Petunjuk Pelaksanaan Validasi Harmita

117Vol. I, No.3, Desember 2004

HarmitaDepartemen Farmasi FMIPA-UI

VALIDASI METODA ANALISIS

Validasi metoda analisis adalahsuatu tindakan penilaian terhadapparameter tertentu, berdasarkanpercobaan laboratorium, untuk mem-buktikan bahwa parameter tersebutmemenuhi persyaratan untuk peng-gunaannya.

PARAMETER PENAMPILANANALISIS

Beberapa parameter analisisyang harus dipertimbangkan dalamvalidasi metode analisis diuraikandan didefinisikan sebagaimana carapenentuannya.

1. Kecermatan (accuracy)Definisi:Kecermatan adalah ukuran yang

menunjukkan derajat kedekatan hasil

PETUNJUK PELAKSANAAN VALIDASIMETODE DAN CARA PERHITUNGANNYA

Majalah Ilmu Kefarmasian, Vol. I, No.3, Desember 2004, 117 - 135ISSN : 1693-9883

ABSTRACTEach analysis method by some reason, must be validated. The parameters are

selectivity, accuracy, precision, linearity, LOD, LOQ, ruggedness, and robustness.The parameters need to be calculated by assay methods.

This paper try to give some information above these methods base on someliteratures (USP 23rd, WHO, journal, etc).

Key words : Validation method, Parameter, Assay and calculation methods.

analis dengan kadar analit yangsebenarnya. Kecermatan dinyatakansebagai persen perolehan kembali(recovery) analit yang ditambahkan.Kecermatan hasil analis sangat ter-gantung kepada sebaran galat siste-matik di dalam keseluruhan tahapananalisis. Oleh karena itu untuk men-capai kecermatan yang tinggi hanyadapat dilakukan dengan cara mengu-rangi galat sistematik tersebut sepertimenggunakan peralatan yang telahdikalibrasi, menggunakan pereaksidan pelarut yang baik, pengontrolansuhu, dan pelaksanaannya yangcermat, taat asas sesuai prosedur.

Cara penentuan:Kecermatan ditentukan dengan

dua cara yaitu metode simulasi(spiked-placebo recovery) atau metodepenambahan baku (standard additionmethod). Dalam metode simulasi, se-jumlah analit bahan murni (senyawa

REVIEW ARTIKEL

MAJALAH ILMU KEFARMASIAN118

pembanding kimia CRM atau SRM)ditambahkan ke dalam campuranbahan pembawa sediaan farmasi(plasebo) lalu campuran tersebutdianalisis dan hasilnya dibandingkandengan kadar analit yang ditam-bahkan (kadar yang sebenarnya).Dalam metode penambahan baku,sampel dianalisis lalu sejumlah ter-tentu analit yang diperiksa ditam-bahkan ke dalam sampel dicampurdan dianalisis lagi. Selisih kedua hasildibandingkan dengan kadar yangsebenarnya (hasil yang diharapkan).Dalam kedua metode tersebut, per-sen peroleh kembali dinyatakan seba-gai rasio antara hasil yang diperolehdengan hasil yang sebenarnya. %Perolehan kembali dapat ditentukandengan cara membuat sampel pla-sebo (eksepien obat, cairan biologis)kemudian ditambah analit dengankonsentrasi tertentu (biasanya 80%sampai 120% dari kadar analit yangdiperkirakan), kemudian dianalisisdengan metode yang akan divalidasi.

Tetapi bila tidak memungkinkanmembuat sampel plasebo karenamatriksnya tidak diketahui sepertiobat-obatan paten, atau karena ana-litnya berupa suatu senyawa endo-gen misalnya metabolit sekunderpada kultur kalus, maka dapat di-pakai metode adisi.

Metode adisi dapat dilakukandengan menambahkan sejumlahanalit dengan konsentrasi tertentupada sampel yang diperiksa, laludianalisis dengan metode tersebut.Persen perolehan kembali ditentukandengan menentukan berapa persen

analit yang ditambahkan tadi dapatditemukan.

Kriteria kecermatan sangattergantung kepada konsentrasi analitdalam matriks sampel dan padakeseksamaan metode (RSD). Vander-wielen, dkk menyatakan bahwa se-lisih kadar pada berbagai penentuan(Xd) harus 5% atau kurang padasetiap konsentrasi analit pada manaprosedur dilakukan. Harga rata-rataselisih secara statistik harus 1,5% ataukurang. Kriteria tersebut dinyatakansecara matematik sebagai berikut:

Xd . 100 < 5%X0

Xd (S(0,95 n – I )). 100 -- < 1,5%

X0 n

Xd = Xi – X0

Xi = hasil analisisX0 = hasil yang sebenarnyaI = nilai t pada tabel t’ student pada

atas 95%S = simpangan baku relatif dari

semua pengujiann = jumlah sampel yang dianalisis

Kadar analit dalam metodepenambahan baku dapat dihitungsebagai berikut:

C R1 =

C + S R2

REVIEW ARTIKEL


R1C = S R2 – R1

C = kadar analit dalam sampelS = kadar analit yang ditambahkan

pada sampelR1 = respon yang diberikan sampelR2 = respon yang diberikan campuran

sampel dengan tambahan analit

Perhitungan perolehan kembalidapat juga ditetapkan dengan rumussebagai berikut: (CF - CA)% Perolehan kembali = x 100

C*A

CF = konsentrasi total sampel yangdiperoleh dari pengukuran

CA = konsentrasi sampel sebenarnyaC*A = konsentrasi analit yang di-

tambahkan

Pada metode penambahan baku,pengukuran blanko tidak diperlukanlagi. Metode ini tidak dapat diguna-kan jika penambahan analit dapatmengganggu pengukuran, misalnyaanalit yang ditambahkan menyebab-kan kekurangan pereaksi, mengubahpH atau kapasitas dapar, dll. Kriteriakecermatan dilakukan sama sepertipada metode simulasi.

Pada percobaan penetapan ke-cermatan, sedikitnya lima sampelyang mengandung analit dan plaseoyang harus disiapkan dengan kadarantara 50% sampai 150% dari kan-dungan yang diharapkan.

Persen perolehan kembali seha-rusnya tidak melebihi nilai presisi

RSD. Rentang kesalahan yang di-ijinkan pada setiap konsentrasi analitpada matriks dapat dilihat pada tabeldi bawah ini:

Analit pd matrik Rata-rata ygsampel, % diperoleh , %

100 98-102> 10 98-102> 1 97-103> 0,1 95-1050,01 90-1070,001 90-1070,000.1 (1 ppm) 80-1100,000.01 (100 ppb) 80-1100,000.001 (10 ppb) 60-1150,000.000.1 (1 ppb) 40-120

Contoh perhitungan:

Perolehan kembali Analit

Dianggap bobot tiap tablet 175 mg.

Penimbangan 20 tablet : 20 x 175 mg= 3500 mg.

Komposisi tablet tdd :

Zat aktif : 20 x 7,5 mg = 150 mg

Berat zat tambahan : 3500 mg – 150 mg = 3350 mg

Penimbangan serbuk plasebo:3.364,791 mg ditambahkan denganMeloksikam: 151,043 mg = 3.515,834mg

Meloksikam yg ditambahkan:151,043 x 99,34% = 150,046 mg

REVIEW ARTIKEL


PEROLEHAN KEMBALI 80, 100DAN 120 %

Perbandingan yang digunakan untukspike placebo : baku yang ditambah-kan = 70:30

Perolehan kembali 80% = 80% x 4 mg= 3,2 mgTerdiri dari serbuk plasebo = 70/100x 3,2 mg = 2,24 mg

% Penimbangan setara 2,24 mgserbuk plasebo = 2,24/150,05 x3515,83 mg = 52,49 mg

% Baku = 30/100 x 3,2 mg = 0,96mg

Penimbangan baku : 9,664 mg x 99,34% = 0,96 mg, larutkan dalam metanol20 ml. Pipet 2 ml untuk sekali penam-bahan sebagai baku.

Rec 100% = 100% x 4 mg = 4 mgTerdiri dari serbuk plasebo = 70/100x 4 mg = 2,80 mg

% Penimbangan setara 2,8 mgserbuk plasebo = 2,80 /150,05x 3515,83 mg = 65,608 mg

% Baku = 30/100 x 4 mg = 1,2 mgPenimbangan baku : 24,315 mg x99,34 % = 24,1545 mg, larutkan dalammetanol 100 ml metanol. Pipet 5 mluntuk sekali penambahan sebagaibaku.

Rec 120% = 120% x 4 mg = 4,8 mgTerdiri dari serbuk plasebo = 70/100x 4,8 mg = 3,36 mg

% Penimbangan setara 3,36 mgserbuk plasebo = 3,36 /150,05x 3515,83 mg = 78,73 mg

% Baku = 30/100 x 4,8 mg = 1,44mg

Penimbangan baku : 30,128 mg x99,34 % = 29,929 mg, larutkan dalammetanol 100 ml metanol. Pipet 5 mluntuk sekali penambahan sebagaibaku.

Contoh perhitungan % PerolehankembaliRata-rata area :1712875 + 1718115 = 1715495 2

Jumlah meloksikam total :1715495 + 3282,9347 x 50 6569,9521 1000

= 3,234 mg (CF)

Penimbangan serbuk plasebo : 53,215 mg

Baku yang ditambahkan : 0,96 mg (C*A)

Dalam 53,215 mg serbuk plaseboterdapat meloksikam sebanyak :

53,215 / 3515,834 x 150,046 mg = 2,271mg (CA)

% Perolehan kembali = (CF - CA)

x 100 C*A

% Perolehan kembali = 3,234 – 2,271 x 100 % = 100,31 % 0,960

REVIEW ARTIKEL


METODE SPIKED PLACEBO RE-COVERY

Penimbangan baku meloksikam :79,615 mg (99,34%) meloksikam !labu tentukur 200ml. Larutkan dalammetanol. Ultrasonik selama 30 menit.

Pipet 2, 4, 6, 10 dan 15 ml larutan !labu tentukur 50 ml dan tambahkan2 ml larutan baku dalam. Tambahkanfase gerak s/d tanda.

Larutan baku dalam :81,212 mg ! labu tentukur 100 mldilarutkan dalam metanol.

(lihat tabel 1 di bawah ini)

Keterangan :Persamaan regresi : y = 0,0173 x +0,01700; r = 0,9999

Contoh perhitungan :Rata rata luas puncak meloksikam :2081430,5

Rata rata luas puncak piroksikam :1541890,5Ratio M/P = 1,3499211

Kadar meloksikam =1,3499211 - 0,01700 x 50 = 3,852mg 0,0173 1000

Serbuk plasebo yang ditimbang92,053 mg mengandung

92,053 x 150,046 = 3,92857 mg3516,831

% Perolehan Kembali = 3,853 x 100% 3,929= 98,06%

2. Keseksamaan (precision)Definisi:Keseksamaan adalah ukuran

yang menunjukkan derajat kese-suaian antara hasil uji individual,diukur melalui penyebaran hasil in-dividual dari rata-rata jika prosedurditerapkan secara berulang padasampel-sampel yang diambil daricampuran yang homogen.

Konsentrasimeloksikam(µg/ml)

Luas krotamogram rata ratamV.det

Angka banding luaskromatrogrammeloksikamdan piroksikamPiroksikam Meloksikam

15,818 1551193,0 449819,0 0,2900

31,636 1546303,5 868274,5 0,5615

47,454 1545185,0 1303159,0 0,8434

79,090 1554005,0 2149441,0 1,3832

118,634 1553935,5 3207326,5 2,0640

Tabel 1. Hasil pengukuran kurva kalibrasi meloksikam menggunakan baku dalam

REVIEW ARTIKEL


Cara penentuan:Keseksamaan diukur sebagai

simpangan baku atau simpanganbaku relatif (koefisien variasi). Ke-seksamaan dapat dinyatakan sebagaiketerulangan (repeatability) atauketertiruan (reproducibility). Keter-ulangan adalah keseksamaan metodejika dilakukan berulang kali olehanalis yang sama pada kondisi samadan dalam interval waktu yangpendek. Keterulangan dinilai melaluipelaksanaan penetapan terpisah leng-kap terhadap sampel-sampel identikyang terpisah dari batch yang sama,jadi memberikan ukuran keseksama-an pada kondisi yang normal. Keter-tiruan adalah keseksamaan metodejika dikerjakan pada kondisi yangberbeda. Biasanya analisis dilakukandalam laboratorium-laboratoriumyang berbeda menggunakan pera-latan, pereaksi, pelarut, dan analisyang berbeda pula. Analis dilakukanterhadap sampel-sampel yang di-duga identik yang dicuplik dari batchyang sama. Ketertiruan dapat jugadilakukan dalam laboratorium yangsama dengan menggunakan pera-latan, pereaksi, dan analis yang ber-beda. Kriteria seksama diberikan jikametode memberikan simpanganbaku relatif atau koefisien variasi 2%atau kurang. Akan tetapi kriteria inisangat fleksibel tergantung padakonsentrasi analit yang diperiksa,jumlah sampel, dan kondisi labora-torium. Dari penelitian dijumpaibahwa koefisien variasi meningkatdengan menurunnya kadar analityang dianalisis. Ditemukan bahwa

koefisien variasi meningkat seiringdengan menurunnya konsentrasianalit. Pada kadar 1% atau lebih,standar deviasi relatif antara labo-ratorium adalah sekitar 2,5% adapada satu per seribu adalah 5%. Padakadar satu per sejuta (ppm) RSDnyaadalah 16%, dan pada kadar part perbilion (ppb) adalah 32%. Pada me-tode yang sangat kritis, secara umumditerima bahwa RSD harus lebih dari2%.

Karena metode presisi adalahfungsi penetapan kadar pada rentangyang dapat diterima menurut De-besis et. al. pada analisa mengguna-kan metode HPLC akan digunakanketentuan presisi berikut: (lihat tabel2 di sebelah).

Untuk menetapkan presisi bahancampuran dan bahan sisa pada artikelobat, formula berikut ini harus di-gunakan untuk menentukan metodeketertiruan yang tepat (interlabo-ratorium).

RSD < 2 (1-0,5 log c)

dan untuk keterulangan :

RSD < 2 (1-0,5 log c) x 0,67

c = konsentrasi analit sebagai fraksidesimal (contoh: 0,1% = 0,001)

Keseksamaan dapat dihitungdengan cara sebagai berikut:

1. Hasil analisis adalah x1, x2, x3, x4,

.....................xnmaka simpangan bakunya adalah

SD =

( Σ (x - x )2 )n – 1

REVIEW ARTIKEL


2. Simpangan baku relatif ataukoefisien variasi (KV) adalah:

KV = SD x 100% x

Percobaan keseksamaan dilaku-kan terhadap paling sedikit enamreplika sampel yang diambil daricampuran sampel dengan matriksyang homogen. Sebaiknya kesek-samaan ditentukan terhadap sampelsebenarnya yaitu berupa campurandengan bahan pembawa sediaanfarmasi (plasebo) untuk melihatpengaruh matriks pembawa terhadapkeseksamaan ini. Demikian jugaharus disiapkan sampel untuk meng-analisis pengaruh pengotor dan hasildegradasi terhadap keseksamaan ini.

Contoh uji homogenitasCara kerja :Standar 100 ppm- Timbang 25,0 mg tetrasiklin HCl.

Masukan kedalam labu ukur 50,0

ml. Tambahkan air sampai 50,0 ml,kocok (lakukan triplo).

- Pipet 2,0 ml larutan diatas. Ma-sukan ke dalam labu ukur 10,0 ml.Tambahkan air sampai 10,0 ml.Kocok (dibuat 10 labu).

Standar 1000 ppm

- Timbang 50,0 mg tetrasiklin HCl.Masukan ke dalam labu ukur 25,0ml. Tambahkan air sampai 10,0 ml,kocok (lakukan triplo)

- Pipet 5,0 ml larutan diatas. Ma-sukan ke dalam labu ukur 10,0 ml.Tambahkan air sampai 10,0 ml.Kocok (dibuat 10 labu)

Suntikan 20 µl standar 100 ppm danstandar 1000 ppm pada HPLCdengan kecepatan alir 1,0 ml/menitdan panjang gelombang 360 nm.

Tabel 2. Rentang maksimum yang diperbolehkan (Perhitungan dibuat berdasarkanatas kepercayaan 99%).

Rentang yangdapat diterima(% klaim)

Penetapan tunggal Penetapan duploMetode RSD

(%)Sistem RSD

(%)Metode RSD

(%)Sistem RSD

(%)98,5 - 101,5 0,58 0,41 0,82 0,58

97 - 103 1,2 0,82 1,6 1,295 - 105 1,9 1,4 2,7 1,990 - 110 3,9 2,8 5,5 3,990 - 115 4,8 3,4 6,9 4,890 - 125 6,8 4,8 9,6 6,885 - 115 5,8 4,1 8,2 5,875 - 125 9,7 6,950 - 150 19,4 13,7

REVIEW ARTIKEL


F = S2

N (terbesar) S2 =

Σ (x – x )2

S2l (terkecil) N – 1

S2 = variansi

F < F tabel

Contoh perhitungan uji keseksama-an (presisi)

Cara kerjaa. Pembuatan larutan baku- Timbang baku Tetrasiklin HCl

20,0; 30,0 mg masing-masing ma-sukan ke dalam labu ukur 50,0 ml.Maka diperoleh konsentrasi larut-an berturut-turut sebesar 400, 500dan 600 ppm.

- Larutkan dengan air sampai 50,0ml, kocok.

- Suntikkan µl larutan baku padaHPLC.

b. Pembuatan larutan uji- Timbang serbuk obat Tetrasiklin

HCl yang kadarnya 80 %, 100 %,

120 % sebesar 100,0 mg (masing-masing 6, setiap 100 mg serbukobat mengandung tetrasiklin HCl50 mg). Masukan ke dalam labuukur 100,0 ml. Maka akan diper-oleh konsentrasi larutan berturut-turut sebesar 400, 500 dan 600 ppm.

- Larutkan dengan air sampai 100,0ml, kocok

- Saring dengan kertas saring Dura-pore membran filter 0,45 mm HV.

- Suntikan 20 µl larutan uji padaHPLC. Hitung % kadarnya.

Presisi dilakukan pada sediaanserbuk obat Tetrasiklin HCl dengankonsentrasi 80 %, 100 %, 120 % kadarTetrasiklin HCl, masing-masingenam kali penimbangan yang dilaku-kan pada hari yang berbeda selama3 hari. Hasil perhitungan tersebutdapat dilihat pada tabel-tabel berikutini.

Tabel 3. Homogenitas dari Tetrasiklin HCl

Konsentrasi KonsentrasiTetrasiklin HCl Area Tetrasiklin Area

(ppm) (ppm)

100 1782560 1000 17824940100 1784392 1000 17830710100 1784506 1000 17831960100 1784857 1000 17851970100 1785275 1000 17853480100 1807112 1000 17895130100 1808175 1000 17899070100 1809577 1000 17921150100 1823930 1000 17933210100 1853383 1000 17959770

Nilai F 4,31

REVIEW ARTIKEL


Tabel 4. Presisi Tetrasiklin 80 %

Konsentrasi Tetrasiklin Area Presentasi kadarHCl (ppm) (%)

400 7168141 80,34400 7159952 80,26400 7112864 79,79400 7136432 80,03400 7116750 79,83400 7127785 79,94

SD < ( Syarat kadar terbesar – terkecil ) = 3,33 0,236

RSD ( < 2 % ) 0,28

Tabel 5. Presisi Tetrasiklin HCl 100 %


500 9184380 100,39500 9305120 101,59500 9502175 103,65500 9335870 101,89500 9283175 101,47500 9193470 100,48


RSD ( < 2 % ) 1,17

Tabel 6. Presisi Tetrasiklin HCl 120 %


600 11206510 120,50600 11157635 120,01600 11124382 119,68600 11132680 119,76600 11173120 120,16600 11227365 120,70


RSD ( < 2 % ) 1,34

REVIEW ARTIKEL


Tabel 7. Presisi Serbuk Obat Tetrasiklin HCl 80 %


400 7158750 80,25400 7126435 79,93400 7109690 79,76400 7142460 80,09400 7171155 80,37400 7129140 79,96


RSD ( < 2 % ) 0,28



500 9195010 100,50500 9312420 101,66500 9392500 102,46500 9311795 101,66500 9176435 100,31500 9137890 99,93


RSD ( < 2 % ) 0,97



600 11216645 120,60600 11134340 119,78600 11231470 120,75600 11175835 120,19600 11149590 119,93600 11197365 120,41


RSD ( < 2 % ) 0,32

REVIEW ARTIKEL


3. Selektivitas (Spesifisitas)DefinisiSelektivitas atau spesifisitas

suatu metode adalah kemampuannyayang hanya mengukur zat tertentusaja secara cermat dan seksamadengan adanya komponen lain yangmungkin ada dalam matriks sampel.Selektivitas seringkali dapat dinyata-kan sebagai derajat penyimpangan(degree of bias) metode yang dilakukanterhadap sampel yang mengandungbahan yang ditambahkan berupacemaran, hasil urai, senyawa sejenis,senyawa asing lainnya, dan diban-dingkan terhadap hasil analisis sam-pel yang tidak mengandung bahanlain yang ditambahkan.

Cara penentuan:Selektivitas metode ditentukan

dengan membandingkan hasil ana-lisis sampel yang mengandung cema-ran, hasil urai, senyawa sejenis, se-nyawa asing lainnya atau pembawaplasebo dengan hasil analisis sampeltanpa penambahan bahan-bahan tadi.

Penyimpangan hasil jika ada meru-pakan selisih dari hasil uji keduanya.

Jika cemaran dan hasil urai tidakdapat diidentifikasi atau tidak dapatdiperoleh, maka selektivitas dapatditunjukkan dengan cara menga-nalisis sampel yang mengandungcemaran atau hasil uji urai denganmetode yang hendak diuji lalu diban-dingkan dengan metode lain untukpengujian kemurnian seperti kroma-tografi, analisis kelarutan fase, danDifferential Scanning Calorimetry.Derajat kesesuaian kedua hasil ana-lisis tersebut merupakan ukuranselektivitas. Pada metode analisisyang melibatkan kromatografi, selek-tivitas ditentukan melalui perhi-tungan daya resolusinya (Rs).

Cara kerja :Untuk uji selektifitas maka zat

yang akan diuji harus ditentuka dulupanjang gelombang maksimum.Dalam hal ini larutan tetrasiklin HClmempunyai panjang gelombangmaksimum 360 nm. Selanjutnya

Tabel 10. Persisi Serbuk Obat Tetrasiklin HCl 80 %


400 7114565 79,81400 7188390 80,54400 7132320 79,99400 7157255 80,24400 7168430 80,35400 7125835 79,92


RSD ( < 2 % ) 0,35

REVIEW ARTIKEL


dibuat larutan baku, larutan uji danlarutan blanko.a. Pembuatan larutan baku tetra-

siklin HCl- Timbang 25,0 mg baku Tetrasiklin

HCl, masukan kedalam labu ukur50,0 ml.


- Suntikkan 20 µl larutan uji padaHPLC. Amati puncaknya padakromatogram HPLC.

b. Pembuatan larutan uji tetrasiklinHCl

- Timbang 100,0 mg serbuk obattetrasiklin HCl, masukan kedalamlabu ukur 100,0 ml.


- Saring dengan kertas saringDurapore membrane filter 0,45µm HV

- Suntikan 20 µl larutan uji padaHPLC. Amati puncaknya padakromatogram HPLC.

Hasil kromatogram Tetrasiklin HClstandar dan sampel harus menun-jukkan waktu retensi yang sama danpada daerah sekitar waktu retensitetrasiklin tersebut tidak boleh adagangguan yang dapat dilihat darikromatogram larutam blanko.

4. Linearitas dan RentangDefinisi:Linearitas adalah kemampuan

metode analisis yang memberikanrespon yang secara langsung ataudengan bantuan transformasi mate-

matik yang baik, proporsional ter-hadap konsentrasi analit dalamsampel. Rentang metode adalahpernyataan batas terendah dantertinggi analit yang sudah ditun-jukkan dapat ditetapkan dengankecermatan, keseksamaan, danlinearitas yang dapat diterima.

Cara penentuan:Linearitas biasanya dinyatakan

dalam istilah variansi sekitar arahgaris regresi yang dihitung berda-sarkan persamaan matematik datayang diperoleh dari hasil uji analitdalam sampel dengan berbagai kon-sentrasi analit. Perlakuan matematikdalam pengujian linearitas adalahmelalui persamaan garis lurusdengan metode kuadrat terkecil an-tara hasil analisis terhadap konsen-trasi analit. Dalam beberapa kasus,untuk memperoleh hubungan pro-porsional antara hasil pengukurandengan konsentrasi analit, data yangdiperoleh diolah melalui transfor-masi matematik dulu sebelum dibuatanalisis regresinya.

Dalam praktek, digunakan satuseri larutan yang berbeda konsen-trasinya antara 50 – 150% kadar analitdalam sampel. Di dalam pustaka,sering ditemukan rentang konsen-trasi yang digunakan antara 0 –200%. Jumlah sampel yang dianalisissekurang-kurangnya delapan buahsampel blanko.

Sebagai parameter adanya hu-bungan linier digunakan koefisienkorelasi r pada analisis regresi linierY = a + bX. Hubungan linier yang

REVIEW ARTIKEL


ideal dicapai jika nilai b = 0 danr = +1 atau –1 bergantung pada arahgaris. Sedangkan nilai a menun-jukkan kepekaan analisis terutamainstrumen yang digunakan. Param-eter lain yang harus dihitung adalahsimpangan baku residual (Sy).Dengan menggunakan kalkulatoratau perangkat lunak komputer,semua perhitungan matematik ter-sebut dapat diukur

^ Σ ( y1 – y1)2

Sy = N – 2^ di mana y1 = a + bx

Sx0 =Sy

b Sx0 = standar deviasi dari fungsi

Vx0 =Sx0

x

Vx0 = koefisien variasi dari fungsi

Contoh penentuan linearitasCara kerja :a. - Timbang baku tetrasiklin HCl

(B1, B2, B3) masing-masingsebesar 20,0; 22,5; 25,0 mg.Masukkan kedalam labu ukur25,0 ml.

- Larutkan dengan air sampai25,0 ml, kocok.

b. - Timbang baku Tetrasiklin HCl(B4, B5) masing-masing sebe-sar 30,0; 35,0 mg. Masukkankedalam labu ukur 50,0 ml.

- Larutkan dengan air sampai50,0 ml, kocok.

Standar 1 :Pipet 1,0 ml larutan baku B3.

Masukan kedalam labu ukur 10,0 ml.Tambahkan air sampai 10,0 ml,kocok.Standar 2 :

Pipet 5,0 ml larutan baku B3.Masukkan ke dalam labu ukur 25,0ml. Tambahkan air sampai 25,0 ml,kocok.Standar 3 :

Pipet 5,0 ml larutan baku B4.Masukkan kedalam labu ukur 10,0 ml.Tambahkan air sampai 10,0 ml,kocok.Standar 4 :

Pipet 5,0 ml larutan baku B1.Masukkan kedalam labu ukur 10,0 ml.Tambahkan air sampai 10,0 ml,kocok.Standar 5 :

Pipet 5,0 ml larutan baku B3.Masukkan kedalam labu ukur 10,0 ml.Tambahkan air sampai 10,0 ml,kocok.Standar 6 : Larutan baku B4Standar 7 : Larutan baku B5Standar 8 : Larutan baku B1Standar 9 : Larutan baku B2Standar 10 : Larutan baku B3

Suntikkan 20 µl standar (sampaidengan standar 10 pada HPLC padaλ : 352 nm dan kecepatan alir 1,0ml/menit. Hubungan linear antarakonsentrasi (ppm) dan area Tetra-siklin HCl dalam pelarut air pada 10perbedaan tingkat konsentrasi antara100 – 1000 ppm ditunjukkan padatabel 9. Hasil dari analisis regresimenggunakan model y = ax + b dapatdilihat pada tabel 11.

REVIEW ARTIKEL


5. Batas Deteksi dan Batas Kuan-titasiDefinisi:Batas deteksi adalah jumlah ter-

kecil analit dalam sampel yang dapatdideteksi yang masih memberikanrespon signifikan dibandingkandengan blangko. Batas deteksi me-rupakan parameter uji batas. Bataskuantitasi merupakan parameterpada analisis renik dan diartikansebagai kuantitas terkecil analit da-lam sampel yang masih dapat meme-nuhi kriteria cermat dan seksama.

Cara penentuan:Penentuan batas deteksi suatu

metode berbeda-beda tergantungpada metode analisis itu mengguna-

kan instrumen atau tidak. Padaanalisis yang tidak menggunakaninstrumen batas tersebut ditentukandengan mendeteksi analit dalamsampel pada pengenceran bertingkat.Pada analisis instrumen batas deteksidapat dihitung dengan mengukurrespon blangko beberapa kali laludihitung simpangan baku responblangko dan formula di bawah inidapat digunakan untuk perhitungan

k x SbQ =Sl

Q = LOD (batas deteksi) atau LOQ(batas kuantitasi)

k = 3 untuk batas deteksi atau 10untuk batas kuantitasi

Tabel 11. Linearitas dari Tetrasiklin HCl

Konsentrasi Tetrasiklin HCl(ppm) Area

100 1791763200 3583526300 5375289400 7167052500 9078290600 11190450700 12542340800 14334110900 161258701000 17918670

Slop b 17937,62Aksis Intersep a 45047,55Koefisien Korelasi (r) 0.999Proses Relatif Standar Deviasi (VxO) 1,504 %ANOVA Lineariti testing 12063,95172

REVIEW ARTIKEL


a. Batas deteksi (Q)Karena k = 3 atau 10Simpangan baku (Sb) = Sy/x,maka

3 Sy/xQ =

Sl

b. Batas kuantitasi (Q)

10 Sy/xQ = Sl

Perhitungan LOD dan LOQ

Sb = simpangan baku respon analitikdari blangko

Sl = arah garis linear (kepekaanarah) dari kurva antara responterhadap konsentrasi = slope (bpada persamaan garis y = a+bx)

Batas deteksi dan kuantitasidapat dihitung secara statistikmelalui garis regresi linier dari kurvakalibrasi. Nilai pengukuran akansama dengan nilai b pada persamaangaris linier y = a + bx, sedangkansimpangan baku blanko sama dengansimpangan baku residual (Sy/x.)

Tabel 12. Hasil pengukuran Kurva Kalibrasi Meloksikam

Konsentrasi meloksikam Luas kromotogram rata-rata(mg/ml) Meloksikam (mV.det)

15,818 423452,531,636 83211747,454 125274179,090 2101372,5118,634 3149102

Persamaan regresi ; y = 26569,95 x – 3282,9347

No Kons.analit Area (Yi) Yi (Yi – Yi)2(µg/ml)

1. 15,818 423.452,5 417053,67 40945025,372. 31,636 832.117,0 837390,28 27807481,963. 47,454 1.252.741,0 1257461,19 22280193,644. 79,090 2.101.372,5 2098134,41 10485226,855. 118,634 31.49102,0 3148710,23 153483,73

Σ = 101671411,6

REVIEW ARTIKEL


Y didapat dari pers regresi, misalnya:X = 15,82 maka

y = 26569,95 x – 3282,9347

= 417053,67

S (y/x)2 = Variasi variabel respon (y),didapat dari data-data yang dekatdengan garis regresi

= Σ (yi – yi)2

N – 2

= 101671411,60 = 33890470,523

S (y/x) = V 33890470,52 = 5821,55

LOD= 3.SD/b LOQ= 10.SD/b

= 3.5821,55 = 10.5821,55 26569,95 26569,95

= 0,66 µg/ml = 2,19 µg/ml

Cara lain untuk menentukanbatas deteksi dan kuantitasi adalahmelalui penentuan rasio S/N (signalto noise ratio). Nilai simpangan bakublanko ditentukan dengan caramenghitung tinggi derau pada peng-ukuran blanko sebanyak 20 kali padatitik analit memberikan respon. Sim-pangan baku blanko juga dihitungdari tinggi derau puncak ke puncak,jika diambil dari tinggi puncakderau atas dan bawah (Np-p) maka s0= Np-p/5 sedangkan kalau dari pun-cak derau bawah saja (puncak negatif)maka s0 = Np/2, selanjutnya perhi-tungan seperti tersebut di atas.

6. Ketangguhan metode (rugged-ness)Definisi:Ketangguhan metode adalah

derajat ketertiruan hasil uji yangdiperoleh dari analisis sampel yangsama dalam berbagai kondisi uji nor-mal, seperti laboratorium, analisis,instrumen, bahan pereaksi, suhu, hariyang berbeda, dll. Ketangguhanbiasanya dinyatakan sebagai tidakadanya pengaruh perbedaan operasiatau lingkungan kerja pada hasil uji.Ketangguhan metode merupakanukuran ketertiruan pada kondisioperasi normal antara lab dan antaranalis.

Cara penentuan:Ketangguhan metode ditentukan

dengan menganalisis beningan suatulot sampel yang homogen dalam labyang berbeda oleh analis yang ber-beda menggunakan kondisi operasiyang berbeda, dan lingkungan yangberbeda tetapi menggunakan pro-sedur dan parameter uji yang sama.Derajat ketertiruan hasil uji kemu-dian ditentukan sebagai fungsi darivariabel penentuan. Ketertiruandapat dibandingkan terhadap kesek-samaan penentuan di bawah kondisinormal untuk mendapatkan ukuranketangguhan metode. Perhitung-annya dilakukan secara statistikmenggunakan ANOVA pada kajiankolaboratif yang disusun olehYouden dan Stainer.

7. Kekuatan (Robustness)Untuk memvalidasi kekuatan

suatu metode perlu dibuat perubahan

REVIEW ARTIKEL


metodologi yang kecil dan terusmenerus dan mengevaluasi responanalitik dan efek presisi dan akurasi.Sebagai contoh, perubahan yang di-butuhkan untuk menunjukkan keku-atan prosedur HPLC dapat mencakup(tapi tidak dibatasi) perubahankomposisi organik fase gerak (1%),pH fase gerak (± 0,2 unit), dan peru-bahan temperatur kolom (± 2 - 3° C).Perubahan lainnya dapat dilakukanbila sesuai dengan laboratorium.

Identifikasi sekurang-kurangnya3 faktor analisis yang dapat mem-pengaruhi hasil bila diganti ataudiubah. Faktor orisinal ini dapatdiidentifikasi sebagai A, B, dan C.Perubahan nilai faktor-faktor inidapat diidentifikasi dengan a, b, danc. Lakukan analisis pada kondisiyang telah disebutkan pada peme-riksaan ketangguhan.

Nilai Penetapanfaktor eksperimental

#1 #2 #3 #4A atau a A A a aB atau b B b B bC atau c C c c C

Untuk menentukan efek peru-bahan A, banding rata-rata hasil (#1+ #2)/2 dengan (#3 + #4)/2, Untukefek perubahan B, bandingkan (#1 +#3)/2 dengan (#2 +#4)/2 dan sete-rusnya.

SELEKSI PARAMETERANALITIK

Parameter analitik yang diper-lukan untuk validasi dapat bervariasi

bergantung pada tipe prosedur ana-litik. Metode yang digunakan untukpemeriksaan produk farmasetikadapat diklasifikasikan seperti dibawah ini :! Kategori I : metode analitikal un-

tuk kuantitasi komponen maupunsubstansi bahan baku obat ataubahan aktif (termasuk pengawet)pada hasil akhir farmasetika ter-masuk dalam kategori I.

! Kategori II : Metode analitik untukmenentukan campuran dalamsubstansi bahan baku atau kompo-nen sisa pada produk akhir farma-setika dimasukkan dalam kategoriII. Metode ini termasuk perhi-tungan kembali secara kuantitatifdan batas tes.

! Kategori III : Metode analitik iniuntuk menentukan performa ka-rakteristik (contoh: disolusi, pe-lepasan obat) termasuk dalamkategori III.

Untuk masing-masing kategoridiperlukan informasi analitik yangberbeda. Tabel 13 berikut mem-berikan langkah-langkah mengenaiparameter analitik yang biasanyadiperlukan untuk masing-masingkategori.

Tes SST (system suitability tests)Dari validasi metode yang

dilakukan dapat diketahui apakahsuatu metode analisis (dalam hal inikromatografi) dapat dipakai padasuatu kondisi tertentu. Untukmengetahui apakah metode tadi

REVIEW ARTIKEL


masih dapat dipakai, seyogyanyadilakukan uji SST, seperti yang dian-jurkan oleh USP XXII/XXIII ataupeneliti lainnya (Wahlich & Carr,1990). Sebaiknya semua parametervalidasi diuji SSTnya, sedangkankhusus untuk kromatografi param-eter tailing factor dan column effi-ciency/ plate count juga diuji.

DAFTAR PUSTAKA

Carr, G.P., Wahlich, J.C., Journal ofPharmaceutical and BiomedicalAnalysis 1990, 8: 612-618.

Debesis, E. et al., Submitting HPLCmethodes to the compendia andregulatory agencies. Pharm.Tech., September 1982. p. 120

Fabre. H. et.al., Assay validation foran active ingredient in a pharma-ceutical formulation: Practicalapproach using ultraviolet spec-trophotometry. Analyst, 1993.118: 1061.

Garfield, F.M. Quality AssurancePrinciples for Analytical Labora-tories. AOAC International,USA, 1991. p. 71

Ibrahim S. Penggunaan Statistikadalam Validasi Metode Analitikdan Penerapannya. Dalam Pro-siding temu ilmiah nasionalbidang Farmasi. VI – 15. 2001.

Indrayanto G, Seminar Sehari Instru-mentasi PT Ditek Jaya, Surabaya,1994.

Siregar, Mirawati., Penetapan KadarMeloksikam dalam sediaan tab-let dan Darah Manusia secara

Tabel 13. Parameter analitik yang harus dipertimbangkan untuk tipe prosedur analitikyang berbeda

Parameter Kualitatif Perhitungan Perhitungan kembali PerhitunganPerforma (ID) kembali Kategori II KembaliAnalitik Kategori I Kuantitatif Batas tes Kategori IIIAkurasi tidak ya ya * *Presisi tidak ya ya tidak yaSpesifisitas ya ya ya ya *Batas deteksi ya tidak tidak ya *Bataskuantitasi tidak tidak ya tidak *Linearitas tidak ya ya tidak *Rentang tidak ya ya * *Ketangguhan ya ya ya ya ya

* mungkin dibutuhkan, bergantung pada sifat tes yang spesifik.

REVIEW ARTIKEL


kromatografi Cair Kinerja Ting-gi, Tesis S2 Ilmu KefarmasianDepartemen Farmasi FMIPA-UI,2004.

Validation of analytical proceduresused in the examination of phar-maceutical materials. WorldHealth Organization 1992 (WHO

Technical Report Series No. 823)p. 117

Validation of Compendial Methods.United States Pharmacopoeia 23rd

revision, United States Pharma-copoeia Convention, Rockville,MD, 1995. p. 1982.

REVIEW ARTIKEL

Petunjuk Pelaksanaan Validasi Harmita

Documents

Transcript of Petunjuk Pelaksanaan Validasi Harmita