PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI - core.ac.ukcore.ac.uk/download/pdf/45362060.pdfPRAKATA...

SITOTOKSISITAS FRAKSI PROTEIN DAUN MIMBA

(Azadirachta indica A. Juss) FP10, FP20, FP30, DAN FP40 TERHADAP

KULTUR SEL HeLa

SKRIPSI

Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)

Program Studi Ilmu Farmasi

Oleh:

Lestarining Wahyu Ndadari

NIM: 038114029

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SANATA DHARMA

YOGYAKARTA

2007

i

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

SITOTOKSISITAS FRAKSI PROTEIN DAUN MIMBA

(Azadirachta indica A. Juss) FP10, FP20, FP30, DAN FP40 TERHADAP

KULTUR SEL HeLa

SKRIPSI

Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)

Program Studi Ilmu Farmasi

Oleh:

Lestarining Wahyu Ndadari

NIM: 038114029

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SANATA DHARMA

YOGYAKARTA

2007

ii


HALAMAN PERSEMBAHAN

Ia membuat segala sesuatu indah pada waktunya, bahkan

Ia memberi kekekalan dalam hati mereka. Tetapi manusia

tidak dapat menyelami pekerjaan yang dilakukan Allah

dari awal sampai akhir. Pengkhotbah 3 : 11

Ku persembahkan karyaku ini kepada: Tuhan Yesus Kristus atas Kasih dan KaryaNya yang luar biasa dalam

hidupku Bapak dan Ibu yang menyayangiku dengan seluruh dukungan, restu

dan doa yang selalu menyertaiku Semua teman-teman dan Almamaterku

v


PRAKATA

Puji dan syukur kepada Tuhan Yang Maha Esa atas karunia dan

anugerahNya sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi yang berjudul

“Sitotoksisitas Fraksi Protein Daun Mimba (Azadirachta indica A. Juss) FP10,

FP20, FP30, dan FP40 terhadap Kultur Sel HeLa” sebagai salah satu syarat untuk

memperoleh gelar sarjana pada Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma.

Penulisan skripsi ini tidak mungkin terwujud tanpa adanya bimbingan,

bantuan dan dukungan dari berbagai pihak yang senantiasa meluangkan waktu

dan pikirannya. Oleh karena itu, pada kesempatan ini penulis ingin mengucapkan

terima kasih yang sebesar-besarnya kepada:

1. Rita Suhadi, M.Si., Apt., selaku dosen dan dekan Fakultas Farmasi Universitas

Sanata Dharma yang bersedia berbagi ilmu dan pengalaman klinis.

2. Drs. A. Yuswanto, Ph.D., S.U., Apt., yang telah memberikan bimbingan,

pengarahan, dan semangat selama penelitian dan penyusunan skripsi.

3. Drs. Mulyono, Apt., yang bersedia berdiskusi dan memberikan saran sebagai

dosen penguji skripsi. yang bersedia meluangkan waktu dan memberikan

masukan dalam menyelesaikan permasalahan.

4. dr. Luciana Kuswibawati, M. Kes., yang memberikan saran sebagai dosen

penguji skripsi.

5. Ign. Y. Kristio Budiasmoro, M.Si. yang membantu dalam pengolahan statistik

dan determinasi tanaman.

vi


6. Dosen dan karyawan Fakultas Farmasi yang telah banyak memberikan

sumbangan ilmu dan tenaga.

7. Kedua orang tua, Bapak Wahjudi dan Ibu J. Endang Lestari serta keluarga

besar atas doa, cinta, nasehat, semangat dan perhatian kepada penulis.

8. Bapak Rajiman, Mbak Yuli, Mbak Istini, Heni, Mas Dwi, segenap karyawan

dan staf Laboratorium Ilmu Hayati UGM yang telah banyak membantu dan

membimbing selama penelitian skripsi ini.

9. Nike, yang telah menjadi teman dan sahabat yang berharga yang Tuhan Yesus

anugerahkan bagi penulis dalam suka, duka, tangis dan tawa ceria.

10. Teman-teman PMK Apostolos yang menjadi keluarga untuk berbagi suka dan

keluh kesah, kekuatan yang menopang dan menarik kembali saat jauh

dariNya, dan semangat dalam pelayanan, dalam mereka kelembutan kasih

Tuhan terpancar.

11. Teman-teman Komunitas Tari Genta Rakyat atas kebersamaan yang indah

dalam perjalanan yang mengagumkan untuk menemukan jati diri. Dance with

our Soul.

12. Leea, Vita, Sari, Lucy, Melon, Ana, Jenny (kelompok Mimba) dan Mila, Wati,

Ratih, Agnes (kelompok Teki) untuk diskusi, kerjasama, dan sebagai teman

seperjuangan suka maupun duka dalam menyelesaikan penyusunan skripsi ini.

13. Seluruh angkatan 2003 Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma

khususnya kelas A kelompok B atas kebersamaan kita dalam setiap belajar di

kelas maupun di luar kelas dan praktikum yang penuh dengan tantangan,

ketegangan dan keceriaan.

vii


14. Semua pihak yang telah memberikan dukungan baik moral maupun material

yang tidak dapat disebutkan satu persatu.

Penulis menyadari masih banyak kekurangan baik dalam isi, bahasa maupun

penulisan skripsi ini. Untuk itu, penulis mengharapkan koreksi dan saran dari

seluruh pembaca untuk lebih menyempurnakan tulisan ini. Penulis berharap

semoga skripsi ini bermanfaat dan memberikan sumbangan bagi ilmu

pengetahuan.

Penulis

viii


INTISARI

Terapi alternatif yang mulai digunakan untuk penyakit kanker adalah dengan daun mimba (Azadirachta indica A. Juss). Hasil penelitian sebelumnya fraksi protein daun mimba hasil pengendapan dengan amonium sulfat 30% dan 60% memiliki efek sitotoksik terhadap kultur sel HeLa. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengetahui sitotoksisitas fraksi protein daun mimba FP10, FP20, FP30 dan FP40 terhadap kultur sel HeLa dan sel Vero.

Penelitian ini adalah penelitian eksperimental murni rancangan acak lengkap pola satu arah. Fraksi protein diendapkan menggunakan amonium sulfat dalam berbagai tingkat kejenuhan dan konsentrasi. Uji sitotoksisitas dilakukan terhadap sel HeLa dan sel Vero secara in vitro menggunakan metode MTT (3-(4,5-dimetil-tiazol-2-il)-2,5-dipheniltetrazolium bromide). Hasil uji berupa prosentase kematian sel. Analisis statistik dengan analisis probit dilakukan untuk mengetahui nilai LC50 dan uji t-independent sample untuk membandingkan sitotoksisitas fraksi protein daun mimba terhadap sel HeLa dan sel Vero.

Hasil uji sitotoksisitas menunjukkan bahwa FP10, FP20, FP30 dan FP40 sitotoksik terhadap sel HeLa dan sel Vero. Nilai LC50 FP10, FP20, FP30 dan FP40 terhadap sel HeLa berturut-turut sebesar 1,5.107 µg/ml; 6.10-3 µg/ml; 3,7.10-13 µg/ml dan 1,8.10-2 µg/ml; sedangkan terhadap sel Vero berturut-turut sebesar 1,2.10-3 µg/ml; 1,2.104 µg/ml; 1,2.10-2 µg/ml dan 2,3.1011 µg/ml. Uji t-independent sample menunjukkan bahwa seluruh fraksi protein daun mimba memiliki perbedaan sitotoksisitas yang tidak signifikan antara sel HeLa dan sel Vero. FP10, FP20, FP30 dan FP40 daun mimba tidak berpotensi untuk dikembangkan sebagai antikanker.

Kata kunci : daun mimba, sitotoksisitas, fraksi protein, LC50, sel HeLa, sel Vero

x


ABSTRACT Neem leaves (Azadirachta indica A. Juss) is now being used as alternative

therapy for cancer. Previous research showed that protein fraction of neem leaves which were precipitated using ammonium sulphate in concentration of 30% and 60% had cytotoxic activity against HeLa cells. This research aim to investigate the cytotoxicity of protein fraction of neem leaves PF10, PF20, PF30, and PF40 against HeLa and Vero cells (normal cells).

This research was pure experimental research with the complete random and one way design. Protein fractions were precipitated with ammonium sulphate in various saturation grades. The cytotoxicity test was determined against HeLa cells and Vero cells in vitro using MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide) method. Data collected was cell death percentage. Data were statistically analysis by probit analysis to determined the LC50 values and independent samples t-test was used to identify whether the protein fractions have selectivity to HeLa cells.

The result indicated that PF10, PF20, PF30, and PF40 of neem leaves show cytotoxic activity to HeLa and Vero cells. LC50 of PF20, PF30, and PF40 against HeLa cells are 1,5.107 µg/ml; 6.10-3 µg/ml; 3,7.10-13 µg/ml and 1,8.10-2 µg/ml respectively; whereas LC50 of PF10, PF20, PF30 and PF40 against Vero cells are 1,2.10-3 µg/ml; 1,2.104 µg/ml; 1,2.10-2 µg/ml and 2,3.1011 µg/ml. The results of independent samples t-test showed that all protein fraction of neem leaves have no significant difference of cytotoxicity between HeLa and Vero cells. In conclusion, PF10, PF20, PF30, and PF40 of neem leaves were not recommended to be developed as anticancer.

Keywords: neem leaves, cytotoxicity, protein fraction, LC50, HeLa cells, Vero cells

xi


DAFTAR ISI

Halaman

HALAMAN JUDUL ......................................................................... ii

HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING ................................ iii

HALAMAN PENGESAHAN ........................................................... iv

HALAMAN PERSEMBAHAN ........................................................ v

PRAKATA ......................................................................................... vi

PERNYATAAN KEASLIAN KARYA ............................................ ix

INTISARI .......................................................................................... x

ABSTRACT ......................................................................................... xi

DAFTAR ISI ...................................................................................... xii

DAFTAR TABEL .............................................................................. xvi

DAFTAR GAMBAR ......................................................................... xviii

DAFTAR LAMPIRAN ...................................................................... xix

ARTI SINGKATAN DAN ISTILAH ASING .................................. xx

BAB I PENGANTAR ........................................................................ 1

A. Latar Belakang ....................................................................... 1

1. Permasalahan ................................................................... 3

2. Keaslian penelitian ........................................................... 3

3. Manfaat penelitian ........................................................... 4

B. Tujuan Penelitian ................................................................... 4

Tujuan umum ......................................................................... 4

Tujuan khusus ........................................................................ 4

xii


BAB II PENELAAHAN PUSTAKA ................................................ 5

A. Tanaman Mimba (Azadirachta indica A. Juss.) .................... 5

1. Nama daerah .................................................................... 5

2. Deskripsi tanaman ............................................................ 5

3. Kandungan kimia ............................................................. 6

4. Penelitian terhadap tanaman mimba ................................ 6

B. Protein .................................................................................... 7

1. Pengertian protein ............................................................ 7

2. Jenis protein berdasarkan kelarutan ................................. 8

3. Pemurnian protein ............................................................ 9

4. Pengukuran konsentrasi protein ....................................... 11

C. Kanker .................................................................................... 11

1. Definisi ............................................................................. 11

2. Proses terjadinya kanker .................................................. 13

3. Kanker leher rahim .......................................................... 18

D. Kultur Sel ............................................................................... 19

1. Sel HeLa ........................................................................... 20

2. Sel Vero ........................................................................... 21

E. Uji Sitotoksisitas In vitro ....................................................... 21

F. Landasan Teori ....................................................................... 23

G. Hipotesis ................................................................................ 24

BAB III METODOLOGI PENELITIAN .......................................... 25

A. Jenis dan Rancangan Penelitian ............................................. 25

xiii


B. Variabel-variabel Penelitian ................................................... 25

C. Definisi Operasional .............................................................. 26

D. Bahan atau Materi Penelitian ................................................. 26

E. Alat-alat Penelitian ................................................................. 27

F. Tatacara Penelitian ................................................................. 28

1. Determinasi tanaman ....................................................... 28

2. Pengumpulan daun mimba ............................................... 28

3. Sterilisasi alat dan bahan .................................................. 28

4. Pembuatan fraksi protein dari daun mimba ..................... 28

5. Pengukuran konsentrasi protein total ............................... 31

6. Propagasi dan panen sel HeLa ......................................... 31

a. Propagasi sel HeLa .................................................... 31

b. Panen sel HeLa .......................................................... 32

7. Propagasi dan panen sel Vero .......................................... 32

a. Propagasi sel Vero ..................................................... 32

b. Panen sel Vero ........................................................... 33

8. Uji sitotoksisitas terhadap sel HeLa dan sel Vero ........... 33

a. Uji sitotoksisitas dengan metode MTT terhadap sel

HeLa .......................................................................... 33

b. Uji sitotoksisitas dengan metode MTT terhadap sel

Vero ............................................................................ 34

G. Analisis Hasil ......................................................................... 35

xiv


BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN ........................................... 36

A. Preparasi Fraksi Protein Daun Mimba ................................... 36

B. Penetapan Konsentrasi Fraksi Protein ................................... 38

C. Uji Sitotoksisitas Fraksi Protein ............................................ 39

BAB V KESIMPULAN DAN SARAN ............................................ 53

A. Kesimpulan ............................................................................ 53

B. Saran ...................................................................................... 53

DAFTAR PUSTAKA ........................................................................ 54

LAMPIRAN ....................................................................................... 58

BIOGRAFI PENULIS ....................................................................... 102

xv


DAFTAR TABEL

Halaman

Tabel I. Prosentase kematian dari uji sitotoksisitas fraksi protein

terhadap sel HeLa ...................................................... 44

Tabel II. Prosentase kematian dari uji sitotoksisitas fraksi protein

terhadap sel Vero ....................................................... 46

Tabel III. Volume larutan ekstrak gubal protein daun mimba ... 58

Tabel IV. Absorbansi fraksi protein pada panjang gelombang

280 nm dan 260 nm .................................................... 60

Tabel V. Hasil uji sitotoksik fraksi protein daun mimba FP10

terhadap kultur sel HeLa ............................................ 61

Tabel VI. Hasil uji sitotoksik fraksi protein daun mimba FP20


Tabel VII. Hasil uji sitotoksik fraksi protein daun mimba FP30


Tabel VIII. Hasil uji sitotoksik fraksi protein daun mimba FP40


Tabel IX. Hasil uji sitotoksik fraksi protein daun mimba FP10

terhadap kultur sel Vero ............................................. 63

Tabel X. Hasil uji sitotoksik fraksi protein daun mimba FP20


xvi


Tabel XI. Hasil uji sitotoksik fraksi protein daun mimba FP30


Tabel XII. Hasil uji sitotoksik fraksi protein daun mimba FP40


xvii


DAFTAR GAMBAR

Halaman

Gambar 1. Reaksi reduksi MTT menjadi formazan .................... 22

Gambar 2. Foto sel HeLa dan sel Vero tanpa perlakuan ............. 41

Gambar 3. Foto sel HeLa dan sel Vero setelah perlakuan ........... 42

Gambar 4. Foto kristal formazan ungu ........................................ 42

Gambar 5. Grafik prosentase kematian sel HeLa ........................ 44

Gambar 6. Grafik prosentase kematian sel Vero ......................... 47

Gambar 7. Foto tanaman Azadirachta indica A. Juss .................. 98

Gambar 8. Foto daun Azadirachta indica A. Juss ....................... 98

Gambar 9. Foto Hi-Mac Sentrifuge HITACHI SCP85 ................ 99

Gambar 10. Foto ELISA reader SLT 340ATC ............................. 99

Gambar 11. Foto Mikroskop (Olympus IMT-2) ............................ 99

Gambar 12. Foto perlakuan dengan sel HeLa dalam 96 well plate 100

Gambar 13. Foto perlakuan dengan sel Vero dalam 96 well plate 100

xviii


DAFTAR LAMPIRAN

Halaman

Lampiran 1. Jumlah penambahan amonium sulfat ........................ 58

Lampiran 2. Perhitungan konsentrasi protein ................................. 60

Lampiran 3. Absorbansi sel dengan metode MTT ......................... 61

Lampiran 4. Hasil analisis probit LC50 fraksi protein terhadap sel

HeLa ........................................................................... 66

Lampiran 5. Hasil analisis probit LC50 fraksi protein terhadap sel

Vero ............................................................................ 78

Lampiran 6. Hasil distribusi data dengan Uji Kolmogorov-Smirnov 90

Lampiran 7. Hasil analisis Uji t-independent sample ..................... 94

Lampiran 8. Foto tanaman dan daun mimba

(Azadirachta indica A. Juss) ...................................... 98

Lampiran 9. Foto Hi-Mac Sentrifuge HITACHI SCP85H, ELISA

reader SLT 340ATC dan mikroskop

(Olympus IMT-2) ....................................................... 99

Lampiran 10. Foto hasil uji sitotoksik fraksi protein daun mimba

FP40 terhadap kultur sel HeLa dan sel Vero dalam

96 well plate ............................................................... 100

Lampiran 11. Surat determinasi tanaman ......................................... 101

xix


ARTI SINGKATAN DAN ISTILAH ASING

continous cell lines : sel yang berasal dari sel primer yang ditumbuhkan terus

menerus

ELISA : Enzyme Link Immunosorbent Assay

FP10 (PF10) : fraksi protein (protein fraction) daun mimba hasil

pengendapan dengan amonium sulfat 10% jenuh

FP20(PF20) : fraksi protein (protein fraction) daun mimba hasil






FBS : Foetal Bovine Serum

MTT : 3-(4,5-dimetil-tiazol-2-il)-2,5-dipheniltetrazolium bromide)

reagen stopper : reagen yang terdiri dari larutan SDS 10% dalam HCl 0,01N

RPMI : Rosswell Park Memorial Institute

SDS : Sodium Dodesil Sulfat

tissue culture flask : tempat untuk menumbuhkan sel, berbentuk botol dengan

leher bengkok

96 well plate : sumuran mikro yang terdiri dari 96 lubang tempat menanam

sel pada uji sitotoksisitas

xx


1

BAB I

PENGANTAR

A. Latar Belakang

Kanker memiliki reputasi sebagai penyakit yang mematikan (Anonim,

2005b). Dalam daftar Badan Kesehatan Dunia penyakit kanker masuk dalam

urutan teratas dari kelompok penyakit. Di seluruh dunia penyakit kanker

menempati urutan kedua setelah penyakit jantung, sedangkan di Indonesia masuk

urutan keenam sebagai penyakit penyebab kematian. Penyakit kanker

diperkirakan diidap oleh 15 orang per 100.000 penduduk di dunia (Mulyadi,

1996). Sampai saat ini penyakit kanker masih menjadi ancaman, sementara obat

spesifik untuk menghentikan perkembangan sel kanker belum juga ditemukan

(Hartono, 1999).

Upaya pencegahan terus diusahakan dengan berbagai terapi seperti

pembedahan, radiasi dan sitostatika. Namun terapi-terapi tersebut membutuhkan

biaya yang besar dan menimbulkan efek samping yang merugikan bagi penderita

sehingga sebagian penderita lebih memilih terapi alternatif. Guna menakar

besarnya manfaat dan risiko terapi alternatif, sangat diperlukan pemahaman

tentang cara kerja terapi alternatif, termasuk penggunaan suplemen makanan

(senyawa antioksidan serta vitamin mineral) dan preparat herbal yang dapat

bekerja melawan kanker (Hartono, 1999).

Pada umumnya antineoplastik menekan pertumbuhan atau proliferasi sel

dan menimbulkan toksisitas. Suatu antikanker diharapkan memiliki toksisitas

1


2

selektif artinya menghancurkan sel kanker tanpa merusak sel jaringan normal

(Ganiswarna, 1995). Oleh sebab itu, penelitian-penelitian menggunakan bahan-

bahan yang berasal dari alam misalnya tanaman, diharapkan dapat menjadi terapi

antikanker alternatif yang bersifat selektif. Daun yang berasal dari tanaman

mimba (Azadirachta indica A. Juss) telah lama diketahui memiliki banyak

manfaat dalam dunia kesehatan antara lain, sebagai antiinflamasi, antirematik,

antipiretik, penurun gula darah, antitukak lambung, hepatoprotektor,

imunopotensiasi, antifertilitas, antivirus, dan antikanker (Sukrasno, 2003).

Penelitian tentang efek sitotoksik fraksi protein daun mimba terhadap

kultur sel kanker telah dilakukan antara lain, fraksi total protein daun mimba

terhadap kultur sel Raji (Ariyani, 2004), terhadap kultur sel SiHa (Lusia, 2004),

terhadap kultur sel HeLa (Febriani, 2004), fraksi protein daun mimba hasil

pengendapan dengan amonium sulfat 30%; 60% dan 100% jenuh terhadap kultur

sel Myeloma (Hariadi, 2006), terhadap kultur sel SiHa (Candra, 2006), terhadap

kultur sel Raji (Robbyono, 2006), dan terhadap kultur sel HeLa (Suwanto, 2006).

Suatu senyawa dapat dinyatakan memiliki potensi untuk dikembangkan

sebagai antikanker apabila mempunyai nilai LC50 ≤ 20 µg/ml (Suffness and

Pezzuto, 1991) dan bersifat toksik selektif (Ganiswarna, 1995). Berdasarkan

penelitian yang dilakukan oleh Suwanto (2006) diketahui bahwa fraksi protein

daun mimba (Azadirachta indica A. Juss) hasil pengendapan dengan amonium

sulfat 30%; 60% dan 100% jenuh memiliki efek sitotoksik terhadap kultur sel

HeLa terutama pada fraksi 30% dan 60% dengan nilai LC50 sebesar 1,0 µg/ml dan

4,1 µg/ml sehingga memiliki potensi untuk dikembangkan sebagai senyawa


3

antikanker. Namun, penelitian yang dilakukan oleh Suwanto (2006) tersebut perlu

dilakukan penelitian dengan fraksinasi yang lebih kecil dan seri konsentrasi yang

lebih banyak untuk mengetahui secara lebih spesifik fraksi protein yang bersifat

sitotoksik terhadap sel HeLa serta keselektifan efek sitotoksiknya terhadap sel

normal. Oleh karena itu, pada penelitian kali ini akan dilakukan fraksinasi

proteinnya dengan pengendapan menggunakan amonium sulfat dengan fraksi

yang lebih kecil yaitu 10% (FP10), 20%(FP20), 30% (FP30) dan 40% (FP40) jenuh

dengan harapan dapat diperoleh hasil yang lebih spesifik dan membandingkan

sitotoksisitasnya terhadap sel Vero (sel normal).

1. Permasalahan

a. Diantara fraksi protein daun mimba FP10, FP20, FP30 dan FP40, manakah

yang mempunyai sitotoksisitas terhadap sel HeLa dan sel Vero ?

b. Berapakah nilai LC50 dari fraksi protein daun mimba FP10, FP20, FP30 dan

FP40 terhadap sel HeLa dan sel Vero ?

c. Apakah fraksi protein daun mimba FP10, FP20, FP30 dan FP40 dapat

dikembangkan sebagai antikanker ?

2. Keaslian penelitian

Sebelumnya pernah dilakukan penelitian mengenai sitotoksisitas fraksi

protein daun mimba (Azadirachta indica A. Juss.) hasil pengendapan dengan

amonium sulfat 30%, 60% dan 100% jenuh terhadap kultur sel HeLa (Suwanto,

2006). Sejauh yang diketahui penulis belum pernah dilakukan penelitian

sitotoksisitas fraksi protein daun mimba (Azadirachta indica A. Juss.) FP10, FP20,

FP30 dan FP40 terhadap kultur sel HeLa dan sel Vero.


4

3. Manfaat penelitian

a. Manfaat teoritis

Penelitian ini dapat melengkapi dan memperkaya teori yang telah ada

mengenai khasiat, penggunaan, dan efek sitotoksisitas fraksi protein daun

mimba terhadap sel HeLa dan sel Vero yang berguna dalam kemajuan

bidang ilmu kefarmasian.

b. Manfaat praktis

Penelitian ini diharapkan dapat digunakan sebagai acuan yang mendukung

penemuan obat alternatif antikanker dari daun mimba.

B. Tujuan Penelitian

Tujuan umum:

untuk mengetahui apakah fraksi protein daun mimba FP10, FP20, FP30 dan FP40

memiliki potensi untuk dikembangkan sebagai senyawa antikanker baru.

Tujuan khusus:

a. untuk mengetahui fraksi protein daun mimba FP10, FP20, FP30 dan FP40

yang mempunyai daya sitotoksisitas terhadap sel HeLa dan sel Vero

b. untuk mengetahui nilai LC50 dari fraksi protein daun mimba FP10, FP20,

FP30 dan FP40 terhadap sel HeLa dan sel Vero

c. untuk mengetahui apakah fraksi protein daun mimba FP10, FP20, FP30 dan

FP40 berpotensi dikembangkan sebagai antikanker.


5

BAB II

PENELAAHAN PUSTAKA

A. Tanaman Mimba (Azadirachta indica A. Juss)

1. Keterangan botani tanaman mimba (Azadirachta indica A. Juss)

Tanaman mimba (Azadirachta indica A. Juss.) termasuk dalam divisi

Spermatophyta, sub divisi Angiospermae, kelas Dicotyledonae, bangsa Meliales,

suku Meliaceae, marga Azadirachta, jenis Azadirachta indica A. Juss. Tanaman

mimba memiliki sinonim yaitu Melia azadirachta Linn. Dalam bahasa Inggris

atau Belanda tanaman ini dikenal dengan nama Margosa tree, Neem tree, atau

Margosier.

(Backer and Backuizen van den Brink, 1963; 1965; Hutapea, 1993)

2. Nama daerah

Tanaman mimba (Azadirachta indica A. Juss.) memiliki nama daerah

Jawa yaitu Imba, mimba, membha, mempheuh. Di wilayah Pasundan (Sunda)

dikenal dengan nama nimba, di Bali dan Nusa Tenggara dikenal dengan nama

intaran, dan di Madura dikenal dengan nama mimba, membha, atau mempheuh

(Sukrasno, 2003).

3. Deskripsi tanaman

Tanaman mimba berupa pohon dengan tinggi 10-15 meter. Batang tegak,

berkayu, bulat, permukaan kasar, percabangan simpodial, coklat. Daun majemuk,

berhadapan, lonjong, melengkung, tepi bergerigi, ujung lancip, pangkal

meruncing, pertulangan menyirip, panjang 5-7 cm, lebar 3-4 cm, tangkai panjang

5


6

8-20 cm, hijau. Bunga majemuk, berkelamin dua, di ujung cabang, tangkai

silindris, panjang 8-15 cm, kelopak hijau, benang sari silindris, putih kekuningan,

putik lonjong, coklat muda, mahkota halus, putih. Buah buni, bulat telur, hijau.

Biji bulat, diameter kurang lebih 1 cm, putih. Akar tunggang, coklat (Hutapea,

1993). Pohon mimba dapat tumbuh di berbagai ketinggian tempat, tetapi di atas

ketinggian 500 meter diatas permukaan laut sulit menghasilkan biji, hanya

daunnya yang tumbuh lebat (Kardinan dan Taryono, 2003).

4. Kandungan kimia

Sampai saat ini, setidaknya ada sembilan senyawa yang telah diisolasi dan

diidentifikasi dari daun mimba yaitu nimonol, nimbolida, 28-deoksi nimbolida, α-

linolenat, 14-15-epoksinimonol, 6-K-O-asetil-7-deasetil-mimosinol, melrasinol,

dan nimbotalin. Penelitian terhadap senyawa-senyawa yang terkandung dalam

daun mimba tersebut mendukung pemanfaatannya dalam dunia kesehatan

(Sukrasno, 2003).

5. Penelitian terhadap tanaman mimba

Beberapa penelitian untuk membuktikan kebenaran khasiat daun mimba

terutama protein daun mimba sebagai antikanker telah dilakukan antara lain,

penelitian sitotoksisitas fraksi total protein daun mimba terhadap kultur sel Raji

(Ariyani, 2004), terhadap kultur sel SiHa (Lusia, 2004), terhadap kultur sel HeLa

(Febriani, 2004), dengan kesimpulan bahwa fraksi protein daun mimba

mempunyai efek sitotoksik terhadap ketiga jenis sel kanker tersebut walaupun

belum dapat dinyatakan sebagai senyawa yang berpotensi untuk dikembangkan

sebagai senyawa antikanker karena nilai LC50 yang diperoleh lebih besar dari 20


7

µg/ml. Penelitian lebih lanjut yaitu sitotoksisitas fraksi protein daun mimba hasil

pengendapan dengan amonium sulfat 30%; 60% dan 100% terhadap sel Raji

(Robbyono, 2006) dengan kesimpulan fraksi 30% berpotensi untuk dikembangkan

sebagai antikanker karena nilai LC50 < 20 µg/ml, sedangkan pada penelitian

serupa terhadap sel HeLa (Suwanto, 2006), terhadap sel Myeloma (Hariadi, 2006)

dan terhadap sel SiHa (Candra, 2006) menyimpulkan bahwa fraksi 30% dan 60%

berpotensi untuk dikembangkan sebagai antikanker sebab nilai LC50 yang

diperoleh juga < 20 µg/ml.

B. Protein

1. Pengertian protein

Kata protein berasal dari protos atau proteos yang berarti pertama atau

utama. Protein merupakan komponen penting atau komponen utama sel hewan

atau manusia. Oleh karena sel itu merupakan pembentuk tubuh hewan maupun

manusia, maka protein yang terdapat dalam makanan berfungsi sebagai zat utama

dalam pembentukan dan pertumbuhan tubuh. Tumbuhan membentuk protein dari

CO2, H2O dan senyawa nitrogen. Protein adalah suatu polipeptida yang

mempunyai molekul besar dengan bobot molekul bervariasi antara 5000 sampai

jutaan (Poedjiadi, 1994). Protein terdapat dalam semua jenis zat hidup: tumbuhan,

hewan, dan jasad renik. Semua protein, selain mengandung karbon, hidrogen, dan

oksigen juga mengandung nitrogen dan sering mengandung belerang dan fosfor

(Sakidja, 1989).


8

Protein merupakan polimer kondensasi asam amino dengan penghilangan

unsur air dari gugus amino dan gugus karboksil. Asam amino pada protein

mempunyai konfigurasi-L dan ikatan amida hanya terbentuk antara gugus amino-

alfa dan gugus karboksil-alfa dari asam amino yang bersangkutan. Beberapa

protein beracun mempunyai peran ekologi dalam melindungi tumbuhan dari

serangan mikroba. Protein beracun lain memberi harapan dalam pengobatan

kanker dan penyakit yang disebabkan virus. Fraksinasi ekstrak protein dapat

dilakukan dengan cara pengendapan menggunakan amonium sulfat (Robinson,

1991).

2. Jenis protein berdasarkan kelarutan

Beberapa jenis protein yang diklasifikasikan berdasarkan kelarutannya

antara lain:

1. albumin merupakan protein yang dapat larut dalam air dan larutan garam,

dapat terkoagulasi oleh panas. Larutan albumin di dalam air dapat

diendapkan dengan penambahan amonium sulfat hingga jenuh.

2. globulin memiliki sifat sukar larut dalam air murni, tetapi dapat larut

dalam larutan garam netral, misalnya larutan NaCl encer. Larutan globulin

dapat diendapkan oleh penambahan garam ammonium sulfat hingga

setengah jenuh. Globulin dapat diperoleh dengan jalan mengekstraksinya

dengan larutan garam (5%-10%) NaCl kemudian ekstrak yang diperoleh

diencerkan dengan penambahan air. Globulin akan mengendap dan dapat

dipisahkan. Globulin juga dapat terkoagulasi oleh panas.


9

3. histon merupakan protein yang mempunyai sifat basa dan dapat larut

dalam air. Pada proses hidrolisis menghasilkan banyak arginin dan lisin.

Histon terdapat di dalam inti sel dalam bentuk ikatan dengan asam nukleat.

4. protamin merupakan protein yang bersifat basa seperti histon, tidak

mengandung tirosin dan triptofan, tetapi mengandung banyak arginin

sehingga mempunyai kadar nitrogen antara 25%-30%. Protamin berikatan

dengan asam nukleat. Protamin larut dalam etanol 70%-80% tetapi tidak

larut dalam air serta etanol absolut.

5. skleroprotein tidak larut dalam air atau larutan garam, banyak

mengandung asam amino Glysin, Alanin dan Prolin.

(Poedjiadi, 1994; Murray dkk, 1995)

3. Pemurnian protein

Suatu jenis protein dari bahan alam dalam keadaan murni tidak mudah

diperoleh sebab molekul protein tidak stabil terhadap pemanasan serta pelarut

organik. Pemurnian protein diawali dengan pemilihan bahan alam yang akan

diproses berdasarkan kadar protein yang terkandung didalamnya yaitu yang

berkadar protein tinggi dan mudah diperoleh. Selanjutnya mengeluarkan protein

dari dalam bahan alam tersebut dengan cara memecahkan sel-sel jaringan secara

mekanik misal dengan cara menghancurkan dan melumatkannya dalam suatu alat

tertentu dan beberapa jenis protein dapat diperoleh dengan melarutkannya dalam

air atau pelarut lain. Dalam proses ini perlu dijaga agar temperatur dan pH larutan

tidak merusak protein. Pada temperatur 40°C protein mudah terdenaturasi, maka

pemurnian protein sering dilakukan pada temperatur rendah, yaitu mendekati titik


10

beku pelarut yang digunakan. Disamping itu, protein juga sensitif terhadap asam

atau basa dengan konsentrasi tinggi, dan biasanya pemurnian protein dilakukan

pada pH mendekati netral dengan menggunakan larutan buffer tertentu (Poedjiadi,

1994).

Setelah diperoleh larutan yang berisi beberapa macam protein maka proses

selanjutnya ialah fraksinasi yaitu memisahkan masing-masing protein dalam

campuran secara fraksi demi fraksi. Dua cara yang biasa digunakan untuk proses

fraksinasi ini yaitu pengendapan dan kromatografi. Proses pengendapan protein

dapat dilakukan menggunakan amonium sulfat berkonsentrasi tinggi atau larutan

jenuh. Beberapa protein berbeda kelarutannya dalam konsentrasi garam yang

berbeda. Cara ini digunakan terutama bila diinginkan satu macam protein saja

sedangkan protein lain tidak diperlukan. Selain dengan garam proses pengendapan

protein dapat dilakukan dengan menyesuaikan pH titik isoelektrik protein yang

diinginkan. Pada titik isoelektrik kelarutan protein berkurang hingga minimum

dan protein yang diinginkan akan mengendap, sedangkan protein lain yang tidak

diinginkan tetap di dalam larutan. Protein dapat dipisahkan satu dari yang lain

dengan cara kromatografi. Kromatografi adsorpsi untuk pemurnian protein

dilakukan dengan menggunakan alumina atau kalsium fosfat sebagai adsorben.

Selain itu kromatografi penukar ion dapat digunakan pula untuk pemurnian

protein. Kolom kromatografi diisi dengan DEAE-selulosa, suatu penukar ion yang

mempunyai gugus dietilaminoetil yang terikat pada selulosa atau dengan penukar

kation yaitu CM-selulosa yang mempunyai gugus karboksimetil terikat pada

selulosa (Poedjiadi, 1994).


11

4. Pengukuran konsentrasi protein

Pada umumnya, metode pemurnian protein harus dilakukan pada

temperatur rendah, pada range 0-4°C. Temperatur rendah meminimalkan

degradasi protein selama pemurnian dengan menghalangi aktifitas protease

(enzim yang memecah ikatan peptida) dan mengurangi kemungkinan protein akan

terdenaturasi, atau membuka ikatannya (banyak protein yang sangat sensitif

terhadap panas). Pada pH netral tirosin, triptofan dan fenilalanin mengabsorpsi

sinar ultraviolet (UV) pada panjang gelombang 280 nm (Moran dkk, 1994;

Murray dkk, 1995).

C. Kanker

1. Definisi

Kanker adalah penyakit yang disebabkan adanya perbanyakan dan

penyebaran yang tidak terkontrol menjadi bentuk tubuh abnormal dari sel tubuh

itu sendiri. Kanker merupakan salah satu penyebab utama kematian di Negara

berkembang, setidaknya satu dari lima pada populasi di Eropa dan Amerika Utara

diperkirakan meninggal karena kanker (Rang dkk, 2003). Kanker ditandai oleh

pembelahan sel yang tidak terkontrol dan kemampuannya untuk menyerang

jaringan lain, baik melalui pertumbuhan langsung pada jaringan (invasi) atau

dengan migrasi sel ke jaringan yang lain (metastasis). Pertumbuhan yang tidak

sesuai aturan ini disebabkan oleh kerusakan DNA, menghasilkan mutasi pada gen

utama yang mengendalikan pembelahan sel, dan fungsi yang lain. Satu atau lebih


12

dari mutasi ini, baik yang diturunkan atau didapatkan, dapat menuntun ke

pembelahan sel yang tak terkendali dan pembentukan tumor (Anonim, 2005b).

Tumor menunjukkan suatu massa yang abnormal di jaringan, baik berupa

malignan (kanker) atau benigna (nonkanker). Tumor benigna tidak menyebar ke

bagian lain tubuh atau menyerang jaringan lain, dan jarang perawatannya untuk

bertahan hidup jika tidak secara kebetulan menekan struktur utama (vital). Tumor

malignan dapat menyerang organ lain, menyebar ke lokasi yang jauh (metastasis)

dan menjadi perawatan untuk bertahan hidup (Anonim, 2005b). Istilah kanker,

neoplasma malignan dan tumor malignan merupakan sinonim. Keduanya

dibedakan dari tumor benigna oleh dediferensiasi, keinvasifan dan kemampuan

metastasis (penyebaran ke bagian lain dari tubuh). Kedua tumor baik benigna

maupun malignan menunjukkan proliferasi yang tidak terkendali. Sel kanker

memiliki karakteristik yang membedakannya dari sel normal, yaitu sel kanker

mengalami pertumbuhan dan pembelahan sel yang tidak terkendali oleh regulasi

pembelahan sel dan pertumbuhan jaringan yang normal, adanya gangguan

diferensiasi dan kehilangan fungsi pada sel kanker, sel kanker mampu melakukan

invasif dan metastasis (Rang dkk, 2003).

Untuk menghambat metastasis kanker, perlu diketahui cara sel tersebut

menyebar. Ada dua cara sel kanker ber-metastasis: melalui angiogenesis

(pembentukan pembuluh darah yang baru) dan penghancuran kolagen yang

merupakan kerangka sel normal. Dengan demikian metastasis akan dapat

dihambat bila angiogenesis dapat dicegah; sementara kolagen yang rusak dapat


13

diperbaiki oleh tubuh sendiri dengan memanfaatkan makanan tertentu (Hartono,

1999).

Pendekatan utama dalam pengobatan kanker yaitu pembedahan, irradiasi,

dan kemoterapi. Penggunaan masing-masing pengobatan tersebut tergantung pada

tipe tumor dan tingkat perkembangannya (Rang dkk, 2003).

2. Proses terjadinya kanker

Sel normal berubah menjadi sel kanker karena satu atau lebih mutasi pada

DNA-nya baik secara diturunkan, bukan kanker itu sendiri yang diturunkan

melainkan gen yang telah termutasi dan mudah berkembang menjadi kanker

maupun dengan cara didapat dari luar sel akibat pemaparan zat kimia, ko-

karsinogen, dan lain-lain. Perkembangan kanker merupakan proses yang rumit,

melibatkan tidak hanya satu perubahan genetik tetapi juga yang lain, seperti

faktor-faktor epigenetik (aksi hormonal, ko-karsinogen dan efek pemacu tumor)

yang tidak hanya menghasilkan kanker itu sendiri melainkan dengan

meningkatkan kemungkinan mutasi genetik yang akan menimbulkan kanker

(Rang dkk, 2003).

Sel kanker mempunyai antigen pada permukan sel yang dapat dikenali dan

bereaksi dengan sistem imun inang sehingga mampu mencegah pertumbuhan

tumor yang tak terkendali. Teori ini dikenal sebagai immunosurveillance

(pemantauan imun). Teori ini bermula dari percobaan yang dilakukan oleh Paul

Ehrlich yang mengamati bahwa hewan dengan pertumbuhan tumor bervirulensi

rendah mengalami penurunan pertumbuhan tumor setelah dilakukan inokulasi sel

tumor berikutnya. Ehrlich menduga lubang pada struktur permukaan sel tumor


14

yang dapat dikenali sebagai sesuatu yang abnormal oleh inang. Penelitian

dilanjutkan oleh Lewis Thomas yang memberikan teori penolakan allograft

menggambarkan mekanisme utama dalam pertahanan alami terhadap neoplasia.

Berdasarkan penelitian-penelitian tersebut, Macfarlane Burnet memberikan teori

immunosurveillance yang berpusat adanya antigen yang tergabung pada sel tumor

(Schwartz, 1991; Dasgupta, 1992).

Teori tersebut menyatakan bahwa sel efektor pada sistem imun secara aktif

beredar di dalam tubuh untuk mengenali dan membasmi sel-sel tumor yang mulai

terbentuk. Penelitian pada tahun 1970 mampu menemukan dan mengidentifikasi

adanya sel T, sel ini menjadi sel efektor yang diduga memperantarai dalam

immunosurveillance. Lebih dari dua dekade terakhir, data-data memunculkan

pendapat bahwa konstituen sistem imun seperti sel natural killer (NK) dan

jaringan cytokine mampu memberi pertahanan terhadap kanker (Ichim, 2005).

Aktivitas sel NK menjadi tanda penunjuk pada beberapa tipe tumor. Sel-

sel NK terlibat baik secara langsung maupun tidak langsung dalam pemantauan

kemunculan tumor dan mikrometastasis. Teori ini kemudian dibuktikan dengan

data yang menunjukkan bahwa onkogen tertransfeksi fibroblas dapat lisis secara

selektif oleh sel NK bila dibandingkan dengan kontrol yang tidak tertransfeksi.

Mekanisme secara tepat sel NK dalam immunosurveillance belum diketahui

secara pasti. Berkaitan dengan efek sitotoksik secara langsungnya, kemungkinan

sel NK mengaktifkan sel lain dalam sistem imun dengan cara memperlengkapinya

dengan bantuan cytokine. Sel NK yang mature tidak menghasilkan cytokine T-

helper 2 (Th2), tetapi lebih pada cytokine T-helper 1 (Th1), tumor necrosis factor


15

(TNF)-α, interferon (IFN)-γ dan granulocyte-macrophage colony-stimulating

factor (GM-CSF). Pada kenyataanya, sekresi IFN-γ oleh sel NK dapat

mempengaruhi pembentukan respon imun tipe Th1 terhadap agen patogen

maupun tumor terinduksi 3-methylcholanthrene (MCA) (Ichim, 2005).

Langkah awal respon imun memerlukan cytokine yang dihasilkan oleh sel-

sel T-helper. Perbedaan cytokine yang dihasilkan oleh sel menentukan tipe respon

imun. Respon imun yang diperantarai sel membutuhkan cytokine Th1, sedangkan

respon imun yang diperantarai antibodi membutuhkan cytokine Th2. Sel T-helper

yang terdiferensiasi menjadi sel Th1 mensekresikan IFN-γ dan sedikit interleukin

(IL)-2 dan IL-12, sedangkan sel Th2 mensekresikan IL-10, IL-4, dan sedikit IL-5.

Namun, tumor memiliki beberapa cara baik spesifik maupun non-spesifik untuk

menghindari respon Th1. Tumor mensekresikan sejumlah agen, termasuk

transforming growth factor (TGF)-β, IL-10 dan prostaglandin E-2, yang

menunjukkan meningkatkan respon imun Th2 ketika menekan respon imun Th1.

Hal ini telah ditunjukkan bahwa jaringan cytokine dari beberapa pasien kanker

cenderung mengarah ke Th2. Pasien-pasien tersebut menunjukkan peningkatan

cytokine Th2 atau penurunan cytokine Th1 baik tumor sistemik maupun lokal.

Penelitian mengenai tumor yang mengembangkan beberapa cara untuk

menghindari respon Th1 sesuai dengan pengertian immunosurveillance. Fakta

bahwa malignan memiliki banyak cara dalam menghindari respon Th1

menunjukkan bahwa kemampuan untuk menghindari respon ini memberikan

keuntungan pertahanan pada sel malignan, yang selanjutnya menunjukkan bahwa

respon Th1 menjadi ancaman bagi neoplasma (Ichim, 2005).


16

Cytokine Th1 IFN-γ berfungsi sebagai antitumor baik secara langsung

maupun tidak langsung. Serangkaian penelitian menunjukkan arti penting IFN-γ

dalam membasmi tumor awal dengan adanya peningkatan keberhasilan

karsinogenesis saat tidak ada IFN-γ. IFN-γ menghambat pertumbuhan tumor

dengan mempengaruhi proliferasi, apoptosis dan angiogenesis. IFN-γ juga

mempunyai efek antitumor tidak langsung dengan memacu respon imun

antitumor yang efektif. Sebagai tambahan dalam mempengaruhi keseimbangan

cytokine Th1-Th2, IFN-γ mampu mengaktifkan makrofag sitotoksik, sel-sel NK

dan sel-sel T NK (Ichim, 2005).

Bukti dari prinsip tipe respon imun yang tidak tepat akan meningkatkan

pertumbuhan tumor telah dibuktikan pada awal 1907 oleh Flexner dan Jobling,

yang menunjukkan bahwa injeksi sel tumor autologous mati meningkatkan

pertumbuhan tumor yang ada lebih dulu. Secara umum, Th2 membawa respon

antibodi ke tumor yang tidak terlindungi dan mendukung perkembangan tumor

dengan menghambat respon imun yang diperantarai sel Th1. Namun, paham

bahwa respon imun yang diperantarai antibodi dapat merugikan pada kanker telah

diusulkan lama sebelum Mossman dan Coffman menunjukkan paradigma Th1-

Th2 pada tahun 1986. Pada tahun 1950-an Kaliss mempopulerkan istilah

”immunological enhancement” untuk menggambarkan peningkatan pertumbuhan

tumor oleh antibodi non-sitotoksik. Teori ini menyebutkan bahwa antibodi

berikatan dengan sel tumor, melapisi atau menutup epitop sel tumor dan kemudian

mencegah respon imun yang diperantarai sel sehingga sel tumor tidak bereaksi


17

dengan imun dan tetap bisa tumbuh dan berkembang, meskipun hal ini belum

pernah dibuktikan dengan percobaan (Ichim, 2005).

Ada dua kategori utama perubahan genetik yang dapat mengakibatkan

munculnya kanker, yaitu:

Aktivasi proto-onkogen menjadi onkogen

Proto-onkogen adalah gen yang secara normal mengendalikan pembelahan sel,

apoptosis, dan diferensiasi tetapi dapat berubah menjadi onkogen oleh adanya aksi

virus atau karsinogen.

Inaktivasi gen penekan tumor

Sel normal mengandung gen yang mempunyai kemampuan untuk menekan

perubahan malignan yang disebut gen penekan tumor (anti-onkogen) dan

sekarang terdapat bukti bahwa mutasi terhadap gen ini terlibat dalam

pembentukan kanker yang berbeda-beda. Kehilangan fungsi dari gen penekan

tumor dapat menjadi peristiwa penting dalam karsinogenesis (Rang dkk, 2003).

Kanker akan muncul bila DNA sel normal mengalami kerusakan sehingga

menyebabkan mutasi genetik. Kalau ini tidak segera dikoreksi, perbanyakan sel

yang DNA-nya rusak tersebut potensial menghasilkan sel kanker. Padahal

perbanyakan sel dimaksudkan untuk pemulihan sel-sel yang aus atau rusak

(Hartono, 1999).

Tingkatan perubahan sel pada pertumbuhan kanker adalah sebagai berikut:

a. hiperplasi yaitu pembengkakan organ tubuh akibat pertumbuhan sel-sel

baru yang abnormal karena hilangnya kontrol pertumbuhan.


18

b. metaplasi yaitu perubahan epitel suatu jenis jaringan dewasa menjadi

jaringan lain yang juga dewasa.

c. displasi yaitu perubahan sel dewasa ke arah kemunduran dalam hal

bentuk, besar dan orientasinya. Masih bersifat reversibel.

d. anaplasi yaitu perubahan serupa displasi yang menyimpang lebih jauh dari

normal. Merupakan suatu ciri tumor ganas yang sangat ireversibel.

e. karsinoma insitu yaitu gambaran sel menjadi sangat atipik namun belum

terdapat pertumbuhan infiltratif.

f. invasi yaitu sel kanker telah menembus lapisan basal jaringan

(Kuswibawati, 2000).

3. Kanker leher rahim

Kanker servik merupakan suatu bentuk malignan pada leher rahim

(servik). Kanker leher rahim merupakan jenis kanker paling banyak kedua di

dunia yang menyerang wanita dan peringkat ketiga kanker yang dapat

menyebabkan kematian setelah kanker payudara dan kanker paru-paru. Kanker ini

menyerang 16 per 100.000 orang wanita dan menyebabkan kematian 9 per

100.000 setiap tahunnya (Anonim, 2007a). Uji sitologi cervical (Pap smear)

menunjukkan identifikasi dan penghilangan lesi prekanker (Anonim, 2005b).

Gejala klinik kanker leher rahim adalah keputihan yang tidak gatal, nyeri dan

perdarahan sehabis senggama, anemia serta gejala-gejala lain yang ditimbulkan

pada metastasis jauh (Fenty, 2000).

Istilah Cervical Intra-epithelial Neoplasia (CIN) digunakan saat pada

servik mengalami perubahan stadium displasia premalignan. Human Papilloma


19

Virus (HPV) pada stadium ini merupakan virus yang beresiko rendah dalam arti

tidak selalu berkembang menjadi kanker tetapi bisa juga menjadi virus beresiko

tinggi menyebabkan kanker leher rahim. Apabila kanker leher rahim dideteksi

lebih dini, maka kanker ini dapat diobati tanpa mempengaruhi kesuburan

(Anonim, 2007a).

Kanker leher rahim atau karsinoma servik uteri paling sering ditemukan di

antara tumor ganas ginekologik, dan umumnya paling banyak ditemukan pada

wanita berusia 31-60 tahun (Fenty, 2000). Lebih dari 90% kasus kanker leher

rahim disebabkan oleh Human Papilloma Virus (HPV) terutama tipe 16 dan 18.

Human Papilloma Virus (HPV) tipe 16 dan 18 mengandung dua macam gen yaitu

E6 dan E7 yang menghambat p53 dan Rb. Gen p53 dan Rb merupakan gen

penekan tumor yang ada di dalam tubuh manusia. Gen p53 terlibat dalam regulasi

apoptosis (bunuh diri sel) dan Rb bertanggung jawab untuk menghentikan siklus

sel pada fase G1. Pada saat fungsi Rb melemah, sel melanjutkan siklus ke fase S

dan mengalami mitosis sempurna, kemudian menghasilkan proliferasi sel dan dari

hal ini menyebabkan adanya pembentukan neoplastik (Anonim, 2007a).

D. Kultur Sel

Kultur sel yang baru diisolasi dari suatu jaringan dan kemudian

ditumbuhkan secara in vitro dikenal sebagai kultur sel primer. Subkultur adalah

pemindahan sel ke flask baru dengan medium yang baru. Subkultur

memungkinkan terjadinya perluasan kultur yang sekarang dikenal sebagai cell

line. Setelah mengalami beberapa kali subkultur, cell line akan mati (disebut finite


20

cell line) atau berubah menjadi continuous cell line. Sel normal dapat mengalami

perubahan menjadi continuous cell line tanpa menjadi malignan, sedangkan tumor

malignan dapat tumbuh pada media kemudian mengalami perubahan dan menjadi

lebih atau kurang tumorigenik. Keuntungan penggunaan continuous cell line

adalah lebih cepat tumbuh sehingga kepadatan populasi sel lebih tinggi,

membutuhkan serum yang lebih rendah dan cukup mudah perawatannya pada

media sederhana, serta memiliki kemampuan untuk tumbuh dalam suspensi.

Kerugiannya meliputi ketidakstabilan kromosomal yang lebih besar, adanya

penyimpangan dari fenotip donor, dan terjadi kehilangan penanda khusus jaringan

(Freshney, 1986).

1. Sel HeLa

HeLa cell line merupakan continouous cell line yang tumbuh sebagai sel

yang semi melekat. HeLa cell line diturunkan dari sel epitel kanker leher rahim

(cervix) manusia. Sel ini diisolasi dari seorang wanita penderita kanker leher

rahim bernama Henrietta Lacks berusia 31 tahun, yang meninggal pada tahun

1951 akibat kanker yang dideritanya. HeLa cell line ini cukup aman dan umum

digunakan untuk kepentingan kultur sel. Sel HeLa merupakan cell line cervix

intraepitel (Cervical Intraepithelial Carcinoma) akibat infeksi HPV 18 (Widiyani,

2005).

Sel HeLa diketahui dapat hidup dan berkembang dengan sangat baik

dalam kultur buatan di laboratorium. Kultur sel HeLa mengalami proliferasi yang

sangat cepat, bahkan jika dibandingkan dengan jenis sel kanker yang lain. Sel-sel

tersebut memiliki telomerase aktif selama pembelahan sel, yang dapat mencegah


21

bertambah pendeknya telomer-telomer yang mengakibatkan penuaan dan bahkan

kematian sel. Sel HeLa mudah menginvasi atau mengkontaminasi kultur sel lain

dalam satu laboratorium yang sama (Anonim, 2007b).

HeLa cell line merupakan immortal cell line yang digunakan dalam

penelitian dibidang kesehatan seperti uji antitumor, uji sitotoksisitas, biologi sel,

dan kemampuan invasi bakteri. Sel ini dapat dikultur menggunakan media RPMI

1640. Media RPMI 1640 mengandung nutrisi yang dibutuhkan oleh sel seperti

asam amino, vitamin, garam-garam anorganik dan glukosa (Freshney, 1986).

2. Sel Vero

Vero epithelial cell line ditemukan pertama pada tahun 1962 oleh Y.

Yasumura dan Y. Kawakita di Universitas Chiba di Chiba, Jepang. Sel Vero

diambil dari ginjal kera dewasa (jenis African Green Monkey) yang sehat.

Walaupun sering digunakan dalam tranfections dan produksi vaksin, sel Vero

juga sering digunakan untuk mendeteksi verotoksin (sekelompok toksin yang

berhubungan yang dihasilkan oleh beberapa strain Escherichia coli yang

merupakan penyebab utama hemorrhagic colitic dan sindrom hemolytic uremic

pada manusia) (Anonim, 2006b).

E. Uji Sitotoksisitas In Vitro

Uji untuk identifikasi agen kemoterapetik kanker yang baru biasanya

dilakukan pada hewan percobaan yang mempunyai kesamaan sifat dengan

manusia. Namun, ada beberapa pertimbangan yang menyebabkan kecenderungan

untuk menggunakan kultur sel dibanding hewan uji. Pertimbangan tersebut antara


22

lain, tes in vitro lebih murah dibanding in vivo, ada perbedaan proses fisiologis

antara hewan percobaan dan manusia, dan adanya pertimbangan moral di dalam

penggunaan hewan sebagai objek penelitian (Freshney, 1986).

Uji MTT (3-(4,5-dimetil-tiazol-2-il)-2,5-dipheniltetrazolium bromide)

didasarkan pada aktivitas mitokondria, yang diinterpretasikan sebagai tolok ukur

kelangsungan hidup sel. Pada uji MTT, garam tetrazolium, 3-(4,5-dimetil-tiazol-

2-il)-2,5-dipheniltetrazolium bromide secara aktif akan diabsorpsi ke dalam sel

hidup dan direduksi dalam mitokondria sel membentuk suatu produk formazan

berwarna ungu. Produk tersebut terakumulasi di dalam sel karena tidak bisa keluar

menembus membran sel. Dengan penambahan DMSO, isopropanil, atau solven

lain yang cocok, produk formazan ungu yang terbentuk tadi baru dapat larut atau

dibebaskan dan siap diukur dengan metode kolorimetri (Barile, 1997).

N

N+N

N

SNBr-

MTT (3-(4,5-dimethyl-thiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide)

HN

N

N N

S

N

Formazan ((2E,4Z)-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-3,5-diphenylformazan)

NADH

NAD

Gambar 1. Reaksi reduksi MTT menjadi formazan

Kematian sel merupakan respon uji sitotoksisitas maka konsentrasi yang

menimbulkan kematian pada 50% populasi pada sel dalam waktu yang spesifik

dan kondisi percobaan yang sesuai diistilahkan dengan median lethal


23

concentration atau LC50 (Cassaret and Doull, 2001). Semakin kecil harga LC50

suatu senyawa berarti senyawa tersebut semakin besar sitotoksisitasnya.

F. Landasan Teori

Penyakit kanker merupakan penyakit yang telah menjadi ancaman di

seluruh dunia, sementara obat spesifik untuk menghentikan perkembangan sel

kanker belum juga ditemukan. Tetapi upaya pencegahan terus diusahakan dengan

terapi alternatif obat antikanker yang berasal dari tanaman.

Tanaman mimba merupakan salah satu tanaman yang diyakini mempunyai

khasiat untuk mengobati kanker. Fraksi protein daun mimba ternyata dapat

memberikan efek sitotoksik terhadap beberapa tipe sel kanker termasuk sel HeLa.

Sel HeLa dapat hidup dan berkembang sangat baik dalam kultur buatan di

laboratorium, diakui aman untuk digunakan dalam kultur sel, dan mampu

memberikan respon yang cukup baik terhadap aktivitas dari senyawa-senyawa

yang diujikan.

Beberapa penelitian tentang sitotoksisitas fraksi protein daun mimba

terhadap sel HeLa sebagai subyek uji telah banyak dilakukan. Dari penelitian

Suwanto (2006) diketahui bahwa fraksi protein hasil pengendapan amonium sulfat

30% dan 60% memiliki nilai LC50 yang berpotensi untuk dikembangkan sebagai

senyawa antikanker. Diduga bahwa protein yang berperan sebagai antikanker

berada terutama antara kedua fraksi protein tersebut sehingga dimungkinkan

untuk memfraksinasi protein kedalam konsentrasi yang lebih kecil lagi dengan

cara pengendapan menggunakan amonium sulfat dengan tingkat kejenuhan 10%


24

(FP10), 20%(FP20), 30% (FP30) dan 40% (FP40). Dengan demikian, diharapkan

dapat diketahui pada fraksi mana protein yang memiliki potensi sebagai

antikanker tersebut paling banyak terendapkan dan kespesifikan protein yang

bersifat antikanker. Namun, fraksi protein daun mimba belum pernah dicobakan

pada sel normal (sel Vero). Jika ternyata tidak menimbulkan kerusakan pada sel

normal (sel Vero), fraksi protein daun mimba dapat diajukan sebagai alternatif

obat antikanker baru. Hal-hal tersebutlah yang mendasari dilakukan penelitian

fraksinasi protein daun mimba menjadi lebih kecil lagi untuk dilihat keberadaan

protein yang berpotensi untuk dikembangkan menjadi senyawa antikanker.

G. Hipotesis

Fraksi protein daun mimba (Azadirachta indica A. Juss) FP10, FP20, FP30

dan FP40 memiliki efek sitotoksik terhadap sel HeLa dan berpotensi untuk

dikembangkan sebagai antikanker.


25

BAB III

METODOLOGI PENELITIAN

A. Jenis dan Rancangan Penelitian

Penelitian eksperimental murni sederhana tunggal dengan rancangan

penelitian acak lengkap pola searah.

B. Variabel-variabel Penelitian

1. Variabel bebas

Konsentrasi fraksi protein daun Azadirachta indica A. Juss FP10, FP20, FP30

dan FP40.

2. Variabel tergantung

Prosentase kematian sel HeLa dan sel Vero pada masing-masing kultur sel.

3. Variabel pengacau terkendali

a. Medium tumbuh sel dikendalikan dengan menggunakan medium RPMI

1640 untuk sel HeLa dan medium M199 untuk sel Vero.

b. Tempat tumbuh dan waktu pemanenan daun mimba dikendalikan dengan

memanen daun pada tempat dan waktu yang sama.

c. pH dan suhu pembuatan fraksi protein, dikendalikan pada pH 7,2 dan suhu

4oC.

4. Variabel pengacau tak terkendali

Kematian sel HeLa dan sel Vero secara alami.

25


26

C. Definisi Operasional

1. Uji sitotoksisitas adalah uji toksisitas secara in vitro menggunakan kultur sel.

2. Fraksi protein adalah protein yang didapat dari ekstrak gubal daun mimba

dengan pengendapan menggunakan amonium sulfat.

3. Lethal Concentration (LC50) adalah konsentrasi fraksi protein daun mimba

yang dapat mengakibatkan kematian 50% populasi sel HeLa maupun sel Vero.

D. Bahan atau Materi Penelitian

1. Bahan utama yang digunakan dalam penelitian ini adalah daun segar tanaman

mimba (Azadirachta indica A. Juss). Daun mimba diambil dari tanaman

mimba (Azadirachta indica A. Juss) yang tumbuh di pekarangan

Laboratorium Hayati LPPT Unit III, Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta,

pada bulan Juni 2006. Daun mimba diambil pada saat tanaman mimba belum

berbunga dan berbiji.

2. Kultur sel HeLa dari stok Laboratorium Ilmu Hayati Universitas Gadjah Mada

3. Kultur sel Vero dari stok Laboratorium Ilmu Hayati Universitas Gadjah Mada

4. Pereaksi untuk isolasi dan penetapan konsentrasi protein dari daun

Azadirachta indica A. Juss dengan bahan p.a (Merck):

a. larutan dapar natrium fosfat 5mM pH 7,2

b. larutan dapar natrium fosfat 5mM pH 7,2 yang mengandung 0,14 M NaCl

c. amonium sulfat

5. Pereaksi untuk uji sitotoksisitas pada sel HeLa dan sel Vero

a. Media pencuci : RPMI 1640 (Sigma), natrium bikarbonat, Hepes (Sigma)


27

b. Media penumbuh sel HeLa : RPMI 1640 (Sigma), Foetal Bovine Serum

(FBS) 10% (Gibco), Penisilin-Streptomisin 2% (Gibco), dan Fungison

0,5% (Gibco)

c. Media penumbuh sel Vero : M199 (Sigma), Foetal Bovine Serum (FBS)

10% (Gibco), Penisilin-Streptomisin 2% (Gibco), dan Fungison 0,5%

(Gibco)

d. Reagen Stopper : natrium dodeksil sulfat 10% dalam HCl 0,01 N (Merck)

e. MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide)

5 mg/ml (Sigma)

f. Trypsin 0,25% (Sigma)

E. Alat-alat Penelitian

Peralatan yang digunakan dalam penelitian ini antara lain: alat-alat gelas

(Pyrex), mortir dan stamper, kain monel, sentrifuge (Sigma K PLC series),

spektrofotometer UV (CECIL Serie 2) dan kuvet 1 ml, mikroskop (Olympus

Model IMT-2), haemocytometer (Nebauer), laminar air flow (Nuraire Class II

type A/B3), inkubator 37ºC, aliran 5% CO2 (Nuraire IR Airflow), 96-well plate

(Nunc), ELISA Reader SLT 340ATC, tissue culture flask, pipet Pasteur, membran

/ tabung dialisis (Sigma), tangki nitrogen cair, penangas air, almari es (National),

mikropipet, timbangan analitik (AND ER-400 H), alumunium foil, magnetic

stirrer, pH meter (TOA electronic HM-5S), mesin vortex (Thermolyne Maximi),

autoklaf, Hi-Mac Sentrifuge (HITACHI SCP85H), tissue, glove, dan masker.


28

F. Tatacara Penelitian

1. Determinasi tanaman

Bahan utama yang akan digunakan dalam penelitian yaitu daun mimba,

telah dideterminasi terlebih dahulu di laboratorium Farmakognosi Fitokimia,

Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta dan dipastikan juga

kebenarannya menggunakan acuan baku (Backer and Backuizen van den Brink,

1963; 1965).

2. Pengumpulan daun mimba

Daun mimba yang digunakan diambil dari pohon mimba yang tumbuh di

pekarangan Laboratorium Hayati, Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta, pada

bulan Juni 2006.

3. Sterilisasi alat dan bahan

Untuk mencegah terjadinya kontaminasi oleh organisme, maka alat-alat

yang digunakan dalam penelitian ini harus disterilkan terlebih dahulu. Alat-alat

tersebut dicuci dengan larutan sabun hingga bersih dan dikeringkan, setelah itu

dibungkus dengan alumunium foil dan disterilkan dalam autoklaf selama 20 menit

pada suhu 121oC (Gennaro, 2000).

4. Pembuatan fraksi protein dari daun mimba

Daun segar tanaman Azadirachta indica A. Juss dikumpulkan, diseleksi,

dan dicuci bersih dengan air mengalir. Daun dipotong kecil-kecil, tulang daun

dibuang dan ditimbang sebanyak 450 gram. Daun kemudian dibungkus dengan

kantong plastik bersih dan disimpan dalam freezer –20ºC selama semalam,

bersama dengan mortir, stamper, dan juga reagen-reagen yang akan digunakan


29

untuk proses selanjutnya dimana bahan-bahan tersebut sebelumnya telah

disterilkan.

Daun ditumbuk halus dengan penambahan sesedikit mungkin dapar

natrium fosfat 5mM pH 7,2 yang mengandung 0,14 M NaCl dalam mortir yang

ditempatkan dalam baskom berisi air es. Hasil tumbukan diperas dengan kain

monel, ditampung dalam tabung conical yang bersih dan steril. Cairan yang

diperoleh disentrifus pada 8000 rpm selama 30 menit. Supernatan dikumpulkan

dalam labu ukur 500 ml yang bersih dan steril.

Supernatan yang diperoleh kemudian diendapkan proteinnya dengan

menambahkan 27,45 gram amonium sulfat perlahan-lahan sambil terus diaduk

menggunakan magnetic stirrer dan dijaga suhunya, kemudian didiamkan selama

semalam di dalam lemari es sambil terus diaduk.

Supernatan kemudian disentrifus lagi pada 8000 rpm selama 25 menit.

Supernatan (1) ditampung dalam labu ukur 500 ml sedang pelet yang yang

diperoleh dilarutkan dengan larutan dapar natrium fosfat 5mM pH 7,2 hingga

volumenya mencapai 3 ml.

Supernatan (1) yang telah ditampung ditambahkan dengan 27,47 gram

amonium sulfat perlahan-lahan sambil terus diaduk menggunakan magnetic

stirrer selama semalam dan dijaga suhunya dalam lemari es. Selanjutnya

supernatan (1) disentrifus 8000 rpm selama 25 menit. Supernatan (2) ditampung

dalam labu ukur 500 ml sedang pelet yang diperoleh dilarutkan dengan larutan

dapar natrium fosfat 5mM pH 7,2 hingga volumenya mencapai 3 ml.


30

Supernatan (2) yang ditampung ditambah dengan 28,35 gram amonium

sulfat perlahan-lahan sambil terus diaduk menggunakan magnetic stirrer selama

semalam dan dijaga suhunya dalam lemari es. Selanjutnya supernatan (2)

disentrifus 8000 rpm selama 25 menit. Supernatan (3) ditampung dalam labu ukur

500 ml sedang pelet yang diperoleh dilarutkan dengan larutan dapar natrium

fosfat 5mM pH 7,2 hingga volumenya mencapai 3 ml.

Supernatan (3) ditambah dengan 29,28 gram amonium sulfat perlahan-

lahan sambil terus diaduk menggunakan magnetic stirrer selama semalam dan

dijaga suhunya dalam lemari es. Selanjutnya supernatan (3) disentrifus 8000 rpm

selama 25 menit. Supernatan (4) ditampung dalam labu ukur 500 ml sedang pelet

yang diperoleh dilarutkan dengan larutan dapar natrium fosfat 5mM pH 7,2

hingga volumenya mencapai 3 ml.

Langkah selanjutnya dilakukan dialisis dengan memasukkan keempat

sampel fraksi protein yang diperoleh tadi ke dalam tabung dialisis dan direndam

dalam larutan dapar natrium fosfat 5mM pH 7,2, diaduk menggunakan magnetic

stirrer selama semalam dalam lemari es. Hasil dialisis ditambahkan larutan dapar

natrium fosfat 5mM pH 7,2 yang mengandung 0,14 M NaCl hingga volumenya

mencapai 10 ml, sentrifus 8000 rpm selama 20 menit. Pelet dibuang sedang

supernatan diambil sebagai sampel fraksi protein dengan konsentrasi 10% jenuh,

sampel fraksi protein dengan konsentrasi 20% jenuh, sampel fraksi protein dengan

konsentrasi 30% jenuh dan sampel fraksi protein dengan konsentrasi 40% jenuh.


31

5. Pengukuran konsentrasi protein total

Fraksi protein 10%, 20%, 30% dan 40% jenuh yang diperoleh, masing-

masing sebanyak 10 μl kemudian ditambah larutan dapar natrium fosfat 5mM

hingga volumenya mencapai 1 ml. Ambil dan masukkan ke dalam kuvet. Ukur

serapan dengan spektrofotometer UV pada panjang gelombang 260 nm dan 280

nm dengan blanko larutan dapar natrium fosfat 5mM pH 7,2.

Concentration = [1.55E(280)] – [0.76E(260)] mg ml-1

(Layne cit., Richterich and Colombo, 1981)

6. Propagasi dan panen sel HeLa

a. Propagasi sel HeLa

Sel diambil dari tangki nitrogen cair, lalu dengan segera dicairkan diatas

penangas air 37ºC. Ampul disemprot dengan etanol 70% dan dibuka. Sel

kemudian dipindahkan ke dalam tabung conical steril yang berisi medium RPMI

1640. Suspensi sel disentrifus 8000 rpm selama 5 menit, supernatan yang didapat

dibuang, kemudian medium RPMI diganti dengan yang baru, disuspensikan

secara perlahan-lahan. Suspensi sel kemudian disentrifus lagi selama 5 menit.

Supernatan dibuang sedang pelet ditambah dengan 1 ml medium penumbuh yang

mengandung 20% FBS. Disuspensikan perlahan hingga homogen, kemudian sel

ditumbuhkan dalam 3-4 tissue culture flask kecil, diinkubasi dalam inkubator

pada suhu 37ºC dengan aliran 5% CO2. Setelah 24 jam, medium diganti dan sel

ditumbuhkan hingga konfluen dan jumlahnya cukup untuk penelitian.


32

b. Panen sel HeLa

Setelah jumlah sel cukup, medium RPMI 1640 kemudian diganti dengan

medium RPMI 1640 yang baru sebanyak 5 ml. Sel dilepaskan dari dinding flask

dengan cara diresuspensikan menggunakan pipet Pasteur. Sel kemudian

dipindahkan ke dalam tabung conical steril, ditambah medium RPMI 1640 sampai

volume 10 ml dan kemudian disentrifus 8000 rpm selama 5 menit. Supernatan

yang didapat dibuang sedang pelet diresuspensi kembali secara perlahan dengan 1

ml media. Jumlah sel dihitung menggunakan haemocytometer. Suspensi sel

kemudian ditambahkan sejumlah medium sehingga diperoleh konsentrasi sel

sebesar 5 x 104 sel / 200 μl yang akan digunakan untuk penelitian.

7. Propagasi dan panen sel Vero

a. Propagasi sel Vero

Sel diambil dari tangki nitrogen cair, lalu dengan segera dicairkan diatas

penangas air 37ºC. Ampul disemprot dengan etanol 70% dan dibuka. Sel

kemudian dipindahkan ke dalam tabung conical steril yang berisi medium M199.

Suspensi sel disentrifus 8000 rpm selama 5 menit, supernatan yang didapat

dibuang, kemudian medium M199 diganti dengan yang baru, disuspensikan

secara perlahan-lahan. Suspensi sel kemudian disentrifus lagi selama 5 menit.

Supernatan dibuang sedang pelet ditambah dengan 1 ml medium penumbuh yang

mengandung 20% FBS. Disuspensikan perlahan hingga homogen, kemudian sel

ditumbuhkan dalam 3-4 tissue culture flask kecil, diinkubasi dalam inkubator

pada suhu 37ºC dengan aliran 5% CO2. Setelah 24 jam, medium diganti dan sel

ditumbuhkan hingga konfluen dan jumlahnya cukup untuk penelitian.


33

b. Panen sel Vero

Setelah jumlah sel cukup (kurang lebih setelah berumur 7 hari), sel dicuci

dengan FBS 10% sebanyak 3 ml. Untuk melepaskan sel-sel dari dinding flask,

diberi trypsin 0,25% sebanyak 1 ml. Sel dipindahkan dalam tabung conical steril

yang sudah berisi M199 sebanyak 7 ml. Kemudian sel dibilas kembali dengan

FBS 10% sebanyak 3 ml. Hasil bilasan dituang ke dalam tabung conical yang

sama dan disentrifus selama 5 menit. Untuk menghilangkan sisa trypsin, sel dicuci

sekali lagi dengan menggunakan medium yang sama. Kemudian pelet ditambah

media kultur sebanyak 1 ml. Selanjutnya lakukan perhitungan jumlah sel dengan

menggunakan haemocytometer. Suspensi sel ditambah sejumlah medium sehingga

memperoleh konsentrasi sel sebesar 2,5x104/100 μl dan siap dipakai untuk

penelitian (Freshney, 1986; Jacoby and Pastan, 1979; Sambrook et al, 1989).

8. Uji sitotoksisitas terhadap sel HeLa dan sel Vero

a. Uji sitotoksisitas dengan metode MTT terhadap sel HeLa

Seratus μl suspensi sel HeLa dengan konsentrasi 5 x 104 sel / 200 μl

dimasukkan ke dalam sumuran-sumuran pada 96-well plate dan diinkubasi

bersama fraksi protein satu seri kadar selama 24 jam. Replikasi dilakukan

sebanyak 5 kali dengan memberikan perlakuan yang sama terhadap 11 baris

sumuran. Sebagai kontrol, 100 μl suspensi sel ditambahkan ke dalam sumuran

yang berisi medium RPMI 1640 dan dapar natrium fosfat 5mM pH 7,2 sedangkan

untuk faktor koreksi, 100 μl sampel ditambahkan ke dalam sumuran yang berisi

medium RPMI 1640 dan dapar natrium fosfat 5mM pH 7,2. Selanjutnya sel

diinkubasikan dalam inkubator dengan aliran 5% CO2 pada suhu 37ºC. Pada akhir


34

inkubasi, pada masing-masing sumuran ditambahkan 10 μl MTT 5 mg/ml, dan

diinkubasi lagi semalam pada suhu 37ºC. Sel yang hidup akan bereaksi dengan

MTT membentuk kristal formazan berwarna ungu. Reaksi MTT dihentikan

dengan penambahan reagen stopper, diinkubasi lagi selama semalam pada suhu

kamar. Kemudian serapan dapat dibaca dengan ELISA Reader pada panjang

gelombang 550 nm.

b. Uji sitotoksisitas dengan metode MTT terhadap sel Vero

Seratus μl suspensi sel Vero dengan konsentrasi 5 x 104 sel / 200 μl

dimasukkan ke dalam sumuran-sumuran pada 96-well plate dan diinkubasi

bersama fraksi protein satu seri kadar selama 24 jam. Replikasi dilakukan

sebanyak 5 kali dengan memberikan perlakuan yang sama terhadap 11 baris

sumuran. Sebagai kontrol, 100 μl suspensi sel ditambahkan ke dalam sumuran

yang berisi medium M199 dan dapar natrium fosfat 5mM pH 7,2 sedangkan untuk

faktor koreksi, 100 μl sampel ditambahkan ke dalam sumuran yang berisi medium

M199 dan dapar natrium fosfat 5mM pH 7,2. Selanjutnya sel diinkubasikan dalam

inkubator dengan aliran 5% CO2 pada suhu 37ºC. Pada akhir inkubasi, pada

masing-masing sumuran ditambahkan 10 μl MTT 5 mg/ml, dan diinkubasi lagi

semalam pada suhu 37ºC. Sel yang hidup akan bereaksi dengan MTT membentuk

kristal formazan berwarna ungu. Reaksi MTT dihentikan dengan penambahan

reagen stopper, diinkubasi lagi selama semalam pada suhu kamar. Kemudian

serapan dapat dibaca dengan ELISA Reader pada panjang gelombang 550 nm.


35

G. Analisis Hasil

Prosentase kematian sel pada metode MTT adalah selisih absorbansi

kontrol dengan absorbansi perlakuan dibagi absorbansi kontrol dikalikan 100%

atau :

Persen kematian = kontrol

sel) tanpaperlakuan - (perlakuan - kontrol x 100%

(Meyer, Ferrigni, Putnam, Jacobsen, Nochols, Mc Laughlin, 1982)

Hasil uji berupa prosentase kematian sel tersebut kemudian dianalisis

secara statistik menggunakan analisis probit untuk mengetahui konsentrasi protein

yang dapat mengakibatkan kematian 50% populasi sel HeLa maupun sel Vero

(LC50). Analisis statistik menggunakan uji t-independent sample dilakukan untuk

membandingkan daya sitotoksisitas fraksi protein daun mimba terhadap sel HeLa

dengan sel Vero.


36

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Preparasi Fraksi Protein Daun Mimba

Daun segar tanaman Azadirachta indica A. Juss yang telah dikumpulkan

dan diseleksi, dicuci bersih dengan air mengalir supaya pengotor-pengotor yang

menempel pada daun dapat dihilangkan. Daun dipotong dari tangkainya,

kemudian digerus dengan penambahan larutan dapar natrium fosfat 5mM pH 7,2

yang mengandung 0,14 M NaCl sedikit demi sedikit dalam mortir yang

ditempatkan dalam wadah berisi air es. Larutan dapar digunakan untuk menjaga

stabilitas, sedangkan kandungan NaCl di dalam larutan dapar tersebut berfungsi

untuk mempermudah kelarutan protein yang terkandung di dalam daun tanaman

mimba. Penggerusan daun dalam mortir yang ditempatkan dalam wadah berisi air

es dimaksudkan untuk menjaga temperatur percobaan supaya protein daun tetap

stabil dan tidak mengalami kerusakan. Ekstrak gubal yang diperoleh dari 450

gram daun mimba sebanyak 515 ml.

Pembuatan fraksi protein daun mimba (Azadirachta indica A. Juss)

dilakukan dengan cara pengendapan protein menggunakan amonium sulfat.

Mekanisme pengendapan protein dengan penambahan amonium sulfat ini disebut

salting out. Amonium sulfat memiliki ion anorganik yang berkompetisi dengan

molekul protein dalam mengikat air. Amonium sulfat dapat mengikat air lebih

banyak daripada protein karena sifat amonium sulfat lebih polar dibandingkan

protein sehingga kelarutan protein dalam air menurun dan dapat mengendap.

36


37

Fraksi protein dibuat secara bertingkat dengan menambahkan amonium

sulfat dalam jumlah tertentu hingga mencapai kejenuhan 10%, 20%, 30%, dan

40%. Fraksi protein 10% jenuh (FP10) diperoleh dengan menambahkan amonium

sulfat sebanyak 27,45 gram ke dalam ekstrak gubal yang pertama kali diperoleh

yaitu 515 ml. Fraksi protein 20% jenuh (FP20) diperoleh dengan menambahkan

amonium sulfat sebanyak 27,47 gram ke dalam 500 ml ekstrak gubal dari

pembuatan fraksi protein 10%. Fraksi protein 30% jenuh (FP30) diperoleh dengan

menambahkan amonium sulfat sebanyak 28,35 gram ke dalam 500 ml ekstrak

gubal dari pembuatan fraksi protein 20%. Fraksi protein 40% jenuh (FP40)

diperoleh dengan menambahkan amonium sulfat sebanyak 29,28 gram ke dalam

500 ml ekstrak gubal dari pembuatan fraksi protein 30%.

Fraksi protein yang telah diperoleh kemudian dimurnikan dari amonium

sulfat yang ikut terendapkan bersama protein dengan cara dialisis. Tabung dialisis

dipanaskan dalam larutan EDTA-NaHCO3 untuk membersihkan tabung dialisis

tersebut dari bahan kimia yang tertinggal pada saat pembuatannya. Masing-

masing fraksi protein dimasukkan ke dalam tabung dialisis terpisah tetapi

direndam di dalam satu beaker glass yang berisi larutan dapar natrium fosfat

5mM pH 7,2 dengan pengadukan menggunakan magnetic stirrer selama semalam

dan dijaga suhunya. Hal ini dilakukan supaya kejenuhan tidak hanya terjadi di

sekitar tabung dialisis tetapi merata di seluruh isi beaker glass sehingga proses

dialisis ini dapat berlangsung sempurna. Proses dialisis terjadi dengan mekanisme

difusi pasif karena konsentrasi amonium sulfat di dalam tabung dialisis lebih

tinggi daripada di luar tabung dialisis sehingga amonium sulfat akan keluar dari


38

tabung dialisis ke dalam beaker glass yang berisi larutan dapar natrium fosfat

5mM pH 7,2. Tabung dialisis bersifat semipermeabel dan mempunyai pori yang

hanya mengeluarkan partikel-partikel kecil yang berukuran kurang dari 15.000-

20.000 Dalton, misalnya partikel amonium sulfat, sedangkan protein yang

merupakan makromolekul akan tersaring dan tetap tertinggal di dalam tabung

dialisis. Pada saat dialisis dilakukan penggantian larutan dapar guna menjaga

perbedaan konsentrasi amonium sulfat yang berada di dalam tabung dialisis dan

yang berada di luar tabung dialisis tetap besar sehingga konsentrasi amonium

sulfat di dalam larutan dapar tidak terlalu jenuh serta mekanisme difusi pasif tetap

terjadi. Proses dialisis dilakukan selama satu malam dan diharapkan amonium

sulfat dapat dikeluarkan semua dari sampel sehingga diperoleh fraksi protein

murni. Penggunaan larutan dapar berfungsi menjaga nilai pH. Nilai pH larutan

dapar dipengaruhi oleh perubahan temperatur. Oleh sebab itu, selama proses

dialisis temperatur tetap dijaga dengan melakukan dialisis di dalam lemari es.

B. Penetapan Konsentrasi Fraksi Protein

Fraksi protein yang telah diperoleh selanjutnya ditetapkan konsentrasinya

secara kolorimetri dengan menggunakan spektrofotometer ultraviolet pada

panjang gelombang 280 nm dan 260 nm. Metode ini digunakan karena protein di

dalam daun mimba mengandung residu asam amino tirosin, triptofan dan

fenilalanin yang strukturnya mempunyai kromofor dan auksokrom sehingga

mampu mengabsorpsi sinar secara maksimal pada panjang gelombang 280 nm.

Penetapan konsentrasi fraksi protein juga dilakukan pada panjang gelombang 260


39

nm sebagai faktor koreksi. Faktor koreksi ini diperlukan untuk mengoreksi adanya

senyawa-senyawa lain yang akan terabsorpsi secara maksimal pada panjang

gelombang 260 nm seperti asam nukleat beserta komponennya dan senyawa-

senyawa yang di dalam strukturnya memiliki cincin purin dan pirimidin.

Perhitungan konsentrasi protein dapat dilihat pada lampiran. Konsentrasi protein

yang diperoleh untuk FP10 adalah 16,40 mg/ml, FP20 adalah 16,15 mg/ml, FP30

adalah 15,94 mg/ml, dan FP40 adalah 9,25 mg/ml.

C. Uji Sitotoksisitas Fraksi Protein

Uji sitotoksisitas dilakukan terhadap kultur sel HeLa. Kultur sel HeLa

diperoleh dari stok kultur sel HeLa yang telah ditumbuhkan terlebih dahulu di

laboratorium hayati Universitas Gadjah Mada. Uji sitotoksisitas menggunakan

metode MTT dilakukan dengan cara menginkubasi kultur sel HeLa konsentrasi

5x104 sel/200 µl media dengan 11 seri konsentrasi untuk masing-masing fraksi

protein daun mimba selama 24 jam pada suhu 37°C. Selanjutnya MTT

ditambahkan ke dalam sumuran berisi sel HeLa dan fraksi protein tersebut,

kemudian diinkubasikan kembali selama 24 jam pada suhu 37°C supaya reaksi

antara sel HeLa dengan MTT dapat tejadi sempurna.

Uji sitotoksisitas dengan metode MTT ini berdasarkan prinsip pemecahan

garam tetrazolium MTT (3-(4,5-dimetil-tiazol-2-il)-2,5-dipheniltetrazolium

bromide) oleh sistem enzim reduktase suksinat tetrazolium yang terdapat di dalam

mitokondria sel membentuk kristal formazan berwarna ungu dan tidak larut. Sel

HeLa yang tetap hidup setelah perlakuan dengan senyawa uji dapat membentuk


40

kristal formazan ungu karena aktivitas metabolisme berlangsung secara aktif

hanya pada sel hidup. Oleh karena itu, garam tetrazolium MTT yang ditambahkan

pada sel hidup akan segera bereaksi dengan cara dipecah oleh enzim reduktase

suksinat tetrazolium membentuk kristal formazan ungu di dalam mitokondria sel

hidup tersebut. Reaksi pembentukan kristal formazan ini dihentikan dengan

menambahkan reagen stopper dan diinkubasikan kembali selama 24 jam pada

suhu 37°C. Reagen stopper yang terdiri dari SDS 1% dalam HCl 0,01 N ini

berfungsi untuk melarutkan kristal formazan sehingga intensitas warna ungu yang

terbentuk dapat dibaca menggunakan ELISA Reader. Alat ELISA Reader ini

mampu mengukur intensitas senyawa pada multiwell.

Pemilihan metode MTT didasarkan pada keakuratan dan kecepatannya di

dalam mengukur absorbansi senyawa yang diukur. Hal ini dikarenakan absorbansi

yang terukur pada ELISA Reader berbanding lurus dengan jumlah sel yang masih

hidup. Penggunaan ELISA Reader ini membutuhkan waktu singkat, dapat

mengurangi subyektivitas peneliti dan mampu mengukur sampel dalam jumlah

banyak. Selain itu, metode MTT ini cukup aman dan sederhana karena tidak

digunakan bahan-bahan berbahaya serta preparasi dan perlakuan terhadap sampel

cukup mudah. Namun demikian, metode MTT ini tidak dapat digunakan untuk

sampel-sampel yang memiliki warna sebab akan mempengaruhi absorbansi yang

terukur pada ELISA Reader.

Senyawa uji yang diperoleh berwarna hijau kecokelatan mempengaruhi

pengukuran absorbansi pada ELISA Reader. Oleh karena itu, dilakukan juga

pengukuran absorbansi senyawa uji sebagai faktor koreksi untuk meminimalkan


41

gangguan dari warna sampel sehingga akan diperoleh absorbansi yang benar-

benar berasal dari warna sel hidup setelah perlakuan dengan senyawa uji. Selain

senyawa uji, digunakan juga kontrol negatif yang berisi sel, medium dan larutan

dapar natrium fosfat 5mM pH 7,2 supaya dapat diketahui bahwa perlakuan yang

diberikan benar-benar berefek terhadap sel HeLa maupun sel Vero.

ii i

ii

i (a) (b)

Gambar 2. (a) i. Sel HeLa hidup dan ii. Sel HeLa mati tanpa perlakuan. (b) i. Sel Vero hidup dan ii. Sel Vero mati tanpa perlakuan

Sebelum melakukan uji sitotoksisitas menggunakan metode MTT, terlebih

dahulu dilakukan pengamatan morfologi baik terhadap sel HeLa maupun sel

Vero. Sel HeLa hidup berbentuk seperti daun memanjang dan hidup melekat di

dasar flask, sedangkan sel HeLa yang mati berbentuk bulat tidak beraturan dan

mengapung di dalam media. Sel Vero hidup berbentuk lonjong dan hidup melekat

di dalam dasar flask, sedangkan sel Vero yang mati berbentuk bulat dan

mengapung pada media. Perbedaan ciri morfologi antara sel HeLa dengan sel

Vero tersebut tampak pada gambar 2.


42

(a) (b) Gambar 3. (a) i. Sel HeLa hidup dan ii. Sel HeLa mati setelah perlakuan dengan fraksi protein daun mimba. (b) i. Sel Vero hidup dan ii. Sel Vero mati setelah perlakuan dengan fraksi protein daun mimba

Pada gambar 3 menunjukkan setelah perlakuan dengan fraksi protein daun

mimba, jumlah sel HeLa hidup maupun jumlah sel Vero hidup semakin

berkurang. Sebaliknya, jumlah sel HeLa mati maupun jumlah sel Vero yang mati

emakin bartambah banyak. s

(a) (b) Gambar 4. (a) i. Kristal formazan ungu dan ii. Sel HeLa mati setelah perlakuan dengan MTT. (b) i. Kristal formazan ungu dan ii. Sel Vero mati setelah perlakuan dengan MTT

iii

ii i

i

i

ii ii


43

Kristal formazan berwarna ungu terbentuk setelah sel HeLa dan Sel Vero

di dalam media masing-m g diberikan perla uan dengan fraksi protein daun

mimba dan MTT. Pada gambar 4, tampak baik sel HeLa hidup m upun sel Vero

hidup membentuk kristal formazan berwarna ungu, sedangkan sel HeLa yang mati

maupun sel Vero yang mati tidak membentuk kristal formazan ungu. Sel Hela dan

sel Vero yang mati tetap dalam bentuknya semula seperti saat sebelum

itambahkan MTT yaitu bulat atau tidak beraturan dan berwarna kuning.

Sel HeLa dan sel Vero yang telah diberi perlakuan, kontrol dan senyawa

njukkan

bahwa

asin k

a

d

uji yang akan digunakan sebagai faktor koreksi diukur absorbansinya

menggunakan ELISA Reader pada panjang gelombang 550 nm. Absorbansi yang

diperoleh berbanding lurus dengan jumlah sel yang hidup setelah perlakuan. Hasil

percobaan menunjukkan sumuran sel yang diberi perlakuan memiliki intensitas

warna yang lebih rendah daripada sumuran sel kontrol. Hasil percobaan ini

sekaligus menunjukkan bahwa pada sumuran sel perlakuan terdapat lebih banyak

sel yang mati daripada sumuran kontrol. Data absorbansi juga menu

nilai absorbansi perlakuan semakin meningkat sesuai dengan semakin

kecilnya kadar protein yang diberikan. Hal-hal tersebut dapat membuktikan

bahwa fraksi protein daun mimba (Azadirachta indica A. Juss) mampu

mengakibatkan kematian sel HeLa dan sel Vero.

Data yang diperoleh dari uji sitotoksisitas fraksi protein daun mimba

terhadap kultur sel HeLa dan sel Vero berupa respon kematian masing-masing sel

dalam bentuk prosentase kematian sel. Tabel I berikut menunjukkan prosentase

kematian sel HeLa seteleh diberi senyawa uji FP10, FP20, FP30 dan FP40 daun


44

mimba dengan konsentrasi terkecil 0,20 µg/ml dan konsentrasi tertinggi 200

µg/ml pada masing-masing fraksi protein. Gambar 5 menunjukkan grafik antara

prosentase kematian sel HeLa dengan konsentrasi fraksi protein daun mimba.

Tabel I.

Prosentase kematian dari uji sitotoksisitas fraksi protein terhadap sel HeLa

Rata-rata Persen Kematian Sel HeLa ( % ) Konsentrasi fraksi protein daun

mimba (µg/ml) FP FP FP FP10 20 30 40

0,20 52,67 63,19 85,50 57,60 0,39 59,72 70,54 86,70 58,9 20,78 56,13 59,41 85,54 68,26 1,56 58,01 66,89 94,09 78,89 3,13 71,36 69,27 97,10 94,91 6,25 63,28 65,93 90,35 87,47

12,50 62,11 69,36 84,60 79,25 25,00 56,54 74,72 97,55 88,38 50,00 45,16 78,78 105,16 73,32

100,00 114,58 89,70 110,46 90,56 200,00 131,94 74,86 89,48 121,76

Grafik % Kematian Sel HeLa

0

20

40

60

80

100

120

140

0.2 0.39 0 3.13 6.2 25 50 00

Konsentrasi (μg/ml)

% K

emat

ian

.78 1.56 5 12.5 100 2

FP10FP20FP30FP40

Gambar 5. Grafik prosentase kematian sel HeLa vs konsentrasi fraksi protein daun mimba (µg/ml).


45

Berdasarkan tabel I dan gambar 5 grafik prosentase kematian sel HeLa

yang telah diberi perlakuan dengan masing-masing fraksi protein pada 11 seri

konsentrasi menunjukkan bahwa fraksi protein daun mimba memiliki

sitotoksisitas yang besar terhadap kultur sel HeLa. Pada perlakuan dengan FP10

dan FP40, grafik cenderung mengalami kenaikan, sedangkan perlakuan dengan

FP20 dan FP30, grafik cenderung menurun meskipun nilai prosentase kematian

fluktuatif yang berarti peningkatan konsentrasi fraksi protein tidak selalu diikuti

oleh peningkatan prosentase kematian sel HeLa. Nilai yang fluktuatif ini

nyebabkan tidak dapat ditarik suatu korelasi hubungan antara prosentase

sel HeLa dan konsentrasi fraksi protein. Hal ini terjadi karena kematian

alami sel HeLa sebagai subjek uji yang merupakan variabel pengacau tak

Pada penelitian yang dilakukan oleh Suwanto (2006) memberikan hasil

sebagai antikanker. Namun respon uji % kematian yang diperoleh juga fluktuatif

sehingga perlu dilakukan ekstrapolasi untuk mengetahui nilai LC .

membunuh 50% dari populasi sel. Analisis regresi probit dilakukan untuk

nilai LC FP sebesar 1,5.107 µg/ml yang menunjukkan bahwa FP daun mimba

tidak mempunyai potensi untuk dikembangkan menjadi senyawa antikanker sebab

l. Pada perlakuan terhadap sel

HeLa nilai LC50 untuk FP20 sebesar 6.10-3 µg/ml; FP30 sebesar 3,7.10-13 µg/ml dan

me

kematian

terkendali yang dapat mempengaruhi hasil uji.

bahwa fraksi protein daun mimba 30% dan 60% berpotensi untuk dikembangkan

50

Nilai LC50 merupakan konsentrasi fraksi protein daun mimba yang mampu

mengetahui nilai LC50 dari tiap fraksi protein. Pada perlakuan terhadap sel HeLa

50 10 10

nilai LC50 yang diperoleh lebih besar dari 20 µg/m


46

FP40 se

LC50 sebesar

1,0 µg/

sar 37,8%.

besar 1,8.10-2 µg/ml yang berarti lebih kecil dari 20 µg/ml. Hasil tersebut

menunjukkan bahwa FP20, FP30 dan FP40 mempunyai potensi untuk

dikembangkan menjadi senyawa antikanker.

Penelitian sebelumnya (Suwanto, 2006) memperoleh nilai

ml untuk fraksi protein 30% dan 4,1 µg/ml untuk fraksi protein 60%. Hasil

tersebut berbeda dengan LC50 yang diperoleh pada penelitian ini terutama pada

fraksi protein 30% (FP30) yaitu 3,7.10-13 µg/ml. Hal ini diduga disebabkan

kandungan protein dalam FP30 pada penelitian ini berbeda dengan protein yang

ada di dalam fraksi protein 30% pada penelitian sebelumnya (Suwanto, 2006).

Berdasarkan nilai r square, maka dapat dinyatakan bahwa FP10 daun

mimba mempengaruhi respon kematian sel HeLa sebesar 1,8%, FP20 mimba

mempengaruhi respon kematian sel HeLa sebesar 53,1%, FP30 mimba

mempengaruhi respon kematian sel HeLa sebesar 9,2% dan FP40 mimba

mempengaruhi respon kematian sel HeLa sebe

Tabel II. Prosentase kematian dari uji sitotoksisitas fraksi protein terhadap sel Vero

Rata-rata Persen Kematian Sel Vero ( % ) Konsentrasi fraksi protein daun

mimba (µg/ml) FP FP FP FP10 20 30 40

0,20 66,88 93,45 63,66 82,75 0,39 64,9 85,33 68,93 79,64 60,78 56,89 77,10 67,71 85,06 1,56 71,44 79,35 69,34 75,84 3,13 63,82 80,01 76,81 77,03 6,25 66,04 73,63 82,06 70,0 7

12,50 75,06 69,91 78,38 66,81 25,00 60,73 67,59 85,49 79,22 50,00 73,62 65,56 90,60 85,14

100,00 70,65 70,43 79,88 73,39 200,00 84,79 75,13 89,50 74,41


47

Grafik % Kematian Sel Vero

0

20

40

% K

ema 60ia

n

80

100

0.2 0.39 0.7 3.13 6.25 5 50 0

sentrasi )

t

FP10FP20FP30FP40

8 1.56 12.5 2 100 20

Kon (μg/ml

Gambar 6 k prosentase an sel V onsentra protein imba (µg/ml).

Berdasarkan tabel II dan gambar 6 gr ik pros kematian

yang telah diberi perlakuan dengan masing-masing fraksi protein pada 11 seri

konsentrasi menunjukkan bahwa fraksi protein daun mimba memiliki

sitotoksisitas terhadap kultur sel Vero. Pada perlakuan dengan FP10 dan FP30,

grafik cenderung mengalami kenaikan, sedangkan perlakuan dengan FP20 dan

FP40, grafik cenderung menurun meskipun nilai prosentase kematian fluktuatif

yang berarti peningkatan konsentrasi fraksi protein tidak selalu diikuti oleh

peningkatan prosentase kematian sel Vero. Nilai yang fluktuatif ini menyebabkan

tidak dapat ditarik suatu korelasi hubungan antara prosentase kematian sel Vero

konsentrasi fraksi protein. Hal ini terjadi karena kematian alami sel Vero

mempengaruhi hasil uji.

. Grafi kemati ero vs k si fraksi daun m

af entase sel Vero

dan

sebagai subjek uji yang merupakan variabel pengacau tak terkendali yang dapat


48

Respon uji % kematian sel Vero yang diperoleh juga fluktuatif sehingga

perlu dilakukan ekstrapolasi untuk mengetahui nilai LC50. Analisis regresi probit

dilakukan untuk mengetahui nilai LC50 dari tiap fraksi protein. Pada perlakuan

terhadap sel Vero nilai LC50 FP20 sebesar 1,2.104 µg/ml dan FP40 sebesar 2,3.1011

µg/ml yang menunjukkan bahwa FP20 dan FP40 daun mimba mempunyai potensi

untuk dikembangkan menjadi senyawa antikanker sebab nilai LC50 yang diperoleh

> 20 µg/ml dan lebih besar dari nilai LC50 FP20 dan FP40 daun mimba terhadap sel

HeLa. Pada perlakuan terhadap sel Vero nilai LC50 untuk FP10 sebesar 1,2.10-3

µg/ml dan FP30 sebesar 1,2.10-2 µg/ml yang berarti < 20 µg/ml. Hasil tersebut

menunjukkan bahwa FP10 dan FP30 tidak mempunyai potensi untuk

dikembangkan menjadi senyawa antikanker karena LC50 FP10 terhadap sel Vero <

20 µg/ml dan lebih kecil dari LC50 FP10 terhadap sel HeLa yang berarti FP10 daun

mimba lebih toksik terhadap sel Vero (sel normal) dibandingkan sel HeLa,

seddangkan LC50 FP30 terhadap sel Vero lebih besar dibandingkan sel HeLa tetapi

nilai LC50 FP30 pada sel Vero < 20 µg/ml.

Berdasarkan nilai r square, maka dapat dinyatakan bahwa FP10 daun

mimba mempengaruhi respon kematian sel Vero sebesar 37,3%, FP20 mimba

mempengaruhi respon kematian sel Vero sebesar 62%, FP30 mimba

mempengaruhi respon kematian sel Vero sebesar 79,6% dan FP40 mimba

mempengaruhi respon kematian sel Vero sebesar 12,5%.

Bila hasil prosentase kematian sel HeLa pada tabel I dibandingkan dengan

sel Vero pada tabel II maka prosentase kematian sel Vero setelah perlakuan

dengan fraksi protein daun mimba cenderung lebih besar daripada sel HeLa,


49

seperti pada FP10 dengan konsentrasi terkecil yaitu 0,2 μg/ml mampu membunuh

sel Vero 66,88%; sedangkan terhadap sel HeLa mampu membunuh sebanyak

52,67%. Selain itu, nilai LC50 yang telah diketahui melalui analisis probit

kemudian dihitung secara statistik untuk menentukan distribusi dari masing-

masing

njukkan bahwa p > 0,05

pada se

kelompok uji. Hasil yang diperoleh menunjukkan bahwa setiap fraksi

memiliki distribusi normal dalam setiap perlakuan sebab nilai p > 0,05. Oleh

karena itu, dapat dilanjutkan analisis menggunakan uji t-independent sample

untuk membandingkan sitotoksisitas fraksi protein terhadap sel HeLa dengan sel

Vero secara statistik. Hasil uji t-independent sample menu

tiap fraksi. Hal ini berarti sitotoksisitas masing-masing fraksi protein daun

mimba terhadap sel HeLa berbeda tidak bermakna dengan sitotoksisitasnya

terhadap sel Vero.

Berdasarkan analisis hasil yang telah dilakukan maka fraksi protein daun

mimba FP10, FP20, FP30 dan FP40 mempunyai kemampuan yang sama dalam hal

menginduksi kematian sel kanker (sel HeLa) dan sel normal (sel Vero) sehingga

tidak memiliki potensi untuk dikembangkan lebih lanjut sebagai antikanker.

Hasil yang diperoleh dari penelitian ini ternyata sama dengan penelitian

serupa yang juga telah dilakukan yaitu, penelitian sitotoksisitas fraksi protein

daun mimba FP10, FP20, FP30 dan FP40 terhadap sel myeloma (Purnamasari, 2007)

yang menyatakan bahwa FP10, FP20, FP30 dan FP40 daun mimba tidak berpotensi

untuk dikembangkan sebagai antikanker. Hasil yang sama juga ditunjukkan pada

penelitian sitotoksisitas fraksi protein FP30, FP40, FP50 dan FP60 terhadap sel HeLa


50

(Puspitaningrum, 2007), begitu pula hasil penelitian serupa terhadap sel myeloma

(Saptawati, 2007)

Namun hasil yang berbeda ditunjukkan pada penelitian sitotoksisitas fraksi

protein FP10, FP20, FP30 dan FP40 terhadap kultur sel Raji (Lahrita, 2006) yang

menyatakan bahwa FP20 daun mimba berpotensi untuk dikembangkan sebagai

antikanker dengan LC50 terhadap sel Raji 2,4.10-11 μg/ml dan LC50 terhadap sel

Vero 1

hadap sel Vero 4,85 x 10-2 μg/ml, begitu pula hasil penelitian

serupa

,1.104 μg/ml, juga pada penelitian serupa terhadap sel SiHa (Harsono,

2007) yang menyatakan bahwa FP20 daun mimba berpotensi untuk dikembangkan

sebagai antikanker dengan LC50 terhadap sel SiHa 0,48 μg/ml dan LC50 terhadap

sel Vero 11,4.103 μg/ml. Hasil berbeda juga ditunjukkan pada pada penelitian

sitotoksisitas fraksi protein FP30, FP40, FP50 dan FP60 terhadap kultur sel Raji

(Jenny, 2007) yang menyatakan bahwa FP60 daun mimba berpotensi untuk

dikembangkan sebagai antikanker dengan LC50 terhadap sel Raji 9,71 x 10-3

μg/ml dan LC50 ter

terhadap sel SiHa (Mellina, 2007) yang menyatakan bahwa FP40 daun

mimba berpotensi untuk dikembangkan sebagai antikanker dengan LC50 terhadap

sel SiHa 0,45 μg/ml dan LC50 terhadap sel Vero > 1 g/ml.

Apabila dibandingkan dengan penelitian Suwanto (2006) yang meneliti

mengenai fraksi protein daun mimba 30%, 60% dan 100% dengan kesimpulan

bahwa fraksi 30% dan 60% berpotensi untuk dikembangkan sebagai antikanker

maka pada penelitian kali ini diketahui bahwa FP10, FP20, FP30 dan FP40 daun

mimba terutama FP30 tidak berpotensi untuk dikembangkan sebagai antikanker.

Nilai LC50 dari FP30 pada sel HeLa < 20 µg/ml tetapi LC50 FP30 pada sel Vero


51

juga < 20 µg/ml sehingga FP30 memiliki kemampuan yang sama dalam

menginduksi kematian sel HeLa dan sel Vero. Suatu senyawa dapat digunakan

sebagai antikanker bila memiliki LC50 ≤ 20 µg/ml (Suffness and Pezzuto, 1991).

Selain itu, senyawa tersebut harus selektif yaitu mampu menekan atau membunuh

sel kanker tanpa merusak sel normal tubuh.

Suatu penelitian mengenai efek antihepatotoksik rebusan daun mimba

(Azadir

secara hati-hati pada pengobatan

kanker

achta indica A. Juss.) pada mencit jantan dengan metode pengukuran

waktu tidur heksobarbital (Murdiana, 2000) menyimpulkan bahwa rebusan daun

mimba pada kisaran dosis 18,2-72,8 mg/kg berat badan mempunyai efek

antihepatotoksik terhadap induksi karbon tetraklorida. Diduga rebusan daun

mimba mengandung asam amino penyusun protein, sedangkan protein adalah

bahan penyusun enzim sehingga rebusan daun mimba mampu menggantikan

enzim-enzim yang terlepas oleh induksi karbon tetraklorida dan asam amino yang

berasal dari rebusan daun mimba dapat memperbaiki fungsi hati terutama Multi

Function Oxidase (MFO) dan sitokrom P-450. Jika dibandingkan dengan

penelitian tersebut, maka fraksi protein daun mimba FP10, FP20, FP30 dan FP40

dalam penelitian ini sebaiknya digunakan

. Namun, bila digunakan untuk pengobatan yang lain seperti

hepatoprotektor berdasarkan beberapa penelitian salah satunya yang dilakukan

oleh Murdiana (2000) maka daun mimba dapat digunakan sebagai

hepatoprotektor.

Penelitian ini menggunakan waktu 24 jam untuk inkubasi sel HeLa

maupun sel Vero dengan fraksi protein dan MTT. Apabila enzim mitokondria


52

masih berfungsi meskipun sel sudah mati maka MTT akan tetap tereduksi oleh

enzim tersebut membentuk kristal formazan ungu. Oleh sebab itu, terdapat dugaan

bahwa lama waktu inkubasi turut mempengaruhi hasil penelitian.

Jenis protein yang bersifat sitotoksik di dalam daun mimba ini maupun

mekanisme aktivitas sitotoksiknya terhadap sel HeLa dan sel Vero belum dapat

ditentukan secara pasti. Namun demikian, berdasarkan cara isolasi protein yang

dilarutkan ke dalam larutan dapar mengandung garam, maka diduga protein yang

memiliki aktivitas sitotoksik adalah protein yang dapat larut dalam pelarut

tersebut yaitu protein albumin, globulin, atau histon.


53

BAB V

KESIMPULAN DAN SARAN

A. Kesimpulan

. Fraksi protein daun mimba (Azadirachta indica A. Juss) FP10, FP20, FP30 dan

FP40 memiliki sitotoksisitas terhadap kultur sel HeLa dan sel Vero.

. Nilai LC50 fraksi protein daun mimba terhadap sel HeLa untuk FP10 sebesar

1,5.107 µg/ml; FP20 sebesar 6.10-3 µg/ml; FP30 sebesar 3,7.10-13 µg/ml dan

FP40 sebesar 1,8.10-2 µg/ml, sedangkan nilai LC50 fraksi protein daun mimba

terhadap sel Vero FP10 sebesar 1,2.10-3 µg/ml; FP20 sebesar 1,2.104 l;

FP30 sebesar 1,2.10-2 µg/ml dan FP40 sebesar 2,3.1011 µg/ml.

. Fraksi protein daun mimba FP10, FP20, FP30 dan FP40 tidak berpotensi untuk

dikembangkan sebagai antikanke

B.

1. Perlu dilakukan penelitian yan aktu inkubasi sel dan fraksi

2. ba yang

1

2

µg/m

3

r.

Saran

g sama dengan w

protein lebih dari 24 jam.

Perlu dilakukan penelitian mengenai jenis-jenis protein daun mim

memiliki mekanisme sitotoksisitas terhadap sel HeLa dan mekanisme

perlindungan terhadap sel normal.

53


54

DAFTAR PUSTAKA

onim, 2005a, Neem, An dia.thefreedictionary.com/Neemhttp://encyclope . Diakses

pada 27 Januari 2006

Anonim, 2005b, Cancer, http://encyclopedia.thefreedictionary.com/

Cancer. Diakses pada 27 Januari 2006

Concentration,http://sbio.uct.ac.za/Sbio/documentation/Protein%20Conce

Anonim, 2006a, Methods for Concentrating Protein Solutions, Protein

ntration.html. Diakses 9 Oktober 2006

line),http://www.olympusmicro.com/primer/techniques/fluorescence/gallerAnonim, 2006b, Normal African Green Monkey Kidney Epithelial Cells (Vero

y/cells/vero/verocells.html, Diakses pada 5 Febuari 2006

onim, 2007a, Cervical Cancer, An p://en.wikipedia.org/wiki/Cervical_cancerhtt ,

Diakses pada 6 Februari 2007 Anonim, 2007b, HeLa, http://en.wikipedia.org/wiki/HeLa, Diakses pada 6

Februari 2007 Ariyani, 2004, Sitotoksisitas Fraksi Protein Daun Mimba (Azadirachta indica A.

Juss.) Terhadap Kultur Sel Raji, Skripsi, Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma, Yogy

,

andra ba (Azadirachta indica A.

u

akarta Backer, C.A. dan Bakhuizen Van Den Brink, R.C., 1963, Flora of Java, Vol I, 3-

12, N.V.P. Noordhoof, Gronin , The Netherlands gen Backer, C.A. dan Bakhuizen Van Den Brink, R.C., 1965, Flora of Java, Vol II,

116-117, 121, N.V.P. Noordhoof, Groningen, The Netherlands Barile, F.A., 1997, Invitro: Methods in Pharmaceutical Research, 2-3 34-43,

Academic Press, Valencia, Spanyol

, 2006, Sitotoksisitas Fraksi Protein Daun MimCJuss.) Hasil Pengendapan dengan Amonium Sulfat 30%, 60% dan 100% Jenuh Terhadap Kultur Sel SiHa, Skripsi, Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta

Cassaret, J.M. and Doull, J., 2001, Toxicology, The Basic Science of Poison, 27,

MacMilan Publishing, Co.Inc., New York Dasgupta, A., 1992, Modern Immunology: Basic, Clinical, Laboratory, Jaypee

Brothers Medical P blisher Ltd., New Delhi


55

Febriani, A.C., 2004, Sitotoksisitas Fraksi Protein Daun Mimba (Azadirachta indica A. Juss.) Terhadap Kultur Sel HeLa, Skripsi, Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta

K

Farmakologi dan Terapi, Bagian Farmakologi Fakultas Kedokteran, Universitas Indonesia, Jakarta

Gennar

onium Sulfat 30%, 60% dan 100% Jenuh Terhadap Kultur Sel Myeloma, Skripsi, Fakultas Farmasi

arsono, V.K., 2007, Sitotoksisitas Fraksi Protein Daun Mimba (Azadirachta

artono, A., 1999, Terapi Nutrisi dan Herbal untuk Kanker,

Fenty, 2000, Kanker Leher Rahim, dalam Yuswanto, Ag. dan Sinaradi, F.,

anker, 1-13, Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta Freshney, R.I., 1986, Culture of Animal Cell: a Manual of Basic Technique,

second (2nd) Ed, 3-10, 183-197, Liss. Inc, New York Ganiswarna, S.G. dan Nafrialdi, 1995, Antikanker dan Imunosupresan, 686-701,

dalam Ganiswarna, S.G., (Ed),

o, A.R., 2000, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th edition, 757-762, Philadelphia College of Pharmacy and Science, Philadelphia

Hariadi A., 2006, Sitotoksisitas Fraksi Protein Daun Mimba (Azadirachta indica

A. Juss.) Hasil Pengendapan dengan Am

Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta

Hindica A. Juss.) FP10, FP20, FP30 dan FP40 Terhadap Kultur Sel SiHa, Skripsi, Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta

Hhttp://www.indomedia.com/intisari/1999/oktober/b1_terapi.htm. Diakses pada 27 Februari 2006

Hutapea, J., 1993, Inventaris Tanaman Obat Indonesia, 67-68, Badan Litbang

Kesehatan, Departemen Kesehatan Republik Indonesia

ational-

Ichim, C.V., 2005, Revisiting immunosurveillance and immunostimulation:

Implications For Cancer Immunotherapy, Volume 3, 1-14, Journal Of Translational Medicine, http://www.translmedicine.com/content/3/1/8, Diakses pada 27 Maret 2007

JacobyAcademia Press Inc, New York

, W.B. and Pastan, I.H., 1979, Methods in Enzymology Cell Culture, Volume VIII,

Jenny, 2007, Sitotoksisitas Fraksi Protein Daun Mimba (Azadirachta indica A.

Juss.) FP30, FP40, FP50 dan FP60 Terhadap Kultur Sel Raji, Skripsi, Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta


56

Kardinan, A. dan Taryono, 2003, Tanaman Obat Penggempur Kanker, 22-29, PT

Kuswib adi, F.,

Kanker, 29-35, Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta

LahritaP30 dan FP40 Terhadap Kultur Sel Raji, Skripsi,

Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta

Lusia, ba (Azadirachta indica A. Juss.) Terhadap Kultur Sel HeLa, Skripsi, Fakultas Farmasi

Mellina

Skripsi, Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta

Meyer, .B., Nochols, D.E., and Mc Laughlin, J.L., 1982, Brine Shrimp: A Convenient General Bioassay for

Moran, . and Rawn, J.D., 1994,

Biochemistry, 2 ed, 4.18, 5.1-5.3, Neil Patterson Publisher/Prentice Hall

ulyadi, 1996, Kanker: Karsinogen, Karsinogenesis dan Antikanker, 93-98,

urdiana, H.E., 2000, Efek Antihepatotoksik Rebusan Daun Mimba (Azadirachta

urnamasari, A., 2007, Sitotoksisitas Fraksi Protein Daun Mimba (Azadirachta

uspitaningrum, L.E., 2007, Sitotoksisitas Fraksi Protein Daun Mimba

Agromedia Pustaka, Jakarta

awati, L., 2000, Apa itu Kanker?, dalam Yuswanto, Ag. dan Sinar

, L., 2007, Sitotoksisitas Fraksi Protein Daun Mimba (Azadirachta indica A. Juss.) FP10, FP20, F

S.W.K., 2004, Sitotoksisitas Fraksi Protein Daun Mim

Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta

, B., 2007, Sitotoksisitas Fraksi Protein Daun Mimba (Azadirachta indica A. Juss.) FP30, FP40, FP50 dan FP60 Terhadap Kultur Sel SiHa,

B.N., Ferrigni, N.R., Putnam, J.E., Jacobsen, L

Active Plant Concenient, Volume 45, 32-34, Planta Medica

L.A., Scrimgeur, K.G., Horton, H.R., Ochs, R.Snd

Inc., London

MTiara Wacana, Yogyakarta

Mindica A. Juss.) Pada Mencit Jantan dengan Metode Pengukuran Waktu Tidur Heksobarbital, Skripsi, Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta

Murray, R.F., Granner, D.K., Mayes, P.A. and Rodwell, V.W., 1995, Biokimia

Harper, ed 22, 47, 52, 53, alih bahasa: Hartono, A., EGC, Jakarta

Pindica A. Juss.) FP10, FP20, FP30 dan FP40 Terhadap Kultur Sel Myeloma, Skripsi, Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta

P(Azadirachta indica A. Juss.) FP30, FP40, FP50 dan FP60 Terhadap Kultur Sel HeLa, Skripsi, Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta


57

Rang, H.P., Dale, M.M., Ritter, J.M. and Moore, P.K., 2003, Pharmacology, fifth (5th) Ed, 693-696, Elsevier Science, London, UK

ichterich, R. and Colombo, J.P., 1981, Clinical Chemistry: Theory, Practice,

obbyono, 2006, Sitotoksisitas Fraksi Protein Daun Mimba (Azadirachta indica

obinson, T., 1991, Kandungan Organik Tumbuhan Tinggi, 245-254, Penerbit

akidja, M.S., 1989, Kimia Pangan, 204, Departemen Pendidikan dan

Sambro ratory

Manual, 2 Edition, Coldspring Harbor Laboratory Press

Saptaw

ltas Farmasi Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta

ademic Press, London

Sukras

uwanto, N.B., 2006, Sitotoksisitas Fraksi Protein Daun Mimba (Azadirachta

h Terhadap Kultur Sel HeLa, Skripsi, Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta

Widiya ’-Hidroksi-3’-metoksifenil)-1-(4”-metoksifenil)prop-2-en-1-on dan Calkon Terhadap Sel

Rand Interpretation, 408, John Wiley & Sons, Ltd, New York, USA

RA. Juss.) Hasil Pengendapan dengan Amonium Sulfat 30%, 60% dan 100% Jenuh Terhadap Kultur Sel Raji, Skripsi, Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta

RITB, Bandung

SKebudayaan Direktorat Jendral Pendidikan Tinggi, Jakarta

ok, Fritsch, E.F. and Maniatis, T., 1989, Molecular Cloning: A Labond

ati, A.Y.E., 2007, Sitotoksisitas Fraksi Protein Daun Mimba (Azadirachta indica A. Juss.) FP30, FP40, FP50 dan FP60 Terhadap Kultur Sel Myeloma, Skripsi, Faku

Schwartz, B.D., 1991, Immunology, 218, The UpJohn Company, Kalamazoo,

Michigan Suffness, M. and Pezzuto, J.M., 1991, Assays Related to Cancer Drug Discovery,

Methods in Plant Biochemistry: Assay for Bioactivity, Vol. 6, Ac

no, 2003, Mimba: Tanaman Obat Multifungsi, 1-10, 20-30, PT Agromedia Pustaka, Jakarta

Sindica A. Juss.) Hasil Pengendapan dengan Amonium Sulfat 30%, 60% dan 100% Jenu

ni, L.R., 2005, Uji Sitotoksisitas Senyawa (2E)-3 (4

HeLa dan Sel Vero, Skripsi, Fakultas Farmasi Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta


58

LAMPIRAN

Lampiran 1. Jumlah penambahan amonium sulfat pada derajat kejenuhan tertentu Tabel III. Volume larutan ekstrak gubal protein daun mimba

Fraksi Protein Volume Ekstrak (ml) FP10 515 FP20 500 FP30 500 FP40 500

Pada kondisi percobaan tertentu yaitu percobaan pada suhu 4°C maka jumlah amonium sulfat yang ditambahkan dihitung menggunakan rumus:

G = 0,3.S1)-(100

S1)-533(S2

G = Jumlah amonium sulfat yang ditambahkan per 1 liter larutan (g) S1 = derajat kejenuhan awal S2 = derajat kejenuhan akhir

(Anonim, 2006a) a. Jumlah amonium sulfat yang ditambahkan untuk mencapai derajat kejenuhan

10% dari kejenuhan total

G = 0,3.0)-(100

0)-533(10

= 53,30 g dalam 1 liter

G = ml 1000ml 515 x 53,30 g

= 27,45 g dalam 515 ml

Jumlah amonium sulfat yang ditambahkan untuk mencapai kejenuhan 10% (FP10) = 27,45 g b. Jumlah amonium sulfat yang ditambahkan untuk mencapai derajat kejenuhan



59

G = 0,3.10)-(100

10)-533(20


G = ml 1000ml 500 x 54,95 g

= 27,47 g dalam 500 ml Jumlah amonium sulfat yang ditambahkan untuk mencapai kejenuhan 20% (FP20) = 27,47 g c. Jumlah amonium sulfat yang ditambahkan untuk mencapai derajat kejenuhan


G = 0,3.20)-(100

20)-533(30


G = ml 1000ml 500 x 56,70 g

= 28,35 g dalam 500 ml Jumlah ammonium sulfat yang ditambahkan untuk mencapai kejenuhan 30% (FP30) = 28,35 g d. Jumlah amonium sulfat yang ditambahkan untuk mencapai derajat kejenuhan


G = 0,3.30)-(100

30)-533(40


G = ml 1000ml 500 x 58,57 g

= 29,28 g dalam 500 ml Jumlah ammonium sulfat yang ditambahkan untuk mencapai kejenuhan 40% (FP40) = 29,28 g


60

Lampiran 2. Perhitungan konsentrasi protein Perhitungan menurut Layne:

Concentration = [1.55E(280)] – [0.76E(260)] mg ml-1

(Layne cit., Richterich and Colombo, 1981)

Tabel IV. Absorbansi fraksi protein pada panjang gelombang 280 nm dan 260 nm Fraksi protein daun

mimba Absorbansi pada λ 280

nm Absorbansi pada λ 260

nm FP10 0,197 0,186 FP20 0,191 0,177 FP30 0,223 0,245 FP40 0,195 0,276

Faktor pengenceran = 100 kali

a. Konsentrasi FP10 = (1,55 x 0,197) - (0,76 x 0,186)

= 0,16399 mg/ml x 100

= 16,399 mg/ml

b.Konsentrasi FP20 = (1,55 x 0,191) - (0,76 x 0,177)

= 0,16153 mg/ml x 100

= 16,153 mg/ml

c. Konsentrasi FP30 = (1,55 x 0,223) - (0,76 x 0,245)

= 0,15945 mg/ml x 100

= 15,945 mg/ml

d. Konsentrasi FP40 = (1,55 x 0,195) - (0,76 x 0,276)

= 0,09249 mg/ml x 100

= 9,249 mg/ml


61

Lampiran 3. Absorbansi sel dengan metode MTT

A. Sitotoksisitas fraksi protein daun mimba terhadap sel HeLa

Tabel V. Hasil uji sitotoksik fraksi protein daun mimba FP10 terhadap kultur sel HeLa

Absorbansi

Konsentrasi fraksi protein

(µg/ml) 0.2 0.39 0.78 1.56 3.13 6.25 12.5 25 50 100 200 Kontrol

I 1.033 1.104 1.108 1.016 0.863 0.98 0.831 1.008 0.797 0.819 0.669 0.869

II 0.944 0.844 0.882 0.829 0.855 0.902 0.841 0.871 1.681 0.822 0.7 0.841

III 0.957 0.642 0.879 0.823 0.778 0.792 0.791 0.85 0.785 0.664 0.681 0.919

IV 1.095 1.08 1.042 1.013 0.843 0.865 0.9 0.821 0.817 0.806 0.675 0.939

Perlakuan

V 0.854 0.88 0.856 0.876 0.886 0.837 0.844 0.875 0.815 0.758 0.678 0.942

Rata-rata 0.977 0.91 0.953 0.911 0.845 0.875 0.841 0.885 0.979 0.774 0.681 0.902

I 0.521 0.521 0.53 0.504 0.513 0.497 0.451 0.477 0.45 0.442 0.525

II 0.541 0.526 0.545 0.539 0.548 0.542 0.486 0.471 0.468 0.467 0.503 Perlakuan tanpa sel

III 0.587 0.593 0.598 0.555 0.699 0.593 0.562 0.531 0.535 1.807 1.878

Rata-rata 0.550 0.547 0.558 0.533 0.587 0.544 0.500 0.493 0.484 0.905 0.969

Tabel VI. Hasil uji sitotoksik fraksi protein daun mimba FP20 terhadap kultur sel HeLa

Absorbansi


(µg/ml) 0.2 0.39 0.78 1.56 3.13 6.25 12.5 25 50 100 200 Kontrol

I 0.951 0.973 0.992 0.937 0.931 0.921 0.901 0.83 0.763 0.663 0.622 0.986

II 1.064 0.981 0.94 1.048 0.916 0.929 0.903 0.839 0.767 0.705 0.596 1.001

III 1.184 0.799 1.163 0.879 0.916 0.958 0.88 0.827 0.77 0.688 1.818 0.993

IV 0.969 0.947 0.939 0.909 0.896 0.871 0.861 0.817 0.705 0.584 0.529 0.998

Perlakuan

V 0.984 0.941 0.938 0.935 0.927 0.905 0.865 0.818 0.714 0.573 0.474 1.004

Rata-rata 1.030 0.928 0.994 0.942 0.917 0.917 0.882 0.826 0.744 0.643 0.808 0.996

I 0.605 0.61 0.577 0.611 0.578 0.557 0.542 0.506 0.501 0.528 0.549


III 0.661 0.656 0.669 0.662 0.656 0.644 0.616 0.573 0.554 0.559 0.553

Rata-rata 0.664 0.635 0.59 0.612 0.611 0.577 0.577 0.574 0.532 0.54 0.557


62

Tabel VII. Hasil uji sitotoksik fraksi protein daun mimba FP30 terhadap kultur sel HeLa

Absorbansi


(µg/ml) 0.2 0.39 0.78 1.56 3.13 6.25 12.5 25 50 100 200 Kontrol

I 0.776 0.755 0.822 0.776 0.772 0.755 0.743 0.75 0.805 0.747 0.657 0.825

II 0.743 0.745 0.774 0.775 0.797 0.83 0.82 0.826 0.796 0.71 1.684 0.779

III 0.782 0.731 0.731 0.796 0.766 0.743 0.903 0.886 0.907 0.686 0.978 0.976

IV 0.773 0.728 0.711 0.746 0.764 0.76 0.731 0.723 0.702 0.733 1.813 0.953

Perlakuan

V 0.729 0.69 0.705 0.755 0.731 0.73 0.72 0.707 0.693 0.694 0.667 0.832

Rata-rata 0.761 0.73 0.749 0.77 0.766 0.764 0.783 0.778 0.781 0.714 1.16 0.873

I 0.558 0.568 0.552 0.512 0.637 0.569 0.639 0.952 1.146 1.183 0.957


III 0.741 0.675 0.699 0.997 0.915 0.772 0.77 0.725 0.62 0.586 0.558

Rata-rata 0.634 0.614 0.622 0.718 0.741 0.679 0.649 0.757 0.826 0.805 1.068

Tabel VIII. Hasil uji sitotoksik fraksi protein daun mimba FP40 terhadap kultur sel HeLa

Absorbansi


(µg/ml) 0.2 0.39 0.78 1.56 3.13 6.25 12.5 25 50 100 200 Kontrol

I 1.116 0.988 1.073 1.021 0.824 0.827 0.792 0.813 0.733 0.662 0.529 0.878

II 0.855 0.873 0.832 0.848 0.817 0.821 0.794 0.797 0.691 0.596 0.392 0.878

III 0.882 0.804 0.831 0.767 0.905 0.774 1.003 0.921 0.751 0.592 0.352 0.914

IV 0.947 1.044 0.823 0.719 0.553 0.642 0.859 0.745 0.803 0.736 0.419 0.892

Perlakuan

V 1.029 1.075 0.761 0.782 0.834 0.921 0.845 0.787 0.707 0.639 0.352 0.854

Rata-rata 0.966 0.957 0.864 0.827 0.787 0.797 0.859 0.813 0.737 0.645 0.409 0.883

I 0.57 0.56 0.579 0.699 0.788 0.875 0.577 0.778 0.464 0.566 0.522


III 0.652 0.649 0.615 0.641 0.873 0.682 0.93 0.821 0.519 0.622 0.633

Rata-rata 0.591 0.594 0.584 0.641 0.742 0.686 0.675 0.71 0.501 0.562 0.601


63

B. Sitotoksisitas fraksi protein daun mimba terhadap sel Vero Tabel IX. Hasil uji sitotoksik fraksi protein daun mimba FP10 terhadap kultur sel Vero

Absorbansi


(µg/ml) 0.2 0.39 0.78 1.56 3.13 6.25 12.5 25 50 100 200 Kontrol

I 0.893 0.842 1.14 1.149 1.175 0.869 0.905 0.895 0.873 0.79 0.699 0.872

II 0.867 0.858 0.857 0.88 0.889 0.883 0.898 0.849 0.869 0.853 0.659 0.918

III 0.879 0.861 0.781 0.849 0.884 0.803 0.88 0.869 0.844 0.806 0.738 0.853

IV 1.165 1.117 0.99 0.819 0.919 0.875 0.877 0.896 0.852 0.827 0.716 1.05

Perlakuan

V 0.873 0.871 0.782 0.852 0.906 0.874 0.879 0.871 0.844 0.846 0.768 0.908

Rata-rata 0.935 0.91 0.91 0.91 0.955 0.861 0.888 0.876 0.856 0.824 0.716 0.920

I 0.608 0.594 0.617 0.633 0.613 0.643 0.666 0.545 0.722 0.6 0.594


III 0.642 0.566 0.53 0.63 0.604 0.361 0.652 0.393 0.528 0.488 0.626

Rata-rata 0.631 0.587 0.513 0.647 0.622 0.548 0.658 0.515 0.614 0.554 0.576

Tabel X. Hasil uji sitotoksik fraksi protein daun mimba FP20 terhadap kultur sel Vero

Absorbansi

Konsentrasi fraksi protein (µg/ml) 0.2 0.39 0.78 1.56 3.13 6.25 12.5 25 50 100 200 Kontrol

I 0.879 0.892 0.866 0.862 0.89 0.934 0.857 0.884 0.853 0.844 0.769 0.904

II 0.9 0.819 0.901 0.876 0.903 0.932 0.868 0.88 0.88 0.828 0.818 0.852

III 0.931 0.886 0.776 0.89 0.916 0.848 1.093 1.102 1.151 0.966 0.932 0.924

IV 0.889 0.88 0.851 0.845 0.855 0.91 0.841 1.012 0.829 0.854 0.818 1.122

Perlakuan

V 0.891 0.921 0.886 0.803 0.904 0.841 0.818 0.866 0.841 0.855 0.825 0.957

Rata-rata 0.898 0.88 0.856 0.855 0.894 0.893 0.895 0.949 0.911 0.869 0.832 0.952

I 0.844 0.87 0.615 0.633 0.737 0.639 0.598 0.666 0.556 0.555 0.586


III 0.724 0.665 0.68 0.722 0.697 0.694 0.628 0.624 0.583 0.645 0.611

Rata-rata 0.836 0.74 0.638 0.659 0.703 0.642 0.609 0.640 0.583 0.588 0.596


64

Tabel XI. Hasil uji sitotoksik fraksi protein daun mimba FP30 terhadap kultur sel Vero

Absorbansi


(µg/ml) 0.2 0.39 0.78 1.56 3.13 6.25 12.5 25 50 100 200 Kontrol

I 0.868 0.886 1.097 1.153 1.034 0.824 0.776 0.749 0.753 0.783 0.847 1.02

II 0.85 0.796 0.957 0.821 0.798 0.814 0.83 0.739 0.785 0.708 0.751 0.88

III 0.84 0.857 0.838 0.851 0.818 0.807 0.784 0.802 0.837 0.835 0.72 0.811

IV 1.185 1.167 0.772 0.833 0.927 0.746 0.793 0.773 0.793 0.724 0.7 1.098

Perlakuan

V 0.854 0.798 0.794 0.766 0.796 0.782 0.812 0.766 0.779 0.752 0.707 0.732

Rata-rata 0.919 0.901 0.892 0.885 0.875 0.795 0.799 0.766 0.789 0.760 0.745 0.908

I 0.589 0.596 0.558 0.565 0.598 0.557 0.566 0.699 0.578 0.577 0.601


III 0.593 0.612 0.644 0.613 0.79 0.658 0.639 0.617 0.723 0.563 0.555

Rata-rata 0.589 0.619 0.598 0.606 0.664 0.632 0.603 0.634 0.704 0.578 0.65

Tabel XII. Hasil uji sitotoksik fraksi protein daun mimba FP40 terhadap kultur sel Vero

Absorbansi


(µg/ml) 0.2 0.39 0.78 1.56 3.13 6.25 12.5 25 50 100 200 Kontrol

I 0.799 0.813 0.815 0.822 0.786 0.762 0.791 0.759 0.696 0.754 0.804 0.843

II 0.788 0.762 0.783 0.753 0.741 0.79 0.78 0.727 0.671 0.753 0.763 0.834

III 0.768 0.759 0.856 0.721 0.764 1.027 1.091 0.905 0.818 0.782 0.737 0.866

IV 0.776 0.815 0.753 0.757 0.755 0.764 0.768 0.599 0.691 0.746 0.758 0.833

Perlakuan

V 0.788 0.77 0.767 0.742 0.744 0.73 0.713 0.695 0.693 0.709 0.781 0.811

Rata-rata 0.784 0.784 0.795 0.759 0.758 0.815 0.829 0.737 0.714 0.749 0.769 0.837

I 0.489 0.552 0.679 0.524 0.548 0.541 0.522 0.552 0.64 0.515 0.562


III 0.598 0.728 0.769 0.578 0.567 0.597 0.581 0.575 0.579 0.51 0.551

Rata-rata 0.639 0.613 0.67 0.557 0.566 0.564 0.551 0.563 0.589 0.526 0.554


65

Persen kematian sel dihitung dengan rumus :

% Kematian = 100% x

AC)(BA −−

Keterangan :

A = Rata-rata absorbansi kontrol

B = Rata-rata absorbansi perlakuan

C = Rata-rata absorbansi perlakuan tanpa sel


66

Lampiran 4. Hasil analisis probit nilai LC50 fraksi protein daun mimba (Azadirachta indica A. Juss) terhadap kultur sel HeLa FP10 Probit * * * * * * * * * * * * P R O B I T A N A L Y S I S * * * * * * * * * * * * DATA Information 9 unweighted cases accepted. 0 cases rejected because of missing data. 0 cases are in the control group. 2 cases rejected because no. responses is greater than no. subjects. 0 cases rejected because LOG-transform can’t be done. MODEL Information ONLY Normal Sigmoid is requested.

� - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -

C * * * * * * * * * * * * P R O B I T A N A L Y S I S * * * * * * * * * * * * Parameter estimates converged after 5 iterations. Optimal solution found. Parameter Estimates (PROBIT model: (PROBIT(p)) = Intercept + BX): Regression Coeff. Standard Error Coeff./S.E. konsentr -.03146 .05401 -.58259 Intercept Standard Error Intercept/S.E. .22600 .04995 4.52458 Pearson Goodness-of-Fit Chi Square = 17.070 DF = 7 P = .017 Since Goodness-of-Fit Chi square is significant, a heterogeneity factor is used in the calculation of confidence limits.

� - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -


67

C * * * * * * * * * * * * P R O B I T A N A L Y S I S * * * * * * * * * * * * Observed and Expected Frequencies Number of Observed Expected konsentr Subjects Responses Responses Residual Prob -.71 100.0 52.7 59.806 -7.137 .59806 -.41 100.0 59.7 59.439 .280 .59439 -.11 100.0 56.1 59.071 -2.944 .59071 .19 100.0 58.0 58.703 -.691 .58703 .49 100.0 71.4 58.333 13.027 .58333 .80 100.0 63.3 57.963 5.318 .57963 1.10 100.0 62.1 57.593 4.521 .57593 1.40 100.0 56.5 57.221 -.680 .57221 1.70 100.0 45.2 56.849 -11.690 .56849 C * * * * * * * * * * * * P R O B I T A N A L Y S I S * * * * * * * * * * * * Confidence Limits for Effective konsentr 95% Confidence Limits Prob konsentr Lower Upper .01 1.31070E+081 . . .02 2.84373E+072 . . .03 9.05950E+066 . . .04 6.63876E+062 . . .05 2.87455E+059 . . .06 3.94174E+056 . . .07 1.21759E+054 . . .08 6.88538E+051 . . .09 6.22085E+049 . . .10 8.17095E+047 . . .15 1.32447E+040 . . .20 8.52338E+033 . . .25 4.15831E+028 . .


68

.30 7.06075E+023 . . .35 2.68333E+019 . . .40 1.71537E+015 . . .45 150074968944 . . .50 15226422.4269 . . .55 1544.85416 . . .60 .13516 . . .65 .00001 . . .70 3.28356E-010 . . .75 5.57544E-015 . . .80 2.72009E-020 . . .85 1.75047E-026 . . .90 2.83742E-034 . . .91 3.72688E-036 . . .92 3.36719E-038 . . .93 1.90412E-040 . . .94 5.88177E-043 . . .95 8.06540E-046 . . .96 3.49228E-049 . . .97 2.55913E-053 . . .98 8.15280E-059 . . .99 1.76886E-067 . . Abbreviated Extended Name Name konsentr konsentrasi

2.01.51.00.50.0-0.5-1.0

Log of konsentrasi

0.6

0.4

0.2

0.0

-0.2

Prob

it

Probit Transformed Responses

R Sq Linear = 0.018


69

FP20 Probit C * * * * * * * * * * * * P R O B I T A N A L Y S I S * * * * * * * * * * * * DATA Information 11 unweighted cases accepted. 0 cases rejected because of missing data. 0 cases are in the control group. 0 cases rejected because LOG-transform can’t be done. MODEL Information ONLY Normal Sigmoid is requested.

� - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -

C * * * * * * * * * * * * P R O B I T A N A L Y S I S * * * * * * * * * * * * Parameter estimates converged after 8 iterations. Optimal solution found. Parameter Estimates (PROBIT model: (PROBIT(p)) = Intercept + BX): Regression Coeff. Standard Error Coeff./S.E. konsentr .18789 .04268 4.40196 Intercept Standard Error Intercept/S.E. .41734 .05074 8.22500 Pearson Goodness-of-Fit Chi Square = 15.677 DF = 9 P = .074 Since Goodness-of-Fit Chi square is NOT significant, no heterogeneity factor is used in the calculation of confidence limits.

� - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -


70

C * * * * * * * * * * * * P R O B I T A N A L Y S I S * * * * * * * * * * * * Observed and Expected Frequencies Number of Observed Expected konsentr Subjects Responses Responses Residual Prob -.71 100.0 63.2 61.183 2.012 .61183 -.41 100.0 70.5 63.331 7.209 .63331 -.11 100.0 59.4 65.439 -6.025 .65439 .19 100.0 66.9 67.500 -.612 .67500 .49 100.0 69.3 69.509 -.239 .69509 .80 100.0 65.9 71.460 -5.529 .71460 1.10 100.0 69.4 73.350 -3.994 .73350 1.40 100.0 74.7 75.175 -.452 .75175 1.70 100.0 78.8 76.930 1.847 .76930 2.00 100.0 89.7 78.614 11.088 .78614 2.30 100.0 74.9 80.225 -5.362 .80225 C * * * * * * * * * * * * P R O B I T A N A L Y S I S * * * * * * * * * * * * Confidence Limits for Effective konsentr 95% Confidence Limits Prob konsentr Lower Upper .01 2.49547E-015 1.21035E-027 1.35451E-010 .02 7.04721E-014 4.97667E-025 1.37091E-009 .03 5.86873E-013 2.26621E-023 5.95595E-009 .04 2.89082E-012 4.00610E-022 .00000 .05 1.05754E-011 4.14313E-021 .00000 .06 3.18958E-011 3.02591E-020 .00000 .07 8.39664E-011 1.72961E-019 .00000 .08 1.99755E-010 8.23738E-019 .00000 .09 4.39352E-010 3.40576E-018 .00000 .10 9.07640E-010 1.25775E-017 .00000


71

.15 .00000 2.80678E-015 .00001 .20 .00000 2.06081E-013 .00004 .25 .00000 8.20246E-012 .00017 .30 .00001 2.23754E-010 .00062 .35 .00005 4.77654E-009 .00202 .40 .00027 .00000 .00629 .45 .00129 .00000 .01894 .50 .00601 .00002 .05648 .55 .02803 .00034 .17098 .60 .13402 .00536 .54375 .65 .67542 .08426 1.95675 .70 3.71367 1.13509 10.20112 .75 23.36843 8.66667 131.38301 .80 181.20077 46.21050 4079.73916 .85 1972.49752 267.70475 271775.75098 .90 39775.77079 2264.04632 57727295.3208 .91 82171.18658 3772.50660 211676513.510 .92 180731.53836 6560.77891 869498438.563 .93 429958.91565 12040.93936 4116198616.02 .94 1131876.35610 23694.21109 23396717131.8 .95 3413779.74903 51213.98955 169976372986 .96 12488540.6296 126503.08967 1749035370912 .97 61516011.2064 383927.90711 3.07659E+013 .98 512288959.937 1676414.02534 1.39393E+015 .99 14467024385.7 17062735.7222 5.69944E+017 Abbreviated Extended Name Name konsentr konsentrasi

210-1

Log of konsentrasi

1.4

1.2

1.0

0.8

0.6

0.4

0.2

Prob

it


R Sq Linear = 0.531


72

FP30 Probit C * * * * * * * * * * * * P R O B I T A N A L Y S I S * * * * * * * * * * * * DATA Information 9 unweighted cases accepted. 0 cases rejected because of missing data. 0 cases are in the control group. 2 cases rejected because no. responses is greater than no. subjects. 0 cases rejected because LOG-transform can’t be done. MODEL Information ONLY Normal Sigmoid is requested.

� - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -

C * * * * * * * * * * * * P R O B I T A N A L Y S I S * * * * * * * * * * * * Parameter estimates converged after 14 iterations. Optimal solution found. Parameter Estimates (PROBIT model: (PROBIT(p)) = Intercept + BX): Regression Coeff. Standard Error Coeff./S.E. konsentr .09948 .06437 1.54553 Intercept Standard Error Intercept/S.E. 1.23647 .06516 18.97602 Pearson Goodness-of-Fit Chi Square = 21.265 DF = 7 P = .003 Since Goodness-of-Fit Chi square is significant, a heterogeneity factor is used in the calculation of confidence limits.

� - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -


73

C * * * * * * * * * * * * P R O B I T A N A L Y S I S * * * * * * * * * * * * Observed and Expected Frequencies Number of Observed Expected konsentr Subjects Responses Responses Residual Prob -.71 100.0 85.5 87.817 -2.319 .87817 -.41 100.0 86.7 88.412 -1.715 .88412 -.11 100.0 85.5 88.986 -3.450 .88986 .19 100.0 94.1 89.540 4.550 .89540 .49 100.0 97.1 90.073 7.026 .90073 .80 100.0 90.3 90.585 -.238 .90585 1.10 100.0 84.6 91.078 -6.473 .91078 1.40 100.0 97.5 91.552 5.997 .91552 2.30 100.0 89.5 92.859 -3.375 .92859 C * * * * * * * * * * * * P R O B I T A N A L Y S I S * * * * * * * * * * * * Confidence Limits for Effective konsentr 95% Confidence Limits Prob konsentr Lower Upper .01 1.53360E-036 . . .02 8.43223E-034 . . .03 4.61882E-032 . . .04 9.38432E-031 . . .05 1.08707E-029 . . .06 8.74505E-029 . . .07 5.44144E-028 . . .08 2.79643E-027 . . .09 1.23916E-026 . . .10 4.87816E-026 . . .15 1.41985E-023 . . .20 1.28986E-021 . . .25 6.17430E-020 . .


74

.30 1.99215E-018 . . .35 4.98181E-017 . . .40 1.05685E-015 . . .45 2.03022E-014 . . .50 3.72153E-013 . . .55 6.82181E-012 . . .60 1.31047E-010 . . .65 2.78007E-009 . . .70 .00000 . . .75 .00000 . . .80 .00011 . . .85 .00975 . . .90 2.83914 . . .91 11.17671 . . .92 49.52668 . . .93 254.52378 . . .94 1583.72643 . . .95 12740.49665 . . .96 147584.10760 . . .97 2998554.24722 . . .98 164248076.599 . . .99 90308944932.0 . . Abbreviated Extended Name Name konsentr konsentrasi

210-1

Log of konsentrasi

2.0

1.8

1.6

1.4

1.2

1.0

Prob

it


R Sq Linear = 0.092


75

FP40 Probit

C * * * * * * * * * * * * P R O B I T A N A L Y S I S * * * * * * * * * * * * DATA Information 10 unweighted cases accepted. 0 cases rejected because of missing data. 0 cases are in the control group. 1 cases rejected because no. responses is greater than no. subjects. 0 cases rejected because LOG-transform can’t be done. MODEL Information ONLY Normal Sigmoid is requested.

� - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -

C * * * * * * * * * * * * P R O B I T A N A L Y S I S * * * * * * * * * * * * Parameter estimates converged after 10 iterations. Optimal solution found. Parameter Estimates (PROBIT model: (PROBIT(p)) = Intercept + BX): Regression Coeff. Standard Error Coeff./S.E. konsentr .33439 .05236 6.38605 Intercept Standard Error Intercept/S.E. .57906 .05224 11.08494 Pearson Goodness-of-Fit Chi Square = 47.202 DF = 8 P = .000 Since Goodness-of-Fit Chi square is significant, a heterogeneity factor is used in the calculation of confidence limits.

� - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -


76

C * * * * * * * * * * * * P R O B I T A N A L Y S I S * * * * * * * * * * * * Observed and Expected Frequencies Number of Observed Expected konsentr Subjects Responses Responses Residual Prob -.71 100.0 57.6 63.378 -5.777 .63378 -.41 100.0 58.9 67.095 -8.173 .67095 -.11 100.0 68.3 70.651 -2.391 .70651 .19 100.0 78.9 74.017 4.878 .74017 .49 100.0 94.9 77.172 17.740 .77172 .80 100.0 87.5 80.100 7.370 .80100 1.10 100.0 79.2 82.789 -3.539 .82789 1.40 100.0 88.4 85.234 3.149 .85234 1.70 100.0 73.3 87.435 -14.118 .87435 2.00 100.0 90.6 89.396 1.169 .89396 C * * * * * * * * * * * * P R O B I T A N A L Y S I S * * * * * * * * * * * * Confidence Limits for Effective konsentr 95% Confidence Limits Prob konsentr Lower Upper .01 2.04853E-009 4.25516E-075 .00004 .02 .00000 1.81961E-068 .00012 .03 .00000 2.92961E-064 .00023 .04 .00000 4.27773E-061 .00037 .05 .00000 1.60340E-058 .00055 .06 .00000 2.48677E-056 .00077 .07 .00000 2.07129E-054 .00103 .08 .00000 1.08595E-052 .00134 .09 .00000 3.97737E-051 .00170 .10 .00000 1.09390E-049 .00212 .15 .00001 9.93913E-044 .00530


77

.20 .00006 5.38615E-039 .01101 .25 .00018 6.17972E-035 .02070 .30 .00050 2.72229E-031 .03664 .35 .00131 6.44961E-028 .06250 .40 .00324 1.02114E-024 .10436 .45 .00781 1.26235E-021 .17277 .50 .01855 1.37786E-018 .28706 .55 .04407 1.47667E-015 .48575 .60 .10616 1.71460E-012 .85615 .65 .26341 2.35942E-009 1.64477 .70 .68637 .00000 3.92201 .75 1.92928 .00578 21.15718 .80 6.09817 .66135 3988.48019 .85 23.32288 4.06749 73043884.1969 .90 126.12584 14.34524 4.70281E+013 .91 189.60554 18.64032 1.24113E+015 .92 295.24906 24.55781 4.38401E+016 .93 480.47844 32.99289 2.22570E+018 .94 827.69426 45.54924 1.80095E+020 .95 1539.05012 65.34581 2.72037E+022 .96 3189.64912 99.16792 9.94981E+024 .97 7813.17070 164.39945 1.41939E+028 .98 25706.75379 319.13864 2.23318E+032 .99 167977.01396 896.36092 9.31496E+038 Abbreviated Extended Name Name konsentr konsentrasi

2.01.51.00.50.0-0.5-1.0

Log of konsentrasi

1.5

1.0

0.5

0.0

Prob

it


R Sq Linear = 0.378


78

Lampiran 5. Hasil analisis probit nilai LC50 fraksi protein daun mimba (Azadirachta indica A. Juss) terhadap kultur sel Vero FP10 Probit * * * * * * * * * * * * P R O B I T A N A L Y S I S * * * * * * * * * * * * DATA Information 11 unweighted cases accepted. 0 cases rejected because of missing data. 0 cases are in the control group. 0 cases rejected because LOG-transform can't be done. MODEL Information ONLY Normal Sigmoid is requested. - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - C * * * * * * * * * * * * P R O B I T A N A L Y S I S * * * * * * * * * * * * Parameter estimates converged after 7 iterations. Optimal solution found. Parameter Estimates (PROBIT model: (PROBIT(p)) = Intercept + BX): Regression Coeff. Standard Error Coeff./S.E. konsentr .13161 .04190 3.14109 Intercept Standard Error Intercept/S.E. .38448 .05056 7.60404 Pearson Goodness-of-Fit Chi Square = 18.446 DF = 9 P = .030 Since Goodness-of-Fit Chi square is significant, a heterogeneity factor is used in the calculation of confidence limits. - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -


79

C * * * * * * * * * * * * P R O B I T A N A L Y S I S * * * * * * * * * * * * Observed and Expected Frequencies Number of Observed Expected konsentr Subjects Responses Responses Residual Prob -.71 100.0 66.9 61.453 5.431 .61453 -.41 100.0 65.0 62.958 1.998 .62958 -.11 100.0 56.9 64.445 -7.551 .64445 .19 100.0 71.4 65.909 5.532 .65909 .49 100.0 63.8 67.350 -3.531 .67350 .80 100.0 66.0 68.766 -2.722 .68766 1.10 100.0 75.1 70.155 4.909 .70155 1.40 100.0 60.7 71.514 -10.781 .71514 1.70 100.0 73.6 72.844 .778 .72844 2.00 100.0 70.7 74.141 -3.490 .74141 2.30 100.0 84.8 75.406 9.380 .75406 C * * * * * * * * * * * * P R O B I T A N A L Y S I S * * * * * * * * * * * * Confidence Limits for Effective konsentr 95% Confidence Limits Prob konsentr Lower Upper .01 2.53016E-021 . . .02 2.98092E-019 . . .03 6.14416E-018 . . .04 5.98436E-017 . . .05 3.81181E-016 . . .06 1.84314E-015 . . .07 7.33950E-015 . . .08 2.52925E-014 . . .09 7.79235E-014 . . .10 2.19531E-013 . .


80

.15 1.59919E-011 . . .20 4.83148E-010 . . .25 8.99379E-009 . . .30 .00000 . . .35 .00000 . . .40 .00001 . . .45 .00013 . . .50 .00120 . . .55 .01080 . . .60 .10084 . . .65 1.01477 . . .70 11.56365 . . .75 159.76106 . . .80 2973.95020 . . .85 89849.11856 . . .90 6545132.03372 . . .91 18439348.1089 . . .92 56809591.1626 . . .93 195770488.967 . . .94 779571042.006 . . .95 3769489757.60 . . .96 24010215055.4 . . .97 233857529836 . . .98 4820181708110 . . .99 5.67893E+014 . . Abbreviated Extended Name Name konsentr konsentrasi

210-1

Log of konsentrasi

1.50

1.25

1.00

0.75

0.50

0.25

0.00

Prob

it


R Sq Linear = 0.373


81

FP20 Probit

C * * * * * * * * * * * * P R O B I T A N A L Y S I S * * * * * * * * * * * * DATA Information 11 unweighted cases accepted. 0 cases rejected because of missing data. 0 cases are in the control group. 0 cases rejected because LOG-transform can't be done. MODEL Information ONLY Normal Sigmoid is requested. - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - C * * * * * * * * * * * * P R O B I T A N A L Y S I S * * * * * * * * * * * * Parameter estimates converged after 11 iterations. Optimal solution found. Parameter Estimates (PROBIT model: (PROBIT(p)) = Intercept + BX): Regression Coeff. Standard Error Coeff./S.E. konsentr -.22236 .04496 -4.94529 Intercept Standard Error Intercept/S.E. .90406 .05851 15.45084 Pearson Goodness-of-Fit Chi Square = 15.602 DF = 9 P = .076 Since Goodness-of-Fit Chi square is NOT significant, no heterogeneity factor is used in the calculation of confidence limits. - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -


82

C * * * * * * * * * * * * P R O B I T A N A L Y S I S * * * * * * * * * * * * Observed and Expected Frequencies Number of Observed Expected konsentr Subjects Responses Responses Residual Prob -.71 100.0 93.5 85.583 7.868 .85583 -.41 100.0 85.3 84.009 1.324 .84009 -.11 100.0 77.1 82.327 -5.231 .82327 .19 100.0 79.4 80.537 -1.186 .80537 .49 100.0 80.0 78.641 1.369 .78641 .80 100.0 73.6 76.641 -3.012 .76641 1.10 100.0 69.9 74.542 -4.633 .74542 1.40 100.0 67.6 72.348 -4.757 .72348 1.70 100.0 65.6 70.065 -4.505 .70065 2.00 100.0 70.4 67.700 2.735 .67700 2.30 100.0 75.1 65.262 9.866 .65262 C * * * * * * * * * * * * P R O B I T A N A L Y S I S * * * * * * * * * * * * Confidence Limits for Effective konsentr 95% Confidence Limits Prob konsentr Lower Upper .01 3.37101E+014 44625101266.3 3.03288E+023 .02 2.00369E+013 5893512100.66 2.83323E+021 .03 3342092548080 1630839035.64 1.46123E+020 .04 868760839022 620285427.797 1.57116E+019 .05 290369962998 282512175.810 2.56145E+018 .06 114246978338 144633637.847 5.47080E+017 .07 50424913497.0 80404249.3021 1.41337E+017 .08 24244114168.3 47525529.6876 4.20718E+016 .09 12455544527.6 29458792.6954 1.39769E+016 .10 6747043484.27 18966333.1264 5.06886E+015


83

.15 533053311.577 3060798.92809 7.61229E+013 .20 70902815.7960 717225.62765 2709839349368 .25 12561501.2869 206255.97216 155170683243 .30 2654983.45522 67246.45620 11912793826.8 .35 628915.80498 23758.94952 1106105695.97 .40 160355.29251 8831.78063 116238118.083 .45 42742.14059 3379.43128 13184913.4626 .50 11634.11604 1306.86059 1555310.99482 .55 3166.72619 501.63657 184834.44707 .60 844.07976 187.10284 21508.78054 .65 215.21586 65.65723 2394.34412 .70 50.98060 20.23691 254.83890 .75 10.77520 4.45919 28.94818 .80 1.90899 .46228 4.59820 .85 .25392 .02046 .86681 .90 .02006 .00034 .12778 .91 .01087 .00012 .08130 .92 .00558 .00004 .04986 .93 .00268 .00001 .02919 .94 .00118 .00000 .01609 .95 .00047 .00000 .00817 .96 .00016 .00000 .00369 .97 .00004 .00000 .00139 .98 .00001 6.45831E-010 .00038 .99 .00000 6.08117E-012 .00005 Abbreviated Extended Name Name konsentr konsentrasi

210-1

Log of konsentrasi

1.6

1.4

1.2

1.0

0.8

0.6

0.4

Prob

it


R Sq Linear = 0.62


84

FP30 Probit C * * * * * * * * * * * * P R O B I T A N A L Y S I S * * * * * * * * * * * * DATA Information 11 unweighted cases accepted. 0 cases rejected because of missing data. 0 cases are in the control group. 0 cases rejected because LOG-transform can't be done. MODEL Information ONLY Normal Sigmoid is requested. - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - C * * * * * * * * * * * * P R O B I T A N A L Y S I S * * * * * * * * * * * * Parameter estimates converged after 9 iterations. Optimal solution found. Parameter Estimates (PROBIT model: (PROBIT(p)) = Intercept + BX): Regression Coeff. Standard Error Coeff./S.E. konsentr .28479 .04556 6.25033 Intercept Standard Error Intercept/S.E. .55599 .05190 10.71352 Pearson Goodness-of-Fit Chi Square = 9.698 DF = 9 P = .376 Since Goodness-of-Fit Chi square is NOT significant, no heterogeneity factor is used in the calculation of confidence limits. - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -


85

C * * * * * * * * * * * * P R O B I T A N A L Y S I S * * * * * * * * * * * * Observed and Expected Frequencies Number of Observed Expected konsentr Subjects Responses Responses Residual Prob -.71 100.0 63.7 63.833 -.176 .63833 -.41 100.0 68.9 66.993 1.942 .66993 -.11 100.0 67.7 70.037 -2.328 .70037 .19 100.0 69.3 72.946 -3.608 .72946 .49 100.0 76.8 75.707 1.104 .75707 .80 100.0 82.1 78.308 3.751 .78308 1.10 100.0 78.4 80.741 -2.359 .80741 1.40 100.0 85.5 82.999 2.489 .82999 1.70 100.0 90.6 85.079 5.517 .85079 2.00 100.0 79.9 86.983 -7.103 .86983 2.30 100.0 89.5 88.711 .792 .88711 C * * * * * * * * * * * * P R O B I T A N A L Y S I S * * * * * * * * * * * * Confidence Limits for Effective konsentr 95% Confidence Limits Prob konsentr Lower Upper .01 7.57238E-011 8.84349E-016 .00000 .02 6.86137E-010 2.18697E-014 .00000 .03 2.77786E-009 1.67365E-013 .00000 .04 7.95348E-009 7.73471E-013 .00000 .05 .00000 2.68615E-012 .00000 .06 .00000 7.74976E-012 .00000 .07 .00000 1.96207E-011 .00001 .08 .00000 4.50711E-011 .00001 .09 .00000 9.60167E-011 .00001 .10 .00000 1.92598E-010 .00002


86

.15 .00000 3.43479E-009 .00008 .20 .00001 .00000 .00028 .25 .00005 .00000 .00078 .30 .00016 .00000 .00198 .35 .00050 .00001 .00471 .40 .00144 .00003 .01072 .45 .00404 .00015 .02382 .50 .01116 .00064 .05248 .55 .03083 .00276 .11633 .60 .08656 .01202 .26385 .65 .25161 .05393 .62733 .70 .77461 .25096 1.63271 .75 2.60671 1.17802 5.13253 .80 10.06797 5.11370 23.68381 .85 48.63928 21.12552 188.65653 .90 352.91663 106.05048 3048.36793 .91 569.57856 154.88046 6035.16471 .92 958.05107 233.10976 12707.32132 .93 1697.09584 364.55432 28883.52522 .94 3213.94433 599.33886 72426.09374 .95 6657.89486 1054.29149 207106.80517 .96 15665.60089 2042.53058 713282.55098 .97 44853.30691 4594.10765 3270170.90223 .98 181590.65951 13455.65179 24827202.5424 .99 1645401.75198 72876.95481 608663179.429 Abbreviated Extended Name Name konsentr konsentrasi

210-1

Log of konsentrasi

1.4

1.2

1.0

0.8

0.6

0.4

0.2

Prob

it


R Sq Linear = 0.796

R Sq Linear = 0.796


87

FP40 Probit

C * * * * * * * * * * * * P R O B I T A N A L Y S I S * * * * * * * * * * * * DATA Information 11 unweighted cases accepted. 0 cases rejected because of missing data. 0 cases are in the control group. 0 cases rejected because LOG-transform can't be done. MODEL Information ONLY Normal Sigmoid is requested. - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - C * * * * * * * * * * * * P R O B I T A N A L Y S I S * * * * * * * * * * * * Parameter estimates converged after 10 iterations. Optimal solution found. Parameter Estimates (PROBIT model: (PROBIT(p)) = Intercept + BX): Regression Coeff. Standard Error Coeff./S.E. konsentr -.07076 .04432 -1.59662 Intercept Standard Error Intercept/S.E. .80398 .05584 14.39921 Pearson Goodness-of-Fit Chi Square = 17.153 DF = 9 P = .046 Since Goodness-of-Fit Chi square is significant, a heterogeneity factor is used in the calculation of confidence limits. - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -


88

C * * * * * * * * * * * * P R O B I T A N A L Y S I S * * * * * * * * * * * * Observed and Expected Frequencies Number of Observed Expected konsentr Subjects Responses Responses Residual Prob -.71 100.0 82.7 80.350 2.399 .80350 -.41 100.0 79.6 79.754 -.111 .79754 -.11 100.0 85.1 79.148 5.909 .79148 .19 100.0 75.8 78.531 -2.694 .78531 .49 100.0 77.0 77.904 -.872 .77904 .80 100.0 70.1 77.267 -7.193 .77267 1.10 100.0 66.8 76.619 -9.809 .76619 1.40 100.0 79.2 75.962 3.260 .75962 1.70 100.0 85.1 75.294 9.843 .75294 2.00 100.0 73.4 74.616 -1.222 .74616 2.30 100.0 74.4 73.929 .484 .73929 C * * * * * * * * * * * * P R O B I T A N A L Y S I S * * * * * * * * * * * * Confidence Limits for Effective konsentr 95% Confidence Limits Prob konsentr Lower Upper .01 1.73343E+044 . . .02 2.43470E+040 . . .03 8.75354E+037 . . .04 1.26899E+036 . . .05 4.05322E+034 . . .06 2.16152E+033 . . .07 1.65406E+032 . . .08 1.65622E+031 . . .09 2.04257E+030 . . .10 2.97504E+029 . .


89

.15 1.02188E+026 . . .20 1.80405E+023 . . .25 7.83953E+020 . . .30 5.93168E+018 . . .35 6.42173E+016 . . .40 8.76112E+014 . . .45 1.37424E+013 . . .50 230235727855 . . .55 3857306078.81 . . .60 60504245.1658 . . .65 825455.53089 . . .70 8936.50022 . . .75 67.61696 . . .80 .29383 . . .85 .00052 . . .90 .00000 . . .91 .00000 . . .92 3.20056E-009 . . .93 3.20476E-010 . . .94 2.45238E-011 . . .95 1.30781E-012 . . .96 4.17720E-014 . . .97 6.05567E-016 . . .98 2.17720E-018 . . .99 3.05801E-022 . . Abbreviated Extended Name Name konsentr konsentrasi

210-1

Log of konsentrasi

1.1

1.0

0.9

0.8

0.7

0.6

0.5

0.4

Prob

it


R Sq Linear = 0.125


90

Lampiran 6. Hasil analisis distribusi data dengan Uji Kolmogorov-Smirnov A. FP10 daun mimba terhadap sel HeLa NPar Tests

Descriptive Statistics

5 9E+015 1.991E+016 1.17772 4E+016LC50N Mean Std. Deviation Minimum Maximum

One-Sample Kolmogorov-Smirnov Test

59E+015

*******.473.473

-.3271.057

.214

NMeanStd. Deviation

Normal Parameters a,b

AbsolutePositiveNegative

Most ExtremeDifferences

Kolmogorov-Smirnov ZAsymp. Sig. (2-tailed)

LC50

Test distribution is Normal.a.

Calculated from data.b.

B. FP20 daun mimba terhadap sel HeLa NPar Tests


5 .0344780 .02738529 .01058 .07703LC50N Mean Std. Deviation Minimum Maximum


5.0344780

.02738529.283.283

-.191.633.819

NMeanStd. Deviation





LC50




91

C. FP30 daun mimba terhadap sel HeLa NPar Tests

Warnings

The data for NPAR TESTS include oversize values. These values will be treated asmissing. 1 unusable values were encountered.


4 107.3571 162.36157888 .00000 343.13087LC50N Mean Std. Deviation Minimum Maximum


4107.3571162.3616

.302

.302-.254.603.860

NMeanStd. Deviation





LC50



D. FP40 daun mimba terhadap sel HeLa NPar Tests




5.0791380

.13657745.345.345

-.281.772.591

NMeanStd. Deviation





LC50




92

E. FP10 daun mimba terhadap sel Vero NPar Tests




5.1020320

.14990898.352.352

-.248.787.565

NMeanStd. Deviation





LC50



F. FP20 daun mimba terhadap sel Vero NPar Tests


5 417771.3 524053.3728 136.15536 1143218LC50N Mean Std. Deviation Minimum Maximum


5417771.3524053.4

.323

.323-.213.723.673

NMeanStd. Deviation





LC50




93

G. FP30 daun mimba terhadap sel Vero NPar Tests




5.0692440

.11402530.324.324

-.272.725.670

NMeanStd. Deviation





LC50



H. FP40 daun mimba terhadap sel Vero NPar Tests

Warnings

The dat S include oversize values. These values will be treated asmissing. ere encountered.

a for NPAR TEST 1 unusable values w


4 5E+018 9.330E+018 7973.899 2E+019LC50N Mean Std. Deviation Minimum Maximum


45E+018

*******.425.425

-.301.851.464

NMeanStd. Deviation





LC50




94

Lampiran 7. Hasil analisis Uji t-independent sample A. FP10 terhadap sel HeLa dan sel Vero T-Test

Group Statistics

5 .1020320 .14990898 .067041345 9E+015 1.991E+016 *******

selvero 10hela 10

LC50N Mean Std. Deviation

Std. ErrorMean

Independent Samples Test

7.111 .029 -1.000 8 .347 8.90E+015 9E+015 -3E+016 *******

-1.000 4.000 .374 8.90E+015 9E+015 -3E+016 *******

Equal variancesassumedEqual variancesnot assumed

LC50F Sig.

Levene's Test forEquality of Variances

t df Sig. (2-tailed)Mean

DifferenceStd. ErrorDifference Lower Upper

95% ConfidenceInterval of the

Difference

t-test for Equality of Means


95

B. FP20 terhadap sel HeLa dan sel Vero T-Test

Group Statistics

5 417771.3 524053.3728 234363.85 .0344780 .02738529 .01224707

selvero 20hela 20


Std. ErrorMean


38.265 .000 1.783 8 .113 417771.31 234363.79 -122673 958215.2

1.783 4.000 .149 417771.31 234363.79 -232927 1068470


LC50F Sig.





Difference



96

C. FP30 terhadap sel HeLa dan sel Vero T-Test

Group Statistics

5 .0692440 .11402530 .050993665 2E+085 3.8284E+085 2E+085

selvero 30hela 30


Std. ErrorMean


7.111 .029 -1.000 8 .347 1.71E+085 1.71E+085 -6E+085 2E+085

-1.000 4.000 .374 1.71E+085 1.71E+085 -6E+085 3E+085


LC50F Sig.





Difference



97

D. FP40 terhadap sel HeLa dan sel Vero T-Test

Group Statistics

5 5E+040 1.0144E+041 5E+0405 .0791380 .13657745 .06107929

selvero 40hela 40


Std. ErrorMean


7.111 .029 1.000 8 .347 4.54E+040 4.54E+040 -6E+040 1E+041

1.000 4.000 .374 4.54E+040 4.54E+040 -8E+040 2E+041


LC50F Sig.





Difference



98

Lampiran 8. Foto tanaman dan daun mimba (Azadirachta indica A. Juss)

Gambar 7. Foto tanaman Azadirachta indica A. Juss

Gambar 8. Foto daun Azadirachta indica A. Juss


99

Lampiran 9. Foto Hi-Mac Sentrifuge HITACHI SCP85H, ELISA reader SLT

340ATC dan mikroskop (Olympus IMT-2)

Gambar 9. Foto Hi-Mac Sentrifuge Gambar 10. Foto ELISA reader SLT 340ATC HITACHI SCP85

Gambar 11. Foto Mikroskop (Olympus IMT-2)


100

Lampiran 10. Foto hasil uji sitotoksik fraksi protein daun mimba FP40 terhadap

kultur sel HeLa dan sel Vero dalam 96 well plate

Gambar 12. Foto perlakuan dengan sel HeLa Gambar 13. Foto perlakuan dengan sel Vero dalam 96 well plate dalam 96 well plate

Keterangan:

A1 sampai E11: kelompok perlakuan sel (sel + media + fraksi protein) menggunakan

FP40 dengan konsentrasi sebagai berikut:

1 = 0,2 μg/ml

2 = 0,39 μg/ml

3 = 0,78 μg/ml

4 = 1,56 μg/ml

5 = 3,13 μg/ml

6 = 6,25 μg/ml

7 = 12,5 μg/ml

8 = 25 μg/ml

9 = 50 μg/ml

10 = 100 μg/ml

11=200μg/ml

F1 sampai H11: kelompok perlakuan tanpa sel (media + fraksi protein)

A12 sampai E12: kelompok kontrol (sel + media)


101

Lampiran 11. Surat determinasi tanaman


102

BIOGRAFI PENULIS

Penulis skripsi dengan judul “Sitotoksisitas Fraksi

Protein Daun Mimba (Azadirachta indica A. Juss) FP10,

FP20, FP30, dan FP40 terhadap Kultur Sel HeLa” memiliki

nama lengkap Lestarining Wahyu Ndadari. Penulis

dilahirkan di Yogyakarta pada tanggal 12 Desember

1985 dan merupakan putri tunggal dari pasangan Bapak

Wahjudi dan Ibu J. Endang Lestari. Penulis mengawali

pendidikan formalnya di Taman Kanak-Kanak

Indriyasana Yogyakarta pada tahun 1990-1991

kemudian melanjutkan ke SD N Maguwoharjo 2 pada tahun 1991-1997. Tahun

1997 hingga 2000 penulis melanjutkan pendidikan di SLTP N 4 Depok

Yogyakarta. Setelah menyelesaikan pendidikan SLTP, tahun 2000 melanjutkan ke

SMU N 9 Yogyakarta dan lulus pada tahun 2003. Tahun 2003 hingga 2007

berkesempatan untuk menempuh pendidikan S1 di Fakultas Farmasi Universitas

Sanata Dharma Yogyakarta. Selama kuliah, penulis juga tergabung dalam sebuah

komunitas tari yang dikenal dengan nama Komunitas Tari Genta Rakyat dan

Persekutuan Mahasiswa Kristen (PMK) Apostolos sejak tahun 2003 hingga

sekarang.


PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI - core.ac.ukcore.ac.uk/download/pdf/45362060.pdfPRAKATA...

Documents

Transcript of PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI - core.ac.ukcore.ac.uk/download/pdf/45362060.pdfPRAKATA...