ANALITICAL BIOCHEMISTRY

POSSIBLE QUESTIONPENDAHULUAN & KROMATOGRAFI1. Bagaimana cara membersihkan glassware?a. Berlemak ( direndam dengan kloroform atau benzene lalu direndam semalam dengan asam kromat.b. Sangat kotor ( dicuci dengan campuran nitrit pekat dan asam sulfat.c. Setelah dicuci (a atau b) kemudian dialiri dengan air keran lalu dibilas dengan akuades.d. Glassware biasa dapat dikeringkan dengan oven, tetapi untuk glassware ukur (volumetric) dicuci dengan alkohol lalu dikeringanginkan.2. Sebutkan dasar pemisahan kromatografi!

Memisahkan molekul berdasarkan massa, ukuran, bentuk, muatan, dan daya adsorbsi.3. Sebutkan 3 komponen sistem kromatografi!

a. Campuran yang akan dipisahkan

b. Fase diam

c. Fase gerak

4. Sebutkan tipe-tipe kromatografi! a. Gel filtration ( ukuran ( semakin besar, semakin cepat keluar dari kolom (kebalikan proses penyaringan).

b. Adsorbtion chromatography ( daya tempel pada fase diam dan gerak ( yang menempel pada adsorben lebih lama dipisahkan.

c. Ion exchange ( muatan

Buffer 1 ( keelektronegatifan lebih rendah dari bead, supaya molekul biru dan ungu tetap menempel pada bead.Buffer 2 ( keelektronegatifan lebih tinggi dari buffer 1 dan lebih rendah dari bead, supaya molekul biru tetap menempel pada bead..Buffer 3 ( keelektronegatifan lebih tinggi dari buffer 2 dan bead.d. Partition: paper and TLC ( kelarutan terhadap solvent (fase gerak); senyawa polar larut pada solvent polar, dan sebaliknya.Perbedaannya:Paper (kertas; spot kurang kompak; tidak dapat menggunakan pereaksi semprot yang bersifat korosif (kertas bolong-bolong laaah (); pemisahan senyawa lebih lama.TLC ( plat silica (polar); spot kompak; bisa pakai pereaksi semprot; pemisahan senyawa lebih cepat.e. Gas ( kecepatan menguap; sampel bersifat volatile (mudah menguap)

5. Apa perbedaan adsorbtion, absorbtion, dan adsorben?Adsorption (chem.) ( The taking up of one substance at the surface of another ( substansi menempel pada permukaan substansi yang lain.

Absorption (chem.) ( Penetration of a substance into the body of another ( masuknya substansi ke dalam substansi lain.

Adsorbent (chem.)( The substance, either solid or liquid, on whose surface adsorption of another substance takes place ( substansi yang permukaannya ditempeli oleh substansi lain.

Chamber Dictionary of Science and Technology. Chambers Edinburgh.6. Apa keunggulan pemisahan makromolekul menggunakan kromatografi?

Tidak menggunakan temperatur dan pH ekstrem, pelarut organik, agen pengoksidasi/pereduksi, sehingga molekul yang dipisahkan tidak mengalami kerusakan aktivitas biologi ( tidak merubah struktur secara irreversible.

ISOLASI DNA

1. Jelaskan tahapan isolasi DNA!

a. Disruption and lyses of the starting materialb. Removal of proteins and other contaminants and finallyc. Recovery of the DNA 2. Sebutkan bahan yang digunakan pada tahap lisis, presipitasi, washing, dan resuspention! Jelaskan fungsinya!a. Lisis Plant cell ( grinding + liquid N ( melisis dinding sel, menginaktifasi enzim yang berperan dalam sintesis fenol (menurunkan aktivitas browning) Buffer lisis (Tris-HCl, SDS, EDTA, proteinase K) ( Tris-HCl: buffer, supaya DNA tidak mengalami shock pH; SDS: melisis membran; EDTA: mengikat ion logam/kovaktor enzim; proteinase K: melisis protein, inaktivasi nuclease). b. Presipitasi

I: PCIA (phenol chloroform isoamyl alcohol) ( memisahkan DNA dengan bagian sel yang lain. II: Salt ( mengubah ikatan H antara air dan fosfat, sehingga DNA tidak larut dalam air. III: Etanol ( mengubah struktur DNA sehingga mengalami presipitasi.

c. Washing

EtOH 70% dingin ( menghilangkan garam-garam pada saat presipitasi.

d. Resuspention

Jika DNA langsung dipakai ( pakai air

Jika DNA akan disimpan lama ( Buffer TE 3. Apa pertimbangan pemilihan metode isolasi DNA?4. Bagaimana cara mengukur konsentrasi dan kemurnian DNA?5. Apa saja faktor yang mempengaruhi keberhasilan isolasi DNA?

Pengeringan setalah washing, agar etOH tidak mengganggu proses PCR.

BUKA LAPORAN MASING-MASING (PCR

1. Apa prinsip PCR?

2. Sebutkan komponen PCR dan jelaskan fungsinya!

3. Jelaskan tahapan PCR!

4. Mengapa perlu suhu yang berbeda-beda?

Suhu optimal untuk setiap tahapan berbeda.5. Mengapa proses denaturasi pertama lebih lama daripada siklus selanjutnya?

Karena DNA yang akan didenaturasi masih panjang, sedangkan untuk siklus selanjutnya sudah pendek (sekuens DNA target/amplimer/amplicon).

6. Faktor apa saja yang perlu dioptimasi saat PCR?

Konsentrasi MgCl, primer, dNTPs, enzim polymerase Suhu annealing7. Jelaskan syarat primer yang baik!8. Apa perbedaan PCR dan RAPD?

PCR ( 2 primer (Reverse dan Forward); ukuran primer 16-20 bp; suhu annealing 55oC; penempelan primer spesifik; Mg rendah (jika tinggi, maka spesifisitas penempelan primer turun); amplifikasi gen spesifik; reprodusibilitas lebih tinggi dari RAPD. RAPD ( one and only; 10 bp; lebih rendah dari PCR 35oC; penempelan primer tidak spesifik (random); Mg harus tinggi; analisis polimorfism/variasi pada genome; reprodusibilitas lebih rendah dari PCR.ELEKTROFORESIS

1. Apa prinsip kerja elektroforesis?2. Sebutkan jenis-jenis elektroforesis!

3. Mengapa DNA/RNA/protein dapat bergerak pada gel elektroforesis?

Mereka bermuatan negatif (DNA & RNA memiliki gugus pospat; protein yang terdenaturasi oleh SDS) akan bergerak menuju kutub positif (anode) akibat adanya aliran listrik.

4. Jelaskan faktor yang mempengaruhi kecepatan migrasi molekul pada gel elektroforesis!

5. Sebutkan komponen elektroforesis dan jelaskan fungsinya!

6. Sebutkan cara visualisasi hasil elektroforesis!

7. Jelaskan perbedaan elektroforesis gel agarose dan SDS-PAGE? Elektroforesis gel agarose ( gelnya agarose; porinya lebih besar; pemisahan secara horizontal; sampel DNA dan RNA; pewarna (dicampur di gel atau direndam setelah running): EtBr atau good view. SDS-PAGE ( gelnya akrilamid dan bis-akrilamid, stacking dan resolving; porinya lebih kecil; pemisahan secara vertikal; sampel protein; pewarnaan: staining dengan comassie blue, destaining dengan MeOH.8. Jelaskan perbedaan Native PAGE dan SDS-PAGE! Native PAGE: protein yang dipisahkan masih fungsional (masih terasosiasi, subunit2 yang berbentuk seperti aslinya); pergerakannya tidak konsisten tetapi tetap digunakan untuk analisis lebih lanjut (misal: aktivitas enzim).

SDS-PAGE: protein terdenaturasi (menjadi untaian linear dan terpisahkan menjadi komponen subunitnya).ANALISIS PROTEIN

1. Mengapa perlu dilakukan analisis protein?

2. Jelaskan tahapan analisis protein!

3. Sebutkan bahan-bahan yang diperlukan dalam analisis protein!

4. Jelaskan mekanisme deteksi ekspresi protein dengan Western Blotting!

5. Jelaskan metode deteksi protein hasil WB!6. Jelaskan faktor-faktor yang mempengaruhi keberhasilan blotting! (slide 27) Buffer ( bergantung blotting yang digunakan; semi-dry blotter ( three buffer; wet blotter ( Towbins buffer. MeOH ( perendam membran; meningkatkan afinitas protein pada membran; menghambat elusi protein dari gel; 5% PVDF membrane; 10-20% nitrocellulose membrane. Voltase atau arus konstan ( bergantung ketebalan filter; wet blotter perlu lebih tinggi voltase dan arus daripada semi-dry. Contact between gel, membrane, and filters ( pemberian penekanan yang rata pada membran (misal: pada 5 tempat) dapat menghasilkan hasil yang bagus; jika digulung maka hasilnya tidak rata atau muncul gelembung. 7. Apa fungsi Mass Spectrophotometry (MS) dalam analisis protein?