DAFTAR ISI PRAKTIKUM 1 : BIOMOLEKULER...................................................... ...........................2 EKTRAKSI DNA.................................................................... ..............................................2 PCR (POLYFERASE CHAIN REACTION)................................................. ......................6 ELEKTROFORESIS.................................................................. .........................................10 PRAKTIKUM 2 : BIOINFORMATIKA.................................................... .........................14 LANGKAH-LANGKAH................................................................. ....................................14 HASIL DESAIN PRIMER DNA......................................................... ...............................18PRAKTIKUM 1 : BIOLMOLEKULER DNA merupakan suatu unit terkecil dari makhluk hidup yang merupakan pembawa sifa t keturunan. Analisa DNA banyak digunakan untuk karakterisasi sifat genetik pada level molekuler yang secara langsung mencerminkan sifat genotip (materi genetik ) yang dimiliki oleh organisme tertentu. Analisis DNA ini terdiri dari tiga taha p yaitu ekstraksi DNA, PCR, dan elektroforesis. EKSTRAKSI DNA Ekstraksi DNA diawali dengan perusakan dan atau pembuangan dinding sel, yang dap at dilakukan baik dengan cara mekanis seperti sonikasi, tekanan tinggi, beku-lel eh maupun dengan cara enzimatis seperti pemberian lisozim. Langkah berikutnya ad alah lisis sel. Bahan-bahan sel yang relatif lunak dapat dengan mudah diresuspen si di dalam medium bufer nonosmotik, sedangkan bahan-bahan yang lebih kasar perl u diperlakukan dengan deterjen yang kuat seperti triton X-100 atau dengan sodium dodesil sulfat (SDS). Pada eukariot langkah ini harus disertai dengan perusakan membran nukleus. Setel ah sel mengalami lisis, remukan-remukan sel harus dibuang. Biasanya pembuangan r emukan sel dilakukan dengan sentrifugasi. Protein yang tersisa dipresipitasi men ggunakan fenol atau pelarut organik seperti kloroform untuk kemudian disentrifug asi dan dihancurkan secara enzimatis dengan proteinase. DNA yang telah dibersihk an dari protein dan remukan sel masih tercampur dengan RNA sehingga perlu ditamb ahkan RNAse untuk membersihkan DNA dari RNA. Molekul DNA yang telah diisolasi te rsebut kemudian dimurnikan dengan penambahan amonium asetat dan alkohol atau den gan sentrifugasi kerapatan menggunakan CsCl . Berikut ini langkah-langkah dalam mengekstraksi DNA: 1. Masukan darah sebanyak 0.1 ml atau 100 ml 2. Tambahkan buffer ekstraksi sebanyak 4 x volume total sampel. 3. Tambahkan buffer lisis 1 sebanyak 50 ?l 4. Tambahkan enzim proteinase K sebanyak 10 ?l 5. Homogenkan dengan alat vorteks selama 5 detik6. Inkubasikan dalam penangas air pada suhu 55C selama 45 menit 7. Tambahkan 100 ml buffer lisis 2 8. Homogenkan dengan cara membolak-balik tabung sebanyak 50x 9. Simpan dalam wadah berisi es atau di dalam freezeer selama 10 menit 10. Sentrifuga sampel pada kecepatan 14.000 rpm selama 5 menit (ingat pada s aat melakukan sentrifuga, berat sampel yang digunakan harus seimbang) 11. Pindahkan fasa atas ke dalam tabung 1.5 ml yang baru, jangan sampai enda pan terbawa 12. tambahkan kloroform sebanyak x volume total sampel 13. homogenkan sampel dengan cara membolak-balik tabung sebanyak 50 x. 14. Sentrifuga sampel pada kecepatan 14.000 rpm selama 5 menit. 15. Pindahkan fasa atas kedalam tabung baru 16. Tambahkan alkohol 100% (-20C) sebanyak minimal 2 x volume total sampel (a tau sampai pada tanda 1.5 ml pada tabung) 17. homogenkan larutan dengan cara membolak-balik tabung sebanyak 50x, amati saat membolakbalikkan tabung dan catat yang terjadi.(sampel dalam alkohol dapat disimpan pada suhu -20Cuntuk membantu proses presipitasi DNA), (untuk praktikum cukup sampai dengan tahap 15) Presipitasi DNA 18. Sentrifuga pada kecepatan 14000 rpm selama 5 menit 19. buang alkohol, hati-hati jangan sampai endapan DNA ikut terbuang 20. Tambahkan 1 ml alkohol 70 %, bolak-balikkan tabung 21. Sentrifuga tabung selama 5 menit dengan kecepatan 14000 rpm 22. buang alkohol, hati-hati jangan sampai endapan DNA terbuang 23. Balikkan tabung dengan hati-hati di atas kertas tisu, biarkan hingga tid ak ada lagi alkohol dalam tabung 24. tambahkan pelarut DNA sebanyak 20-50 ul (tergantung jumlah asam nukleat/ DNA yang diperoleh) 25. Simpan tabung dalam penangas / oven dengan suhu 50C selama 5 menit agar D NA dapat larut,bantu larutkan DNA dengan cara menjentik-jentik tabung hingga end apan larut. Selain dengan menggunakan cara diatas, DNA juga bisa di ekstraksi dengan 3 metod a lain yaitu: ektraksi organik, ekstraksi Chelex, dan FTA paper (gambar 3.1). Ekstraksi organik, kadang-kadang dikenal sebagai ekstraksi zat asam karbol cholo form, telah digunakan untuk waktu yang lama dan mungkin telah digunakan untuk si tuasi di mana baik RFLP atau PCR dilakukan. Bobot molekular tinggi DNA, yang ma na penting bagi metoda RFLP, mungkin diperoleh secara paling efektif dengan eks traksi organik. Metoda Chelex dari ekstraksi DNA lebih cepat dibandingkan dengan metode ekstraks i organik. Sebagai tambahan, metoda Chelex membutuhkan lebih banyak langkah dan kebanyakan langkah itu digunakan untuk mengkontaminasi sampel ke sampel. Bagaima napun hal itu menghasilkan DNA tunggal sebagai hasil proses ekstraksi dan oleh k arena itu hanya yang bermanfaat untuk prosedur pengujian yang berbasis PCR. Metoda yang populer untuk persiapan pengambilan referensi sampel adalah dengan m enggunakan noda darah dengan mengoleskannya ke kain kapas, dikenal dengan suatu carikan, dengan menghasilkan bulatan kira-kira 1 cm2 pada kain kapas tersebut, d engan rata-rata 70.000-80.000 sel darah putih dan menghasilkan rata-rata 500ng D NA genomic. Hasil nyata akan bervariasi dengan jumlah sel-sel darah putih yang a kan menunjukkan sampel dan efisiensi proses ekstraksi DNA. Gambar 3.1 Skema yang biasa digunakan untuk proses ekstrasi DNA Ekstraksi DNA disimpan secara khusus pda suhu -20oC, atau bahkan pada suhu -80oC pada penyimpanan dalam waktu lama, untuk menjaga aktifitas inti. Nucleas-nuclea s adalah enzim-enzim (protein) yang diketemukan di dalam sel-sel turunan DNA unt uk memungkinkan pendauran ulang menyangkut komponen-komponen nucleotide. Nucleas es memerlukan magnesium untuk bekerja dengan baik sehingga salah satu pengujian untuk mencegah mereka dari mencerna DNA di dalam darah adalah menggunakan tabung purple-topped yang berisi bahan pengawet darah yang dikenal sebagai EDTA. EDTA meliputi, atau membalut, semua magnesium bebas dengan begitu mencegah nucleases menhancurkan DNA di dalam contoh darah yang dikumpulkan.PCR (POLYFERASE CHAIN REACTION) Reaksi PCR meniru reaksi penggandaan atau replikasi DNA yang terjadi dalam makhl uk hidup. Secara sederhana PCR merupakan reaksi penggandaan daerah tertentu dari DNA cetakan (template) dengan batuan enzim DNA polymerase. Komponen PCR Selain DNA template yang akan digandakan dan enzim DNA polymerase, komponen lain yang dibutuhkan adalah: Primer Primer adalah sepasang DNA utas tunggal atau oligonukleotida pendek yang mengini siasi sekaligus membatasi reaksi pemanjangan rantai atau polimerisasi DNA. Jadi jangan membayangkan kalau PCR mampu menggandakan seluruh DNA bakteri E. coli yan g panjangnya kira-kira 3 juta bp itu. PCR hanya mampu menggandakan DNA pada daer ah tertentu sepanjang maksimum 10000 bp saja, dan dengan teknik tertentu bisa sa mpai 40000 bp. Primer dirancang untuk memiliki sekuen yang komplemen dengan DNA template, jadi dirancang agar menempel mengapit daerah tertentu yang kita ingink an. dNTP (deoxynucleoside triphosphate) dNTP alias building blocks sebagai batu bata penyusun DNA yang baru. dNTP terdiri atas 4 macam sesuai dengan basa penyusun DNA, yaitu dATP, dCTP, dGTP dan dTTP. Buffer Buffer yang biasanya terdiri atas bahan-bahan kimia untuk mengkondisikan reaksi agar berjalan optimum dan menstabilkan enzim DNA polymerase. Ion Logam Ion logam bivalen, umumnya Mg++, fungsinya sebagai kofaktor bagi enzim DNA polym erase. Tanpa ion ini enzim DNA polymerase tidak dapat bekerja. Ion logam monovalen, kalsium (K+). SIKLUS PCR Tahap Denaturasi Awal Denaturasi sempurna template DNA pada permulaan PCR merupakan salah satu hal pen entu suksesnya reaksi PCR. Tidak sempurnanya denaturasi DNA menyebabkan pengguna an template yang tidak efisien pada permulaan siklus amplifikasi dan hasil PCR y ang kurang baik. Denaturasi awal harus dilakukan sekitar 1-3 menit pada suhu 95C jika kandungan GC dari DNA target adalah 50% atau less. Interval ini dapat ditin gkatkan hingga10 menit jika kandungan GC dari DNA templet sangat tinggi. Jika denaturasi awal kurang dari 3 menit pada suhu 95C, Taq DNA Polymerase dapat ditambahkan pada campuran saat reaksi awal. Jika waktu denaturasi awal yang dipe rlukan sangat lama atau suhu yang digunakan sangat tinggi, maka Taq DNA Polymera se harus ditambahkan setelah denaturasi awal untuk menjaga stabilitas enzim yang secara drastis turun pada suhu lebih dari 95C. Tahap Denaturasi. Biasanya denaturasi selama 0.5 2 menit pada suhu 94-95C sudah cukup baik, ketika produk PCR yang disintesis pada siklus amplifikasi awal cukup pendek dari pada t emplet DNA dan telah terdenaturasi secara sempurna pada kondisi tersebut. Jika D NA yang diamplifikasi memiliki kandungan GC yang cukup tinggi, waktu denaturasi sebaiknya ditingkatkan mecapai 3-4 menit. Selain itu penambahan bahan untuk memb antu proses denaturasi dapat dilakukan misalnya dengan gliserol (hingga 10-15 %) , DMSO (hingga 10%) atau formamid (hingga 5%). Dengan adanya bahan tersebut, tem peratur anealing harus diatur secara experimental, mengingat Tm dari primer-temp lat menurun secara signifikan ketika bahan-bahan tersebut digunakan. Jumlah enzi m dalam reaksi harus ditingkatkan hingga 50%, mengingat DMSO dan formamid, pada konsentrasi tersebut menghambat aktivitas Taq DNA Polymerase. Selain itu, ada ca ra umum yang dapat dilakukan untuk mengurangi Tm dari produk PCR yaitu dengan me ngganti dGTP dengan 7-deaza-dGTP dalam campuran reaksi. Tahap Annealing Primer. Biasanya suhu optimal anealing adalah 5C lebih rendah dari temperatur melting (Tm ) primer-template DNA duplex. Inkubasi selama 0.5-2 menit biasanya sudah cukup. Namun, jika diperoleh produk PCR yang tidak spesifik, maka suhu anealing dapat d itingkatkan pada tahap tersebut 1-2C.Tahap Extending. Biasanya tahap pemanjangan (extending) ini dilakukan pada suhu 70-75C. Kecepatan sintesis DNA oleh Taq DNA Polymerase pada suhu tersebut sangat tinggi. Periode d ari tahap ini yang direkomendasikan adalah 1 menit untuk mensintesis fragmen PCR hingga 2 kb. Apabila fragmen DNA yang lebih besar yang akan diamplifikasi, maka waktu extensinya di tingkatkan menjadi 1 menit tiap 1 kb. Jumlah Siklus. Jumlah siklus PCR tergantung dari jumlah template DNA dalam campuran reaksi dan jumlah produk PCR yang diinginkan. Untuk kurang dari 10 salinan dari templet DNA , dapat dilakukan sebanyak 40 siklus. Jika jumlah awal templet DNA cukup tinggi, maka 25-35 siklus sudah cukup. Tahap Extending Akhir. Setelah akhir siklus, sampel biasanya di inkubasikan pada suhu 72C selama 5-15 me nit yang bertujuan untuk menyelesaikan penggandaan yang belum selesai dari produ k PCR baru. Juga, pada tahapan ini, aktifitas akhir transferasi dari Taq DNA Pol ymerase akan menambahkan nukleotida A pada ujung 3 produk PCR. Selanjutnya, jika fragmen PCR ini akan digunakan untuk diklon pada vektor, biasanya diperlukan wak tu sekitar 30 menit. Optimasi Reaksi PCR. Program PCR asli biasanya menggunakan 1 menit untuk tahap denaturasi dan anealin g. Kondisi ini memerlukan waktu yang cukup panjang dibandingkan dengan waktu asl i yang diperlukan. Selain itu, jika produk PCR kita kurang dari 1 kb, maka 1 men it merupakan waktu ekstensi yang cukup lama. Jika memungkinkan, gunakan PCR 2-langkah: 1. Denaturasi Awal, 2-3 menit pada suhu 94 C 2. Denaturasi, 15 detik pada suhu 94 C 3. Anealing dan ekstensi simultan, x menit pada suhu 68 C x tergantung pada panjang produk yang diinginkan, 1 menit/kb 4. Ulangi langkah 2 sebanyak 29-39 siklus. Jika Tm dari primer yang digunakan kurang dari 65 C, atau PCR 2-langkah ini tida k memberikan hasil yang diinginkan, maka gunakan, PCR 3-langkah: 1. Denaturasi awal, 2-3 menit pada suhu 94 C 2. Denaturasi, 15 detik pada suhu 94 C 3. Annealing, 15 detik pada suhu x C x tergantung pada Tm, biasanya 5 derajat dari Tm Primer terendah 4. Ekstensi, x detik x tergantung pada ukuran Produk yang diinginkan, 1 menit/kb 5. Ulangi langkah 2 sebanyak 29-39 siklus.ELEKTROFORESIS Elektroforesis adalah suatu teknik yang mengukur laju perpindahan atau pergeraka n partikel-partikel bermuatan dalam suatu medan listrik. Prinsip kerja dari ele ktroforesis berdasarkan pergerakan partikel-partikel bermuatan negatif (anion), dalam hal tersebut DNA, yang bergerak menuju kutub positif (anode), sedangkan pa rtikel-partikel bermuatan positif (kation) akan bergerak menuju kutub negatif (a node) (Klug & Cummings 1994: A-6). Elektroforesis digunakan untuk mengamati has il amplifikasi dari DNA. Hasil elektroforesis yang terlihat adalah terbentuknya band yang merupakan fragmen DNA hasil amplifikasi dan menunjukkan potongan-poto ngan jumlah pasangan basanya (Klug & Cummings 1994: 397). Teknik elektroforesis mempergunakan medium yang terbuat dari gel. Perpindahan p artikel pada medium gel tersebut dipengaruhi oleh faktor-faktor seperti ukuran p artikel, komposisi dan konsentrasi gel, densitas muatan, kuat medan listrik dan sebagainya. Semakin kecil partikel tesebut, maka pergerakan atau migrasinya aka n semakin cepat, karena matriks gel mengandung jaringan kompleks berupa pori-por i sehingga partikel-partikel tersebut dapat bergerak melalui matriks tersebut (B rown 1992: 19).Di dalam elektroforesis digunakan sumber arus listrik searah (DC), ruang untuk e lektroforesis (Comb, Well, platform dan cetakan wadah gel), larutan buffer (buff er ionik dan loading buffer), matriks elektroforesis, marker dan gel (Klug & Cum mings 1994: A-6). Elektroforesis digunakan dengan tujuan untuk mengetahui ukuran dan bentuk suatu partikel baik DNA, RNA dan protein. Selain itu, elektroforesis juga digunakan u ntuk fraksionasi yang dapat digunakan untuk mengisolasi masing-masing komponen d ari campurannya, mempelajari fitogenetika, kekerabatan dan mempelajari penyakit yang diturunkan (Klug & Cummings 1994: A-6). Elektroforesis dalam bidang geneti ka, digunakan untuk mengetahui ukuran dan jumlah basa yang dikandung suatu sekue n DNA tertentu (Klug & Cummings 1994: A-7). Pembuatan gel elektroforesis GEL AGAROSE 1 % 1.Timbang 1gr agarose 2.masukkan kedalam 100 ml 1 X TAE 3.panaskan dalam oven sampai homogen 4.tambahkan etidium bromid 0,01 l 5.siapkan cetakan agarose dengan sisirnya 6.tuangkan dan tunggu sampai keras GEL AKRILAMID (Sediaan untuk 25 ml) 1.tambahkan air (DW) 15 ml 2.masukkan 5 x TBE sebanyak 5 ml 3.aduk sampai homogen (jernih) 4.tambahkan acrilamid 30 % sebanyak 5 ml 5.tambahkan APS sebanyak 150 l 6.tambahkan Temed sebanyak 15 l ELEKTROFORESIS GEL AGAROSA Gambar1: Perangkat gel elektroforesa Metoda Elektroforesis Gel Agarosa didasarkan pada pergerakan mulekul bermuatan d alam media penyangga matriks stabil di bawah pengaruh medan listrik. Media yang umum digunakan adalah gel agarosa atau poliakrilamid. Elektroforesis gel agarosa digunakan untuk memisahkan fragmen DNA yang berukuran lebih besar dari 100 pb d an dijalankan secara horizontal, sedangkan elektroforesis poliakrilamid dapat me misahkan 1 pb dan dijalankan secara vertikal. Elektroforesis poliakrilamid biasa nya digunakan untuk menentukan urutan DNA (sekuensing). Larutan DNA yang bermuatan negatif dimasukkan ke dalam sumur-sumur yang terdapat pada gel agarosa dan diletakkan di kutup negatif, apabila dialiri arus listrik dengan menggunakan larutan buffer yang sesuai maka DNA akan bergerak ke kutup po sitif. Laju migrasi DNA dalam medan listrik berbanding terbalik dengan massa DNA . Migrasi DNA terutama ditentukan oleh ukuran panjang dan bentuk DNA. Fragmen DN A yang berukuran kecil akan bermigrasi lebih cepat dibanding yang berukuran besa r, sehingga elektroforesis mampu memisahkan fragmen DNA berdasarkan ukuran panja ngnya. Setelah proses elektroforesis selesai, dilakukan proses pewarnaan (staining) aga r molekul sampel yang telah terpisah dapat dilihat. Etidium bromida, perak, atau pewarna "biru Coomassie" (Coomassie blue) dapat digunakan untuk keperluan ini. Jika molekul sampel berpendar dalam sinar ultraviolet (misalnya setelah "diwarna i" dengan etidium bromida), gel difoto di bawah sinar ultraviolet. Jika molekul sampel mengandung atom radioaktif, autoradiogram gel tersebut dibuat. Pita-pita (band) pada lajur-lajur (lane) yang berbeda pada gel akan tampak setel ah proses pewarnaan; satu lajur merupakan arah pergerakan sampel dari "sumur" ge l. Pita-pita yang berjarak sama dari sumur gel pada akhir elektroforesis mengand ung molekul-molekul yang bergerak di dalam gel selama elektroforesis dengan kece patan yang sama, yang biasanya berarti bahwa molekul-molekul tersebut berukuran sama. "Marka" atau penanda (marker) yang merupakan campuran molekul dengan ukura n berbeda-beda dapat digunakan untuk menentukan ukuran molekul dalam pita sampel dengan meng-elektroforesis marka tersebut pada lajur di gel yang paralel dengansampel. Pita-pita pada lajur marka tersebut dapat dibandingkan dengan pita samp el untuk menentukan ukurannya. Jarak pita dari sumur gel berbanding terbalik ter hadap logaritma ukuran molekul. Gambar 2: Pita DNA Setelah Elektroforesis dan Diamati di Bawah Sinar UVPRAKTIKUM 2 : BIOINFORMATIKA Tujuan : 1. Untuk mempelajari cara mencari dan mendapatkan data dari genebank 2. Untuk mendesain PCR primer dari sekuens DNA Langkah-langkah: 1. ketikkan http://www.ncbi.nlm.nih.gov pada address bar 2. setelah muncul halaman utama, terdapat kotak dialog pencarian. Pilih gene dan k etikkan nama gene yang ingin dicari. Dalam hal ini saya memilih gene untuk Porph yria yaitu ALAS2 3. kemudian klik search dan akan muncul beberapa pilihan sekuens yang berkaitan dengan gene ALAS2. 4. klik pada salah satu judul yang diinginkan. (ALAS2 untuk homo sapiens) 5. setelah hasilnya muncul, tarik kursor ke bawah dan klik pada FASTA 6. format FASTA yang diperoleh adalah sebagai berikut. Kemudian block kurang leb ih 20 baris (1000-1500). Klik kanan lalu copy. 7. selanjutnya buka tab baru dan ketikkan frodo.wi.mit.edu atau gunakan google s earch dengan keyword primer3. 8. pada kotak kosong yang tersedia di halaman utama, klik kanan lalu paste. Maka akan muncul DNA yang telah di copy dari halaman sebelumya. 9. pada kotak dialog product size isi dengan menggunakan range angka (100-300). Pa da Primer size isikan min.18 dan max.27 . kemudian pada Primer tm isikan dengan min. 57 dan max.63 10. kemudian klik Pick Primers.Hasil: Setah semua langkah-langkah dilakukan dengan benar maka akan muncul desain PCR p rimer dari sekuens DNA seperti gambar dibawah ini. Jika angka pada product size sesuai dengan range yang telah kita masukkan sebelum nya maka tidak terjadi kesa lahan. (contoh: angka dibawah menunjukkan 138. Hasil tersebut benar karena range product size yang dimasukkan sebelumnya adalah 100-300).