 1

PERSIAPAN KERJA IN VITRO DI LABORATORIUM

1. Memasuki Lab

Ketika masuk ke dalam lab, tas dan jaket disimpan di dalam locker sedangkan sepatu dilepas ketika akan memasuki ruangan kerja (jangan lupa membawa log book). Cuci tangan sebelum mulai bekerja.

2. Jas Lab, Masker, dan Sarung Tangan Selalu gunakan jas lab ketika akan bekerja di laboratorium. Masker dan sarung tangan digunakan untuk menghindari terjadinya kontaminasi dan paparan bahan yang berbahaya (misal: saat menimbang MTT yang bersifat karsinogenik).

3. Perlengkapan Kerja Siapkan lampu spiritus, semprotan alkohol 70 %, mikropipet, tisu gulung, korek, spidol marker, buangan basah, dan buangan kering (dilapisi plastik bening) sebelum memasuki ruangan kerja. Peralatan steril (botol duran, conical, tip, tabung reaksi kecil, dll. yang telah diautoklaf) disimpan di dalam inkubator di ruang preparasi (sebelah oven di ruang pencucian alat). Jika tip (yellow dan blue tip) yang digunakan habis, isi kembali kotaknya dengan tip baru kemudian seal dengan selotip dan letakkan di meja di ruang pencucian untuk diautoklaf. Alat yang selesai dipakai, dicuci dengan air biasa dan direndam di dalam air sabun di bawah bak cuci. Khusus botol media, cuci dengan sabun, bilas dengan air murni/ aqua purificata (di dalam ember warna biru bertutup), dan masukkan ke dalam oven. Sampah kering (tip, tisu, plate, dll.) dibuang di tempat sampah. Kembalikan mikropipet, tisu, lampu spiritus, alkohol 70% di tempat semula setelah selesai bekerja.

4. Sterilisasi LAF Nyalakan UV untuk sterilisasi LAF selama tidak kurang dari 20 menit. Jika memungkinkan, UV juga peralatan yang akan digunakan (bahan-bahan jangan ikut di-UV). Kemudian, matikan lampu UV, buka penutup LAF, dan nyalakan lampu biasa. Jangan berada di depan LAF saat udara laminar akan berhembus dari LAF. Selanjutnya, semprot permukaan meja LAF dengan alkohol 70 % dan keringkan dengan tisu. Jika saat ke lab LAF sudah dinyalakan, tidak perlu di-UV lagi, tetapi tetap semprot dengan alkohol. Setelah selesai bekerja, semprot kembali LAF dengan alkohol, matikan dan tutup kembali LAF.

5. Lampu Spiritus (Bunsen) Nyalakan lampu spiritus. Jika isi spiritus habis, isi kembali terlebih dahulu. Jangan gunakan lampu spiritus jika spiritus tinggal sedikit. Api digunakan untuk memanaskan ujung pipet, tip, tutup plate atau disk, dan segala macam tutup botol, conical tube, dan mulut botol serta conical tube sebelum dituang atau ditutup kembali. Hal ini dilakukan untuk menjaga sterilitas selama kerja.

6. Media (RPMI, DMEM), PBS, Tripsin-EDTA, dll. Bahan-bahan yang disimpan di dalam lemari es, seperti media dan PBS 1x, dikeluarkan terlebih dahulu agar saat akan dipakai tidak dalam keadaan dingin. Tripsin-EDTA harus dalam suhu kamar saat akan digunakan karena Tripsin tidak akan bekerja jika masih dalam keadaan dingin. Bahan-bahan ini jangan di-UV. Kembalikan bahan ke dalam lemari es setelah selesai digunakan. Jangan memakai bahan-bahan yang tidak dilabel/ milik orang lain.

7. Pemakaian LAF LAF maksimal dipakai oleh 2 orang secara bersamaan. Semprot semua peralatan dan botol bahan dengan alkohol 70% sebelum dimasukkan ke dalam LAF. Semprot juga kedua tangan setiap kali akan bekerja di LAF jika kedua tangan sempat keluar dari LAF.

 

3 | P r o t o k o l   i n   v i t r o   C C R C   

8. Inverted microscope Mikroskop digunakan untuk mengamati keadaan sel setiap kali akan bekerja. Amati kondisi sel serta kemungkinan kontaminasi bakteri atau jamur. Matikan lampu mikroskop (kembalikan ke posisi-0 dahulu) setiap kali selesai menggunakan. Dokumentasi (foto) sel juga diambil dari mikroskop ini.

9. Inkubator CO2 Inkubator digunakan untuk inkubasi sel (menyimpan sel). Jangan membuka inkubator terlalu lama karena akan menurunkan kadar CO2 di dalamnya. Kendorkan tutup flask jika akan dimasukkan inkubator. Flask diletakkan dengan posisi ujung flask berada di sisi dalam inkubator.

 

4 | P r o t o k o l   i n   v i t r o   C C R C   

PROTOKOL 2

FORMULA MEDIA KULTUR LENGKAP (MK)

Alat:

1. Mikropipet 1 ml 2. Botol duran 100 ml 3. Stiker label

Bahan yang diperlukan setiap membuat media kultur lengkap (MK):

No. Bahan Jumlah (%) Jumlah (per 100 ml)

1. Penisilin-streptomisin 1 % 1 ml

2. FBS (Fetal bovine serum) quilified 10 % 10 ml

3. Media (RPMI/DMEM) Ad 100 % ad 100 ml

 

5 | P r o t o k o l   i n   v i t r o   C C R C   

PROTOKOL 6

PANEN SEL

Alat:

1. Pipet pasteur 2. Mikropipet 1 ml 3. Conical tube 4. Stiker label/ pulpen marker

Bahan:

1. PBS 2. Tripsin-EDTA 1x (Tripsin 0,25%) 3. MK (DMEM/RPMI)

Langkah Pekerjaan

1. Ambil sel dari inkubator CO2, amati kondisi sel. Panen sel dilakukan setelah sel 80% konfluen.

2. Buang media dengan menggunakan pipet Pasteur steril.

3. Cuci sel 2 kali dengan PBS 1x (volume PBS + ½ volume media awal).

4. Tambahkan tripsin-EDTA 1x (tripsin 0,25%) secara merata dan inkubasi di dalam inkubator selama 3 menit1.

5. Tambahkan media + 5 ml untuk menginaktifkan tripsin. Resuspensi sel dengan pipet sampai sel terlepas satu-satu (tidak menggerombol).

6. Amati keadaan sel di mikroskop. Resuspensi kembali jika masih ada sel yang menggerombol.

7. Transfer sel yang telah lepas satu-satu ke dalam conical steril baru.

Keterangan: 1. Untuk dish diameter 10 cm, tripsin-EDTA = 450 µl, untuk flask= 300 µl; dekantir tripsin yang

berlebih. Tripsin-EDTA digunakan untuk melepaskan sel.

 

6 | P r o t o k o l   i n   v i t r o   C C R C   

PROTOKOL 7

SUBKULTUR

Alat:

1. Pipet pasteur 2. Mikropipet 1 ml 3. Conical tube 4. Culture dish 5. Stiker label/ pulpen marker

Bahan:

1. MK (DMEM/RPMI)

Langkah Pekerjaan

1. Lakukan panen sel sesuai dengan protokol panen sel (protokol 6).

2. Resuspensi suspensi sel di dalam conical tube.

3. Ambil + 300 µl panenan sel dan masukkan ke dalam conical yang lain. Tambahkan 7 ml

MK dan resuspensi kembali.

4. Tuang sel ke dalam wadah (dish) yang telah disiapkan. Homogenkan dan amati kondisi dan jumlah sel secara kualitatif.

5. Inkubasi semalam dan ganti MK esok harinya. Amati keadaan sel sebelum dan setelah diganti media.

 

7 | P r o t o k o l   i n   v i t r o   C C R C   

PROTOKOL 8

PENGHITUNGAN SEL

Alat:

1. Mikropipet 20 µl 2. Hemacytometer/ hemocytometer 3. Counter 4. Mikroskop (inverted/cahaya)

Bahan:

1. Suspense sel hasil panen sel (protokol 6)

Langkah Pekerjaan

1. Ambil sel dari inkubator CO2, amati kondisi sel. Panen sel dilakukan setelah sel 80% konfluen.

2. Buang media dengan menggunakan pipet Pasteur steril.

3. Cuci sel 2 kali dengan PBS 1x (volume PBS + ½ volume media awal).

4. Tambahkan tripsin-EDTA 1x (tripsin 0,25%) secara merata dan inkubasi di dalam inkubator selama 3-5 menit1.

5. Tambahkan media + 2-3 ml untuk menginaktifkan tripsin. Resuspensi sel dengan pipet sampai sel terlepas satu-satu (tidak menggerombol).

6. Amati keadaan sel di mikroskop. Resuspensi kembali jika masih ada sel yang menggerombol.

7. Transfer sel yang telah lepas satu-satu ke dalam conical steril baru. Tambahkan MK + 2-3 ml. Resuspensi sel.

8. Ambil 10 µl panenan sel dan pipetkan ke hemacytometer.

9. Hitung sel di bawah mikroskop (inverted atau mikroskop cahaya biasa) dengan counter2.

10. Transfer sejumlah sel yang diperlukan ke dalam conical yang lain dan tambahkan MK sesuai dengan konsentrasi sel yang dikehendaki3.

Keterangan: 1. Untuk dish, tripsin-EDTA = 0,75 ml, untuk flask = 0,5 ml; dekantir tripsin yang berlebih. Tripsin-

EDTA digunakan untuk melepaskan sel.

 

8 | P r o t 

2. H

Ju

3. Ju

ke

m

U

t o k o l   i n  

Hemacytomete

umlah sel yan

umlah ml pan

emudian ditam

misal: a. Jumlah

96-web. Volumc. Karena

diperlud. Jadi, s

ad 10 Untuk perlakua

v i t r o   C C

er memiliki 4

(B)

ng dihitung/m

nenan sel yan

mbahkan MK

h total sel yanll plate 5x1

me panenan sea setiap sumukan untuk msetelah sejumml. an sel MCF-7

sel T47D sel HeLa

C R C  

kamar hitung

(A)

l = Σsel kama

ng ditransfer =

K ad sejumlah

ng diperlukan103 x 100 sumel yang diperlmuran akan enanam sel =

mlah volume p

7 = 5x103 sel/s= 5x103 sel/s= 5x103 sel/s

GamhitunSel batastidakbawamem

(chamber), s

ar A + Σsel ka 4

= Jumlah tota Jumlah se

ml yang dipe

n untuk menamuran (dibuatlukan (dalam diisi 100 µl

= 100 µl x 100panenan sel

sumuran, sumuran, sumuran,

mbar 1. (A) Heng. Setiap kayang gelap s luar di seb

k ikut dihitunah ikut d

mudahkan dala

sbb:

amar B + Σsel4

l sel yang dipel terhitung/m

erlukan.

nam 5x103 set lebih) = 5x10ml) = 5x105 : MK berisi

0 sumuran = ditransfer ke

emacytometeamar hitung t

(mati) dan sbelah atas dang. Sel di badihitung. (Bam penghitun

l kamar C + Σ

perlukan ; l

el WiDr di set05 sel. : jumlah sel tsel, maka t10 ml. conical baru

r terdiri dari 4terdiri dari 16sel yang be

an di sebelahatas kiri dan) Counter ngan sel.

Σsel kamar D

tiap sumuran

terhitung/mlotal volume

, ditambahka

4 kamar 6 kotak. rada di

h kanan n batas

untuk

x 104

pada

yang

an MK

 

9 | P r o t o k o l   i n   v i t r o   C C R C   

PROTOKOL 9

PREPARASI SAMPEL

Alat:

1. Mikropipet 20, 200, 1000 µl 2. Tabung reaksi kecil 3. Rak tabung kecil 4. Vortex 5. Conical tube

Bahan:

1. Stok sampel (10 mg) dalam eppendorf 2. DMSO 3. MK

Langkah Pekerjaan

1. Timbang sampel kurang lebih 10 mg dengan saksama (gunakan neraca analitik semimikro) di dalam eppendorf.

2. Uji kelarutan sampel dalam DMSO.

3. Tambahkan 50 µl DMSO dan coba larutkan dengan bantuan vortex.

4. Jika belum larut, tambahkan 50 µl DMSO lagi dan larutkan kembali.

5. Buat baru stok sampel dalam DMSO setiap kali akan digunakan untuk perlakuan (recentur paratus).

Buat seri kadar sampel dengan pengenceran stok dalam DMSO menggunakan MK. Jika terjadi endapan pada pengenceran pertama, jangan dilanjutkan. Pikirkan dahulu solusinya agar sampel bisa larut, kemudian ulangi lagi pembuatan seri kadar dari stok DMSO.

Catatan:

1. Range seri konsentrasi untuk orientasi 7-8 seri kadar + 1 – 500 µg/ml (ppm) Contoh: 1, 10, 25, 50, 100, 150, 200, 400 µg/ml

2. Volume akhir tiap seri konsentrasi untuk perlakuan dibuat 400 µl (100 µl/sumuran, triplo).

 

10 | P r o t o k o l   i n   v i t r o   C C R C   

PROTOKOL 10

UJI SITOTOKSIK METODE MTT

Alat:

1. Mikropipet 20, 200, 1000 µl 2. Tabung reaksi kecil 3. Rak tabung kecil 4. Vortex 5. Conical tube

Bahan:

1. Stok sampel (10 mg) dalam eppendorf 2. DMSO 3. MK 4. PBS 5. 96-well plate 6. Tisu makan (kotak) 7. Buangan untuk media bekas dan PBS

Langkah Pekerjaan

1. Ambil sel dari inkubator CO2, amati kondisi sel. Gunakan kultur sel dalam kondisi 80% konfluen untuk dipanen.

2. Panen sel sesuai dengan protokol panen.

3. Hitung jumlah sel dan buat pengenceran sel dengan MK sesuai kebutuhan mengikuti protokol penghitungan sel.

4. Transfer sel ke dalam sumuran, masing-masing 100 µl. Setiap kali mengisi 12 sumuran, resuspensi kembali sel agar tetap homogen.

5. Sisakan 3 sumuran kosong (jangan diisi sel).

6. Amati keadaan sel di mikroskop untuk melihat distribusi sel. Dokumentasikan.

7. Inkubasi sel di dalam inkubator selama semalam (agar sel pulih kembali setelah panen).

8. Perlakuan sel dengan sampel dilakukan setelah sel kembali dalam keadaan normal. Jika dalam waktu semalam kondisi sel belum pulih, inkubasikan kembali. Selalu amati kondisi sel sebelum perlakuan.

9. Setelah sel normal kembali, segera buat seri konsentrasi sampel untuk perlakuan (termasuk kontrol sel dan kontrol DMSO)1 sesuai dengan protokol preparasi sampel (protokol 9).

10. Ambil plate yang telah berisi sel dari inkubator.

 

11 | P r o t o k o l   i n   v i t r o   C C R C   

11. Buang media sel (balikkan plate 180° di atas tempat buangan, kemudian tekan plate secara perlahan di atas tisu makan untuk meniriskan sisa cairan)

12. Masukkan 100 µl PBS ke dalam semua sumuran yang terisi sel, kemudian buang PBS dengan cara membalik plate seperti no. 10. Tiriskan sisa cairan dengan tisu.

13. Masukkan seri konsentrasi sampel ke dalam sumuran (triplo).

14. Inkubasi di dalam inkubator. Lama inkubasi tergantung pada efek perlakuan terhadap sel. Jika dalam waktu 24 jam belum terlihat efek sitotoksik, inkubasi kembali selama 24 jam (waktu inkubasi total: 24-48 jam).

15. Menjelang akhir waktu inkubasi, dokumentasikan kondisi sel untuk setiap perlakuan (foto dahulu).

16. Buang media sel, cuci PBS 1x (seperti pada no. 11), dan tambahkan reagen MTT 100 µl ke setiap sumuran, termasuk kontrol media (tanpa sel)2. Inkubasi sel selama 2-4 jam di dalam inkubator (sampai terbentuk formazan).

17. Periksa kondisi sel dengan mikroskop inverted. Jika formazan telah jelas terbentuk, tambahkan stopper SDS 10% dalam 0,1 N HCl. Pekerjaan tidak perlu dilakukan di dalam LAF hood.

18. Bungkus plate dengan kertas atau alumunium foil dan inkubasikan di tempat gelap (suhu ruangan) semalam (jangan diletakkan di inkubator!).

19. Hidupkan ELISA reader, tunggu proses progressing hingga selesai.

20. Buka pembungkus plate dan tutup plate. Masukkan ke dalam ELISA reader (posisi jangan terbalik). Baca absorbansi masing-masing sumuran dengan ELISA reader dengan λ=550-600 nm (595 nm, tekan tombol START).

21. Matikan kembali ELISA reader. Simpan dan temple kertas hasil ELISA pada LOG BOOK. Setiap kali pembacaan di ELISA reader, catat di buku catatan pemakaian ELISA READER.

22. Buat grafik absorbansi (setelah dikurangi kontrol media) vs konsentrasi (jangan di-log-kan) untuk melihat profil sel hidup.

Hitung prosentase sel hidup3 dan analisis harga IC50 dengan Excell (Regresi linear dari log konsentrasi) atau SPSS (Probit/Logit).

Keterangan: 1. Kontrol negatif = sel + media. Kontrol DMSO = sel + % terbesar DMSO yang digunakan dalam

MK. % DMSO terbesar dilihat dari konsentrasi DMSO dalam seri konsentrasi sampel yang paling pekat.

2. Stok MTT (5mg/ml) timbang 50 mg sebuk MTT, larutkan dalam 10 ml PBS (dengan bantuan vortex). Reagen MTT untuk perlakuan (0,5 mg/ml) ambil 1 ml stok MTT dalam PBS (5mg/ml), encerkan dengan MK ad 10 ml (untuk 1 buah 96 well plate).

 

12 | P r o t o k o l   i n   v i t r o   C C R C   

Gunakan sarung tangan! (MTT – karsinogenik).

3. Prosentase sel hidup = (Absorbansi perlakuan – Absorbansi kontrol media) x 100% (Absorbansi kontrol negatif – Absorbansi kontrol media)

4. Grafik yang dibuat: a. Profil sel hidup: Absorbansi terkoreksi (absorbansi perlakuan-absorbansi kontrol media)

v.s. konsentrasi. Profil SD (standar deviasi) juga diperhitungkan. b. Profil persentase sel hidup: % sel hidup v.s. konsentrasi. Profil SD juga diperhitungkan. c. Untuk regresi linear: % sel hidup v.s. log konsentrasi, dicari persamaan regresi dan R2,

dihitung harga IC50. 5. Contoh desain plate:

 

13 | P r o t o k o l   i n   v i t r o   C C R C   

PROTOKOL 11

UJI APOPTOSIS METODE DOUBLE STAINING

Alat:

1. Mikropipet 20, 200, 1000 µl 2. Tabung reaksi kecil 3. Rak tabung kecil 4. Vortex 5. Cover slip

Bahan:

1. Stok sampel (10 mg) dalam eppendorf 2. DMSO 3. MK 4. PBS 5. 24-well plate 6. Buangan untuk media bekas dan PBS 7. Reagen etidium bromida-akridin oranye (karsinogen)

Hati-hati, reagen mudah menguap! Gunakan sarung tangan dan masker saat pengecatan.

Langkah Pekerjaan

1. Ambil sel dari inkubator CO2, amati kondisi sel. Gunakan kultur sel dalam kondisi 80% konfluen untuk dipanen.

2. Panen sel sesuai dengan protokol panen.

3. Hitung jumlah sel sesuai dengan protokol penghitungan sel. Jumlah sel yang dibutuhkan untuk uji imunositokimia adalah 5x104 sel/sumuran (5x104 sel/1000 µl MK). Buat pengenceran suspensi sel sehingga konsentrasi sel akhir 5x104 sel/1000 µl MK.

4. Siapkan 24 well plate dan cover slip.

5. Masukkan cover slip ke dalam sumuran menggunakan pinset dengan hati-hati. Transfer 1000 µl suspensi sel ke atas cover slip. Setiap akan mengisi sumuran, resuspensi sel kembali.

6. Amati keadaan sel di mikroskop untuk melihat distribusi sel.

7. Inkubasi sel di dalam inkubator selama semalam (agar sel pulih kembali setelah panen).

8. Perlakuan sel dengan sampel dilakukan setelah sel kembali dalam keadaan normal. Jika dalam waktu semalam kondisi sel belum pulih, ganti media sel (MK) dan inkubasikan kembali. Selalu amati kondisi sel sebelum perlakuan.

9. Setelah sel normal kembali, segera buat satu konsentrasi sampel (cukup satu – pada IC50) untuk perlakuan dan satu kontrol DMSO. Kontrol sel hanya ditambah MK.

 

14 | P r o t o k o l   i n   v i t r o   C C R C   

10. Ambil 24 well plate dari inkubator.

11. Buang semua MK dengan pipet Pasteur secara perlahan-lahan.

12. Isikan PBS masing-masing 500 µl.

13. Buang PBS dengan pipet Pasteur secara perlahan-lahan.

14. Masukkan sampel ke dalam sumuran.

15. Masukkan juga media dan kontrol DMSO.

16. Inkubasi di dalam inkubator. Lama inkubasi tergantung pada efek perlakuan dalam mengakibatkan apoptosis (10-24 jam).

17. Amati kondisi sel setelah 10 jam, dokumentasikan. Konsultasikan untuk menentukan waktu inkubasi.

18. Setelah inkubasi selesai, keluarkan plate dari inkubator.

19. Buang semua media dengan pipet Pasteur secara perlahan.

20. Isikan PBS 500 ml ke dalam sumuran secara perlahan.

21. Buang PBS dengan pipet Pasteur secara perlahan.

22. Ambil cover slip dengan pinset dengan bantuan ujung jarum dengan hati-hati.

23. Letakkan di atas object glass (kaca obyek). Posisi sel harus berada di atas, jangan sampai terbalik.

24. Beri label.

25. Teteskan 10 µl reagen campuran etidium bromida-akridin oranye di atas cover slip. Ratakan dengan cara menggoyang secara perlahan.

26. Amati di bawah mikroskop fluoresen.

27. Jika pewarnaan belum optimal, tunggu beberapa menit dan amati kembali.

28. Dokumentasikan. Set kamera dengan setting khusus untuk fluoresen.

29. Setelah selesai, buang cover slip dan cuci kembali object glass.

 

15 | P r o t o k o l   i n   v i t r o   C C R C   

PROTOKOL 12

UJI IMUNOSITOKIMIA

Alat:

1. Mikropipet 20, 200, 1000 µl 2. Tabung reaksi kecil 3. Rak tabung kecil 4. Vortex 5. Cover slip 6. Object glass 7. 6-well plate bekas/ dish bekas yang bersih.

Bahan:

1. Stok sampel (10 mg) dalam eppendorf 2. DMSO 3. MK 4. PBS 5. 24-well plate 6. Buangan untuk media bekas dan PBS 7. Tisu basah (untuk inkubasi). 8. Reagen imunositokimia (Metanol, Novostain universal detection kit, antibodi COX-2/VEGF/dll.)

Langkah Pekerjaan

1. Ambil sel dari inkubator CO2, amati kondisi sel. Gunakan kultur sel dalam kondisi 80% konfluen untuk dipanen.

2. Panen sel sesuai dengan protokol panen.

3. Hitung jumlah sel sesuai dengan protokol penghitungan sel. Jumlah sel yang dibutuhkan untuk uji imunositokimia adalah 5x104 sel/sumuran (5x104 sel/1000 µl MK). Buat pengenceran suspensi sel sehingga konsentrasi sel akhir 5x104 sel/1000 µl MK.

4. Siapkan 24 well plate dan cover slip.

5. Masukkan cover slip ke dalam sumuran menggunakan pinset dengan hati-hati. Transfer 1000 µl suspensi sel ke atas cover slip. Setiap akan mengisi sumuran, resuspensi sel kembali.

6. Amati keadaan sel di mikroskop untuk melihat distribusi sel.

7. Inkubasi sel di dalam inkubator selama semalam (agar sel pulih kembali setelah panen).

8. Perlakuan sel dengan sampel dilakukan setelah sel kembali dalam keadaan normal. Jika dalam waktu semalam kondisi sel belum pulih, ganti media sel (MK) dan inkubasikan kembali. Selalu amati kondisi sel sebelum perlakuan.

9. Setelah sel normal kembali, segera buat satu konsentrasi sampel (cukup satu – pada

 

16 | P r o t o k o l   i n   v i t r o   C C R C   

IC50) untuk perlakuan dan satu kontrol DMSO. Kontrol sel hanya ditambah MK.

10. Ambil 24 well plate dari inkubator.

11. Buang semua MK dengan pipet Pasteur secara perlahan-lahan.

12. Isikan PBS masing-masing 500 µl.

13. Buang PBS dengan pipet Pasteur secara perlahan-lahan.

14. Masukkan sampel ke dalam sumuran.

15. Masukkan juga media untuk kontrol sel (2 kontrol sel).

16. Inkubasi di dalam inkubator. Inkubasi 15 jam.

17. Amati kondisi sel setelah 14 jam, dokumentasikan. Siapkan metanol dingin dan PBS.

18. Pada jam ke-15, inkubasi dengan sampel dihentikan. Pekerjaan selanjutnya, tidak perlu di dalam LAF.

19. Buang semua media dengan pipet Pasteur secara perlahan.

20. Isikan PBS 500 ml ke dalam sumuran secara perlahan.

21. Buang PBS dengan pipet Pasteur secara perlahan.

22. Ambil cover slip dengan pinset dengan bantuan ujung jarum dengan hati-hati.

23. Letakkan di dalam sumuran 6-well plate bekas atau dish bekas yang bersih.

24. Beri label.

25. Teteskan 300 µl metanol dingin, inkubasi 10 menit di dalam freezer.

26. Buang metanol secara perlahan, jangan sampai cover slip terbalik. Jika pengecatan akan dilanjutkan pada hari berikutnya, simpan cover slip di dalam freezer.

27. Tambahkan 500 µl PBS pada cover slip, diamkan 5 menit. Ambil PBS dengan mikropipet 1 ml, buang. Lakukan 2 kali. (intinya, dicuci dengan PBS)

28. Tambahkan 500 µl akuades, diamkan 5 menit. Buang akuades. Lakukan 2 kali. (intinya, dicuci dengan akuades)

29. Teteskan larutan hidrogen peroksidase (blocking solution). Inkubasi 10 menit. Buang larutan (dengan mikropipet).

30. Teteskan prediluted blocking serum, inkubasi 10 menit. Buang larutan.

31. Teteskan antibodi monoklonal primer untuk antigen yang ingin diamati (missal: COX-2), inkubasi 10 menit.

 

17 | P r o t o k o l   i n   v i t r o   C C R C   

32. Tambahkan 500 µl PBS, inkubasi 5 menit. Buang PBS.

33. Teteskan antibody sekunder (biotinylated universal secondary antibody), inkubasi 10 menit.

34. Tambahkan 500 µl PBS, inkubasi 5 menit. Buang PBS.

35. Teteskan reagen yang berisi kompleks streptavidin-enzim peroksidase, inkubasi 10 menit.

36. Tambahkan 500 µl PBS, inkubasi 5 menit. Buang PBS.

37. Teteskan larutan DAB, inkubasi 10 menit.

38. Tambahkan akuades 500 µl, kemuadian buang kembali akuadesnya.

39. Teteskan larutan MayeHaematoxylin, inkubasi 3 menit.

40. Tambahkan akuades 500 µl, kemuadian buang kembali akuadesnya.

41. Angkat cover slip dengan pinset secara hati-hati, kemudian celupkan dalam xylol.

42. Celupkan cover slip dalam alkohol. Keringkan cover slip.

43. Letakkan cover slip di atas object glass, tetesi dengan lem (mounting media). Tutup cover slip dengan cover slip kotak.

44. Amati dengan mikroskop cahaya.

Catatan:

1. Untuk imunositokimia, minimal diperlukan 3 perlakuan (3 cover slip):

a. Kontrol sel tanpa antibodi (akan menunjukkan warna biru).

b. Kontrol sel dengan antibodi.

c. Perlakuan dengan sampel.

2. Ekspresi protein tertentu akan ditunjukkan dengan warna coklat pada sitoplasma (bukan inti sel).

Warna biru menunjukkan tidak adanya protein yang ingin diamati.

 

18 | P r o t o k o l   i n   v i t r o   C C R C   

PROTOKOL 10

UJI KOMBINASI DENGAN AGEN KEMOTERAPI

Alat:

1. Mikropipet 20, 200, 1000 µl 2. Tabung reaksi kecil 3. Rak tabung kecil 4. Vortex 5. Conical tube

Bahan:

1. Stok sampel (10 mg) dalam eppendorf 2. DMSO 3. MK 4. PBS 5. 96-well plate 6. Tisu makan (kotak) 7. Buangan untuk media bekas dan PBS

Langkah Pekerjaan

1. Ambil sel dari inkubator CO2, amati kondisi sel. Gunakan kultur sel dalam kondisi 80% konfluen untuk dipanen.

2. Panen sel sesuai dengan protokol panen.

3. Hitung jumlah sel dan buat pengenceran sel dengan MK sesuai kebutuhan mengikuti protokol penghitungan sel.

4. Transfer sel ke dalam sumuran, masing-masing 100 µl. Setiap kali mengisi 12 sumuran, resuspensi kembali sel agar tetap homogen.

5. Sisakan 3 sumuran kosong (jangan diisi sel).

6. Amati keadaan sel di mikroskop untuk melihat distribusi sel. Dokumentasikan.

7. Inkubasi sel di dalam inkubator selama semalam (agar sel pulih kembali setelah panen).

8. Perlakuan sel dengan sampel dilakukan setelah sel kembali dalam keadaan normal. Jika dalam waktu semalam kondisi sel belum pulih, inkubasikan kembali. Selalu amati kondisi sel sebelum perlakuan.

9. Setelah sel normal kembali, segera buat seri konsentrasi sampel dan agen kemoterapi (misal: Doxorubicin) untuk perlakuan (termasuk kontrol sel). Seri konsentrasi terdiri dari 4 konsentrasi: IC50, ¾ IC50 , ½ IC50,dan ¼ IC50.

10. Ambil plate yang telah berisi sel dari inkubator.

 

19 | P r o t o k o l   i n   v i t r o   C C R C   

11. Buang media sel (balikkan plate 180° di atas tempat buangan, kemudian tekan plate secara perlahan di atas tisu makan untuk meniriskan sisa cairan)

12. Masukkan 100 µl PBS ke dalam semua sumuran yang terisi sel, kemudian buang PBS dengan cara membalik plate seperti no. 10. Tiriskan sisa cairan dengan tisu.

13. Masukkan seri konsentrasi sampel ke dalam sumuran @ 50 µl (triplo). Masukkan seri konsentrasi Doxorubicin untuk kombinasi @ 50 µl.

14. Inkubasi di dalam inkubator. Lama inkubasi tergantung pada efek perlakuan terhadap sel. Jika dalam waktu 24 jam belum terlihat efek sitotoksik, inkubasi kembali selama 24 jam (waktu inkubasi total: 24-48 jam).

15. Menjelang akhir waktu inkubasi, dokumentasikan kondisi sel untuk setiap perlakuan (foto dahulu).

16. Buang media sel, cuci PBS 1x (seperti pada no. 11), dan tambahkan reagen MTT 100 µl ke setiap sumuran, termasuk kontrol media (tanpa sel)2. Inkubasi sel selama 2-4 jam di dalam inkubator (sampai terbentuk formazan).

17. Periksa kondisi sel dengan mikroskop inverted. Jika formazan telah jelas terbentuk, tambahkan stopper SDS 10% dalam 0,1 N HCl. Pekerjaan tidak perlu dilakukan di dalam LAF hood.

18. Bungkus plate dengan kertas atau alumunium foil dan inkubasikan di tempat gelap (suhu ruangan) semalam (jangan diletakkan di inkubator!).

19. Hidupkan ELISA reader, tunggu proses progressing hingga selesai.

20. Buka pembungkus plate dan tutup plate. Masukkan ke dalam ELISA reader (posisi jangan terbalik). Baca absorbansi masing-masing sumuran dengan ELISA reader dengan λ=550-600 nm (595 nm, tekan tombol START).

Desain plate

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A

Seri konsentrasi 1-4

sampel

Seri konsentrasi 1-4 Sampel

+ Doxo kons 1

Seri konsentrasi 1-4 Sampel

+ Doxo kons 3

B C D E

Seri konsentrasi 1-4

Doxorubicin

Seri konsentrasi 1-4 Sampel

+ Doxo kons 2

Seri konsentrasi 1-4 Sampel

+ Doxo kons 4

Kontrol Sel F G Kontrol Media H

 

20 | P r o t o k o l   i n   v i t r o   C C R C   

PROTOKOL 14

FLOWCYTOMETRY

1. Perlakuan

 

21 | P r o t o k o l   i n   v i t r o   C C R C   

2. Preparasi Sel untuk Flowcytometry

Langkah 6 well plate 24 well 1. Siapkan 2 eppendorf untuk 1 jenis perlakuan. 2. Ambil media dengan mikropipet 1 ml (blue), transfer ke eppendorf I,

jika kurang masukkan ke eppendorf II.

3. Sentrifus (2000 rpm, 5 menit) 4. Buang media. 5. Isikan PBS (@ 500µl) ke dalam sumuran. @ 500 µl 6. Ambil PBS dan transfer ke dalam eppendorf I. 7. Sentrifus (2000 rpm, 5 menit) 8. Buang PBS. @ 500 µl 9. Ulangi tahap 5-6 sekali lagi. 10. Tambahkan tripsin 0,25% (200 µl), inkubasi di inkubator 2 menit 50 µl 11. Tambahkan media (@ 1 ml), resuspensi, dan pindah ke eppendorf I

dan/ II. (sel harus lepas satu per satu – amati di mikroskop inverted)

@ 500 µl

Tambahkan kembali PBS 500 µl ke dalam sumuran untuk mengambil sisa sel, kemudian transfer ke dalam eppendorf II.

12. Sentrifus semua eppendorf (2000 rpm, 30 detik) – tekan “pulse” di sentrifugator

13. Buang media/PBS, cuci pellet sel dengan PBS dingin @ 500 µl @ 500 µl 14. Gabungkan suspensi sel dalam eppendorf I. Bilas eppendorf

kosong dengan PBS, transfer ke eppendorf I.

15. Sentrifus lagi eppendorf yang berisi PBS (2000 rpm, 30 detik) 16. Buang PBS, cuci kembali pellet dengan PBS dingin @ 500 µl. @ 500 µl 17. Sentrifus (2000 rpm, 30 detik). 18. Buang PBS. 19. Tambahkan reagen flowcytometry 300 µl – buat stok reagen dahulu

dan bungkus alufoil. sama

20. Bungkus tiap eppendorf dengan alufoil. 21. Inkubasi di waterbath 37°C, 10 menit. 22. Jika akan disimpan, masukkan ke dalam lemari es (jangan di

freezer).

23. Jika langsung di-flocyto, vortex eppendorf (tanpa membuka bungkus alufoil).

24. Masukkan ke flowcyto-tube yang sudah diberi filter (kain nylon/kain kaca) menggunakan mikropipet 1 ml.

25. Baca di FACS Calibur.

Catatan:

1. Konsentrasi akhir dalam PBS 500 µl =

a. Propidium Iodide (PI): 50 µg/ml

b. RNase : 20 µg/ml

c. Triton-X 100 (pro GC - Merck) : 0.1 %

 

22 | P r o 

2. S

3. R

t o k o l   i n

tok awal reag

a. PI : 2,5

b. RNase

c. Triton-

Reagen flowcy

  v i t r o   C

gen:

5 mg/ml / 50x

e : 10 mg/ml

-X : 1x

ytometry untu

Gam

C R C  

x (penimbang

k 1 sampel: 2

mbar. Sentrifu

3. Runnin

4. A

an 0,7 mg dil

25 µl PI (50x)

ugator Sorva

ng Flowcytom

Analisis Data

arutkan dalam

+ 1 µl RNase

all. : Pulse

metry

a

m 700 µl PBS

e + 0,5 µl TX

e

S)

+ PBS ad 500 µl

 

23 | P r o 

t o k o l   i n

Gambar.

  v i t r o   C

. Tangki nitrog

C R C  

gen cair temppat penyimpanan sel yang dikryo ( - 1799°C).