Laporan Praktikum Proyek Genetika Molekuler Mikroba Percobaan 03 Purifikasi DNA dan Ligasi

Nama NIM Tgl. Percobaan Tgl. Pengumpulan Kelompok Asisten

: Ridwan Muhamad Rifai : 10408040 : 23 September 2010 : 30 September 2010 :6 : Rahma

Program Studi Mikrobiologi Sekolah Ilmu dan Teknologi Hayati Institut Teknologi Bandung 2010

1. Tujuan a. Mempurifikasi DNA berupa fragmen insert dari agarosa elektroforesis b. Meligasikan fragmen insert dalam vektor pGEMT-Easy

2. Metode a. Purifikasi DNA Elektroforesis digunakan untuk memilah fragmen DNA berdasarkan beratnya. Setelah dipisahkan, fragmen DNA ini dapat diekstraksi dari agar elektroforesis menggunakan protokol purifikasi DNA. Purifikasi DNA akan memisahkan fragmen DNA murni dengan zat pengotor semisal agarosa itu sendiri. Ada banyak metode purifikasi DNA namun yang akan digunakan pada praktikum ini adalah dengan protokol GeneaidTM Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit. Protokol ini terdiri dari empat tahap, yaitu : 1) Disosiasi Gel Pada tahap ini, agar yang masih bercampur dengan DNA dilarutkan dalam suatu pelarut. Karena agar melarut, maka DNA akan terpisah dari agar. - Agar yang mengandung fragmen DNA sasaran dipotong di bawah sinar UV - Agar dimasukan dalam microcentrifuge tube 1,5 ml - Ditambahkan 500 l DF buffer, dihomogenisasi dengan vortex - Diinkubasi pada suhu 55-60oC selama 10-15 menit hingga agar melarut 2) Penempelan DNA Pada tahap ini, DNA sudah terpisah dari agar karena agar telah larut dalam DF buffer. Kemudian dilakukan penyaringan dengan metode gravitasi agar DNA dapat melekat pada silika gel pada column. - 800 l sampel dimasukan dalam DF Column dan diletakan di atas Collection Tube 2 ml - DF column disentrifugasi selama 30 detik - Supernatan dibuang dan DF Column ditempatkan kembali pada Collection Tube 2 ml

3) Pencucian Pada tahap ini, DF column dicuci dan dibersihkan dari sisa zat-zat yang masih menempel sehingga akan menghasilkan DNA yang lebih murni lagi. DNA yang terperangkap matrix akan tercucu oleh beberapa buffer. - 400 l Wash Buffer ditambahkan dalam DF Column - DF Column disentrifugasi selama 1 menit @ 14000 rpm - Supernatan dibuang lalu didiamkan 1 menit - Ditambah 600 l W1 Buffer, kemudian disentrifugasi lagi - Cairan pada microtube dibuang kemudian DF Column disentrifugasi 3 menit 4) Elusi Pada tahap ini DNA yang sudah berhasil dipurifikasi akan dielusi. DNA akan ditarik dari matrix sehingga akan didapatkan larutan berisi DNA murni. - DF Column yang telah kering dipindahkan ke microcentrifuge baru - Sebanyak 30 l Elution Buffer dimasukan tepat di tengah matrix - Didiamkan selama 2 menit - Microcentrifuge kemudian disentrifugasi selama 2 menit untuk mengelusi DNA yang telah dipurifikasi

5) Elektroforesis Hasil Purifikasi Untuk mengetahui apakah purifikasi berhasil dan untuk mengetahui besaran DNA yang berhasil dipurifikasi maka dilakukan elektroforesis terhadap laruatn yang didapat setelah elusi. Sebanyak 5 l larutan dimasukan dalam well elektroforesis dan di running bersama ladder 1kb. Hasil elektroforesis ini akan menentukan jumlah reagen yang dibutuhkan pada tahap ligasi.

b. Ligasi Ligasi adalah proses penempelan DNA dalam hal ini proses penyisipan fragmen insert dalam suatu vektor berupa plasmid. Proses ligasi ini diakukan setelah fragmen DNA insert dari agar dipurifikasi dengan metode sebelumnya. Ligasi membutuhkan reagen. Kuantitas reagen ini ditentukan dari hasil perhitungan elektroforesis fragmen DNA yang dipurifikasi sebelumnya. Hasil perhitungan (akan dihitung di bagian pembahasan Purifikasi DNA) adalah sebagai berikut.

Komponen Reaksi

2X Rapid Ligation Buffer, T4 DNA Ligase pGEM-T or pGEM-T Easy Vector (50ng) Insert DNA T4 DNA Ligase (3 Weiss units/l) Deion hingga volume mencapai 20L *Ratio molar dari produk PCR: vector bisa memerlukan optimasi.

Konsen Awal 10x 1 5 ng 1

Konsen Akhir 1x 1 62,5 ng 1

Volume 2L 1L 12,5 l 1L 3,5L

Reagen ligasi dimasukan dalam tube 1,5 ml dan dihomogenisasi dengan memipet campuran. Setelah reagen dicampur, maka campuran dibiarkan semalaman pada suhu 4oC (overnight). Nilai ratio dari vektor:insert = 1:5

3. Hasil Pengamatan a. Purifikasi DNA Hasil Purifikasi DNA tampak berwarna bening. Sebanyak 5 l larutan kemudian dielektroforesis dan didapatkan band sebagai berikut.

1

2

3

4

L

L

5

6

7

8

A

Terlihat bahwa hasil elektroforesis kelompok kami (kelompok 6) menunjukan ada satu buah band. Band ini kemudian dicocokan dengan ladder untuk mengkuantifikasi besaran DNA yang berhasil diisolasi. Hasil dari

pengkuantufikasian ini dapat digunakan untuk menghitung banyaknya reagen yang dibutuhkan pada proses ligasi.

b. Ligasi Belum ada pengamatan hasil ligasi

4. Pembahasan a. Purifikasi DNA Purifikasi DNA sangat dibutuhkan dalam proses isolasi DNA dari sampel bahkan persiapan fragmen insert seperti praktikum ini. Ada beberapa hal yang harus diperhatikan saat melakukan purifikasi DNA. Mulai dai pemotongan gel agar yang harus dilakukan dengan hati-hati, penuh keamanan, dan segera karena sinar UV dapat membuat dimer pada DNA. Lalu pada saat merunning Geneaid Protocol pastikan seluruh prosedur dilakukan secara benar semisal jangan membuang microtube melainkan hanya cairan di dalamnya saja pada proses penempelan DNA.

Seperti yang sudah dijelaskan sebelumnya, hasil elektroforesis purifikasi ini menentukan kuantitas reagen ligasi. Berikut perhitungannya.

Dari gambar di atas dapat dilihat bahwa band kelompok kami bila dibandingkan dengan ladder akan menunjukan besaran 750 bp. Menurut tabel GeneRuler (lihat gambar), nilai 750 bp ini menunjukan kadar 25 ng. Setelah analisis kirologi maka tebal dari band kelompok kami 1x dari tebal ladder pada besaran 750 bp. Maka dapat diasumsikan kadar fragmen DNA kami bernilai 25 ng juga. Konsentrasi dari fragmen DNA ini adalah 25 ng/5 l atau 5 ng/l karena jumlah fragmen DNA hasil purifikasi yang dimasukan adalah 5 l.

Nilai rasio vektor : insert kelompok kami adalah 1:5 dan inkubasi dilakukan secara overnight. Konsentrasi hasil purifikasi kemudian digunakan untuk menghitung reaksi ligasi, yang cara penghitungannya terdapat pada manual pGEMT easy:

ng vektor kb insert kb vektor Maka,

= 50 ng = 0,75 kb = 3 kb

Dibutuhkan 6,25 ng insert untuk melakukan ligasi. Namun karena bentuk dari fragmen DNA cair dan tak mungkin menimbang sebanyak 62,5 ng, maka dilakukan konversi dari berat ini ke volume melalui konsentrasi insert yang didapatkan dari perhitungan elektroforesis di atas (5 ng/l). Maka volume insert yang dibutuhkan adalah l

Semua reagen yang telah dikuantifikasi kemudian dicampur untuk proses ligasi.

b. Ligasi Belum dilakukan pengamatan ligasi.

5. Kesimpulan a. Berhasil dilakukan purifkasi DNA dari gel agarosa. DNA ini berupa fragmen insert dengan besaran 750 bp. b. Hasil ligasi belum dapat ditentukan karena pengamatan belum dilakukan.

6. Daftar PustakaPROMEGA. 2009. pGEM-T and pGEM-T Easy Vector Systems. USA : PROMEGA