Abstrak

Streptococcus pneumoniae pilus-1 dikodekan oleh pilus islet 1 (PI-1), yang memiliki tiga varian klonal (clade I, II dan III). Penelitian In vitro dan in vivo tes telah menunjukkan bahwa pilus-1 terlibat dalam pelekatan ke sel epitel dan virulensi. Ekspresi pilus-1 diatur secara ketat dan melibatkan interaksi berbagai regulator genetik, termasuk PI-1 RlrA regulator positif. Ekspresi pilus pada analisis tingkat sel tunggal positif strain PI-1 menunjukkan biphasic. Strain ini menunjukkan dua fenotip yang berbeda dari sub-populasi bakteri, salah satu dari stain mengekspresikan pilus, sementara yang lainnya tidak. Proporsi dari dua fenotipe ini adalah variabel antara strain yang diuji dan tidak dipengaruhi oleh genotipe, serotipe, kondisi pertumbuhan, morfologi koloni atau dengan kehadiran antibodi yang langsung mengarah pada komponen pilus.

Rangkaian PI-1 pada dua sub-populasi mengungkapkan adanya mutasi, sehingga menunjukkan bahwa ekspresi biphasic bukan karena modifikasi genetik dalam PI-1. Pada ekspresi profil Microarray dan analisis western blot secara keseluruhan lysates bakteri dilakukan dengan membandingkan dua diperkaya sub-populasi, mengungkapkan bahwa ekspresi pilus diatur pada tingkat transkripsi (on / off regulasi), dan bahwa tidak ada gen lain, selain yang dikodekan oleh PI-1. Kesimpulannya, over-ekspresi dari regulator positif RrlA cukup untuk menginduksi ekspresi pilus di pilus-1 bakteri negatif. Secara keseluruhan, data yang disajikan menunjukkan bahwa ekspresi fenotipe pilus biphasic bisa menjadi contoh bistability pada pneumococcus.

Pendahuluan

Beberapa pneumokokus faktor virulensi telah diidentifikasi, namun, sedikit yang diketahui tentang faktor-faktor penentu penyakit dasar dan bagaimana mereka diekspresikan selama perkembangan penyakit. Seperti kebanyakan streptococcus, S. pneumonia menghiasi permukaannya dengan filamen multimerik yang panjang yang dikenal sebagai pili terdiri dari ikatan kovalen subunit. Pili pneumokokus dihungkan dengan virulensi dan kemampuan mikroorganisme untuk melekat pada sel-sel epitel dan kolonisasi di nasofaring. Subunit pilus-1 menunjukkan memberikan perlindungan pada tikus yang invasif terinfeksi, oleh karena itu dianggap potensial untuk vaksin generasi baru berbasis protein untuk penyakit yang disebabkan S. pneumonia. Pilus pneumokokus ini dikodekan oleh pilus islet 1 (PI-1), lokus 12 kb, mengandung tujuh gen encoding regulator transkripsi (RlrA), yang positif mengatur ekspresi pilus dan ekspresinya sendiri, tiga subunit struktur pilus (RrgA, RrgB dan RrgC) dan tiga enzim sortase (SrtC-1, SrtC-2 dan SrtC-3), yang secara kovalen merakit subunit pilus pada permukaan bakteri. Beberapa laporan epidemiologi molekul menunjukkan bahwa PI-1 terdapat dalam sekitar 30% dari isolasi pneumokokus, terlepas dari asal geografis dan hasil penyakit dianalisis. PI-1 klonal diwariskan oleh strain S. pneumoniae, dan yang kehadirannya dikaitkan dengan isolasi dari genotipe daripada serotipe. PI-1 ada dalam tiga varian, yaitu clade I, II dan III. Karena setiap varian dikaitkan dengan klon tertentu, tampilan PI-1 menunjukkan prevalensi regional yang berbeda, tergantung pada distribusi klon. Sebagian besar variabilitas PI-1 terkonsentrasi pada gen yang mengkode komponen pilus: RrgB, subunit utama pilus, dan RrgA, yang merupakan adhesin utama.

Mengingat implikasi serius yang mungkin dimiliki pilus untuk penyakit dan transmisi, beberapa laporan telah berfokus pada evaluasi regulator genetik yang mampu memodulasi ekspresi pilus sehingga terjadi virulensi bakteri. Tujuh protein, selain RlrA regulator PI-1 positif, ditunjukkan oleh kelompok yang berbeda untuk mempengaruhi secara negatif in vitro pilus tingkat ekspresi (MgrA, HK343, Merr, CbpS, TCS08, mntE, Psar).

Namun, masih belum jelas apakah semua pneumococci PI-1 positif memiliki pili (in vitro dan in vivo), dan apakah perbedaan genetik dan kondisi pertumbuhan dapat mempengaruhi tingkat ekspresi pilus-1. Dalam sebuah penelitian, analisis ekspresi pilus-1 dalam panel 139 klinis strain S. pneumoniae, membuktikan bahwa semua strain yang diuji, terlepas dari serotipe, genotipe dan kondisi pertumbuhan, terdapat dua fenotip berbeda sub-populasi, menunjukkan ekspresi pilus yang tinggi (di sini didefinisikan sebagai Pil +) dan tingkat tidak terdeteksi (di sini didefinisikan sebagai Pil-). Selain itu, selama pertumbuhan proporsi Pil + / Pil-tidak dipengaruhi oleh adanya antibodi anti-RrgB. Untuk lebih menjelaskan ekspresi fenotip pilus, untuk sejumlah strain dipisahkan menjadi sekitar 95% kemurnian dua bakteri sub-populasi, diperkaya baik dalam mengekspresikan pilus atau tidak-mengekspresikan pilus pneumococci. Urutan analisis PI-1 dua sub-populasi mengungkapkan adanya variasi fase genetik dalam pulau itu. Akhirnya, dibandingkan profil ekspresi dari dua sub-populasi dalam panel strain klinis S. pneumoniae dan menyimpulkan bahwa: 1) ekspresi pilus diatur di tingkat transkripsi, 2) pengaturan ini melibatkan semua komponen PI-1 dan 3) tidak ada gen lain selain yang dikodekan oleh PI-1 bersamaan diatur di isolasi yang diuji.

Diskusi

Setelah identifikasi pertama pada bakteri gram positif lain, pili telah terdeteksi pada permukaan utama S. pneumoniae dan terbukti imunogenik dan terlibat dalam patogenisitas pada in vivo dan in vitro. Laporan epidemiologis telah ditetapkan bahwa PI-1, pengkodean protein terlibat dalam biogenesis pilus-1, terdapat sekitar 30% dari isolasi pneumokokus dan ada dalam tiga varian genetik yang terkait.

Struktur molekul dari pilus-1 dan mekanisme perakitan pilus telah diselidiki, dan diduga sejumlah regulator genetik PI-1 telah diditemukan. Namun, masih sangat sedikit yang diketahui tentang pengaturan ekspresi pilusi, kondisi lingkungan mampu memodulasi dan perlengkapan kompleks makromolekul yang mengatur biogenesis pili. Selain itu, dalam semua studi yang disebutkan, evaluasi ekspresi pilus S. pneumoniae selalu tidak pada dasar sel tunggal, tetapi sebagai rata-rata perilaku populasi yang besar.

Dengan menggunakan metode pendeteksian bisa untuk membedakan sel tunggal. Berbeda dengan protein lain, komponen pilus-1 menunjukkan ekspresi bifasik. Kedua sub-populasi fenotip yang berbeda, Pil + dan Pil-, hadir dalam rasio variabel dalam semua uji strain. Rasio ekspresi pilus diwariskan oleh sel anak dan tidak dipengaruhi oleh genetik bakteri dan karakteristik epidemiologi, dalam kondisi pertumbuhan in vitro, atau pertumbuhan dengan pilus antisera. Selain itu, rasio ekspresi pilus pada isolasi karier dan invasif menunjukkan hasil yang serupa. Sebagian besar isolasi koloni pada media padat dari jenis yang sama menunjukkan kemiripan pola ekspresi pilus, sehingga menunjukkan bahwa ini

mungkin dipengaruhi oleh beberapa sifat genetik dari strain, masih tak dikenal. Namun, beberapa populasi koloni bakteri menunjukkan perbedaan rasio bakteri Pil + / Pil-. Oleh karena itu, karena isolasi dari isolat klinis host manusia selalu menyiratkan proses pertumbuhan in vitro dan seleksi koloni stokastik, rasio ekspresi pilus yang diamati mungkin tidak mewakili ekspresi pili in vivo sehingga perlu penyelidikan lebih lanjut.

Analisis ekspresi pilus (baik oleh microarray dan western blot ) dilakukan dengan membandingkan dua sub-populasi, H dan L, maing-masing diperkaya Pil + dan Pil- bakteri. Ekspresi profil Microarray profil ekspresi hanya mampu mendeteksi perubahan yang signifikan dalam ekspresi komponen PI-1, termasuk regulator positif rlrA, sementara perubahan ekspresi gen di luar PI-1 dalam lima strain yang diuji (H vs L sub-populasi) tetap tidak terdeteksi. Selain itu, ekspresi RlrA (seperti RrgB dan SrtC-2) cukup untuk menginduksi polimerisasi dari fungsional pilus pada Pil-pneumococci, mengakibatkan saklar biosintesis pilus dari ''off'' ke ''on''. RlrA sebagai regulator positif dari transkripsi gen PI-1, mampu mengaktifkan transkripsinya sendiri dan untuk membangun umpan balik positif. Selain itu, fenomena ini didukung oleh perbedaan dalam transkrip rlrA pada H vs L subpopulasi. Perubahan transkripsi rlrA terdapat dalam kisaran yang diobservasi untuk tiga PI-1 sortases (dan jauh lebih rendah daripada yang diamati untuk subunit struktural), sehingga dalam protein regulasi dan enzim (mengerahkan aktivitas katalitik), perubahan transkripsi kecil bisa cukup untuk menginduksi perbedaan fenotipik. Data ini menunjukkan dua kemungkinan skenario: i) ekspresi pilus ini dimodulasi oleh interaksi dari berbagai regulator, tapi transkripsi perubahan di luar PI-1 tetap tidak terdeteksi dengan alat tes sebagaimana diharapkan karena perubahan yang sangat sedikit dalam peraturan transkrip bisa bertanggung jawab untuk perubahan fenotipik penting, terutama bila diuraikan seperti dalam kasus ini secara tidak langsung melalui regulator lain, ii) ekspresi pilus tidak tergantung pada regulator terletak di luar PI-1, tetapi perubahan langsung dalam respon terhadap rangsangan eksternal diketahui atau kebisingan meningkatkan transkripsi dari rlrA dan dengan demikian beralih'' pada'' biosintesis pilus. Tambahan data yang diperoleh menganalisis ekspresi pilus pada tingkat sel tunggal dalam knock-out mutan yang diketahui PI-1 represor, tampaknya untuk mengecualikan kemungkinan keterlibatan langsung mereka dalam pilus regulasi (data tidak ditampilkan), dan karena itu mendukung hipotesis kedua.

Meskipun mekanisme molekuler memicu peraturan tersebut kejadian masih belum jelas, data yang disajikan dalam karya ini menunjukkan bahwa ekspresi pilus S. pneumoniae bisa menjadi contoh bistability, seperti yang baru-baru ini disarankan untuk Streptococcus pyogenes FCT3 dikodekan pili [56]. Bahkan, istilah ini biasanya disebut contoh fenotipik variasi di mana: 1) dua ekspresi yang stabil negara hidup berdampingan dalam populasi, 2) kebisingan atau faktor yang berbeda beroperasi di seluruh sel mengemudi populasi untuk beralih ke alternatif negara berekspresi dan menentukan keseluruhan beralih probabilitas; 3) peraturan tersebut terjadi melalui kehadiran loop umpan balik, baik positif atau negatif ganda [57-59]. Selain itu, bistability adalah epigenetik di alam (bukan disebabkan oleh perubahan dalam urutan DNA). Dalam hal ini, data kami mengecualikan kemungkinan kejadian variasi fase dalam PI-1, tapi genetic modifikasi hadir di tempat lain dalam genom (masih diselidiki) secara tidak langsung dapat mempengaruhi ekspresi pilus.

Dasar molekul dan manfaat biologis bistability ini Fenomena saat ini tidak diketahui. Agaknya, switching tersebut mekanisme telah berevolusi sebagai cara bagi bakteri untuk menjadi fenotip pra-beradaptasi

untuk bertahan hidup hadir atau pending merugikan kondisi. Kemungkinan besar, heterogenitas ini membantu bakteri untuk memanfaatkan relung yang berbeda dalam sebuah ekosistem, dan bahkan memiliki potensi untuk meningkatkan kebugaran secara keseluruhan dari spesies, dan menyiapkan sub-populasi sel S. pneumoniae untuk segera beradaptasi di respon terhadap stres atau kondisi lingkungan yang berbeda.

Sebagai kesimpulan, penelitian ini telah menunjukkan bahwa ekspresi pilus berikut pola biphasic, dan merupakan mekanisme yang diatur on-off terjadi pada tingkat transkripsi dan melibatkan semua PI-1 komponen, termasuk PI-1 RlrA regulator positif (ada bisa menjadi beberapa daerah promotor dalam PI-1 menanggapi RlrA regulasi positif). Penelitian lebih lanjut diperlukan untuk lebih memperjelas mekanisme molekuler yang bertanggung jawab untuk pilus biphasic fenotipe. Temuan ini menunjukkan bahwa pendekatan eksperimental baru harus dirancang untuk menilai kontribusi pilus-1 sampai virulensi. Selain itu, penemuan ini fenotipe biphasic mengarah ke kebutuhan untuk mengevaluasi ekspresi pilus pneumokokus selama infeksi dan untuk memahami jika in vivo kondisi akan memodulasi rasio ekspresi pilus, atau jika, masih alasan yang tidak diketahui, koeksistensi dari dua sub-populasi heterogen diperlukan untuk memanfaatkan potensi virulensi pilus.