Kelompok Guanin:

Ahmad Hamidi

David Lazuardi

Fitri Amalia

Kianti Kasya Kiresya

Rayhan Hafidz Ibrahim

Zainah

polimer linier yang tersusun dari monomer-monomernya yaitu

nukleotida. Asam nukleat ada dua jenis, yaitu DNA (deoxyribonucleic acid) dan RNA (ribonucleic acid)

Asam nukleat biasanya ditemukan

di nukleus (inti sel)

ASAM NUKLEAT NUKLEOTIDA

BASA RIBONUKLEOSIDA DEOKSIRIBONUKLEOSIDA

ADENIN

GUANIN

URASIL

SITOSIN

TIMIN

ADENOSIN

GUANOSIN

URIDIN

SITIDIN

TIMIDIN

21-DEOKSIADENOSIN

21-DEOKSIGUANOSIN

21-DEOKSIURIDIN

21-DEOKSISITIDIN

21-DEOKSITIMIDIN

Nukleosida

Gugus Penyusun Nukleotida

Asam nukleat

Nukleotida

Pentosa

Ribosa Deoksiribosa

Gugus fosfat

Basa Nitrogen

Purin Pirimidin

Gugus Fosfat

Gugus Fosfat Gugus fosfat terikat pada atom C nomor 5 melalui ikatan

fosfoester. Untuk membentuk polimer nukleotida atau Asam Nukleat maka terjadi ikatan fosfodiester yaitu ikatan gugus

fosfat dengan gugus gula pentosa dari satu nukleotida dengan nukleotida lain yaitu pada atom karbon nomer 5 dan 3.

Gugus fosfat menyebabkan asam nukleat bermuatan negatif kuat dan bersifat asam.

\

Gugus fosfat dapat berikatan dengan gugus fosfat lain dan penamaannya sesuai jumlah gugus fosfat. (mono, di, tri)

Contoh pada ATP, ADP, dan AMP

Gugus Fosfat

Perbedaan antara kedua bentuk gula tersebut terletak pada atom C nomor 2. Pada RNA, atom C nomor 2 berikatan dengan gugus hidroksil (OH) sedangkan pada DNA atom C nomor 2 berikatan dengan atom H.

Gula Pentosa

Ada 2 jenis Gula pentosa

yangmenyusun Nukleotida yaitu:

Ribosa , pada RNA

Deoksiribosa, pada DNA

Adenine

Guanine

Pirimidin

Basa Nitrogen

Purin

Thymine Uracil Cytosine

Basa Purin berasal dari senyawa heterosiklik yang terdiri dari 2 gabungan siklik (bisiklik).

Perbedaan struktur ini berpengaruh pada jumlah ikatan hidrogen saat berpasangan dengan basa pirimidin.

Purin Adenine C5H3N4

Guanine C5H4N5O

Basa Nitrogen

Basa pirimidin merupakan bentuk senyawa siklik.

DNA: Cytosine dan Thymine

RNA: Cytosine dan Uracil

Cytosine C4H5N3O

Thymine C5H6N2O2

Pirimidin

Uracil C4H4N2O2

Basa Nitrogen

Nukleosida vs Nukleotida

DNA

DNA ?

DNA adalah asam nukleat yang mengandung materi genetik dan berfungsi untuk mengatur perkembangan biologis seluruh bentuk kehidupan secara seluler.

Terdapat pada nukleus, mitokondria dan kloroplas. DNA nukleus berbentuk linear dan berasosiasi sangat erat dengan protein histon, sedangkan DNA mitokondria dan kloroplas berbentuk sirkular dan tidak berasosiasi dengan protein histon.

Model struktur DNA itu pertama kali dikemukakan oleh James Watson dan Francis Crick pada tahun 1953 di Inggris.

Bentuk Double Helix oleh “Watson & Crick’s”

• DNA tersusun oleh dua rantai polinukleotida yang saling berpilin membentuk heliks ganda (Double helix) dengan orientasi yang berlawanan (antiparalel). Rantai yang satu memiliki orientasi 5’ 3’ dan rantai yang lain memiliki orientasi 3’ 5’.

• Satu putaran komplementer terdiri dari 10 pasang basa dan berotasi 360.

• Arah pembacaan basa nukleotida dari ujung-5‛ menuju ujung-3‛.

Struktur DNA

Struktur DNA

• Proporsi basa A dan T serta C dan G selalu sama sehingga komposisi DNA dapat dinyatakan dengan kandungan G+C yang berkisar antara 26 % - 74%. (Hukum Chargaff)

• Semakin besar nilai C+G maka semakin sulit untaian ganda DNA tersebut dipisahkan. (Berhubungan dengan ikatan hidrogen)

• Kerangka gula deokribosa dan fosfat yang menyusun DNA terletak di bagian luar molekul sedangkan basa purin atau pirimidin ada di sebelah dalam untaian (helix).

• Basa Purin akan selalu berpasangan dengan basa Pirimidin. (A-T ; G-C) disebut KOMPLEMENTARITAS

DNA mempunyai dua lekukan eksternal yaitu lekukan besar dan lekukan kecil yang keduanya berfungsi sebagai tempat melekatnyan molekul protein tertentu.

Struktur DNA

Tipe DNA Berdasarkan Bentuk dan Struktur Fisik

Tipe DNA Arah Putar DNA

Tipe DNA Berdasarkan Bentuk dan Struktu Fisik

Bentuk B.

DNA ini merupakan DNA putar kanan. DNA dengan bentuk B memiliki lekukan mayor yang lebih besar daripada bentuk-bentuk DNA lainnya dengan kedalaman 0,85 nm dan lebar 1,1-1,2 nm. Lekukan minornya memiliki kedalaman 0,75 nm dan lebar 0,6 nm. Bentuk ini merupakan bentuk DNA yang paling banyak ditemukan di alam dibandingkan dengan bentuk yang lain. DNA bentuk B juga tahan pada keadaan kelembaban yang tinggi hingga sekitar 93%.

Bentuk A. DNA ini juga merupakan DNA putar kanan. DNA bentuk A merupakan DNA bentuk B yang berubah bentuk pada kelembaban 75%. Pada bentuk ini, pasangan basa menjadi miring dengan sudut 13° dari sumbu heliks. Lekukan mayor bentuk A lebih dalam, yaitu sekitar 1,35 nm, dan lebih sempit, yaitu sekitar 0,27 nm, daripada bentuk B. Sementara itu, lekukan minor bentuk A berukuran lebih lebar (sekitar 1,1 nm) dan lebih dangkal (sekitar 0,28 nm) daripada bentuk B.

Bentuk Z. DNA ini merupakan DNA putar kiri. Bentuk Z ini merupakan perubahan dari DNA bentuk B yang berada dalam konsentrasi NaCl yang tinggi. Bentuk Z ini memiliki gugus berulang (repeating unit) yang terdiri dari 2 pasangan basa nitrogen, sebagai anak tangga, dan susunan fosfat-gula, sebagai tulang punggung, yang berbentuk zigzag.

Tipe DNA Berdasarkan Bentuk dan Struktu Fisik

Ikatan Kimia pada DNA

• Ikatan hidrogen adalah suatu bentuk interaksi lemah antara suatu atom elektro negatif (atom akseptor) dengan atom hidrogen yang terikat secara kovalen pada atom yang lain (atom donor)

• Terdapat 3 ikatan hidrogen pada basa Guanine dan Citosune, dan 2 ikatan hidrogen pada basa Adenine dan Thymine. Sehingga ikatan G-C lebih kuat daripada A-T

Ikatan Hidrogen

Ikatan Kimia pada DNA

• Pada asam nukleat terdapat pula ikatan kovalen melalui gugus fosfat yang menghubungkan antara gugus hidroksil (OH) pada posisi 5’ gula pentosa dan gugus hidroksil pada posisi 3’ gula pentosa nukleotida berikutnya. Ikatan ini dinamakan ikatan fosfodiester karena secara kimia gugus fosfat berada dalam bentuk diester. Oleh karena ikatan fosfodiester menghubungkan gula pada suatu nukleotida dengan gula pada nukleotida berikutnya

Ikatan Fosfodiester

Ikatan Kimia pada DNA

Ikatan glikosidik adalah ikatan yang menghubungkan gula pentosa dengan basa nitrogen.

Ikatan Glikosidik

Pengemasan DNA

RNA

RNA ?

Merupakan substansi genetik yang berperan sebagai perantara dalam proses pengkodean protein dari gen yang terdapat di dalam DNA.

Molekul RNA mempunyai bentuk yang berbeda dengan DNA. RNA memiliki bentuk pita tunggal dan tidak berpilin. Tiap pita RNA merupakan polinukleotida yang tersusun atas banyak ribonukleotida. Tiap ribonukleotida tersusun atas gula ribosa, basa nitrogen, dan asam fosfat.

Struktur RNA

• RNA hanya terdiri dari satu untai tunggal, akan tetapi dapat melipat lipat dirinya dalam suatu aturan tertentu. RNA terdiri dari kumpulan-kumpulan nukleotida. Nukleotida tersebut terdiri dari fosfat, ribose, dan basa nitrogen.

• Basa nitrogen pada RNA untuk purin sama dengan DNA yaitu adenine-guaine. Hal yang berbeda terletak pada basa pirimidin dimana RNA tidak memiliki timin melainkan urasil dam sitosin.

Jenis-jenis RNA

RNA

rRNA

siRNA

miRNA tRNA

mRNA

• Ribosomal RNA (rRNA) adalah RNA

yang merupakan bagian dari Ribosom dan berfungsi untuk sintesis protein pada makhluk hidup

• Disintesis dalam inti sel. • rRNA dan Ribosomal protein

membentuk Ribosom dengan presetanse berat 60% rRNA dan 40% protein

• Terdapat dua jenis rRNA yaitu Large Subunit (LSU) dan Small Subunit (SSU)

• Sebesar 75% total RNA adalah rRNA

Small Ribosomal Sub Unit

Large Ribosomal Sub Unit

Ribosomal RNA (r-RNA)

• rRNA LSU dan SSU terletak berhimpitan dengan mRNA berada diantaranya

• Terdapat tiga binding sites pada Ribosom yaitu A (Aminoacyl-tRNA bidnign site), P (Peptidyl-tRNA binding site) dan E (Exit site)

Large Subunit (LSU)

Small Subunit (SSU)

Struktur r-RNA

• RNA Transfer adalah RNA yang berfungsi menerjemahkan kode genetik dari RNA Duta (mRNA) dan membawa asam amino spesifik ke Ribosom dalam proses sintesis protein

• tRNA disebut juga antikodon yang memiliki kodon komplemen dari mRNA atau kodon

• Terdapat 61 jenis kodon yang mengkode 20 jenis asam amino

• Diperlukan minimal 31 tRNA untuk melakukan translasi dalam proses sintesis protein

RNA Transfer (t-RNA)

Double helical stem domains terbentuk dari ikatan pasangan basa nitrogen yang saling berkomplemen dalam satu untaian yang sama

Loop domains terbentuk ketika pasangan basa nitrogen tidak saling berkomplemen sehingga tidak terbentuk ikatan atau dapat disebakan adanya basa termodifikasi yang mencegah terbentuknya pasangan basa

A U A C C

U A U G G

C U

C U

G U U

stem loop

: : : : :

Struktur RNA:

Sebagian besar RNA memiliki struktur sekunder yang terdiri dari domain stem (batang) dan loop (lingkaran)

Struktur t-RNA

Terminal 3’ mempunyai sekuens CCA tempat asam

amino spesifik melekat

Terminal 5’ yang mengandung

fosfat

Acceptor stem yang terdiri dari 7 pasang basa nitrogen yang berikatan dari

nukleotida terminal 3’ dan

5’

Lengan D yang terdiri dari 4 pasang basa nitrogen dan

loop yang mengandung

dihydrouridine

Lengan Antikodon yang terdiri dari 5

pasang basa nitrogen dan loop yang mengandung

antikodon

Struktur t-RNA

Lengan T yang terdiri dari 5 pasang basa nitrogen dan

loop TΨC yang disebut

pseudouridine

• RNA yang bertugas untuk mengkopi susunan genetik suatu DNA untuk dapat dibawa ke ribosom dimana nantinya akan dimulai pembentukan protein.

• Dalam pembentukan protein, mRNA akan dicari pasanganan asam aminonya oleh tRNA

RNA messenger (m-RNA)

• Tersusun dari Polinukleotida: gugus fosfat, gula ribosa, dan basa nitrogen (Guanin, Adenin, Sitosin dan Urasil)

• Merupakan satu rantai panjang tunggal.

Struktur m-RNA

• Ujung 5’ adalah ujung awal dari mRNA yang terbuat

dari guanin yang telah dimodifikasi yang berfungsi sebagai ujung yang dapat diidentifikasi oleh ribosom dan melindungi dari degradasi eksonukleat hanya terdapat sel eukariotik.

Struktur m-RNA

• Daerah Koding adalah daerah dimana transkripsi terjadi.

Terdiri dari kodon-kodon yang terbentuk dari transkripsi dengan DNA dan nantinya akan di translasi dengan tRNA. Daerah koding biasanya dimulai dengan kodon AUG (kodon start) dan diakhiri dengan kodon UAA, UAG atau UGA (kodon stop).

• Untranslated Region (UTR) Daerah yang tidak di translasi dari awal sampai akhir

(5’UTR dan 3’UTR). Terletak di kedua ujung mRNA.

• Ujung Poly(A) Ujung mRNA yang terdiri daru adenin yang membantu

dalam translasi.

• RNAi adalah suatu proses dimana terjadi penghambatan aktivitas atau ekspresi dari suatu gen tertentu.

• Ditemukan oleh Andrew Z. Fire (Stanford University) dan Craig C. Mello (University of Massachusetts)

• Diteliti menggunakan cacing (C. elegans) dan lalat buah (D. melanogaster).

• Merupakan potongan gen dengan panjang 21-23 nukleotida yang berasal dari dsRNA.

• Rantai ganda 21 nt terdiri dari 19 pasangan basah dan 2 nt belalai 3’

• RNAi terdiri dari 2 jenis RNA yaitu microRNA (miRNA) dan small interfering (siRNA)

Interfernce RNA (-RNA)

1. Rantai dsRNA masuk kedalam sitoplasma sel (baik dalam bentuk alami ataupun sentetis), dan akan langsung dikenali oleh enzim yang disebut Dicer (pemotong). Enzim ini akan memotong rantai dsRNA menjadi rantai yang pendek-pendek (21 base pair, termasuk 2 nucleotide dengan 3’-end di kedua ujungnya).

2. Dicer-dicer tadi (bersama co-factor lainnya) akan sangat aktif memotong-motong dsRNA sehingga akan terdapat banyak potongan-potongan kecil dari dsRNA, yang kita sebut dengan small interfering RNA (siRNA) yang masih memiliki rantai ganda (double-stranded).

3. Selanjutnya siRNA akan dikenali oleh RNA-Induced Silencing Complex (RISC) yang mengandung enzim Argonaut, dimana pada fase ini siRNA akan dibelah menjadi rantai tunggal (single-stranded) yang akan mengaktifkan RISC.

Small Interfering RNA (si-RNA)

4. RISC yang aktif akan segera mencari messenger RNA (mRNA) yang baru keluar dari inti sel, setelah proses transkripsi dari DNA . Dan single-stranded siRNA didalam RISC akan dengan tepat mengenali target dan mengikat pasangan basa-komplemen-nya (base-pairing with the complementary) di mRNA.

5. Setiap RISC mengandung aktifitas enzim endonuclease (Argonaut subunit) yang bertugas memotong target mRNA menjadi bagian-bagian kecil, sehingga informasi genetik dari DNA untuk dirubah menjadi protein musnah. Potongan-potongan mRNA ini akan terdegradasi secara alami dengan mekanisme endogenous.

Small Interfering RNA (si-RNA)

• microRNA ( mi-RNA ) adalah suatu molekul kecil yang merupakan salah satu jenis non-coding RNA ( mengandung sekitar 22 nukleotida ) yang dapat ditemukan dalam tanaman , hewan , dan beberapa virus , yang berfungsi dalam RNA silencing dan pasca - transkripsi dari ekspresi gen

Micro RNA (mi-RNA)

Micro RNA (mi-RNA)

DNA vs RNA

Asam Nukleat

DNA RNA

Genetik Non

Genetik

DNA

Menyimpan materi genetic yang diwariskan organisme dari orangtua

Autokatalis

Mengontrol sintesis protein melalui RNA

Mengontrol aktivitas hidup organisme

DNA

DNA Mitokondria

DNA Nukleus

DNA Kloroplas

DNA Plasmid

DNA Polimerasi

DNA Ligase

DNA Mitokondria

Mengkode enzim dan beberapa protein yang diperlukan untuk aktivitas mitokondria yaitu respirasi sel.

DNA Nukleus

Pembawa kode untuk protein melalui proses transkripsi dan translasi.

DNA Kloroplas

Mengode enzim dan beberapa protein yang diperlukan untuk reaksi terang pada proses anabolisme

DNA Plasmid

Memelihara sejumlah ciri-ciri yang stabil dari generasi ke generasi. Plasmid berfungsi sebagai vektor atau pemindah.

DNA Polimerase

Membaca untaian DNA yang utuh sebagai template (cetakan) yang kemudian digunakan untuk menyintesis untaian DNA baru

DNA Ligase

Menggabungkan fragmen yang terbentuk saat proses replikasi, menyambungkan potongan-potongan DNA yang baru disintesis, dan berperan dalam proses reparasi DNA

RNA

Genetik

Non - Genetik

mRNA

tRNA

rRNA

siRNA

dll

RNA - Genetik

• Pembawa keterangan genetic

• Mengatur aktivitas sel.

• Hanya bisa ditemukan pada makhluk hidup tertentu yang tidak mempunyai DNA, misalnya virus.

RNA NON - Genetik

• membawa dan menyampaikan kode atau informasi genetic.

mRNA (Messanger RNA)

• membawa serta menerjemahkan urutan nukleotida dalam mRNA menjadi urutan asam amino dalam polipeptida.

tRNA (Transfer RNA)

• mesin perakit dalam sintesis protein yang bergerak ke satu arah mRNA.

• Katalisator proses sintesis

rRNA (Ribosomal RNA)

• Pengaturan ekspresi genetic

• Peredaman gen (genesilencing)

miRNA (Micro RNA)

• Menginterferensi dan meregulasi ekspresi gen

• mendegradasi mRNA dan menjadikan struktur kromatinnya menjadi kompak.

siRNA (Small Interfeering RNA)

• Melakukan modifikasi kima pada RNA lainnya, terutama rRNA dan tRNA.

snoRNA (Small Nucleolar RNA)

• Melakukan proses pre-mRNA atau hnRNA di dalam nucleus

• Mengatur telomere, membantu dalam regulasi, membentuk snRNP, dan membantu dalam penyambungan RNA

snRNA (Small Nuclear RNA)

• Mengtranskib mRNA dari DNA

RNAP (RNA Polimerase)

• Membantu langsung mRNA ribosom (polipeptida kompleks) menjadi ER padat setelah translasi terjadi

SRP RNA (Signal-recognition particle RNA)

• hasil langsung dari transkripsi DNA yang dikenal dengan pre-mRNA

hnRNA (Heterogeneus Nuclear RNA)

• sensor RNA yang mendeteksi dan merespons terhadap lingkungan atau metabolic, dan mempengaruhi ekspresi gen

Riboswitches (RNA Switches)

• melawan infeksi virus dan kerusakan genomic akibat menyisipnya materi genetic asing

• menghambat ekspresi gen pada sekuens yang spesifik

RNAi (RNA Interference)

• berperan dalam trans-splicing mRNA

SmY RNA

• berfungsi dalam modifikasi nukleotida mRNA

gRNA (Guide RNA)

REKAYASA GENETIKA

• Teknologi DNA rekombinan atau rekayasa genetika telah melahirkan revolusi baru dalam berbagai bidang kehidupan manusia, yang dikenal sebagai revolusi gen.

• Produk teknologi tersebut berupa organisme transgenik atau organisme hasil modifikasi genetik (OHMG), yang dalam bahasa Inggris disebut dengan Genetically Modified Organism (GMO).

REKAYASA GENETIKA PADA PERTANIAN DAN PETERNAKAN

• Metode Elektroporasi : Langsung • Elektroporasi adalah merupakan metode yang menggunakan

kejutan listrik untuk memperbesar pori-pori pada membran sel sehingga dapat meningkatkan pemeabilitas membran. Untuk melakukan metode ini, sel terlebih dahulu harus ditumbuhkan pada media hingga mencapai masa di sekitar pertengahan fase log. Lalu sinyal elektrik akan menginduksi perbesaran pori-pori pada membran sel sehingga molekul yang berukuran kecil seperti DNA dapat masuk ke dalam membran sel.

• Metode elektroporasi sudah diaplikasikan dalam berbagai bidang. Dalam bidang pertanian, elektroporasi dapat digunakan untuk memodifikasi mikroorganisme agar dapat menambat nitrogen bebas yaitu dengan menyisipkan gen yang dapat menambat nitrogen bebas. Selain itu juga dapat dihasilkan tanaman transgenik yang memiliki genotipe yang lebih istimewa (seperti peningkatan mutu, rasa dan ketahanan misalnya).

Karbid Silikon (Silicon Carbide) : Langsung

• Suspensi sel tanaman yang akan ditransformasi dicampur dengan serat silicon carbide dan DNA plasmid dari gen yang diinginkan dimasukkan kedalam tabung Eppendorf, kemudian dilakukan pencampuran dan pemutaran dengan vortex.

• Serat karbid berfungsi sebagai jarum injeksi mikro (micro injection) untuk memudahkan transfer DNA kedalam sel tanaman. Metode ini telah digunakan dan menghasilkan tanaman jagung transgenik yang fertil.

Penembakan Partikel (Particle bombardment) : Langsung

• Metoda gene gun atau particle bombardment merupakan teknik paling modern dalam transformasi tanaman. Metode transfer gen ini dioperasikan secara fisik dengan menembakkan partikel DNA-coated langsung ke sel atau jaringan tanaman. Dengan cara partikel dan DNA yang ditambahkan dapat menembus dinding sel dan membran, kemudian DNA larut dan tersebar didalam sel atau jaringan secara independen.

• Penggunaan senjata gen memberikan hasil yang bersih dan aman, meskipun ada kemungkinan terjadi kerusakan sel selama proses penembakan berlangsung. Penggunaan particle bombardment membuka peluang baik dalam memproduksi tanaman transgenik dari berbagai spesies yang sebelumnya sukar ditransformasi dengan Agrobacterium, khususnya tanaman monokotil.

Kloning • Kloning adalah kopian yang identik. Konsep

dasarnya adalah memasukkan sel, mengisolasi, lalu memproduksi suatu duplikat dari sel itu sendiri.

• Kloning DNA melibatkan pemisahan gen dan atau segmen DNA dari kromosom yang lebih besar, lalu memasukkan kedalam molekul kecil dari DNA lalu mereplikasi DNA yang dimodifikasi hingga ribuan bahkan jutaan kali melalui jumlah dari host cell dan juga pembuatan kopi di DNA di setiap sel.

Prosedur Kloning • Memotong DNA di lokasi yang tepat. Endonuklease spesifik

(restriction endonuclease) menyediakan beberapa gunting molecular.

• Memilih molekul kecil dari DNA yang bisa duplikasi diri sendiri. DNA itu disebut juga vector kloning. Sejenis tipikal plasmid atau DNA

• Menggabungkan 2 DNA secara kovalen. Enzim DNA ligase menghubungkan vector kloning dan DNA untuk dikloningkan. Molekul DNA komposit terdiri dari penghubung segmen kovalen dari 2 atau lebih sumber yang sering disebut DNA rekombinan.

• Memindahkan DNA rekombinan dari tabung reaksi ke host cell yang menyediakan perlengkapan enzimatik untuk replikasi DNA.

• Memilih dan mengidentifikasi host cell yang mengandung DNA rekombinan.

Kloning Pada Domba Dolly

Kloning Pada Balteri

Kloning Pada Kloning

Terapi Gen

• Terapi gen adalah suatu teknik terapi yang digunakan untuk memperbaiki gen-genmutan (abnormal/cacat) yang bertanggung jawab terhadap terjadinya suatu penyakit.

• Selain memasukkan gen normal ke dalam sel mutan, mekanisme terapigen lain yang dapat digunakan adalah melakukanr ekombinasi homolog untuk melenyapkan gen abnormal dengan gen normal, mencegah ekspresi gen abnormal melalui teknik peredaman gen, dan melakukan mutasi balik selektif sehingga gen abnormal dapat berfungsi normal kembali.

Terapi Gen Untuk Kanker • Menambahkan gen tertentu pada sel kanker sehingga lebih

peka terhadap kemoterapi maupun radiasi, atau menghalangi kerja gen yang dapat membuat sel kanker kebal terhadap obat-obat kemoterapi. Juga dicoba cara lain, membuat sel sehat lebih kebal terhadap kemoterapi dosis tinggi, sehingga tidak menimbulkan efek samping.

• Menambahkan gen tertentu sehingga sel-sel tumor/kanker lebih mudah dikenali dan dihancurkan oleh sistem kekebalan tubuh. Atau sebaliknya, menambahkan gen pada sel-sel kekebalan tubuh sehingga lebih mudah mendeteksi dan menghancurkan sel-sel kanker.

• Memberikan gen yang mengaktifkan protein toksik tertentu pada sel kanker, sehingga sel tersebut melakukan aksi “bunuh diri” (apoptosis).

Jenis-Jenis Terapi Gen • Terapi gen sel somatik (somatic-cell gene therapy) atau gene therapy non

hereditable.

Pada terapi gen sel somatik, gen yang normal atau telah dimodifikasi ditransfer ke dalam sel-sel somatik pasien. Terapi gen ini hanya dapat mengatasi penyakit atau kelainan pada pasien yang bersangkutan. Gen yang telah diperbaiki atau dimodifikasi ini tidak dapat diturunkan kepada generasi selanjutnya, karena gen yang telah diperbaiki ini hanya ada pada sel-sel somatik saja dan tidak ada pada sel-sel germinal. Terapi gen somatik (somatic cell gene therapy) mirp dengan transplantasi sel, jaringan atau organ.

Pada transplantasi organ ke tubuh resipien, organ yang ditransplantasikan itu mengandung gen-gen yang berbeda dengan pasien. Pada terapi gen ini beberapa sel pasien diambil, diperbaiki gennya dan kemudian dikembalikan ke pasiennya. Hal ini menyebabkan terapi gen sel somatik tidak serumit dan tidak seberbahaya transplantasi organ.

• Terapi gen sel germinal (Germ line /hereditable gene therapy) Pada terapi gen sel germinal, gen yang mengalami defek pada sel-

sel germinal akan diperbaiki dengan cara menginsersikan dan mengintegrasikan gen yang normal atau gen yang telah dimodifikasi kedalam genom sel-sel ger minal. Gen yang telah diinsersikan ini kemudian akan diturunkan ke generasi berikutnya.

Terapi gen sel germinal sangat bermanfaat untuk mengatasi penyakit-penyakit genetik dan penyakit-penyakit yang bersifat herediter. Akan tetapi terapi gen sel germinal hingga kini masih sulit dilakukan karena alasan teknis dan etik. Bila gen yang mengalami defek pada sel-sel germinal ini diperbaiki dan diturunkan berarti kita telah mengubah genetik seseorang. Hal inilah yang menjadi kendala untuk melakukan terapi gen sel germinal.

Proses Terapi Gen

Forensik (PCR) Metode PCR dapat dilakukan di laboratorium dimana dapat menggunakan

bahan berupa • DNA original untuk dikopi • Dua molekul primer yang berbeda untuk mengurung DNA yang utuh • Nukleotida diperlukan untuk kerangkanya • Larutan buffer dan • Tag DNA poymerases • Dua primer diperlukan untuk mengkomplement, satu strand DNA pada awal

daerah target dan primer kedua untuk mengkomplement strand lainnya pada akhir daerah target.

Pada kondisi tertentu, daerah DNA akan berlipat ganda menjadi jumlah yang besar dalam waktu singkat. Proses pencampuran PCR mengikuti 3 tahapan yaitu: denaturasi, annealing primer dan replikasi DNA, detailnya adalah sebagai berikut:

• a. Satu potong DNA original didenaturasi pada suhu 94-96oC, dobel helix strand dipisahkan menjadi single strand.

• b. Primer mengikat masing-masing strand DNA pada suhu sekitar 50-65oC • c. Suhu dinaikkan sampai 72oC untuk replikasi DNA.

Gambar Proses Forensik (PCR)

Replikasi DNA

Komponen dalam Sintesis DNA

1. Polimerase DNA : enzim yang berfungsi mempolimerisasi nukleotida-nukleotida

2. Ligase DNA : enzim yang berperan menyambung DNA utas lagging

3. Primase DNA : enzim yang digunakan untuk memulai polimerisasi DNA pada lagging strand

4. Helikase DNA : enzim yang berfungsi membuka jalinan DNA double heliks

5. Single strand DNA-binding protein : menstabilkan DNA induk yang terbuka

Proses Replikasi

Proses Replikasi

Leading Strand Lagging Strand

Perbedaan Proses Replikasi Pada Prokariotik Dan Eukariotik

Pada prokariot, proses replikasi terjadi secara cepat dan terus-menerus. Pada proses replikasi tersebut jarang sekali terjadi kesalahan. Hal ini dikarenakan genom pada prokariot lebih sederhana daripada eukariot. Selain itu proses replikasi hanya terjadi di satu tempat yang disebut oriC.

Perbedaan Proses Replikasi Pada Prokariotik Dan Eukariotik

Pada eukariot, molekul DNA lebih besar daripada di prokariot dan tidak melingkar, dan juga banyak tempat untuk memulai replikasi. Pada eukariot replikasi DNA hanya terjadi pada fase S di dalam interfase

Transkripsi RNA

Inisiasi

Elongasi

Terminasi

Inisiasi

• Enzim RNA polimerase menemukan tempat yang tepat untuk memulai inisiasi di double helix DNA (promoter).

• Dalam menemukan tempat inisiasi, RNA polimerase dibantu oleh sigma factor.

• RNA polimerase memotong ikatan double helix DNA induk.

Elongasi

• RNA polimerase bergerak sepanjang molekul DNA dan membuka double helix.

• RNA polimerase merangkai ribonukleotida ke ujung 3’ (RNA yang terbentuk adalah dari ujung 5’ ke 3’).

Terminasi

• Setelah proses transkripsi RNA selesai, enzim RNA polimerase dan RNA yang baru hasil proses transkripsi terlepas dari DNA.

• Double helix DNA kembali berikatan satu sama lain (tanpa melalui proses replikasi).

Perbedaan Proses Transkripsi pada Prokariotik Dan Eukariotik

Pada prokariotik tempat terjadinya proses transkripsi (di dalam nukleus) dan translasi (sitoplasma) tidak dapat dibedakan atau hampir sama. Hal ini dikarenakan prokariot tidak memiliki membran inti yang memisahkan keduanya. Sehingga, memungkinkan translasi mRNA dimulai saat transkripsi masih berlangsung. Sedangkan untuk eukariot sebelum RNA bisa meninggalkan nukleus, transkrip RNA eukariotik dari gen pengode protein dimodifikasi dalam berbagai cara, menghasilkan mRNA akhir yang fungsional.

Perbedaan Proses Transkripsi pada Prokariotik Dan Eukariotik

Selain itu, pada eukariotik, RNA-d yang dihasilkan itu tidak langsung dapat berfungsi dalam sintesis polipeptida, sebab masih mengandung segmen-segmen yang tidak berfungsi, yang disebut intron. Sedangkan segmen-segmen yang berfungsi untuk sintesis protein disebut ekson. Didalam nukleus terjadi pematangan atau pemasakan RNA-d, yaitu dengan jalan melepaskan segmen-segmen intron dan merangkaikan segmen-segmen ekson. Gabungan segmen-segmen ekson membentuk satu rantai atau utas RNA-d yang mengandng sejumlah kodon untuk penyusunan polipeptida. Rantai RNA-d ini dikenal sebagai sistron.

Deteksi asam nukleat

Analisis Kuantitaif Analisis Kualitatif

1. PCR 2. Microarray

3. Spektroskopi UV-VIS

1. Elektroforesis 2. DNA sequencing 3. Hibridisasi in situ

4. Blooting

1. PCR (Polymerase Chain Reaction )

• Berperan dalam Analisis Kuantitatif dan Kualitatif karena berfungsi untuk menduplikasi DNA atau RNA dalam jumlah besar dengan waktu singkat

Nn merupakan jumlah potongan DNA pada n-siklus, No merupakan jumlah potongan DNA target pada awal siklus, n merupakan jumlah siklus, dan E merupakan nilai sensitifitas (0<E<1)

Terdiri dari 3 tahap 1. Denaturasi : Denaturasi DNA

ditujukan agar DNA dapat terpisah menjadi 2 rantai yang terpisah agar dapat terhibidrisasi

2. Annealing : DNA yang terdenaturasi kemudian dihibridisasi dengan potongan DNA primer. Potongan DNA primer berisikan 3 basa nukleotida utama dari fragmen DNA yang hendak di perbanyak jumlahnya

3. Extending : Pemanjangan atau proses duplikasi DNA.

Komponen PCR

1. DNA templat adalah DNA untai ganda yang membawa urutan basa fragmen atau gen yang akan digandakan. Urutan basa ini disebut juga urutan target (target sequence)

2. Primer adalah molekul oligonukleotida untai tunggal yang terdiri atas sekitar 30 basa yang menginisiasi sekaligus membatasi reaksi pemanjangan rantai atau polimerisasi DNA. Polimerisasi primer dapat berlangsung karena adanya penambahan basa demi basa dari dNTP yang dikatalisasi oleh enzim DNA polimerase. Pada PCR enzim DNA polimerase yang digunakan harus termostabil karena salah satu tahap adalah denaturasi yang membutuhkan suhu tinggi.

3. dNTP (deoxynucleoside triphosphate) dNTP alias building blocks sebagai ‘batu bata’ penyusun DNA yang baru. dNTP terdiri atas 4 macam sesuai dengan basa penyusun DNA, yaitu dATP, dCTP, dGTP dan dTTP.

4. Buffer terdiri atas bahan-bahan kimia untuk mengkondisikan reaksi agar berjalan optimum dan menstabilkan enzim DNA polymerase

JENIS PCR

Reverse Transcriptase RT-PCR dikenal dengan Kinetic Polymerase Chain Reaction. RT PCR merupakan modifikasi dari PCR, di mana yang diamplifikasi berupa mRNA. Pada RT-PCR, sampel yang digunakan bukan DNA, melainkan RNA

Real Time PCR (qPCR) Yang membedakan kedua metode ini adalah pada metode qPCR detektor langsung diberikan dalam analisis. Detektor dapat berupa pewarna fluorosen. Detektor berkerja dengan mengeluarkan cahaya fluorosen (warna hijau) yang nantinya akan dianalisis untuk menghitung konsentrasi asam nukleat dalam sampel. Cahaya fluorosen yang dilepaskan akan ditangkap oleh sistem komputasi dalam instrument qPCR

2. Microarray

Tahapan microarray, antara lain:

1. Mengumpulkan sel atau jaringan yang akan dianalisis

2. Isolasi mRNA dengan menggunakan primer poly-T

3. Membuat cDNA yang diberi fluoresens

4. Hibridisasi

5. Pembacaan dengan menggunakan laser

6. Analisis

Prinsip dasar analisis dari microarray adalah dengan cara menghibridisasi DNA sampel pada chip DNA lalu mengukur jumlah hibridisasi mRNA pada cDNA dalam chip tersebut

3. Spectroscopy UV-VIS

Konsentrasi protein atau asam nukleat dalam larutan dapat dengan akurat

ditentukan oleh pengukuran absorbansi. Absorbansi (A) berkaitan dengan

intensitas cahaya sebelum (I0) dan setelah (I). Persamaannya ialah sebagai

berikut:

A = - log10(I/I0) ... (1)

Absorbansi linear tergantung pada konsentrasi, sesuai dengan Hukum Lambert-

Beer:

A = Ɛ c l ... (2)

di mana c = konsentrasi (Molar)

l = lebar kuvet (cm)

Ɛ = koefisien molar absorbsi (L mol-1 cm-1)

Konsentrasi asam nukleat dalam larutan dapat ditentukan dari kuat absorbansi 260 nm. Faktanya, jumlah asam nukleat sering dinyatakan sebagai 'A260'. Untuk DNA untai ganda, 1 unit A260 setara dengan 50 mg DNA, untuk DNA untai tunggal itu setara dengan 33 mg DNA, dan untuk RNA untai tunggal setara 40 mg RNA. Protein menyerap jauh lebih lemah daripada asam nukleat

• Asam nukleat menunjukkan absorbansi yang kuat di wilayah 240-275 nm.

• Hasil serapan dari data 260 nm akan di bandingkan dengan Standar untuk mengetahui konsentrasi kandungan DNA

4. Sequencing

Tujuan dari DNA sequencing adalah mencari pola yang diketahui di

dalam sekuen. Pola ini bisa terlibat di fungsi biologis, antara lain

mengkode protein atau/dan RNA, mengontrol eskpresi gen, dan

mengontrol replikasi DNA. DNA Sequencing merupakan tahapan akhir

penentuan urutan nukleotida fragmen hasil amplifikasi. Metode pada

DNA Sequencing ada 2 macam, yaitu Metode Maxam-Gilbert dan

Metode Sanger. Metode Maxam didasarkan pada pembelahan

nukleotidaoleh bahan kimia yang spesifik. Metode ini memerlukan DNA

untai ganda sehingga tidak memerlukan primer untuk mensintesis untai

baru kembali. Pemotongan DNA terjadi secara kimia sehingga reagen

kimia tertentu harus ditambahkan ke dalam sistem reaksi. Reagen ini

bersifat toksik karena selain memotong DNA dalam tabung, juga dapat

memotong DNA dalam tubuh kita. Sequencing dilakukan melalui

pembelahan DNA template dengan gugus fosfat pada ujung 5’

Prinsip dasar dari metode Sanger adalah terjadinya terminasi rantai nukleotida sebagai akibat adanya nukleotida dideoksi (ddNTP). Metode ini memerlukan DNA untai tunggal. Reaksi sekuensing dengan metode Sanger memerlukan primer, dNTP, ddNTP, dan enzim polimerase. Pada reaksi Sanger, digunakan primer yang dikatalisis oleh fragmen Klenow DNA polimerase. Sekuensing DNA ini dilakukan pada empat reaksi terpisah. Keempat reaksi tersebut berisi dNTP dan ddNTP dengan perbandingan yang sama, sehingga polimerisasi DNA dapat berlangsung dan berhenti pada tempat-tempat yang sesuai.

5. Elektroforesis

• Prinsip dasar dari metode ini adalah dengan mengamati perbedaan panjang rantai dan muatan listrik dari DNA. Elektroforesis ini juga merupakan teknik untuk memisahkan sampel DNA berdasarkan atas ukuran (berat molekul) dan struktur fisik molekulnya

• Pada gel electrophoresis untuk DNA, enzim restriksi memotong DNA menjadi beberapa fragmen dengan panjang bervariasi

• Larutan yang mengandung fragmen2 ini ditempatkan di dalam suatu gel tebal. Bila arus listrik diberikan pada gel tersebut, maka satu sisi gel akan bermuatan positif sedangkan sisi lainnya akan bermuatan negatif.

• Semua fragmen tadi akan bergerak dari sisi gel yang bermuatan negatif ke arah ujung yang bermuatan positif. Fragmen yang lebih kecil akan bergerak lebih cepat dibandingkan yang berukuran lebih besar. Apabila arus listrik dihentikan , fragmen DNA tadi telah terpisah-pisah di dalam gel tersebut dan yang berukuran lebih kecil akan berada lebih dekat pada ujung postif

• Urutan DNA complement dpt digunakan sbg probe untuk menentukan restriction fragment pada gel yang memiliki urutan nukleotida tertentu

• Ada tiga jenis gel yang dapat digunakan dalam elektroforesis DNA,

yaitu:

1. Gel poliakrilamida denaturasi, berfungsi untuk memurnikan penanda oligonukleotida dan menganalisis hasil ekstensi primer.

2. Gel alkalin agarosa, berfungsi untuk memisahkan rantai DNA yang berukuran besar.

3. Gel agarose formaldehid denaturasi, berfungsi untuk menyediakan sistem elektroforesis yang digunakan untuk fraksi RNA pada ukuran standar

Faktor Pengaruh 1. Ukuran Molekul DNA 2. Konsentrasi Gel 3. Bentuk Molekul 4. Densitas muatan 5. Pori-Pori Gel 6. Beda Potensial 7. Larutan Buffer

6. Hibridisasi In situ

• Prinsip dasar dari pelaksanaan metode ini adalah dengan memanfaatkan probe untuk mendeteksi nukleotida yang terdapat dalam DNA dan RNA sebuah sampel. Probe merupakan sebuah fragmen dari DNA dengan panjang yang bervariasi (umumnya 100-1000 jenis basa). Pembuatan probe dapat dilakukan dengan cara PCR, dimana pada metode tersebut DNA dari sampel direaksikan dengan sejumlah DNA polimerase

• Proses hibridisasi diinisiasi dengan proses imobilisasi DNA sampel. Hal ini ditujukan agar penangan sampel dapat dilakukan dengan lebih mudah (posisi DNA menjadi tetap). Proses imobilisasi tersebut dilakukan dengan tahapan elektroforesis yang kemudian dipindahkan menuju kertas filter (nylon atau nitroselulosa contoh yang umum). DNA yang sudah terimobilisasi kemudian akan di denaturasi. Denaturasi ditujukan agar DNA sampel yang akan dianalisis dapat terhibridisasi dengan probe. Denaturasi dilakukan dengan cara memanaskan DNA dengan NaOH

BLOOTING

Teknik pemindahan bagian asam nukleat yang telah dipisahkan, RNA

atau DNA, dari bentuk gel ke lembaran tipis atau matriks membran

agar bagian protein tersebut mengalami imobilisasi. Terdapat tiga

macam blotting, yaitu Northern Blotting, Southern Blotting, dan Western

Blotting.

Northern Blotting

Northern blot digunakan untuk dapat menentukan berat molekul dari suatu mRNA spesifik di antara campuran RNA. Langkah pertama dalam Nothern Blotting adalah mengubah sifat, atau memisahkan RNA dalam sampel ke dalam rantai tunggal, yang menjamin bahwa untaian tersebut tidak terlipat dan tidak ada ikatan antarrantai. Molekul-molekul RNA kemudian dipisahkan menurut ukurannya menggunakan metode elektroforesis gel.

Northern blooting Southern Blooting

Southern Blooting

Southern Blotting adalah metode yang dapat mendeteksi pola DNA spesifik dalam sampel DNA. Dinamai demikian oleh karena disesuaikan dengan penemunya, yakni Edward Southern. Sebagai prosedur laboratorium, Southern Blotting dapat digunakan untuk menganalisis keseluruhan DNA organisme (genom) untuk mengidentifikasi urutan tertentu yang menarik.

Langkah pertama dalam Southern Blotting adalah mempersiapkan campuran DNA dengan memecahnya menjadi fragmen-fragmen kecil menggunakan protein, yang disebut enzim restriksi. Campuran fragmen DNA kemudian dipisahkan menurut ukurannya, dengan cara teknik elektroforesis gel. Setelah pemisahan, potongan rantai ganda DNA berubah sifatnya atau dipisahkan menjadi rantai tunggal dalam gel. Selanjutnya, DNA ditransfer dari gel ke membran blotting