HPLCHigh Performance Liquid Chromatography

Hida Salmah Fajriati (051011175) Mukhlis Bayu Irawan (051011177) Aisyah Rohmaniyah (051011179) Reza Devia Larasati (051011227) Fajar Agung Nur A (051011233) Oktaviana Eka D (051011235) Ramadhani Fadiah (051011237) Hartiningtyas (051011239)

Kelompok KS-05Kelas A

Pengembangan dan validasi metode HPLC untuk penentuan simultan dari rosiglitazone dan glimepiride dalam

bentuk sediaan gabungan dan plasma manusia

Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (HPLC) adalah teknik kromatografi yang digunakan untuk memisahkan campuran senyawa dengan tujuan mengidentifikasi, mengukur dan memurnikan masing-masing komponen campuran. Untuk analisis Rosiglitazone dan Glimepiride dalam bentuk sediaan gabungan dan plasma manusia digunakan RP-HPLC. RP-HPLC menggunakan fase gerak polar dan fase diam non polar.

PENDAHULUAN

RoziglitazoneRosiglitazone (nama dagang Avandia, GlaxoSmithKline) adalah obat antidiabetes di kelas thiazolidinedione obat. Ia bekerja sebagai sensitizer insulin, dengan mengikat reseptor PPAR dalam sel-sel lemak dan membuat sel-sel lebih responsif terhadap insulin.

Berat Molekul : 393.8877

GlimepirideGlimepiride diindikasikan untuk mengobati diabetes mellitus tipe 2, modus kerjanya adalah untuk meningkatkan produksi insulin oleh pankreas. Hal ini tidak digunakan untuk diabetes tipe 1 karena pankreas tidak lagi mampu memproduksi insulin.

Berat Molekul : 490.62

Beberapa tahun terakhir hanya ada satu metode spektrofotometri yang telah dilaporkan untuk penentuan atau analisis Rosiglitazone dan Glimepiride, tapi metode tersebut memiliki sensitivitas yang rendah. Oleh karena itu dilakukan pengembangan sensitivitas metode HPLC dalam penentuan Rosiglitazone dan Glimepiride.

Pemilihan kolomdilakukan percobaan menggunakan berbagai kolom :1. Symmetry C18 column (150 mm x 4.6 mm, 5 μm

particle size) menghasilkan peak yang simetris dan resolusi tinggi.

2. Zorbax SB-Phenyl column (250 mm x 4.6 mm, 5 μm particle size) resolusi rendah

3. Hypurity C8 column (250 mm x 4.6 mm, 5 μm particle size) sensitivitas rendah

Sehingga dipilih kolom pertama.

Kondisi dan Optimasi Kromatografi

Komposisi Fase GerakDilakukan modifikasi fase gerak meliputi jenis dan rasio pelarut organik yang digunakan, serta pengaruh pH.• Jenis pelarut organik

Pelarut organik

peak Waktu retensi

resolusi sensitifitas

Metanol Sangat kecil dan lebar

rendah

Etanol lama rendah

Propanol lama rendah rendah

Acetonitril tajam Tidak terlalu lama

tajam

• Rasio fase gerakDilakukan percobaan fase gerak dengan berbagai konsentrasi acetonitril 40-70% v/v.

Waktu retensi ROS dan GLM dengan rasio acetonitril.

Dari studi yang dilakukan diperoleh pemisahan optimum pada rasio 60% acetonitril.

• Pengaruh pHPengaruh pH fase gerak dalam waktu retensi dan jumlah pelat teoritis untuk larutan uji diteliti menggunakan fase gerak dari 0,02 M buffer fosfat dengan pH berkisar 2,6-6,0. Diketahui bahwa, peningkatan pH akan meningkatkan waktu retensi dari masing-masing ROS dan GLM sampai dengan pH 5,0. Di luar pH 5, waktu retensi menurun. Dari grafik diketahui bahwa pada pH 5,0 jumlah pelat teoritis maksimum.

Kondisi HPLC Metode analisis : LC-10A (Shimadzu, Kyoto, Jepang) Detektor : detektor UV (SPD-10AV) auto-injector : SIL-10 AXL Pompa : LC-10 λ analisis : 235 nm Run Time : 8 menit pada laju alir 1 ml menit-1 Elusi : Isokratik Fase gerak : campuran asetonitril dan 0,02 M dapar

fosfat pH 5 (60: 40, V / V) Kolom : Simetri ® C18 (150 mm x 4,6 mm id, 5

pM ukuran partikel), Waters, Irlandia Volume injeksi : 30 ml.

EKSPERIMENTAL

Bahan dan Reagen BAHAN :

- Standar Rosiglitazone Maleat.- Standar Glimepiride.- Avandarylᵀᴹ tablet (dalam label tertulis mengandung 4mg rosiglitazone maleat dan 2mg glimepiride /tablet)

REAGEN : - Acetonitril- Dapar fosfat

Plasma manusia.

Timbang 20 mg masing-masing Rosiglitazone, glimepiride dan nicardipine

Masukkan ke labu ukur 100 ml

Tambahkan metanol ad tanda (200 µg / mL)

Larutan Standard

VALIDASI METODE

LINIERITAS LOD & LOQ

AKURASI

PROSEDUR UJI LINEARITAS

Larutan standard diencerkan untuk mendapatkan larutan dengan kadar Rosiglitazon 0,10 – 25 µg / mL, glimepirid 0,125-12,5 µg / mL, dan Nicardipin 20 µg / mL.

Dibuat persamaan regresi Area vs Konsentrasi

LOD & LOQ

• LOQ dan LOD dihitung menurut ICH guidelines (ICH Topic Q2B 2004),dengan menggunakan persamaan :

• LOQ =10 Sa/b• LOD =3,3 Sa/b Sa(standart deviasi) b (slope)

LOD & LOQ

• Nilai LOQ ditemukan sebesar 0,13µg/ml untuk ROS dan 0,11 µg/ml untuk GLM. Dan masing- masing mempunyai nilai LOD sebesar 0,04 µg/ml.

UJI AKURASIAnalisis statistik hasil yang diperoleh dengan menggunakan Student t-test dan rasio varians F-test mengungkapkan tidak ada perbedaan yang signifikan antara kinerja dari dua metode mengenai akurasi dan presisi, masing-masing (Tabel 2).

Timbang 10 tablet Avandaryl™

Serbukkan (timbang berat serbuk total)

Timbang serbuk setara 20,0 mg Rosiglitazone dan 10 mg Glimepiride

Masukkan corong pisah

Ekstraksi dengan 30ml methanol (3X)

Ekstrak disaring dan dimasukkan ke labu ukur 100ml

Corong pisah dan kertas saring dicuci dengan methanol

Methanol ad tanda

Penerapan metode untuk analisis Avandaryl™ tablet

+

Lakukan pengenceran sehingga didapatkan kadar yang memenuhi rentang persamaan

regresi (Linieritas)

Suntikkan ke HPLC

Penerapan metode untuk plasma manusia

Plasma kosong ditambah larutan standar dari kedua obat untuk mencapai konsentrasi standar kalibrasi 0,1-0,25-0,5-0,75 dan 1,0 µg / mL; untuk masing-masing Rosiglitazone dan Glimepiride pada

konsentrasi konstan Nicardipin (2 µg mL-1)

1ml plasma manusia dengan konsentrasi obat yang meningkat dipindahkan ke dalam tabung sentrifus

Masing-masing tabung + 2ml Acetonitril

Vortex selama 5menit

Disentrifus dengan kecepatan 3500rpm selama 15menit pada suhu kamar

Supernatan tersebut diuapkan menggunakan gas nitrogen pada suhu 45 ° C

Sampel kering direkonstitusi dengan Acetonitril

Rasio luas puncak diplot versus konsentrasi obat dalam µg mL-1 untuk mendapatkan grafik kalibrasi

Suntikkan 30µl (3X replikasi)

APLIKASI PHARMACEUTICAL

• Analisis bentuk sediaan• Aplikasi Biologi• Presisi metode yang diusulkan pada spiked

human plasma.

Analisis bentuk sediaanMetode yang diusulkan selanjutnya

diterapkan pada penentuan obat di tablet ko-formulasi. (hasilnya ditampilkan di tabel).

Selektivitas metode diselidiki dengan mengobservasi setiap gangguan yang dihadapi dari eksipien tablet yang umum, seperti pati, magnesium stearat, laktosa, dan avisil. Hal ini menunjukkan bahwa senyawa ini tidak mengganggu hasil dari metode yang diusulkan.

Aplikasi BiologiSensitivitas yang tinggi dari metode yang

diusulkan memungkinkan penentuan rosiglitazone dalam spiked human plasma. Ketersediaan hayati absolut rosiglitazone adalah 99%.

Gangguan yang timbul dari asam amino endogen telah diatasi dengan presipitasi sederhana protein. Metode hanya melibatkan pengendapan protein plasma sederhana dengan asetonitril sebelum pengukuran.

Presisi metode yang diusulkan pada spiked human plasma

Presisi dievaluasi melalui mereplikasi spiked human plasma dengan konsentrasi ROS dan GLM yang berbeda dalam satu hari (repeatibility). Rata-rata %recovery adalah 97,70 ± 2,19 dan 98,10 ± 2,62 untuk masing-masing ROS dan GLM.

Presisi ditentukan dengan menganalisis konsentrasi yang sama selama tiga hari berturut-turut (Intermediate Precision). Persentase perolehan kembali rata-rata berdasarkan rata-rata dari tiga penentuan terpisah adalah 97.19 ± 2.05 dan 93.86 ± 2.04 untuk masing-masing ROS dan GLM.

KESIMPULAN

Metode HPLC yang dilakukansesuai untuk analisis Rosiglitazone dan Glimepiride dalam bentuk sediaan campuran. Metode ini memiliki keuntungan dibandingkan dengan metode lainnya dalam hal sensitivitas, efisiensi waktu dan batas deteksi minimum. Selain itu metode ini dapat diterapkan pada penentuan kombinasi obat tersebut dalam plasma manusia.

HASIL PRAKTIKUM

Kondisi HPLC

• Kolom : µ Bondapak C 18• Fase mobil : Metanol – Air (85:15)• Detektor : Spektrofotometer Diode

Array (λ 287 nm)• Flow Rate : 1,5 ml /menit• Temperatur : 30°C

Validasi Metode

• Selektivitas• Linieritas• Akurasi & Presisi

Selektivitas

Harga Rs tidak dapat dihitung karena pada waktu pengamatan pada HPLC, peak Trimetoprim tidak tampak.

LinieritasBaku Kerja Kadar

Sulfametoksazol (ppm)

sulfametoksazol

Rt (min) Area

I 99 1,865 3199,17603

II 148,5 1,870 4922,23340

III 198 1,880 6233,46973

IV 247,5 1,884 8252,52344

V 297 1,894 9628,42969

Persamaan regresi : y = bx + a y = 32,7046x - 28,3525

r = 0,9982

Akurasi dan Presisi

• % recovery : 45,38%• RSD : 86,55%

Tidak memenuhi persyaratan