POTENSI ANTIOKSIDAN FILTRAT DAN BIOMASSA … · Cinchona officinalis . memiliki aktivitas...

POTENSI ANTIOKSIDAN FILTRAT DAN BIOMASSA HASIL

FERMENTASI KAPANG ENDOFIT Colletotrichum spp.

DARI TANAMAN KINA (Cinchona calisaya Wedd.)

AYU SEPTIAWAN

JURUSAN BIOLOGI

FAKULTAS SAINS DAN TEKNOLOGI

UNIVERSITAS ISLAM NEGERI SYARIF HIDAYATULLAH

JAKARTA

2014 M / 1436 H

POTENSI ANTIOKSIDAN FILTRAT DAN BIOMASSA HASIL

FERMENTASI KAPANG ENDOFIT Colletotrichum spp.

DARI TANAMAN KINA (Cinchona calisaya Wedd.)

AYU SEPTIAWAN

1110095000004

SKRIPSI

Sebagai Salah Satu Syarat Untuk Memperoleh Gelar Sarjana Sains

Pada Program Studi Biologi Fakultas Sains dan Teknologi

Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah

Jakarta

JURUSAN BIOLOGI

FAKULTAS SAINS DAN TEKNOLOGI

UNIVERSITAS ISLAM NEGERI SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA

2014 M / 1436 H

PERNYATAAN

DENGAN INI SAYA MENYATAKAN BAHWA SKRIPSI INI ADALAH

HASIL KARYA SENDIRI YANG BELUM PERNAH DIAJUKAN SEBAGAI

SKRIPSI ATAU KARYA ILMIAH PADA PERGURUAN TINGGI ATAU

LEMBAGA MANAPUN.

Jakarta, Desember 2014

Ayu Septiawan

1110095000004

AYU SEPTIAWAN

Potensi Antioksidan Filtrat dan

Biomassa Hasil Fermentasi

Kapang Endofit Colletotrichum

spp. dari Tanaman Kina

(Cinchona calisaya Wedd.)

JAKARTA

2014 M / 1436 H

ABSTRAK

AYU SEPTIAWAN. Potensi Antioksidan Filtrat dan Biomassa Hasil

Fermentasi Kapang Endofit Colletotrichum spp. dari Tanaman Kina

(Cinchona calisaya Wedd.). Skripsi. Jurusan Biologi Fakultas Sains dan

Teknologi. UIN Syarif Hidayatullah Jakarta. 2014.

Kapang endofit yang hidup pada suatu tanaman memiliki kemampuan untuk

menghasilkan senyawa metabolit yang sama dengan tanaman inang tanpa

merugikan inangnya. Kapang endofit Colletotrichum spp. pada tanaman kina

(Cinchona calisaya Wedd.) berpotensi menghasilkan senyawa antioksidan.

Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui potensi ekstrak biomassa dan filtrat

kapang endofit Colletotrichum spp. sebagai antioksidan serta mengetahui aktivitas

antioksidan yang tertinggi dari keduanya. Ekstrak diuji menggunakan metode 1,1-

difenil-2-pikrilhidrazil (DPPH) dengan pengujian Kromatografi Lapis Tipis

(KLT) dan spektrofotometer UV-Vis. Pengujian KLT menunjukkan seluruh

ekstrak filtrat dan biomassa Colletotrichum spp. memiliki hasil positif antioksidan

yang ditandai dengan perubahan warna pelat menjadi kuning. Terdapat dua isolat

yang memiliki nilai Rf yang hampir sama dengan standar vitamin C yaitu ekstrak

biomassa Colletotrichum sp. 8 dan ekstrak filtrat Colletotrichum sp. 10 yaitu 0,71.

Pengujian spektrofotometer UV-Vis menunjukkan bahwa isolat M1

(Colletotrichum sp. 1) memiliki nilai Inhibition Concentration 50% (IC50)

tertinggi ekstrak biomassa yaitu 1489,565 ppm dan ekstrak filtrat yaitu 837,143

ppm. Hasil identifikasi senyawa menggunakan Gas Chromatography Mass

Spectrophotometry (GCMS) menunjukkan terdapat 4 senyawa dari ekstrak

biomassa dan 5 senyawa dari ekstrak filtrat yang memiliki aktivitas antioksidan.

Kata kunci: Antioksidan, Colletotrichum, ekstrak biomassa, ekstrak filtrat,

1,1-difenil-2-pikrilhidrazil (DPPH).

ABSTRACT

AYU SEPTIAWAN. Potential Antioxidant Filtrate and Biomass

Fermentation of Endophytic Fungus (Colletotrichum spp.) from Cinchona

Plant (Cinchona calisaya Wedd.). Undergraduate Thesis. Department of

Biology. Faculty of Science and Technology. UIN Syarif Hidayatullah

Jakarta. 2014.

Endophytic fungus which lived on a plant can produce a metabolit compound that

equal to the host plant without damaging the plant. Endophytic fungus in

cinchona plant (Cinchona calisaya Wedd.) was potentially produce bioactive

compound, the example was Colletotrichum spp. The research aimed to know the

potential of biomass and filtrate extract of Colletotrichum spp. as an antioxidant

with the highest antioxidant activity amongst them. The extract was test with 1,1-

diphenyl-2-picrylhydrazyl method (DPPH) with Thin Layer Cromatografi (TLC)

and UV-Vis spectrofotometry tested. The result from TLC test showed that all of

the Colletotrichum spp. filtrate and biomass had positive value antioxidant seen

from the color turning to yellow after it extracted with DPPH solution. There are

two isolates which has an Rf value that almost equal to the vitamin C standard

that is 0.71, those are biomass extract Colletotrichum sp. 8 and filtrate exctract

Colletotrichum sp. 10. UV-Vis spectrofotometry tested showed M1

(Colletotrichum sp. 1) isolate has the highest IC50 (inhibition concentration)

biomass extract value of 1489,565 ppm and filtrat exctract value of 837,143 ppm.

The result of compound identification with GCMS showed that were four

compound of biomass extract and five of filtrate extract that have antioxidant

activity.

Kata kunci: Antioxidant, biomass extract, Colletotrichum, filtrate extract,

1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH).

i

KATA PENGANTAR

Puji syukur penulis panjatkan kehadirat Allah SWT atas segala rahmat dan

karunia-Nya hingga penulis dapat menyelesaikan penulisan skripsi ini. Skripsi yang

berjudul “Potensi Antioksidan Filtrat dan Biomassa Hasil Fermentasi Kapang

Endofit Colletotrichum spp. dari Tanaman Kina (Cinchona calisaya Wedd.)” ini

disusun untuk memenuhi salah satu syarat melaksanakan tugas akhir pada Jurusan

Biologi Fakultas Sains dan Teknologi UIN Syarif Hidayatullah Jakarta.

Penyusunan skripsi ini tidak terlepas dari bantuan berbagai pihak sehingga

pada kesempatan ini penulis ingin menyampaikan ucapan terima kasih kepada:

1. Dr. Agus Salim, M.Si., selaku Dekan Fakultas Sains dan Teknologi UIN

Syarif Hidayatullah Jakarta.

2. Dr. Dasumiati, M.Si., selaku Ketua Jurusan Biologi UIN Syarif Hidayatullah

Jakarta dan penguji I sidang skripsi yang telah memberikan saran, kritik dan

ilmu yang bermanfaat bagi penulis.

3. Etyn Yunita, M.Si., selaku Sekertaris Jurusan Biologi UIN Syarif

Hidayatullah Jakarta dan penguji II sidang skripsi yang telah memberikan

saran, kritik dan ilmu yang bermanfaat bagi penulis.

ii

4. Dra. Nani Radiastuti, M.Si., selaku pembimbing I yang telah banyak

memberikan ilmu, pengarahan, pemahaman, saran dan bimbingan selama

melaksanakan penelitian dan penulisan skripsi.

5. Drs. Dede Sukandar, M.Si., selaku pembimbing II yang telah memberikan

ilmu, pengarahan, pemahaman, saran dan bimbingan selama melaksanakan

penelitian dan penulisan skripsi.

6. Kedua orang tua yang saya cintai yaitu Jurnalis Chaniago dan Irnawati karena

telah memberikan dukungan moril maupun materil, serta keluarga besar saya

yang memberikan motivasi dalam menyelesaikan penulisan.

7. Dr. Irawan Sugoro, Dr. Megga Ratnasari Pikoli, dan Adi Riyadhi, M.Si.

selaku penguji seminar yang memberikan saran dan kritik.

8. Seluruh dosen Jurusan Biologi UIN Syarif Hidayatullah Jakarta yang telah

mendidik penulis selama kegiatan perkuliahan.

9. Dalli, Alfida, Ario, Arif, Indina, Irma, Jane, Ima, Ayun, Nisa, Mutia, Sara,

Ica, Rini, Mala, Mega serta seluruh rekan-rekan Biologi angkatan 2010 yang

memberikan motivasi kepada penulis semoga silaturahmi kita semua terus

terjalin sampai akhir hayat.

10. Ami Prawira yang selalu meluangkan waktu dan memberikan motivasi

penulis saat penelitian dan penulisan skripsi.

11. Ka Rina dan Ka Kiki yang membantu penulis saat penelitian di PLT UIN

Syarif Hidayatullah.

iii

12. Puji Astuti, S.Si., Ida Farida, S.Pd., Festy Auliyaur R, S.Si., Nur Amaliah

Solihat, S.Si., Fitriyah, S.Si., mba Nita, pak Aris, mba ernita, dan staf

laboratorium lainnya di Pusat Laboratorium Terpadu UIN Syarif Hidayatullah

Jakarta yang telah membantu penulis saat penelitian.

13. Semua pihak yang senantiasa memberikan dorongan serta bantuan moral

maupun material sehingga Penulis dapat menyelesaikan skripsi ini.

Penulis menyadari dalam penulisan ini masih jauh dari kesempurnaan, untuk

itu saran dan kritik dari pembaca yang membangun sangat penulis harapkan.

Akhir kata, semoga tulisan ini dapat bermanfaat bagi para pembacanya.

Jakarta, Desember 2014

Penulis

iv

DAFTAR ISI

KATA PENGANTAR .................................................................................... i

DAFTAR ISI .................................................................................................. iv

DAFTAR GAMBAR ..................................................................................... vi

DAFTAR TABEL ......................................................................................... vii

DAFTAR LAMPIRAN ................................................................................. viii

BAB I. PENDAHULUAN .............................................................................. 1

1.1. Latar Belakang ........................................................................... 1

1.2. Rumusan Masalah ..................................................................... 3

1.3. Hipotesis .................................................................................... 3

1.4. Tujuan ........................................................................................ 4

1.5. Manfaat ...................................................................................... 4

BAB II. TINJAUAN PUSTAKA .................................................................... 5

2.1. Tanaman Kina (Cinchona calisaya Wedd.) .................................. 5 2.1.1 Senyawa Bioaktif pada Tanaman Kina

(Cinchona calisaya Wedd.) ............................................... . 6

2.2. Mikroba Endofit ............................................................................... 7

2.2.1 Interaksi Mikroba Endofit dengan Tanaman .................. 8

2.3. Colletotrichum spp ................................................................... 8

2.4. Radikal Bebas dan Antioksidan ................................................ 10

2.5. Uji DPPH (1,1-difenil-2-pikrilhidrazil) .................................... 12

2.6. Kromatografi Lapis Tipis ......................................................... 13

2.7. Spektrofotometer UV-Vis ........................................................ 15

2.8. GC-MS ..................................................................................... 15

BAB III. METODOLOGI PENELITIAN ................................................... 17

3.1. Waktu dan Tempat Penelitian .................................................. 17

3.2. Alat dan Bahan ......................................................................... 17

3.3. Sumber Isolat ............................................................................ 18

3.4. Cara Kerja ................................................................................. 19

v

3.4.1. Bagan Kerja Penelitian .................................................... 19

3.4.2. Peremajaan Kapang Endofit ............................................ 20

3.4.3. Pengamatan Kapang Endofit ........................................... 20

3.4.4. Fermentasi Cair Kapang Endofit ..................................... 20

3.4.5. Ekstraksi Hasil Fermentasi dengan Pelarut Organik ....... 21

3.4.6. Uji Senyawa Antioksidan dari Ekstrak Hasil

Fermentasi ........................................................................ 22

3.4.6.1 Metode DPPH Menggunakan Uji

Kromatografi Lapis Tipis (KLT) ......................... 22

3.4.6.2 Metode DPPH Menggunakan

Spektrofotometer UV-Vis .................................... 23

3.4.7. Analisis Ekstraksi Metabolit Sekunder dengan

GC-MS ............................................................................ 23

3.5. Analisis Data ............................................................................ 24

BAB IV. HASIL DAN PEMBAHASAN ...................................................... 25

4.1 Fermentasi Cair Kapang Endofit Coletotrichum spp. .............. 25

4.2 Uji Autografi Aktivitas Antioksidan ........................................ 28

4.3 Uji Aktivitas Antioksidan Menggunakan Spektrofotometer

UV-Vis ..................................................................................... 31

4.4 Analisa GC-MS ........................................................................ 38

BAB V. PENUTUP ......................................................................................... 44

5.1 Kesimpulan ............................................................................... 44

5.2 Saran ......................................................................................... 44

DAFTAR PUSTAKA ..................................................................................... 45

vi

DAFTAR GAMBAR

Gambar 1. Morfologi bunga, daun dan batang Cinchona calisaya Wedd. ...... 6

Gambar 2. Morfologi Colletotrichum spp A) makroskopis B) mikroskopis ... 9

Gambar 3. Konida dan appresoria dalam skala 10 µm dari genus

Colletotrichum A) Colletotrichum crassipes (kiri) dan

B)Colletotrichum gleosporoides (kanan) ....................................... 9

Gambar 4. Struktur kimia DPPH .................................................................. 13

Gambar 5. Mekanisme reaksi metode DPPH ................................................ 13

Gambar 6. Skema bagan kerja penelitian ....................................................... 19

Gambar 7 Nilai Rf (Retardation factor) keterangan: K) kontrol

Vitamin C A) intraseluler Colletotrichum sp. 8

B) ekstraseluler Colletotrichum sp. 10 ........................................ 30

Gambar 8. Aktivitas antioksidan ekstrak filtrat Colletotrichum spp.

berdasarkan nilai IC50 .................................................................. 32

Gambar 9. Aktivitas antioksidan ekstrak biomassa Colletotrichum spp.

berdasarkan nilai IC50 ................................................................. 34

Gambar 10. Kromatogram hasil GC-MS ekstrak filtrat ................................. 38

Gambar 11. Kromatogram hasil GC-MS ekstrak biomassa ........................... 41

vii

DAFTAR TABEL

Tabel 1. Kode isolat Colletorichum spp. .............................................................. 18

Tabel 2. Hasil fermentasi cair kapang endofit Colletorichum spp. pada

medium PDB selama 21 hari pada suhu ruang ..................................... 25

Tabel 3. Hasil uji KLT ekstrak Colletorichum spp. setelah disemprot

DPPH ..................................................................................................... 29

Tabel 4. Hasil identifikasi komponen ekstrak filtrat Colletorichum sp. 1

dengan pelarut etil asetat ........................................................................ 38

Tabel 5. Hasil identifikasi komponen ekstrak biomassa Colletorichum sp.1

dengan pelarut metanol .......................................................................... 41

viii

DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran 1. Tabel verifikasi morfologi Colletotrichum spp. secara

makroskopis dan mikroskopis ....................................................... 51

Lampiran 2. Hasil Kromatografi Lapis Tipis (KLT) ekstrak kapang

endofit Colletotrichum spp. .......................................................... 58

Lampiran 3. Hasil uji antioksidan ...................................................................... 62

1

BAB I

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Senyawa antioksidan adalah senyawa pemberi elektron (electron donors).

Secara biologis, pengertian antioksidan adalah senyawa yang mampu menangkal

atau meredam dampak negatif oksidan dalam tubuh (Winarsi, 2007). Senyawa

bioaktif antioksidan dapat diperoleh dari beberapa sumber yaitu tanaman, hewan,

mikroba dan organisme laut (Prihatiningtias, 2005). Penggunaan senyawa

antioksidan saat ini semakin meluas seiring dengan semakin besarnya pemahaman

masyarakat tentang peranan antioksidan dalam menghambat penyakit degeneratif

(Tahrir et al., 2003).

Salah satu tanaman obat yang banyak dikenal adalah tanaman kina

(Cinchona calisaya Wedd.). Tanaman kina (Cinchona sp.) dapat menghasilkan

senyawa alkaloid kuinin, kuinidin, sinkonin, dan sinkonidin yang dapat digunakan

sebagai sumber bahan baku obat antimalaria (Simanjuntak et al., 2002). Ekstrak

daun tanaman Cinchona ledgeriana diketahui memiliki aktivitas antioksidan serta

kadar fenol yang tinggi (Al–Mustafa dan Al–Thunibat, 2008). Tanaman Cinchona

officinalis memiliki aktivitas antioksidan dan mengandung senyawa fenolik

(Ravishankara et al., 2003).

Kapang endofit adalah kapang yang hidup di dalam jaringan tanaman dan

mampu membentuk koloni dalam jaringan tanaman tanpa membahayakan

tanaman inangnya. Kapang endofit memiliki kemampuan untuk menghasilkan

2

senyawa metabolit yang sama dengan tanaman inangnya (Strobel dan Daisy,

2003). Penelitian dari Maehara et al. (2011), menyatakan bahwa kapang endofit

Diaporthe sp. yang diisolasi dari tanaman kina dapat memproduksi senyawa

alkaloid yang sama seperti tanaman kina. Penelitian dari Winarno (2006),

menyatakan bahwa kapang endofit dari batang C. ledgeriana dan C. pubescens

dapat menghasilkan senyawa alkaloid yang sama seperti tanaman inangnya.

Kapang endofit yang hidup pada suatu tanaman telah banyak diteliti

sebagai sumber penghasil senyawa bioaktif salah satunya sebagai antioksidan.

Kapang Phomopsis sp. dari tanaman obat Mesua ferrea memiliki aktivitas

antioksidan dengan pengujian peredaman radikal bebas (Jayanthi et al., 2011).

Kapang endofit Phomopsis sp. dan Xylaria sp. dari tanaman Emblica officinalis

memiliki aktivitas antioksidan yang tinggi (Nath et al., 2012). Kapang genus

Aspergillus dan Colletotrichum dari tanaman Rhizophora sp. memiliki aktivitas

antioksidan (Saputri, 2013). Kapang Colletotrichum gleosporioides dari tanaman

Justicia gendarussa menghasilkan senyawa antikanker yang sama seperti tanaman

induknya (Gangadevi dan Muthumary, 2008). Kapang endofit Colletotrichum spp.

dari tanaman C. calisaya Weed. menghasilkan senyawa kuinin serta senyawa

bioaktif lainnya yang berperan sebagai antibakteri (Mutiea, 2014). Kapang endofit

yang hidup pada tanaman kina dapat digunakan sebagai salah satu sumber

penghasil senyawa antioksidan.

Kapang Colletotrichum termasuk genus yang banyak ditemukan setelah

kapang Phomopsis spp. sebagai kapang endofit dari tanaman kina (C. calisaya

Wedd.). Berdasarkan penelitian sebelumnya telah ditemukan kapang endofit

3

Colletotrichum spp. sebanyak 14 morphotype. Kapang Colletotrichum spp. telah

diisolasi dari beberapa organ tanaman kina yaitu daun, buah, kulit kayu, petiole,

dan akar di Pusat Perkebunan Teh dan Kina (PPTK) Gambung, Ciwidey, Jawa

Barat. Selama ini belum pernah dilaporkan potensi antioksidan isolat kapang

endofit Colletotrichum spp. dari tanaman kina karena penelitian kapang endofit

dari tanaman kina lebih banyak difokuskan untuk mendapatkan senyawa kuinin

sebagai antimalaria. Oleh karena itu, perlu dilakukan penelitian potensi

antioksidan isolat kapang endofit Colletotrichum spp. dari tanaman kina (C.

calisaya Wedd.).

1.2 Rumusan Masalah

1. Isolat ekstrak filtrat dan biomassa kapang endofit Colletotrichum spp. dari

tanaman kina (C. calisaya Wedd.) manakah yang berpotensi sebagai

antioksidan?

2. Bagaimana aktivitas antioksidan ekstrak filtrat dan biomassa isolat kapang

endofit Colletotrichum spp. dari tanaman kina (C. calisaya Wedd.)?

1.3 Hipotesis

1. Seluruh isolat ekstrak filtrat dan biomassa kapang endofit Colletotrichum

spp. dari tanaman kina (C. calisaya Wedd.) berpotensi sebagai

antioksidan.

4

2. Ekstrak filtrat dan biomassa isolat kapang endofit Colletotrichum spp. dari

tanaman kina (C. calisaya Wedd.) memiliki aktivitas antioksidan yang

berbeda.

1.4 Tujuan

1. Mengetahui potensi ekstrak filtrat dan biomassa seluruh isolat kapang

endofit Colletotrichum spp. dari tanaman kina (C. calisaya Wedd.) sebagai

antioksidan.

2. Mengetahui aktivitas antioksidan yang tertinggi dari ekstrak filtrat dan

biomassa isolat kapang endofit Colletotrichum spp. dari tanaman kina (C.

calisaya Wedd.).

1.5 Manfaat

Penelitian ini diharapkan memberikan informasi tentang potensi isolat

kapang endofit Colletotrichum spp. dari tanaman kina (C. calisaya Wedd.)

sebagai antioksidan sehingga dapat dimanfaatkan sebagai salah satu alternatif

sumber senyawa bioaktif alami.

5

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Tanaman Kina (Cinchona calisaya Wedd.)

Tanaman kina merupakan tanaman obat berupa pohon yang berasal dari

Amerika Selatan di sepanjang pegunungan Andes. Tanaman kina masuk ke

Indonesia tahun 1852 berasal dari Bolivia (Sultoni, 1995). Tinggi pohon antara 4-

15 m, berbulu halus atau lokos. Daun elip sampai lanset, bagian pangkal dan

ujung daun lancip, tangkai daun tidak berbulu, panjang tangkai 3-6 mm. Mahkota

bunga berwarna kuning agak putih, bentuk melengkung panjang 8-12 mm. Buah

lanset sampai bulat telur dengan ukuran panjang 8-12 mm dan lebar 3-4 mm (Tao

dan Taylor, 2011). Menurut Tjitrosoepomo (2002), klasifikasi tanaman kina

adalah sebagai berikut Kelas : Dicotyledoneae; Suku : Rubiaceae; Genus :

Cinchona; Spesies : Cinchona calisaya Wedd.

Tanaman kina tumbuh baik dengan curah hujan tahunan ideal yaitu 2.000-

3.000 mm/tahun dan merata sepanjang tahun, penyinaran matahari yang tidak

terlalu terik, temperatur antara 13,5-21°C, kelembaban relatif 68-97% (Tao dan

Taylor, 2011). Pengembangan usaha tanaman kina terus berkurang, sehingga

kebun yang ada kurang terpelihara dan tidak ada program replanting yang baik.

Kondisi tanaman kina koleksi kebun percobaan Gambung rusak berat, minimnya

pemeliharaan, dan banyaknya tanaman mati. Pengelolaan diprioritaskan kepada

rehabilitasi aksesi tanaman yang hilang (Komisi Nasional Sumber Daya Genetik,

2008).

6

Gambar 1. Morfologi Bunga, Daun dan Batang Cinchona calisaya Wedd.

(Dokumentasi pribadi, 2013).

2.1.1 Senyawa Bioaktif pada Tanaman Kina (Cinchona calisaya Wedd.)

Tanaman kina merupakan bahan baku farmasi yang sangat bernilai

ekonomis dan dikenal lama sebagai obat antimalaria. Khasiat tanaman kina

sebagai antimalaria berasal dari senyawa bioaktif berupa alkaloid kinin

(C20H24N2O2), kinidin (isomer dari kinin), sinkona (C19H22N2O) dan sinkonidin

(isomer dari sinkona). Beberapa bagian dari tanaman kina (akar, batang, daun dan

kulit) mengandung senyawa alkaloid kuinin dalam jumlah yang berbeda

(Simanjuntak et al., 2002).

Alkaloid yang sangat penting dari tanaman kina yaitu kinin (C20H24N2O2)

untuk penyakit malaria dan kinidin (isomer dari kinin) untuk penyakit jantung

(Sultoni, 1995). Umumnya di dalam ekstrak C. ledgeriana Moens dan C.

pubescens VAHL terdapat 12-18% alkaloid (Winarno, 2006). Ekstrak kulit kayu

Cinchona officinalis memiliki komponen fenolik yang berperan sebagai

antioksidan (Ravishankara, 2003). Ekstrak daun Cinchona ledgeriana memiliki

aktivitas antioksidan dan kadar fenol yang tinggi (Al-Mustafa dan Al-Thunibat,

2008).

7

2.2 Mikroba Endofit

Mikroba endofit adalah mikroba yang hidup di dalam jaringan tanaman

pada periode tertentu dan mampu hidup dengan membentuk koloni dalam jaringan

tanaman tanpa membahayakan inangnya. Mikroba endofit dapat diisolasi dari

jaringan akar, batang, dan daun. Jenis mikroba yang paling umum ditemukan

adalah fungi (Strobel dan Daisy, 2003). Menurut Radji (2005), mikroba endofit

memiliki kemampuan untuk memproduksi senyawa metabolit sekunder sesuai

tanaman inangnya. Menurut Tan dan Zou (2001), hal ini disebabkan adanya

pertukaran genetik yang terjadi antara inang dan mikroba endofit secara

evolusioner. Kapang diketahui mampu menghasilkan senyawa metabolit sekunder

seperti alkaloid, terpen, steroid, flavonoid, kuinon, fenol dan lain sebagainya.

Senyawa-senyawa ini sebagian besar mempunyai potensi sebagai senyawa

bioaktif. Menurut Winarsi (2007), flavonoid dan kuinon diketahui merupakan

antioksidan non enzimatis larut lemak.

Kapang endofit tidak memerlukan lahan luas untuk tumbuh dan

membutuhkan waktu lebih pendek untuk menghasilkan senyawa metabolit aktif

dibandingkan bila menumbuhkan tanaman inangnya (Strobel dan Daisy, 2003).

Hasil penelitian Azizah (2013), bahwa ekstrak isolat kapang dari tanaman

Avicennia sp. menghasilkan aktivitas antioksidan. Isolat kapang endofit yang

menghasilkan aktivitas antioksidan adalah genus Aspergillus. Penelitian dari

Winarno (2006), 2 jenis kapang endofit yang diisolasi dari batang kina Cinchona

ledgeriana Moens dan Cinchona pubescens Vahl (Rubiaceae) dapat memproduksi

senyawa alkaloid kinin dan sinkonin seperti yang dihasilkan pada kulit batang

8

kina. Berdasarkan penelitian Simanjuntak et al. (2002), skrining dan identifikasi

hasil fermentasi dalam media sintetik menunjukkan bahwa mikroba endofit yang

diisolasi dari tanaman Cinchona sp. dapat memproduksi senyawa alkaloid. Hasil

penelitian yang dilakukkan oleh Nath et al. (2012) menyatakan bahwa kapang

endofit Phomopsis sp. dan Xilaria sp. memperlihatkan aktifitas antioksidan yang

tinggi dan juga memiliki tingkat fenol yang tinggi.

2.2.1 Interaksi Mikroba Endofit dengan Tanaman

Hubungan simbiosis mutualisme antara mikroba endofit dengan tanaman

inang terutama perannya yang sangat penting dalam melindungi tanaman

inangnya terhadap patogen dan predator (Strobel dan Daisy, 2003). Simbiosis

antara fungi (mikroba) endofit dengan tanaman obat, fungi (mikroba) dapat

membantu proses penyerapan unsur hara yang dibutuhkan oleh tumbuhan untuk

proses fotosintesis serta melindungi tumbuhan inang dari serangan penyakit, dan

hasil dari fotosinteis dapat digunakan oleh fungi untuk mempertahankan

kelangsungan hidupnya (Petrini et al., 1992).

2.3 Colletotrichum spp.

Ciri-ciri umum Colletotrichum sp. yaitu permukaan koloni berwarna putih

dengan tepi tidak rata serta ekstur seperti kapas tebal dan bagian belakang koloni

berwarna putih dengan bercak merah kekuningan. Konidia berbentuk lonjong,

berwarna hialin dan memiliki apresorium berdinding tebal. Spora Colletotrichum

tumbuh baik pada suhu 25-280C, sedang suhu dibawah 5

0C dan diatas 40

0C tidak

dapat berkecambah (Semangun, 2000).

10

dijadikan bahan dalam meningkatkan produksi taxol seperti yang dihasilkan oleh

Justicia gendarussa (Gangadevi dan Muthumary, 2008). Ekstrak kapang endofit

Colletotrichum sp. dari tanaman Piper ornatum memiliki kemampuan sebagai

antioksidan (Tianpanich et al., 2011). Ekstrak kapang endofit Colletotrichum dari

tanaman Polygala elongata berpotensi sebagai sumber antioksidan (Pawle dan

singh, 2014).

2.4 Radikal Bebas dan Antioksidan

Radikal bebas merupakan salah satu bentuk senyawa berupa oksigen

reaktif dan sebagai senyawa yang memiliki elektron yang tidak berpasangan serta

memiliki reaktivitas yang lebih tinggi dibandingkan senyawa oksidan non radikal.

Radikal bebas dapat terbentuk melalui dua cara yaitu secara endogen (sebagai

respon normal proses biokimia intrasel maupun ekstrasel) dan secara eksogen

(misalnya dari polusi, makanan, serta injeksi ataupun absorpsi melalui kulit).

Serangan radikal bebas terhadap molekul di sekelilingnya akan menyebabkan

terjadinya sebuah reaksi berantai yang dapat menghasilkan senyawa radikal baru.

Dampak reaktivitas senyawa radikal bebas yaitu kerusakan sel atau jaringan,

penyakit autoimun, penyakit degeneratif, hingga kanker (Winarsi, 2007).

Serangan radikal bebas ini dapat diatasi dengan suatu senyawa penangkal yang

disebut antioksidan (Salamah et al., 2011).

Senyawa antioksidan adalah senyawa pemberi elektron (electron donors).

Secara biologis, pengertian antioksidan adalah senyawa yang mampu menangkal

atau meredam dampak negatif oksidan dalam tubuh. Antioksidan bekerja dengan

cara mendonorkan satu elektronnya kepada senyawa yang bersifat oksidan

11

sehingga aktivitas senyawa oksidan tersebut bisa dihambat. Berdasarkan

sumbernya ada dua macam antioksidan yaitu antioksidan alami dan antioksidan

buatan (sintetik). Antioksidan alami mampu melindungi tubuh terhadap kerusakan

yang disebabkan oksigen reaktif dan mampu menghambat penyakit degeneratif

(Winarsi, 2007).

Secara umum, antioksidan dikelompokkan menjadi 2, yaitu antioksidan

enzimatis dan non enzimatis. Antioksidan enzimatis misalnya enzim superoksida

dismutase (SOD), katalase, dan glutation peroksida. Antioksidan non enzimatis

masih dibagi lagi menjadi dua kelompok yaitu antioksidan larut lemak dan

antioksidan larut air. Tokoferol, karotenoid, flavonoid, quinon, dan bilirubin

tergolong antioksidan larut lemak. Asam askorbat, asam urat, protein pengikat

logam, dan protein pengikat heme tergolong antioksidan larut air. Vitamin C atau

asam askorbat mampu bereaksi dengan radikal bebas kemudian berubah menjadi

radikal askorbil. Askorbat dapat langsung menangkap radikal bebas dengan atau

tanpa katalisator enzim. Reaksinya terhadap senyawa oksigen reaktif lebih cepat

dibandingkan dengan komponen cair lainnya (Winarsi, 2007). Antioksidan tidak

hanya digunakan dalam industri farmasi, tetapi juga digunakan secara luas dalam

industri makanan, industri petroleum, industri karet dan sebagainya (Tahrir et al.,

2003). Senyawa bioaktif berupa antioksidan dapat diperoleh dari beberapa sumber

diantaranya dari tumbuhan, hewan, mikroba dan organisme laut (Prihatiningtias,

2005).

Penelitian dari Azizah (2013), senyawa antioksidan yang dihasilkan dari

ekstrak filtrat memiliki aktivitas yang paling tinggi dibandingkan yang dihasilkan

12

ekstrak biomassa yaitu memiliki IC50 407,407 µg/mL yaitu genus kapang

Aspergillus yang diisolasi dari tanaman mangrove Avicennia sp. Penelitian dari

Saputri (2013), aktivitas antioksidan yang dihasilkan genus Colletotrichum yang

diisolasi dari tanaman mangrove Rhizophora sp. ekstrak biomassa lebih tinggi

yaitu IC50 44,62 µg/mL dibandingkan aktivitas antioksidan genus Aspergillus

ekstrak filtrat yaitu IC50 404,41 µg/mL (Saputri, 2013).

2.5 Uji DPPH (1,1-difenil-2-pikrilhidrazil)

DPPH merupakan senyawa radikal bebas. Metode uji DDPH adalah

metode untuk mengukur kemampuan suatu senyawa antioksidan dalam

menangkap radikal bebas. Penangkapan senyawa radikal bebas berhubungan

dengan kemampuan komponen senyawa dalam menyumbangkan elektron atau

hidrogen. Setiap molekul yang dapat menyumbangkan elektron atau hidrogen

akan bereaksi dan akan memudarkan DPPH. Intensitas warna DPPH akan berubah

dari ungu menjadi kuning oleh elektron yang berasal dari senyawa antioksidan.

Semakin tinggi konsentrasi sampel yang digunakan maka semakin rendah nilai

absorbansi dari larutan DPPH. DPPH memberikan serapan kuat pada panjang

gelombang 517 nm dengan warna violet gelap (Molyneux, 2004).

Metode DPPH merupakan metode yang sering digunakan untuk skrining

aktivitas antioksidan berbagai tanaman obat. Metode ini didasarkan pada reaksi

reduksi dari larutan metanol di dalam radikal bebas DPPH yang berwarna dengan

penghambatan radikal bebas. Metode ini melibatkan pengukuran penurunan

serapan DPPH pada panjang gelombang maksimalnya, dimana semakin besar

konsentrasi semakin besar pula persen penghambatanya (Mailandari, 2012).

13

Gambar 4. Struktur Kimia DPPH (Molyneux, 2004)

Inhibiton Concentration (IC50) merupakan nilai yang menunjukkan

kemampuan penghambatan proses oksidasi sebesar 50% suatu konsentrasi sampel

(ppm). Senyawa murni yang memiliki aktivitas antioksidan tinggi akan memiliki

IC50 yang rendah. Aktivitas antioksidan yang sangat kuat memiliki nilai IC50

kurang dari 50 µg/mL begitu juga dengan nilai IC50 vitamin C sebagai kontrol

positif (Pratiwi et al., 2013). Antioksidan dikatakan kuat jika IC50 < 50 ppm, aktif

jika IC50 50-100 ppm, sedang jika IC50 101-250 ppm, lemah jika 250-500 ppm

dan tidak aktif jika IC50 > 500 ppm (Jun et al., 2003).

Gambar 5. Mekanisme reaksi metode DPPH (Molyneux, 2004)

2.6 Kromatografi Lapis Tipis

Kromatografi merupakan metode pemisahan yang umum dilakukan

untuk suatu campuran senyawa alam secara fisik yaitu dengan mendistribusikan

komponen yang dipisahkan diantara dua fase, yaitu fase gerak dan fase diam.

Tranfer massa antara kedua fase tersebut terjadi ketika komponen dalam

14

campuran terserap pada permukaan partikel atau terbagi kedalam sejumlah cairan

yang melewatinya (Khopkar, 2003).

Salah satu jenis kromatografi cair-padat adalah kromatografi lapis tipis

(KLT). Prinsip kerja dari KLT adalah perbedaan tingkat kelarutan suatu senyawa

diantara dua fase. Metode ini sering digunakan karena sederhana, cepat dalam

memisahkan dan sensitif. Metode KLT melibatkan dua sifat fase yaitu fase diam

dan fase gerak dengan komposisi berbagi pelarut dimana dapat memisahkan

senyawa berdasarkan perbedaan kepolaran. Fase diam yang digunakan adalah

senyawa yang dapat menahan pergerakan sampel yang dibawa oleh fase gerak

karena memiliki kepolaran yang sesuai dengan komponen yang dipisahkan. Fase

diam yang digunakan adalah silika gel GF254. Permukaan silika gel terdiri atas

gugus Si-O-Si dan gugus silanol (Si-OH). Gugus silanol bersifat sedikit asam dan

polar sehingga gugus ini mampu membentuk ikatan hidrogen dengan solut-solut

yang sedikit polar sampai polar (Rohman dan Gandjar, 2008). Pemisahan yang

optimal dapat terjadi apabila fase gerak yang digunakan adalah campuran dua

pelarut organik karena daya elusi campuran kedua pelarut dapat mudah diatur

(Rohman, 2009).

Kombinasi yang tepat antara pelarut, absorben, dan eluen penting dalam

efisiensi eluasi. Teknik kromatografi lapis tipis sangat bermanfaat untuk

menganalisis obat, senyawa-senyawa organik dan bahan lainnya (Harmita, 2006).

Menurut Khopkar (2003), sampel diteteskan pada salah satu bagian tepi pelat

kromatografi (sebanyak 0,01-10 µl). Pemisahan dengan KLT dapat menentukan

plasticiser, tinta, antioksidan, dan formulasi zat pewarna.

15

2.7 Spektrofotometer UV-Vis

Metode ini didasarkan pada perubahan warna radikal bebas. Absorbansi

yang diukur pada metode ini adalah absorbansi larutan DPPH sisa yang tidak

beraksi dengan senyawa antioksidan. Spektrofotometer UV-Vis akan mengukur

besarnya energi yang diabsorbansi atau diteruskan oleh suatu zat. Larutan yang

mengandung zat yang dapat menyerap cahaya monokromatik akan mengakibatkan

terjadinya pemantulan, penyerapan atau penerusan dari cahaya tersebut (Harmita,

2006). Panjang gelombang yang digunakan untuk uji antioksidan adalah panjang

gelombang maksimum absorbansi. Variasi ukuran λ max yang digunakan adalah

515 nm, 516 nm, 517 nm, 518 nm, dan 520 nm (Molyneux, 2004). Penelitian

Azizah (2013), menggunakan λ max sebesar 517 nm untuk mengetahui aktivitas

antioksidan dari ekstrak kapang mangrove Avicennia sp. dengan menggunakan

spektrofotometer UV-Vis. Penelitian Saputri (2013), juga menggunakan λ max

sebesar 517 nm untuk mengetahui aktivitas antioksidan dari ekstrak kapang

mangrove Rhizophora sp. dengan menggunakan spektrofotometer UV-Vis.

2.8 GC-MS

Kromatografi spektroskopi massa merupakan teknik analisis yang

menggabungkan dua metode analisa yaitu kromatografi gas dan spektroskopi

massa. Kromatografi gas yaitu untuk menganalisis jumlah senyawa secara

kuantitatif dan kedua spektrofotometri massa untuk menganalisis molekul struktur

senyawa analitik. Prinsip kerja dari GC yaitu pemisahan campuran berdasarkan

perbedaan kecepatan migrasi komponen-komponen penyusunnya. GC biasa

16

digunakan untuk mengidentifikasi suatu senyawa yang terdapat pada campuran

gas dan juga menentukan konsentrasi suatu senyawa dalam fase gas. Penggunaan

GC dapat dipadukan dengan MS sehingga menghasilkan data yang lebih akurat

dalam mengidentifikasi senyawa yang dilengkapi standar molekulnya (Pavia et al,

2006).

Pemisahan komponen dalam GCMS terjadi di dalam kolom (kapiler) GC

dengan melibatkan dua fase, yaitu fase gerak dan fase diam. Fase gerak

merupakan gas pembawa dan fase diam adalah zat yang ada di dalam kolom.

Proses pemisahan dapat terjadi karena terdapat perbedaan kecepatan alir dari tiap

molekul di dalam kolom. Komponen yang telah dipisahkan masuk kedalam ruang

MS sebagai detektor secara intrumentasi (Hermanto, 2008).

17

BAB III

METODOLOGI PENELITIAN

3.1 Waktu dan Tempat Penelitian

Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Desember 2013. Lokasi penelitian

yaitu laboratorium Mikrobiologi, laboratorium Lingkungan dan Pangan. Pusat

Laboratorium Terpadu (PLT) UIN Syarif Hidayatullah Jakarta.

3.2 Alat dan Bahan

Alat-alat yang digunakan adalah autoklaf (ALP), timbangan analitik

(Ohaus), Laminar Air Flow Cabinet (ESCI), rotary evaporator (Heidolph

Instrument), hot plate (Thermolyne Chimarec ® 1), Magnetik Stirer, shaker,

mikropipet 1000 µL dan 100 µL, vortex (Thermolyne), oven (Memmert), corong

pisah (Schoot Duran), mortar, spektrofotometer UV-Vis (Perkin Elmer Precisely),

mikroskop cahaya (Olympus C 011), mikroskop stereo (Olympus C 011), GC-MS

Shimadzu QP 2010, lampu UV dan kamera.

Bahan-bahan yang digunakan adalah isolat kapang endofit Colletotrichum

spp. dari tanaman kina (Cinchona calisaya Wedd.), media Potato Dextrose Agar

(PDA), media Potato Dextrose Broth (PDB), etil asetat p.a, metanol p.a, alkohol

70%, 1,1-difenil-2-pikrilhidrazil (DPPH), vitamin C, akuades, dan pelat

Kromatografi Lapis Tipis (KLT) silika gel GF254.

18

3.3 Sumber Isolat

Isolat kapang endofit Colletorichum spp. yang telah diisolasi berasal dari

berbagai organ tanaman kina sebanyak 14 morphotype.

Tabel 1. Kode Isolat Colletorichum spp.

No Morphotype Kode isolat Hasil blast Sumber isolat

1 M1 3-1-5-B4 Colletotrichum sp. 1 Daun

2 M2 1-7-5-B3 Colletotrichum sp. 2 Buah

3 M3 1-4-5-A1 Colletotrichum sp. 3 Kulit kayu

4 M4 1-1-5-A2 Colletotrichum sp. 4 Daun

5 M5 4-7-5-C1 Colletotrichum sp. 5 Buah

6 M6 1-2-5-B1 Colletotrichum sp. 6 Petiole

7 M7 2-5-1-D1 Colletotrichum sp. 7 Akar

8 M8 5-7-5-B1 Colletotrichum sp. 8 Buah

9 M30 1-7-2-A4 Colletotrichum sp. 9 Buah

10 M37 5-4-2-A3 Colletotrichum sp. 10 Kulit kayu

11 M53 3-5-2-B1 Colletotrichum sp. 11 Akar

12 M57 3-7-4-C3 Colletotrichum sp. 12 Buah

13 M76 1-1-1-A5 Colletotrichum sp. 13 Daun

14 M82 2-1-5-B1 Colletotrichum sp. 14 Daun

19

3.4 Cara Kerja

3.4.1. Bagan Kerja Penelitian

Ekstraksi Ekstraksi

etil asetat 3X 3X metanol

Gambar 6. Skema Bagan Kerja Penelitian.

Isolat kapang endofit Colletotrichum spp. dari tanaman kina

(C. calisaya Wedd.)

Peremajaan di media PDA

Fermentasi cair (Still culture) di media PDB

Hasil fermentasi

Filtrat Biomassa

Ekstrak etil

asetat

Filtrat Biomassa Ekstrak

metanol

Ekstrak kering Ekstrak kering

Analisis Aktivitas Antioksidan

Autografi dengan Kromatografi

Lapis Tipis (KLT)

Spektrofotometer

UV-Vis

Pengamatan makroskopis dan mikroskopis

GC-MS

20

3.4.2. Peremajaan Kapang Endofit

Isolat kapang endofit Colletotrichum spp. dari masing-masing morphotype

ditanam pada cawan petri yang berisi media Potato Dextrose Agar (PDA) secara

duplo dan disimpan selama 7 hari pada suhu ruang. Isolat yang diremajakan

tersebut disimpan sebagai kultur stok dan working culture.

3.4.3. Pengamatan Kapang Endofit

Pengamatan secara makroskopis dilakukkan dengan mengamati warna

koloni kapang, bentuk area miselium kapang, bentuk tepi miselium kapang,

mengamati ada atau tidaknya bintik jingga dan bintik hitam serta kapang yang

terdapat pada cawan didokumentasikan menggunakan kamera digital.

Pengamatan secara mikroskopis menggunakan mikroskop stereo dan

mikroskop cahaya. Konidia diambil menggunakan ose secara aseptis. Bagian

permukaan koloni diambil dan diletakan diatas gelas objek yang telah ditetesi

shear’s diamati di bawah mikroskop cahaya dengan perbesaran 100 sampai 1000

kali menggunakan minyak imersi.

3.4.4. Fermentasi Cair Kapang Endofit

Isolat tunggal yang telah diremajakan dari cawan petri diinokulasikan ke

dalam medium fermentasi cair yaitu Potato Dextrose Broth (PDB). Medium PDB

yang digunakan yaitu sebanyak 200 ml untuk setiap isolat. Pembuatan medium

dilakukan dengan menimbang medium lalu dilarutkan dengan menggunakan

akuades. Medium dilarutkan dan dipanaskan diatas hot plate menggunakan

magnetik stirrer sampai mendidih dan larut kemudian medium dimasukkan

21

kedalam botol fermentasi yang ditutup sumbat dan disterilisasi pada suhu 121°C

selama 15 menit.

Inokulasi dilakukan dengan mengambil 3 cetakan dari isolat kapang yang

ada didalam PDA cawan dengan sedotan steril lalu dimasukkan kedalam medium

PDB secara aseptis. Medium PDB tersebut diinkubasikan selama 21 hari pada

suhu ruang (27°C) tanpa pengocokan. Setelah 21 hari, hasil fermentasi dipisahkan

antara filtrat dan biomassa dengan cara disaring untuk uji antioksidan.

3.4.5. Ekstraksi Hasil Fermentasi dengan Pelarut Organik

Hasil fermentasi yang telah disaring dan dipisahkan antara filtrat dan

biomassa, kemudian diekstraksi cair cair pada filtrat dengan penambahan etil

asetat sedangkan ekstraksi cair cair pada biomassa menggunakan metanol.

a) Ekstraksi cair cair terhadap filtrat (ekstrak filtrat)

Filtrat diberi etil asetat sebanyak 100 ml (v/v). Kemudian dikocok dalam

corong terpisah, dan didiamkan beberapa saat sampai terbentuk dua lapisan.

Lapisan atas (lapisan organik) merupakan ekstrak etil asetat yang akan melarutkan

senyawa-senyawa organik yang ada pada ekstrak kapang lalu fraksi ini

dipisahkan. Lapisan bawah merupakan fraksi air lalu fraksi tersebut ditambahkan

etil asetat baru kemudian dikocok dengan corong pisah dan didiamkan beberapa

saat sampai terbentuk dua lapisan (pengocokan fraksi air dengan etil asetat

dilakukkan sebanyak tiga kali) dan hanya lapisan atas saja yang diambil. Fraksi

etil asetat yang diperoleh disatukan dan dikeringkan menggunakan rotary

evaporator suhu 40°C sampai didapatkan ekstrak kering untuk uji antioksidan.

22

b) Ekstraksi cair cair terhadap biomassa (ekstrak biomassa)

Biomassa hasil saringan diekstraksi dengan metanol sebanyak 100 ml

(v/v) dan dihaluskan menggunakan mortar sampai isolat kapang halus kemudian

dimaserasi dan di shaker selama 24 jam. Kemudian disaring untuk diambil

filtratnya sedangkan biomassanya (ampas) diberi metanol baru (maserasi

dilakukan berulang sebanyak tiga kali). Hasil ekstraksi yang diperoleh kemudian

dipekatkan menggunakan rotary evaporator suhu 40°C sehingga diperoleh ekstrak

pekat untuk dilakukkan uji antioksidan.

3.4.6. Uji Senyawa Antioksidan dari Ekstrak Hasil Fermentasi

3.4.6.1. Metode DPPH Menggunakan Kromatografi Lapis Tipis (KLT)

Ekstrak pekat yang didapatkan dari biomassa dan filtrat sebanyak satu

mg dilarutkan dengan 10 ml metanol lalu di vortex sampai larut, setelah itu

sampel ditotolkan pada pelat kromatografi lapis tipis (KLT) begitu juga dengan

pembuatan vitamin C sebagai kontrol. Pelat KLT dimasukkan ke dalam chamber

yang berisi fase gerak etil asetat: metanol : air dengan perbandingan (100:13,5:10)

ml. Pelat yang telah mencapai garis akhir dikeluarkan dari chamber dan

dikeringkan. Kromatogram disemprot menggunakan larutan DPPH (Tamat et al.,

2007). Larutan stok DPPH disimpan kedalam botol gelap (pembuatan larutan

DPPH selalu baru untuk setiap pengujian) lalu diamkan selama 20 menit (Saputri,

2013). Intensitas warna DPPH akan berubah dari warna ungu menjadi kuning

yang disebabkan oleh elektron yang berasal dari senyawa antioksidan (Molyneux,

2004). Menurut Listiandiani (2011), bercak pada KLT diamati di bawah sinar UV

23

pada λ 254 nm dan λ 366 nm. Bercak pada pelat diamati dan dihitung nilai Rf

(retardation factor) dengan rumus :

3.4.6.2. Metode DPPH Menggunakan Spektrofotometer UV-Vis

Pengujian dilanjutkan dengan uji persentasi yaitu untuk menentukan

kadar antioksidan menggunakan spektrofotometer dengan cara ekstrak dilarutkan

didalam metanol dan dibuat stok untuk pengenceran. Seri pengenceran dibuat dari

larutan stok sebanyak lima variasi konsentrasi. Ekstrak kapang dari berbagai

variasi konsentrasi sebanyak 2 ml ditambahkan 2 ml DPPH 0,002% didalam

metanol. Ekstrak didiamkan selama 30 menit di dalam botol gelap (Bendra, 2012).

Larutan stok DPPH disimpan kedalam botol gelap (pembuatan larutan ini

selalu baru untuk setiap pengujian) lalu diamkan selama 20 menit (Azizah, 2013).

Pembanding (kontrol) yang digunakan adalah larutan vitamin C dalam metanol

dengan berbagai variasi konsentrasi. Absorbansi dari kedua larutan tersebut

diukur menggunakan spektrofotometer UV-VIS pada λ maksimum 517 nm.

Pengukuran absorbansi dilakukan 2 kali pengulangan. Aktivitas antioksidan

diukur dari penurunan absorbansi larutan DPPH akibat penambahan ekstrak hasil

fermentasi (Molyneux, 2004).

3.4.7. Analisis Ekstraksi Metabolit Sekunder dengan GC-MS

Ekstrak kapang endofit yang memiliki nilai IC50 yang tertinggi secara

intraseluler (ekstrak metanol) dan secara ekstraseluler (ekstrak etil asetat) dipilih

24

untuk dianalisis menggunakan GC-MS Shimadzu QP 2010 untuk mengetahui

komponen senyawa yang terdapat pada kedua ekstrak tersebut. Sampel sebanyak

1 µl diinjeksikan ke dalam GC-MS yang dioperasikan menggunakan kolom kaca

panjang 25 m, diameter 0,25 mm dan ketebalan 0,25 µl dengan fase diam CP-Sil 5

CB dengan temperatur 10oC/menit, gas pembawa helium bertekanan 12 kPa, total

laju 30 mL/menit dan split rasio sebesar 1:50 (Sastroamidjojo, 2001).

3.5 Analisis Data

Data hasil uji aktivitas antioksidan dibuat dalam bentuk kurva dengan

menggunakan program Microsoft Excel 2007. Pembanding (kontrol) yang

digunakan adalah vitamin C. Persentase inhibisi ekstrak kapang terhadap larutan

DPPH dihitung menggunakan rumus :

Hasil pengujian didapat nilai absorbansi sampel uji dan absorbansi kontrol,

dari nilai absorbansi tersebut dihitung nilai % inhibisi dari berbagai konsentrasi

kemudian disajikan dalam bentuk kurva regresi linier yang diplotkan antara

konsentrasi pada sumbu X dengan aktivitas peredaman DPPH (% inhibisi) pada

sumbu Y. Nilai IC50 ditetapkan dari persamaan regresi linier Y = ax+b dengan

memasukkan nilai 50 kedalam Y. Konsentrasi ini merupakan konsentrasi ekstrak

hasil fermentasi yang dibutuhkan untuk menghasilkan penghambatan radikal

DPPH sebesar 50% (Azizah, 2013; Saputri, 2013).

25

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Fermentasi Cair Kapang Endofit Colletotrichum spp.

Fermentasi cair kapang endofit Colletotrichum spp. bertujuan untuk

mendapatkan metabolit sekunder dari kapang tersebut. Medium Potato Dextrose

Broth (PDB) adalah medium yang umum digunakan untuk menumbuhkan jamur,

kapang dan khamir karena media ini mengandung sumber nutrisi yang mendorong

sporulasi kapang, produksi zat warna dan pertumbuhan jamur secara subur

(Pelczar dan Chan, 2010). Media PDB mengandung sumber karbon yang berasal

dari kentang dan dextrose. Sumber karbon merupakan komponen terpenting

dalam medium pertumbuhan, karena sel-sel mikroba sebagian besar terdiri dari

unsur-unsur karbon dan nitrogen (Pratiwi, 2008).

Tabel 2. Hasil fermentasi cair kapang endofit Colletotrichum spp. pada medium

PDB selama 21 hari pada suhu ruang.

No Kapang Tampak fisik Karakteristik

1

Medium PDB (kontrol)

Medium berwarna kuning bening.

2 M1

(Colletotrichum sp.1)

Miselium berwarna putih seperti

beludru. Warna medium mengalami

perubahan menjadi kuning

kecoklatan.

3 M2

(Colletotrichum sp.2)

Miselium berwarna putih keabuan

seperti kapas. Warna medium

berubah menjadi kuning

kecoklatan.

26

Tabel 2. (lanjutan)


4

M3

(Colletotrichum sp. 3)


kapas. Warna medium berubah

menjadi kuning keruh.

5 M4



beludru. Warna medium berubah

menjadi kuning agak kecoklatan.

6 M5



beludru dengan sedikit miselium

yang mengandung konidia

berwarna jingga. Warna medium

berubah menjadi kuning kecoklatan

7 M6


Miselium berwarna putih agak

krem dengan bercak abu-abu.

Warna medium berubah menjadi

kuning sedikit keruh.

8 M7


Miselium berwarna abu-abu dengan

sedikit warna putih seperti kapas.


kuning keruh.

9 M8



beludru dengan sedikit miselium

yang mengandung konidia

berwarna jingga. Warna medium

berubah menjadi kuning

kecoklatan.

10 M30



beludru. Warna medium berubah

menjadi kuning keruh agak

kecoklatan.

11 M37



kapas. Warna medium berubah

menjadi kuning agak kecoklatan.

27

Tabel 2. (lanjutan)


12

M53


Miselium berwarna putih keabuan

seperti kapas. Warna medium

berubah menjadi kuning lebih

bening.

13 M57



kapas dengan sedikit miselium yang

mengandung konidia berwarna

jingga. Warna medium berubah

menjadi kuning kecoklatan.

14 M76



beludru seperti kapas. Warna

medium berubah menjadi kuning

keruh.

15 M82


Miselium berwarna putih dengan

sedikit abu-abu dibagian tepi.


kuning agak kecoklatan.

Miselium kapang endofit Coletotrichum spp. terbentuk pada bagian

permukaan atas medium fermentasi cair (Tabel 2). Terbentuknya miselium karena

adanya pertumbuhan dari kapang. Miselium yang terbentuk pada bagian

permukaan atas medium diakibatkan karena saat fementasi medium tidak dikocok

(still condition). Menurut Gandjar et al. (2006), proses pertumbuhan kapang

dimulai dari konidia atau spora lalu berkecambah membentuk hifa kemudian

membentuk miselium. Pertumbuhan kapang pada medium yang tidak dikocok

akan mengakibatkan miselium tumbuh pada bagian permukaan atas medium

berupa lapisan yang semakin lama akan menebal.

28

Warna medium PDB mengalami perubahan menjadi kuning kecoklatan

yang awalnya kuning bening, seperti yang terjadi pada sampel M1, M2, M4, M5,

M8, M30, M37, M57, dan M82. Warna medium menjadi kuning keruh yang

awalnya kuning bening terjadi pada sampel M3, M6, M7, dan M76 sedangkan

pada sampel M53 warna medium berubah menjadi kuning lebih bening (Tabel 2).

Perubahan yang terjadi diduga karena adanya aktivitas dari kapang dalam

memanfaatkan nutrisi yang terdapat pada medium PDB selama proses fermentasi.

Hal ini sesuai dengan penelitian Jauhari (2010), yang menyatakan bahwa

perubahan warna substrat dapat dikarenakan adanya aktivitas kapang endofit atau

proses metabolisme kapang dalam memanfaatkan nutrisi yang terdapat di dalam

medium. Kapang diduga menghasilkan metabolit primer dan metabolit sekunder.

Menurut Gandjar et al. (2006), pertumbuhan fungi dapat diketahui dari

penambahan massa sel dan proses metabolisme kapang yang menyebabkan

perubahan pada substrat yaitu timbulnya perubahan warna atau kekeruhan pada

suatu substrat cair. Medium yang semula bening akan berubah menjadi keruh

tetapi medium yang semula tidak terlalu bening menjadi bening karena adanya

aktivitas dari kapang. Oleh karena itu, dapat dikatakan bahwa kapang endofit

Colletotrichum spp. mengalami pertumbuhan dan menghasilkan metabolit dalam

medium fermentasi PBD.

4.2 Uji Autografi Aktivitas Antioksidan

Kromatografi Lapis Tipis (KLT) digunakan sebagai uji pendahuluan untuk

mengetahui aktivitas antioksidan ektrak filtrat dan biomassa Colletotrichum spp.

Aktivitas antioksidan dari ekstrak filtrat dan biomassa Colletotrichum spp.

29

ditandai dengan perubahan warna pada pelat KLT dari ungu menjadi kuning

setelah disemprot larutan 1,1-difenil-2-pikrilhidrazil (DPPH) (Mailandari, 2012).

Keberadaan aktivitas antioksidan ditandai dengan hasil positif dan sebaliknya.

Hasil uji KLT dapat dilihat secara lengkap pada Tabel 3.

Tabel 3. Hasil uji KLT ekstrak Colletotrichum spp. setelah disemprot DPPH.

No Sampel Filtrat Biomassa

1 M1 (Colletotrichum sp.1) + +


3 M3(Colletotrichum sp.3) + +












15 Vitamin C (kontrol) + +

Keterangan: (+) memiliki senyawa aktif antioksidan (warna kuning)

(-) tidak memiliki senyawa aktif antioksidan

Hasil uji KLT memperlihatkan bahwa seluruh ekstrak filtrat dan biomassa

Colletotrichum spp. positif memiliki senyawa aktif antioksidan (Tabel 3). Hasil

positif ditandai dengan adanya bercak kuning berlatar ungu yang semakin

memudar setelah disemprot larutan DPPH (Lampiran 2). Hal ini sesuai dengan

penelitian (Azizah, 2013), yang menyatakan bercak kuning berlatar ungu yang

semakin memudar setelah disemprot DPPH menandakan adanya keberadaan

senyawa antioksidan dari ekstrak sampel. Menurut Molyneux (2004), suatu

senyawa dapat dikatakan memiliki aktivitas antioksidan apabila senyawa tersebut

30

mampu mendonorkan atom hidrogennya untuk berikatan dengan DPPH ditandai

dengan semakin hilangnya warna ungu menjadi kuning pucat. Hal ini

menunjukkan bahwa seluruh ekstrak filtrat dan biomassa Colletotrichum spp.

berpotensi sebagai antioksidan yang ditandai dengan hasil positif pada uji KLT.

Gambar 7. Nilai Retardation factor (Rf) K) kontrol Vitamin C A) ekstrak

biomassa Colletotrichum sp.8 B) ekstrak filtrat Colletotrichum sp. 10

Nilai Retardation factor (Rf) digunakan untuk mengetahui komponen

senyawa yang terdapat pada ekstrak filtrat dan biomassa yang akan dibandingakan

dengan vitamin C. Nilai Rf standar vitamin C dengan menggunakan eluen etil

asetat, metanol dan air adalah 0,74. Nilai Rf sampel yang mendekati nilai Rf

standar vitamin C adalah ekstrak biomassa Colletotrichum sp. 8 dan ekstrak filtrat

Colletotrichum sp. 10 yaitu 0,71 dengan eluen yang sama (Gambar 7). Eluen yang

digunakan untuk standar vitamin C sama dengan sampel. Nilai Rf antara bercak

ekstrak biomassa Colletotrichum sp. 8 dan ekstrak filtrat Colletotrichum sp. 10

dengan standar vitamin C hampir sama. Menurut Rohman (2009), menyatakan

bahwa suatu senyawa dapat dikatakan identik apabila mempunyai nilai Rf yang

sama jika diukur pada kondisi KLT yang sama. Menurut Margiono (2008),

31

apabila dua bercak memiliki nilai Rf yang hampir sama maka kemungkinan besar

komponen tersebut berasal dari kelompok senyawa yang sama. Hal ini diduga

bahwa bercak ekstrak biomassa Colletotrichum sp. 8 dan ekstrak filtrat

Colletotrichum sp. 10 dengan standar vitamin C diduga merupakan kelompok

senyawa yang sama.

Nilai Rf dari seluruh sampel bervariasi ada yang nilainya lebih tinggi atau

lebih rendah dibandingkan standar vitamin C yaitu dari 0,2 sampai 0,82

(Lampiran 2). Nilai Rf menunjukan keberadaan suatu senyawa yang terdapat di

dalam suatu sampel. Senyawa yang terkandung antara satu sampel dengan sampel

yang lain memiliki perbedaan. Menurut Lasmaria (2011), sampel yang memiliki

nilai Rf yang lebih tinggi atau lebih rendah dapat dikarenakan adanya senyawa

lain yang terkandung pada masing-masing ekstrak sehingga menghasilkan nilai Rf

yang berbeda. Nilai Rf merupakan nilai yang sangat sensitif karena banyak faktor

yang dapat menyebabkan nilai Rf berubah. Menurut Robinson (1995), nilai Rf

berubah karena faktor suhu, eluen, dan banyaknya senyawa yang ditotolkan. Oleh

karena itu, nilai Rf tidak dapat diandalkan untuk identifikasi senyawa sehingga

perlu adanya pengujian lanjutan.

4.3 Uji Aktivitas Antioksidan Menggunakan Spektrofotometer UV-Vis.

Pengujian aktivitas antioksidan metode 1,1-difenil-2-pikrilhidrazil (DPPH)

menggunakan spektrofotometer uv-vis melibatkan pengukuran nilai absorbansi

pada panjang gelombang maksimum 517 nm dengan berbagai variasi konsentrasi

yaitu 150 ppm, 300 ppm, 600 ppm, 1200 ppm dan 2400 ppm. Nilai absorbansi

32

akan menurun apabila konsentrasi sampel semakin besar yang mengakibatkan

semakin besarnya persen penghambatan. Aktivitas antioksidan dari sampel akan

merubah warna larutan DPPH dalam metanol yang semula berwarna ungu

menjadi kuning (Molyneux, 2004; Lasmaria, 2011). Aktivitas antioksidan

dinyatakan dengan nilai Inhibition Concentration 50% (IC50). Nilai IC50 dihitung

berdasarkan persen penghambatan terhadap radikal DPPH dari masing-masing

konsentrasi larutan sampel secara lengkap dapat dilihat pada Gambar 8.

Gambar 8. Aktivitas antioksidan ekstrak filtrat Colletotrichum spp.

berdasarkan nilai IC50

Hasil analisis regresi menunjukan bahwa seluruh ekstrak filtrat memiliki

aktivitas antioksidan yang bervariasi. Ekstrak filtrat Colletotrichum sp. 1 memiliki

aktivitas antioksidan tertinggi dengan nilai IC50 837,143 ppm dan ekstrak filtrat

Colletotrichum sp. 11 memiliki aktivitas antioksidan terendah dengan nilai IC50

2017,2 ppm (Gambar 8). Aktivitas antioksidan dinyatakan dengan nilai IC50

dimana aktivitas antioksidan akan berbanding terbalik dengan nilai IC50. Semakin

tinggi aktivitas antioksidan suatu sampel maka semakin rendah nilai IC50 dan

0

500

1000

1500

2000

2500

IC5

0(p

pm

)

ekstrak

filtrat

33

sebaliknya (Pratiwi et al., 2013). Aktivitas antioksidan tertinggi dari seluruh

ekstrak filtrat memiliki nilai IC50 sebesar 837,143 ppm. Hal ini menunjukkan

bahwa seluruh ekstrak filtrat Colletotrichum spp. tergolong tidak aktif sebagai

antioksidan. Menurut Jun et al. (2003), aktivitas antioksidan dikatakan tidak aktif

jika memiliki nilai IC50 > 500 ppm.

Aktivitas antioksidan seluruh ekstrak filtrat Colletotrichum spp. jauh lebih

rendah apabila dibandingkan dengan vitamin C yang memiliki IC50 sebesar 3,793

ppm (Gambar 8). Rendahnya aktivitas antioksidan pada seluruh ekstrak filtrat

Colletotrichum spp. karena vitamin C merupakan senyawa murni yang umum

digunakan sebagai pembanding karena memiliki aktivitas antioksidan kuat

terbukti dengan nilai IC50 yang kecil (Arindah, 2010). Ekstrak filtrat

Colletotrichum spp. yang diuji pada penelitian ini masih berupa ekstrak kasar

(crude extract) dan bukan senyawa murni. Menurut Hanani et al. (2005), apabila

ekstrak masih berupa ekstrak kasar masih ada kemungkinan senyawa murni yang

dikandung suatu sampel memiliki aktivitas peredaman radikal bebas lebih kuat

dibandingkan ekstrak kasarnya.

Aktivitas antioksidan yang dihasilkan setiap ekstrak filtrat Colletotrichum

spp. bervariasi (Gambar 8). Perbedaan aktivitas antioksidan yang dihasilkan setiap

ekstrak filtrat Colletotrichum spp. diduga karena setiap spesies kapang memiliki

kemampuan yang berbeda dalam memproduksi senyawa metabolit. Menurut

Pratiwi (2008), spesies mikroorganisme tertentu mungkin mampu memproduksi

beberapa macam metabolit sekunder, sedangkan spesies yang lain hanya

memproduksi satu atau dua macam metabolit sekunder saja. Oleh karena itu,

34

kemampuan setiap ekstrak filtrat kapang endofit Colletotrichum spp. berbeda

dalam menghasilkan senyawa metabolit berupa antioksidan terlihat dari aktivitas

antioksidan yang bervariasi.

Ekstrak filtrat Colletotrichum sp. 1 memiliki aktivitas antioksidan tertinggi

apabila dibandingan seluruh ekstrak filtrat spesies lainnya (Gambar 8). Tingginya

aktivitas antioksidan dari ekstrak filtrat Colletotrichum sp. 1 diduga karena

spesies kapang endofit tersebut memiliki kemampuan memproduksi metabolit

tertentu yang berperan sebagai antioksidan dibandingkan spesies lainnya. Menurut

Strobel dan Daisy (2003), endofit dengan spesies yang sama diisolasi dari

tanaman yang sama tetapi hanya salah satu endofit yang akan menghasilkan

senyawa bioaktif sangat tinggi pada suatu kultur. Menurut Dewick (2002),

produksi metabolit sekunder tertentu hanya ditemukan pada organisme spesifik,

atau terdapat pada strain (galur) yang spesifik serta hanya diproduksi pada

kondisi-kondisi tertentu.

Gambar 9. Aktivitas antioksidan ekstrak biomassa Colletotrichum spp.

berdasarkan nilai IC50

0

500

1000

1500

2000

2500

IC5

0(p

pm

)

ekstrak

biomassa

35

Aktivitas antioksidan yang dihasilkan seluruh ekstrak biomassa

Colletotrichum spp. bervariasi. Hasil analisis regresi menunjukkan ekstrak

biomassa Colletotrichum sp. 1 memiliki aktivitas antioksidan tertinggi dengan

nilai IC50 1489,565 ppm. Aktivitas antioksidan terendah terdapat pada ekstrak

biomassa Colletotrichum sp. 7 dengan nilai IC50 2351,157 ppm (Gambar 9). Hal

ini menunjukkan bahwa seluruh ekstrak biomassa Colletotrichum spp. tergolong

tidak aktif sebagai antioksidan. Menurut Jun et al. (2003), aktivitas antioksidan

dikatakan tidak aktif jika memiliki nilai IC50 > 500 ppm.

Ekstrak biomassa Colletotrichum sp. 1 memiliki aktivitas antioksidan

tertinggi dari seluruh ekstrak biomassa dengan nilai IC50 1489,565 ppm tetapi

memiliki aktivitas antioksidan yang sangat rendah (Gambar 9). Kapang endofit

Colletotrichum sp. 1 diisolasi dari organ daun tanaman kina (Chinchona calisaya

Wedd.) (Tabel 1). Berdasarkan penelitian sebelumnya ekstrak daun Chinchona

ledgeriana memiliki aktivitas antioksidan dengan metode DPPH–TEAC sebesar

84,2 ± 1,9 mg g– pada ekstrak metanol dan 17,1 ± 0,6 mg g

– pada ekstrak akuades

(Al–Mustafa dan Al–Thunibat, 2008). Mikroba endofit diketahui memiliki

kemampuan memproduksi senyawa metabolit sekunder yang sama dengan

tanaman inangnya. Metabolit sekunder yang dihasilkan mikroba endofit

kemungkinan karena adanya transfer genetik dari tanaman inang kedalam mikroba

endofit (Radji, 2005). Hal ini diduga Colletotrichum sp. 1 dari tanaman kina

(Cinchona calisaya Wedd.) memiliki aktivitas antioksidan tertinggi karena

mampu menghasilkan metabolit seperti organ daun tanaman kina.

36

Kapang endofit Colletotrichum sp. 4, Colletotrichum sp. 10, dan

Colletotrichum sp. 14 diisolasi dari organ yang sama yaitu organ daun tetapi

memiliki aktivitas antioksidan yang berbeda serta seluruh ekstrak biomassa

Colletotrichum spp. yang diisolasi dari organ tanaman yang berbeda memiliki

aktivitas yang berbeda pula (Gambar 9). Hal ini menunjukan bahwa setiap spesies

Colletotrichum spp. memiliki kemampuan yang berbeda dalam menghasilkan

senyawa antioksidan. Penelitian Petrini et al. (1992), menyatakan bahwa kapang

endofit dengan spesies yang sama pada satu tanaman yang sama namun diisolasi

dari organ tanaman yang berbeda memiliki kemampuan untuk memproduksi

metabolit sekunder yang berbeda. Menurut Srikandace et al. (2007), kapang

endofit memiliki kemampuan untuk menghasilkan senyawa metabolit yang

berbeda-beda. Oleh sebab itu, ekstrak biomassa Colletotrichum spp. dalam

penelitian ini memiliki kemampuan yang berbeda dalam menghasilkan senyawa

antioksidan.

Ekstrak biomassa Colletotrichum sp. 1 memiliki aktivitas antioksidan yang

lebih tinggi dibandingkan seluruh ekstrak biomassa dengan nilai IC50 1489,565

ppm (Gambar 9). Penelitian Saputri (2013), menyatakan bahwa ekstrak biomassa

kapang genus Colletotrichum yang diisolasi dari tanaman Rhizophora sp.

memiliki nilai IC50 sebesar 44,62 µg/ml. Menurut Jun et al. (2003), aktivitas

antioksidan dikatakan aktif jika IC50 50-100 ppm dan tidak aktif jika IC50 > 500

ppm. Hal ini menunjukkan bahwa ekstrak biomassa Colletotrichum dari

Rhizophora sp. lebih aktif sebagai antioksidan apabila dibandingkan ekstrak

biomassa Colletotrichum spp. dari tanaman kina terlihat dari nilai IC50 yang kecil.

37

Seluruh ekstrak biomassa Colletotrichum spp. memiliki aktivitas

antioksidan yang sangat rendah dibandingkan standar vitamin C. Vitamin C

sebagai kontrol positif memiliki nilai IC50 sebesar 3,793 ppm (Gambar 9).

Rendahnya aktivitas antioksidan yang dihasilkan ekstrak biomassa Colletotrichum

spp. dibandingkan vitamin C diduga karena ekstrak yang diuji masih merupakan

ekstrak kasar (crude extract) dan bukan senyawa murni. Apabila ekstrak masih

berupa ekstrak kasar masih ada kemungkinan senyawa murni yang dikandung

suatu sampel memiliki aktivitas peredaman radikal bebas lebih kuat dibandingkan

ekstrak kasarnya (Hanani et al., 2005).

Tingginya aktivitas antioksidan vitamin C karena vitamin C merupakan

senyawa murni. Vitamin C memiliki aktivitas antioksidan kuat terbukti dengan

nilai IC50 yang kecil (Arindah, 2010). Vitamin C mudah mengalami oksidasi oleh

radikal bebas karena mempunyai ikatan rangkap serta terdapat 2 gugus –OH yang

terikat pada ikatan rangkap tersebut. Vitamin C mampu menangkap radikal bebas

dengan atau tanpa katalisator enzim. Reaksinya terhadap senyawa oksigen reaktif

lebih cepat dibandingkan dengan komponen cair lainnya (Winarsi, 2007).

4.4 Analisis GC-MS

Analisa GC-MS bertujuan untuk mengetahui komponen senyawa yang

terkandung didalam ekstrak kapang endofit Colletotrichum spp. terpilih yaitu

sampel M1 (Colletotrichum sp. 1). Pemilihan sampel untuk diuji GC-MS

berdasarkan hasil aktivitas antioksidan tertinggi dari ekstrak filtrat dan biomassa.

Hasil GC-MS ekstrak filtrat dapat dilihat pada Gambar 10 dan Tabel 4.

38

Gambar 10. Kromatogram Hasil GC-MS Ekstrak Filtrat

Tabel 4. Hasil identifikasi komponen ekstrak filtrat Colletotrichum sp.1

dengan pelarut etil asetat.

No Nama Komponen % area

1 Etilbenzena 3.86

2 p-Dimetilbenzena 3.28

3 o-Silena 21.38

4 1-metiletil-Benzena 0.67

5 1,4-dikloro-Benzena 1.61

6 Cis-Limonen Oksida 1.34

7 Naptalen * 5.55

8 Metil Salisilat* 1.34

9 4-kloro-Fenol* 2.09

10 Sikloundekanon 0.72

11 9,10-dihidroksi-Asam oktadekanoat* 1.25

12 1,2,4-Trihidroksi-p-metana 1.00

13 2,4-bis(1,1-dimetiletil)-Fenol * 1.42

14 3,4-dihidro-8-hidroksi-3-metil 1H-2-Benzopiran-1-one* 24.44

15 1,1'-(2,6-dimetil-3,5-piridindiyl)bis- Etanon 23.12

16 Benzopenon 1.30

17 2-Asam karboksilat, 5-(1-heksinil)-Furan 3.50

18 3-metoksi-2,4,6-trimetil-Fenol, * 1.47

19 bis(2-metilpropil) ester 1,2- Asam Benzendikarboksilat 0.67

*) Memiliki aktivitas antioksidan.

39

Hasil GC-MS senyawa bioaktif yang terkandung didalam ekstrak etil

asetat kapang endofit Colletotrichum sp. 1 sedikitnya terdapat 19 komponen

senyawa yang termasuk kedalam golongan senyawa fenol, aromatik, ester, keton,

dan alkana. Senyawa naftalen memiliki % area 5.55. Senyawa fenol banyak

ditemukan dengan % area yang berbeda yaitu 2.09, 1.42, 1.47. Senyawa asam

oktadekanoat memiliki % area 1.25. Senyawa benzopiran memiliki % area 24.44.

Persen area yang paling tinggi terdapat pada komponen senyawa benzopiran

(Tabel 4).

Senyawa naptalen, metil salisilat, fenol, asam oktadekanoat dan

benzopiran memiliki aktivitas antioksidan. Kemampuan senyawa-senyawa

tersebut telah dibuktikan oleh beberapa penelitian yang telah dilakukan

sebelumnya. Penelitian Vijayavel et al. (2007), senyawa naptalen dari ekstrak

Chorola vulgaris mempunyai efek anti radikal bebas. Menurut Sutrisno (2012),

senyawa metil salisilat termasuk golongan senyawa fenolik. Senyawa fenolik

memiliki struktur khas yaitu terdapat satu atau lebih gugus hidroksil yang terikat

pada satu atau lebih cincin aromatik benzena sehingga senyawa ini memiliki

kemampuan sebagai antioksidan. Penelitian Gul et al. (2011), metabolit sekunder

seperti komponen fenolik (asam fenolik, flavonoid, kuinin, dan kumarin),

komponen nitrogen (alkaloid dan amina), vitamin, terpenoid dan metabolit

sekunder lainnya terbukti memiliki aktivitas antioksidan. Penelitian Nath et al.

(2012), kapang endofit Phomopsis sp. dan Xylaria sp. memiliki aktifitas

antioksidan dan tingkat fenol yang tinggi. Penelitian Swantara dan Parwata

(2011), senyawa yang paling aktif bersifat antioksidan pada Gracilaria

40

coronopifolia yaitu 1-nonadekena; asam heksadekanoat; asam 9-oktadekanoat.

Penelitian Seo et al. (2006), senyawa benzopiran dari ganggang coklat Sargasum

thunbergii terbukti efektif meredam radikal bebas. Penelitian Tianpanich et al.

(2006), menyatakan bahwa senyawa benzopiran atau isokumarin yang dihasilkan

kapang endofit Colletotrichum sp. dari tanaman Piper ornatum memiliki aktivitas

antioksidan.

Hasil GC-MS memperlihatkan bahwa pelarut etil asetat mampu

mengekstrak komponen senyawa lebih banyak apabila dibandingkan pelarut

metanol (Tabel 4 dan 5). Hal ini diduga karena pelarut etil asetat bersifat semi

polar dimana mampu mengekstrak senyawa polar dan non polar yang terdapat

pada sampel. Menurut Oyi et al. (2007), pelarut etil asetat mampu mengekstrak

senyawa polar dan non polar karena pelarut ini bersifat semi polar. Pelarut akan

melarutkan senyawa yang sesuai dengan tingkat kepolarannya. Pelarut etil asetat

memiliki kemampuan melarutkan senyawa sterol, terpenoid, saponin, flavonoid,

dan senyawa fenol. Hal ini sesuai dengan hasil yang diperoleh dimana pelarut etil

asetat dapat mengekstrak senyawa fenol dari ekstrak filtrat Colletotrichum sp.1.

Senyawa fenol memiliki kemampuan menyumbangkan atom hidrogen

yang menyebabkan radikal DPPH dapat terduksi menjadi bentuk yang lebih stabil.

Aktivitas peredaman radikal bebas oleh senyawa fenol dipengaruhi oleh jumlah

dan posisi hidrogen fenolik dalam molekulnya dimana semakin banyak jumlah

gugus hidroksil pada senyawa fenol maka semakin besar aktivitas antoksidan

yang dihasilkan (Pratiwi et al., 2013). Senyawa fenol memiliki aktivitas

41

antioksidan, antitumor, dan antibiotik. Kandungan total fenol memiliki korelasi

yang kuat dan berbanding lurus dengan aktivitas antioksidan (Widiastuti, 2010).

Gambar 11. Kromatogram Hasil GC-MS Ekstrak Biomassa

Tabel 5. Hasil identifikasi komponen ekstrak biomassa Colletotrichum sp.1

dengan pelarut metanol.

No Nama Komponen % area

1 N,N-Dimethyl-3-metoksipropilamin 3.26

2 2-butoksi Etanol 4.78

3 Siklotetrasiloksan 12.83

4 Asam butanedioat, dimetil ester 6.84

5 4-metoksi Fenol* 4.21

6 Etanol, 2-butoksi (CAS) (2-Asam Butoksietil asetat) 5.16

7 Siklopentasiloksan-dekametil 6.43

8 1,2-dihidro-1,1,6-trimetil Naptalen* 9.72

9 Korlumidin 7.06

10 Asam heksadekanoat* 11.51

11 Metil ester 8,11-Asam oktadekanoat * 7.50

12 13-Asam oktadekanoat, metil ester (CAS) Metil

Oktadec-13-Enoat *

15.32

13 Asam oktadekanoat, metil ester (CAS) Metil stearat * 5.38

*) Memiliki aktivitas antioksidan.

42

Hasil analisis GC-MS menunjukan bahwa dalam ekstrak metanol kapang

endofit Colletotrichum sp.1 terdapat sedikitnya 13 komponen senyawa yang

termasuk kedalam golongan senyawa fenol, aromatik, ester, alkana, alkohol, dan

amina. Senyawa fenol memiliki % area 4.21. Senyawa naftalen memiliki % area

9.72. Senyawa asam heksadekanoat memiliki % area 11.51. Senyawa asam

oktadekanoat banyak ditemukan dengan % area yang berbeda yaitu 7.50, 15.32,

5.38. Persen area yang paling tinggi terdapat pada komponen senyawa asam

oktadekanoat (Tabel 5).

Senyawa fenol, naptalen, asam heksadekanoat dan asam oktadekanoat

diperkirakan memiliki aktivitas antioksidan pada ekstrak metanol (Tabel 5).

Kemampuan senyawa-senyawa tersebut telah dibuktikan oleh beberapa penelitian.

Menurut Liu et al. (2007), ekstrak metanol fungi endofit Xylaria sp. dari tanaman

Ginkgo biloba memiliki aktivitas antioksidan yang tinggi karena keberadaan

senyawa fenol. Penelitian Swantara dan Parwata (2011), menyatakan bahwa

senyawa yang paling aktif bersifat antioksidan pada Gracilaria coronopifolia

yaitu 1-nonadekena, asam heksadekanoat, dan asam 9-oktadekanoat. Persen area

dari komponen senyawa asam oktadekanoat memiliki persen area yang tertinggi

dibandingkan senyawa lain yang berperan sebagai antioksidan (Tabel 5). Hal ini

diduga komponen senyawa asam oktadekanoat yang banyak berperan dalam

meredam radikal bebas dari larutan DPPH sebagai antioksidan. Penelitian Miryati

et al. (2011), menyatakan kandungan asam heksadekanoat dalam ekstrak kulit

buah mangis berperan sebagai antioksidan. Menurut Setyaningsih et al. (2014),

senyawa asam heksadekanoat pada ekstrak daun dan ranting tanaman jarak pagar

43

(Jatropha curcas L.) memiliki efek antioksidan. Penelitian Vijayavel et al. (2007),

menyatakan senyawa naptalen dari ekstrak Chorola vulgaris memiliki efek anti

radikal bebas.

Menurut Nimah et al. (2012), pelarut metanol secara efektif dapat

mengekstrak senyawa flavonoid, fenolik, dan saponin. Hal ini sesuai dengan hasil

yang diperoleh dimana pelarut metanol dapat mengekstrak senyawa fenol dari

ekstrak biomassa Colletotrichum sp. 1. Menurut Tamat et al. (2007), senyawa

fenol dengan gugus hidroksil yang terikat pada cincin aromatik merupakan

senyawa yang efektif sebagai antioksidan karena senyawa tersebut mampu

meredam radikal bebas dengan cara memberikan atom hidrogen (donor proton)

dari gugus hidroksil kepada radikal bebas.

44

BAB V

PENUTUP

5.1 Kesimpulan

1. Seluruh ekstrak kapang endofit Colletotrichum spp. dari tanaman kina (C.

calisaya Wedd.) memiliki potensi antioksidan ekstrak biomassa dan

ekstrak filtrat yang ditandai dengan perubahan warna pelat KLT menjadi

kuning setelah disemprot DPPH dan nilai IC50 dari masing-masing ekstrak

filtrat dan biomassa.

2. Ekstrak kapang endofit Colletotrichum sp. 1 dari tanaman kina (C.

calisaya Wedd.) memiliki aktivitas antioksidan tertinggi dari ekstrak filtrat

yaitu sebesar 837,143 ppm dan ekstrak biomassa sebesar 1900,46 ppm.

3. Senyawa hasil GC-MS Colletotrichum sp. 1 yang berperan sebagai

antioksidan dari ekstrak biomassa adalah senyawa fenol, naptalen, asam

heksadekanoat dan asam oktadekanoat sedangkan senyawa ekstrak filtrat

yang berperan sebagai antioksidan adalah naptalen, metil salisilat, fenol,

asam oktadekanoat dan benzopiran.

5.2 Saran

Perlu dilakukan optimasi kondisi fermentasi, pengujian tambahan untuk

memperkuat hasil pengujian dengan uji fitokimia, perhitungan rendemen hasil

ekstraksi dan uji total fenol.

45

DAFTAR PUSTAKA

Al–Mustafa, A.H., dan O.Y. Al–Thunibat. 2008. Antioxidant Activiity of Some

Jordanian Medicinal Plants Used Traditionally for Treatment of Diabetes.

Pakistan Journal of Biological Sciences. 11(3):351–358.

Aly, A., A. Debbab, dan P. Proksch. 2011. Fifty Years of Drug Discovery from

Fungi. Fungal Divers. 50: 3–19.

Andayani, R., Y. Lisawati, dan Maimunah. 2008. Penentuan Aktivitas

Antioksidan, Kadar Fenolat total dan Likopen pada Buah Tomat

(Lycopersicum L.). Jurnal Sains dan Teknologi Farmasi. 13: 9

Arindah, D. 2010. Fraksinasi dan Identifikasi Golongan Senyawa pada Daging

Buah Pepino (Solanum muricatum Aiton) yang Berpotensi Sebagai

Antioksidan. Skripsi. Fakultas Sains dan Teknologi. UIN Malang.

Azizah, S.K. 2013. Aktivitas Antioksidan Ekstrak Isolat-Isolat Kapang dari

Tanaman Mangrove Avicennia sp. Skripsi. Fakultas Sains dan Teknologi.

Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta.

Bendra, A. 2012. Uji Aktivitas Antioksidan Ekstrak Daun Premma oblongata

Miq. dengan Metode DPPH dan Identifikasi Golongan Senyawa Kimia

dari Fraksi Teraktif. Skripsi. FMIPA. Universitas Indonesia.

Cano, J., J. Guarro, dan J. Gene. 2004. Molecular and Morphological

Identification of Colletotrichum Species of Clinical Interest. Journal Of

Clinical Microbiology. 42(6): 2450–2454.

Dewick, M. D. 2002. Medicinal Natural Product: A Biosynthetic Approach. Edisi

2. John Wiley dan Sons LTD. England.

Gandjar, I., W. Sjamsuridzal, dan A. Oetari. 2006. Mikologi Dasar dan Terapan.

Yayasan Obor Indonesia. Jakarta.

Gangadevi, V., dan J. Muthumary. 2008. Isolation of Colletotrichum

gloeosporioides, a Novel Endophytic Taxol-Producing Fungus From the

Leaves of a Medicinal Plant (Justicia gendarussa). Mycologia Balcanica.

5: 1–4.

Gul, M.Z., L.M. Bhakshu, F. Ahmad, A. K Kondapi, I.A. Qureshi, dan I. A

Ghazi. 2011. Evaluation of Abelmoschus Moschatus Extracts for

Antioxidant, Free Radical Scavenging Antimicrobial and

Antiproliferative Activities Using in Vitro Assays. BMC

Complementary & Alternative Medicine. 11:46

46

Hanani, E., A. Mun’in, dan R. Sekarini. 2005. Identifikasi Senyawa Antioksidan

dalam Spons Callyspongia sp dari Kepulauan Seribu. Majalah Ilmu

Kefarmasian. 2(3): 127-133.

Harmita. 2006. Buku Ajar Analisis Fisikokimia. Departemen Farmasi FMIPA UI.

Depok.

Hermanto, S. 2008. Mengenal Lebih Jauh Teknik Analisa Kromatografi dan

Spektofotometri. Pusat Laboratorium Terpadu UIN Syarif Hidayatullah.

Jakarta.

Jauhari, L.T. 2010. Seleksi dan Identifikasi Kapang Endofit Penghasil

Antimikroba Penghambat Pertumbuhan Mikroba Patogen. Skripsi. UIN

Syarif Hidayatullah. Jakarta.

Jayanthi, G., S. Kamairaj, K. Karthikeyan, dan J. Muthumary. 2011.

Antimicrobial and Antioksidan Activity of Cassia siamea Flowers

Phomopsis sp. GJJM07 isolated from Mesua ferrea. International Journal

of Science. 1:85-90.

Jun, M.H.Y., Yu, J., Fong, X., Wan, C.S., dan Yang, C.T. 2003. Comparison of

Antioxidant Activities of Isoflavones from Kudzu Root (Pueraria labata

Ohwl). Journal Food Science. 68(6): 2117– 2122.

Khopkar, S.M. 2003. Konsep Dasar Kimia Analitik. UI Press. Jakarta.

Komisi Nasional Sumber Daya Genetik. 2008. Lokakarya Penyusunan National

Report on Plant Genetic Resources : Warta Plasma Nutfah Indonesia No

20 Tahun 2008. http://indoplasma.or.id. Diakses pada 8 Oktober 2013

pukul 20.13 WIB

Lasmaria, C. 2011. Antioksidan yang Dihasilkan Kapang Aspergillus spp. dan

pengaruhnya Terhadap Perbaikan Jaringan Hati Tikus Putih (Rattus

norvegicus L.) Galur Sprague Dawley. Tesis. Program Pascasarjana. UI.

Depok.

Listiandiani, K. 2011. Identifikasi Kapang Endofit ES1, ES2, ES3,DAN ES4 dari

Broussonetia papyrifera Vent. dan Pengujian Aktivitas Antimikroba.

Skripi. FMIPA. Universitas Indonesia.

Liu, X., M. Dong, X. Chen, M. Jiang, X. Lu, dan G. Yan. 2007. Antioxidant

Activity and Phenolics of an Endophytic Xylaria sp. from Ginkgo biloba.

Food Chemistry. 105(2): 548–554.

Maehara, S., P. Simanjuntak, C. Kitamura, K. Ohashi, dan H. Shibuya. 2011.

Cinchona Alkaloids are Also Produced by an Endophytic Filamentous

Fungus Living in Cinchona Plant. Chem Pharm Bull. 59(8): 1073-1074.

http://indoplasma.or.id/berita/berita_2008_lokakarya_nationalreport_november20%0908.html

47

Mailandari, M. 2012. Uji Aktivitas Antioksidan Ekstrak Daun Garcinia kydia

Roxb. dengan Metode DPPH dan Identifikasi Senyawa Kimia Fraksi

yang Aktif. Skripsi. FMIPA. Universitas Indonesia.

Margiono, S. 2008. Produksi Metabolit Sekunder (Antibiotik) oleh Isolat Jamur

Endofit Indonesia. Majalah Farmasi Indonesia. 19(2): 86-94.

Miryanti, A., L. Sapei, K. Budion, dan S. Indra. 2011.Ekstraksi Antioksidan dari

Kulit Buah Manggis (Garcinia mangostana L.). Lembaga Penelitian dan

Pengabdian Masyarakat. Bandung.

Molyneux, P. 2004. The Use of The Stable Free Radical Diphenylpicryl-hydrazyl

(DPPH) for Estimating Antioxidant Activity. Journal of Science and

Technology. 26(2): 211-219.

Mutiea, D. 2014. Aktivitas Antibakteri dan Produksi Kuinin dari Kapang Endofit

(Colletotrichum spp.) Tanaman Kina (Cinchona calisaya Wedd.). Skripsi.

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta.

Nath, A., P. Raghunatha, dan S.R. Joshi. 2012. Diversity and Biological

Activities of Endophytic Fungi of Emblica officinalis, an Ethnomedicinal

Plant of India. Journal of Mycobiology. 40(1): 8-13

Nimah, S., W. F. Ma’ruf dan A. Trianto. 2012. Uji Bioaktivitas Ekstrak Teripang

Pasir (Holothuria scabra) Terhadap Bakteri Pseudomonas aeroginosa dan

Bacillus cereus. Jurnal Perikanan. 1(2): 1-9.

Oyi, A.R., J.A. Onaolapo, A.K. Haruna, dan C.O. Morah. 2007. Antimicrobial

Screening and Stability Studies of the Crude Exctract of Jatropha curcas

Linn. Latex (Euphorbiaceae). Nigerian Journal of Parmaceutical Science.

6(2):14-20.

Pavia D.L., G.M. Lampman, G.S. Kriz, dan R.G. Engel. 2006. Introduction to

Organic Laboratory Techniques: A Microscale Approach. Edisi 4. Brooks

Cole Pub Co. United Kingdom.

Pawle, G dan S.K. Singh. 2014. Antioxidant Potential of Endophytic Fungus

Colletotrichum Species Isolated From Polygala elongata. International

Journal of Pharma and Bio Sciences. 5(3): 313-319.

Pelczar, M.J., dan Chan. 2010. Dasar-Dasar Mikrobiologi. UI Press. Jakarta.

Petrini, O., T.N. Sieber, L. Toti, dan O. Viret. 1992. Ecology Metabolite

Production and Utilization in Endophytic Fungi. Swiss Naturs Toxins.

78:196

Pratiwi, S.T. 2008. Mikrobiologi Farmasi. Erlangga. Jakarta.

48

Pratiwi, D., S. Wahdaningsih, dan Isnidar. 2013. The Test of Antioxidant Activity

from Bawang Mekah Leaves (Eleutherine americana Merr.) Using DPPH

(2,2-Diphenyl-1-Picrylhydrazyl) Method. Traditional Medicine Journal.

18(1): 9-16.

Prihatiningtias, W. 2005. Senyawa Bioaktif Fungi Endofit Akar Kuning

(Fibraurea chloroleuca Miers) Sebagai Senyawa Antimikroba. Tesis.

Sekolah Pascasarjana. UGM.

Radji, M. 2005. Peranan Bioteknologi dan Mikroba Endofit dalam

Pengembangan Obat Herbal. Majalah Ilmu Kefarmasian. 2(3): 113-126.

Ravishankara, M.N., H. Padh dan M. Rajani. 2003. Antioxidant Activity of

Cinchona officinalis Stem Bark Exctract. Oriental Pharmacy and

Experience Medicine. 3(4): 205-211.

Robinson, T. 1995. Kandungan Organik Tumbuhan Tinggi. ITB Press. Bandung.

Rohman, A. 2009. Kromatografi untuk Analisis Obat. Graha Ilmu. Yogyakarta.

Rohman, A dan I.G. Gandjar. 2008. Kimia Farmasi Analisis. Pustaka Belajar.

Yogyakarta.

Salamah, E., P. Sri, dan P. Ellis. 2011. Aktivitas Antioksidan dan Komponen

Bioaktif pada Selada Air (Nasturtium offcinale L. R. Br). Jurnal

Pengolahan Hasil Perikanan Indonesia. 14(2): 85-91.

Saputri, R.E. 2013. Aktivitas Antioksidan Ekstrak Kapang Mangrove Rhizophora

sp. Skripsi. Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta.

Semangun, H. 2000. Penyakit-Penyakit Tanaman Perkebunan di Indonesia.

Gajah Mada University Press. Yogyakarta.

Seo, Y., K.E Park, Y.A. Kim, H.Y. Lee, J.S. Yoo, J.W. Ahn, dan B.J. Lee. 2006.

Isolation of Tetraprenyltolyquinols from the Brown Alga Sargasum

thunbergii. Chem Pharm Bull. 54(12): 1730-1733.

Setyaningsih, D., C. Pandji, dan D.D. Perwatasari. 2014. Kajian Aktivitas

Antiosidan dan Antimikroba Fraksi dan Ekstrak dari Ranting Jarak Pagar

(Jatropha curcas L.) serta Pemanfaatannya pada Produk Personal

Hygiene. Jurnal Agritech. 34(2).

Simanjuntak, P., T. Parwati, Bustanussalam, T.K. Prana, dan H. Shibuya. 2002.

Produksi Alkaloid Kuinina oleh Beberapa Mikroba Endofit dengan

Penambahan Zat Induser. Majalah Farmasi Indonesia. 13(1): 1-6.

49

Simanjuntak, P., Bustanussalam, T.K. Prana, K. Ohashi, dan H. Shibuya. 2002.

Biotransformasi Senyawa Alkaloid Kinkona oleh Kapang Xilaria sp.

Menjadi Alkaloid Kinkona N-Oksida. Majalah Farmasi Indonesia. 13(2):

95-100.

Srikandace, Y., Y. Hapsari, dan P. Simanjuntak. 2007. Seleksi Mikroba Endofit

Curcuma zedoaria dalam Memproduksi Senyawa Kimia Antimikroba.

Jurnal Ilmu Kefarmasian Indonesia. 5(2):77-84

Strobel, G. dan B. Daisy. 2003. Bioprospecting for Microbial Endophytes and

Their Natural Product. Microbiology and Molecular Biology. 67(4): 491-

502.

Sultoni, A. 1995. Petunjuk Kultur Teknis Tanaman Kina. Asosiasi Penelitian dan

Pengembangan Perkebunan Indonesia. Pusat Penelitian Teh dan Kina.

Gambung.

Sutrisno, W. 2012. Sintesis Senyawa Dimer Isoeugenol Menggunakan Enzim

Peroksidase dari Kulit Bawang Bombay (Allium cepa L.) Serta Uji

Aktivitas Antioksidan. Tesis. Magister Ilmu Kimia. UI.

Swantara, I.M.D., dan I.M.O.A. Parwata. 2011. Kajian Senyawa Antioksidan pada

Rumput Laut dari Pantai Sekitar Bali. The Exellence Research. 89-97.

Tahrir, I., K. Wijaya, dan D. Widianingsih. 2003. Terapan Analisis Hansch untuk

Aktivitas Antioksidan Senyawa Turunan Flavon/Flavonol. Seminar

Chemometrics. Universitas Gajah Mada.

Tamat, S.R., T. Wikanta., dan L.S. Maulina. 2007. Aktifitas Antioksidan dan

Toksisitas Senyawa Bioaktif dari Ekstrak Rumput Laut Hijau Ulva

reticulata Forsskal. Jurnal Ilmu Kefarmasian Indonesia. 5(1).

Tan, R.X., dan W.X. Zou. 2001. Endophytes: a Rich Source of Functional

Metabolites. Journal of Natural Product. 18: 448-459.

Tao, C dan M.C. Taylor. 2011. Cinchona linnaeus. Journal Flora China. 19: 88-

89.

Tianpanich, K., S. Prachya, S. Wiyakrutta, C. Mahidol, S. Ruchirawat, dan P.

Kittakoop. 2011. Radical Scavenging and Antioxidant Activities of

Isocoumarins and a Phthalide Endophytic Fungus Colletotrichum sp.

Journal of Natural Product. 74(1): 79–81.

Tjitrosoepomo, G. 2002. Taksonomi Tumbuhan (Spermatophyta). Gadjah Mada

University Press. Yogyakarta.

50

Vijayavel, K., C. Anbuselvam, dan M.P. Balasubramanian 2007. Antioxidant

Efect of the Marine Algae Chorella vulgaris Against Napthalene Induces

Oxidative Stress in the Albino Rats. Molecule Cell Biochemistry. 303(1-2)

39-44.

Widyastuti, N. 2010. Pengukuran Aktivitas Antioksidan dengan Metode

CUPRAC, DPPH, dan FRAP serta Korelasinya dengan Fenol dan

Flavonoid pada Enam Tanaman. Skripsi. FMIPA. IPB.

Winarno, E.K. 2006. Produksi Alkaloid oleh Mikroba Endofit yang Diisolasi dari

Batang Kina Cinchona Ledgeriana Moens dan Cinchona Pubescens Vahl

(Rubiaceae). Jurnal Kimia Indonesia. 1(2): 59-66.

Winarsi, H. 2007. Antioksidan Alami dan Radikal Bebas: Potensi dan Aplikasinya

Dalam Kesehatan. Kanisius. Yogyakarta.

58

Lampiran 2. Hasil kromatografi lapis tipis (KLT) ekstrak kapang endofit Colletotrichum spp.

Kode isolat Filtrat Biomassa

Rf Setelah

disemprot

DPPH

UV λ

254

UV λ 366 Rf Setelah

disemprot

DPPH

UV λ 254 UV λ 366

M1 (Colletotrichum sp.1) Rf=0,57 Rf=0,48

Rf=0,23

Rf=0,68 Rf=0,51

M2 (Colletotrichum sp.2) Rf=0,6

Rf=0,54

M3(Colletotrichum sp.3) Rf=0,46

Rf=0,34

Rf=0,43

Rf=0,37 Rf=0,31


Rf=0,6 Rf=0,54

59

Lampiran 3. (Lanjutan)


Rf Setelah

disemprot

DPPH

UV λ

254


disemprot

DPPH

UV λ 254 UV λ 366


Rf=0,51


Rf=0,2


Rf=0,2

M8 (Colletotrichum sp.8)

Rf=0,48

Rf=0,71

60



Rf Setelah

disemprot

DPPH

UV λ

254


disemprot

DPPH

UV λ 254 UV λ 366


Rf=0,68


Rf=0,82


Rf=0,25


Rf=0,68

61



Rf Setelah

disemprot

DPPH

UV λ

254


disemprot

DPPH

UV λ 254 UV λ 366


Rf=0,28

Rf=0,6


Rf=0,57

Vitamin C (kontrol) Rf=0,74

62

Lampiran 3. Hasil Uji Antioksidan

A. Tabel hasil uji antioksidan kapang Colletotrichum spp. ekstrak etil asetat (ekstraseluler)

Kode isolat Konsentrasi

(ppm)

∑

Absorbansi

%

Inhibisi

Persamaan regresi

linear

IC50

(ppm)

M1 150

300

600

1200

2400

0,147

0,139

0,125

0,113

0,066

39,506

43,004

48,560

53,704

72,840

y = 0,014x + 38,28

R² = 0,989

837,143

M2 150

300

600

1200

2400

0,181

0,176

0,142

0,099

0,051

20,485

22,467

37,445

56,608

77,753

y = 0,026x + 18,75

R² = 0,963

1201,923

M3 150

300

600

1200

2400

0,170

0,148

0,129

0,114

0,062

13,706

25,125

34,772

42,893

68,782

y = 0,022x + 16,30

R² = 0,961

1531,818

M4 150

300

600

1200

2400

0,118

0,107

0,099

0,084

0,062

28,788

35,455

40,303

49,091

62,424

y = 0,014x + 30,17

R² = 0,966

1416,423

M5 150

300

600

1200

2400

0,165

0,150

0,127

0,091

0,043

12,963

20,635

32,804

52,116

77,513

y = 0,028x + 13,07

R² = 0,976

1318,929

M6 150

300

600

1200

2400

0,145

0,139

0,125

0,109

0,058

7,962

11,783

20,382

30.892

63,057

y = 0,024x + 4,405

R² = 0,995

1899,792

M7

150

300

600

1200

2400

0,116

0,107

0,096

0,086

0,048

5,328

12,705

21,311

29,508

60,656

y = 0,023x + 4,251

R² = 0,986

1989,086

63



(ppm)

∑

Absorbansi

%

Inhibisi

Persamaan regresi

linear

IC50

(ppm)

M8 150

300

600

1200

2400

0,187

0,174

0,148

0,118

0,080

10,952

17,381

29,762

43,810

62,143

y = 0,022x + 12,29

R² = 0,954

1714,091

M30 150

300

600

1200

2400

0,178

0,171

0,155

0,120

0,082

9,898

13,452

21,32

39,086

58,629

y = 0,022x + 8,058

R² = 0,981

1906,454

M37 150

300

600

1200

2400

0,181

0,156

0,126

0,096

0,031`

15,258

26,995

40,845

55,164

85,446

y = 0,029x + 17,48

R² = 0,969

1121,379

M53 150

300

600

1200

2400

0,171

0,159

0,145

0,122

0,083

9,524

15,873

23,280

37,037

56,085

y = 0,020x + 9,656

R² = 0,981

2017,2

M57 150

300

600

1200

2400

0,117

0,107

0,100

0,084

0,046

4,508

12,705

18,443

31,148

62,295

y = 0,024x + 2,937

R² = 0,993

1960,958

M76 150

300

600

1200

2400

0,145

0,139

0,123

0,114

0,062

12,952

16,566

26,205

31,627

62,952

y = 0,021x + 10,09

R² = 0,980

1900,46

M82

150

300

600

1200

2400

0,137

0,137

0,123

0,086

0,055

12,739

13,057

21,656

45,541

65,287

y = 0,024x + 8,611

R² = 0,966

1724,541

64

B. Tabel hasil uji antioksidan kapang Colletotrichum spp. ekstrak metanol (intraseluler)


(ppm)

∑

Absorbansi

%

Inhibisi

Persamaan regresi

linear

IC50 (ppm)

M1 150

300

600

1200

2400

0,145

0,130

0,111

0,087

0,050

13,988

22,917

33,929

48,512

70,238

y = 0,023x + 15,74

R² = 0,965

1489,565

M2 150

300

600

1200

2400

0,197

0,177

0,159

0,120

0,076

5,529

14,904

23,798

42,548

63,702

y = 0,025x + 6,881

R² = 0,966

1724,760

M3 150

300

600

1200

2400

0,198

0,174

0,163

0,145

0,094

11,435

21,973

26,906

34,978

57,848

y = 0,018x + 13,17

R² = 0,969

2046,111

M4 150

300

600

1200

2400

0,195

0,168

0,154

0,125

0,069

10,959

23,516

29,680

43,151

68,493

y = 0,023x + 13,16

R² = 0,972

1601,739

M5 150

300

600

1200

2400

0,155

0,149

0,133

0,093

0,061

13,687

17,039

25,978

48,324

66,201

y = 0,024x + 11,91

R² = 0,961

1587,083

M6 150

300

600

1200

2400

0,178

0,164

0,162

0,123

0,087

7,772

15,026

16,062

36,269

54,922

y = 0,020x + 6,649

R² = 0,971

2167,55

M7

150

300

600

1200

2400

0,118

0,107

0,100

0,084

0,062

3,689

12,705

18,443

31,148

49,180

y = 0,019x + 5,328

R² = 0,969

2351,157

65



(ppm)

∑

Absorbansi

%

Inhibisi

Persamaan regresi

linear

IC50 (ppm)

M8 150

300

600

1200

2400

0,168

0,159

0,142

0,115

0,087

9,189

14,324

23,514

38,108

53,243

y = 0,019x + 9,729

R² = 0,959

2119,526

M30 150

300

600

1200

2400

0,143

0,132

0,125

0,115

0,068

8,917

15,924

20,382

26,752

56,688

y = 0,019x + 7,258

R² = 0,975

2249,579

M37 150

300

600

1200

2400

0,120

0,111

0,103

0,089

0,059

6,589

13,953

20,155

31,395

54,651

y = 0,020x + 6,395

R² = 0,990

2180,25

M53 150

300

600

1200

2400

0,187

0,175

0,164

0,138

0,094

2,865

8,854

14,844

28,125

51,302

y = 0,021x + 1,671

R² = 0,995

2301,381

M57 150

300

600

1200

2400

0,166

0,153

0,142

0,127

0,071

6,497

13,559

19,774

28,531

59,887

y = 0,022x + 4,649

R² = 0,987

2061,409

M76 150

300

600

1200

2400

0,184

0,170

0,153

0,122

0,091

4,427

11,458

20,573

36,719

52,865

y = 0,021x + 5,718

R² = 0,955

2227,15

M82 150

300

600

1200

2400

0,142

0,131

0,114

0,087

0,058

5,034

12,081

23,490

41,946

61,409

y = 0,024x + 5,928

R² = 0,959

1836,333

66

y = 13.89x - 2.3521

R² = 0.9913

0

10

20

30

40

50

60

0 2 4 6

% I

nh

ibis

i

Konsentrasi (ppm)

Series1

Linear

(Series1)

C. Tabel hasil uji aktivitas antioksidan vitamin C.

Konsentrasi (ppm) ∑ Absorbansi % Inhibisi IC50 (ppm)

0,25 0,229 1,986

3,769

0,5 0,220 6,525

1 0,212 9,929

2 0,181 22,837

4 0,107 54,610

D. Kurva regresi linearitas vitamin C.

POTENSI ANTIOKSIDAN FILTRAT DAN BIOMASSA … · Cinchona officinalis . memiliki aktivitas...

Documents

Transcript of POTENSI ANTIOKSIDAN FILTRAT DAN BIOMASSA … · Cinchona officinalis . memiliki aktivitas...