Percobaan 34 C: Denitrifikasi

I. TUJUAN

1. Mengetahui proses denitrifikasi pada aktivitas mikrobiologi tanah.

2. Menunjukkan reduksi nitrat menjadi gas nitrogen (N2).

3. Mengetahui jenis bakteri yang mampu melakukan denitrifikasi.

II. PRINSIP

Setelah nitrifikasi, proses selanjutnya dalam siklus nitrogen adalah

denitrifikasi. Proses ini merupakan pembentukan gas Nitrogen dengan

mereduksi senyawa hasil nitrifikasi, yaitu nitrat secara bertahap. Percobaan ini

menggunakan medium yang mengandung nitrat, substrat untuk pembentukan

gas nitrogen dan tabung durham untuk mendeteksi evolusi gas nitrogen. Gas

Nitrogen yang terbentuk dapat dideteksi dengan kehadiran gelembung gas di

tabung durham. Denitrifikasi tidak terjadi jika di dalam tabung durham tidak

terdapat gas.

III. TEORI DASAR

Proses denitrifikasi merupakan bagian dari siklus nitrogen nitrogen.

Denitrifikasi secara umum merupakan proses reduksi nitrat (NO3-) secara

bertahap menjadi nitrit (NO2-), Nitrouse Dioxide (N2O), Nitrouse Oxide

(NO), sampai menjadi N2.

Ada dua tahap konversi dalam proses denitrifikasi yaitu :

1. Tahap nitrat menjadi nitrit

2. Tahap nitrit menjadi gas nitrogen

Sehingga keseluruhan proses secara berurutan adalah :

NO3 NO2 NO N2O N2

Gambar 1. Posisi Denitrifikasi dalam siklus Nitrogen

Reduksi nitrat menjadi nitrit pada mikroorganisme fakultatif anaerob

terjadi pada kondisi tanpa oksigen atau kondisi anaerob. Pada proses ini,

bakteri menggunakan senyawa anorganik seperti nitrat atau sulfat sebagai

akseptor elektron terminal. Enzim nitrat reduktase mengkatalisasi transfer

elektron dari sitokrom b sehingga nitrat tereduksi menjadi nitrit. Sehingga,

jika oksigen dalam tanah kurang maka akan berlangsung denitrifikasi, yaitu

nitrat direduksi sehingga terbentuk nitrit dan akhirnya menjadi amoniak yang

tidak dapat dimanfaatkan oleh tumbuhan.

Nitrogen dalam bentuk inorganic merupakan akseptor electron yang umum

digunakan dalam respirasi anaerobic. Gambar 2 di bawah merupakan tabel

bentuk-bentuk nitrogen inorganic dengan tingkat oksidasinya.

Gambar 2. Tabel Tingkat Oksidasi Nitrogen Inorganik

Gambar 3. Proses Reduksi Nitrat pada Pada Respirasi Anaerob(Sumber: Brock Biology of Microorganism)

Gambar 3 di atas menunjukkan bagaimana bakteri dapat mereuksi nitrat

pada proses respirasi secara anaerob. Bagian c menunjukkan proses reduksi

nitrat dan nitrooksida terjadi di protein integral yang dibantu dengan enzim

perisplasmic. Proses transfer electron secara aerobik, respirasi nitrat, dan

denitrifikasi pada gambar 3 tersebut dibandingkan. Enzim yang pertama kali

berperan untuk reduksi nitrat adalah nitrate reductese, sebuah “molybdenum”

yang mengandung membrane terintegrasi yang dapat menekan oksigen

(oksigen sebagai akseptor electron). Pada kondisi anoksik (tanpa oksigen),

nitrat harus selalu tersedia sebagai akseptor electron.

Produk pertama dari reduksi nitrat adalah ion nitrit. Enzim nitrit reduktase

kemudian mengubahnya menjadi NO. Beberapa organisme mereduksi nitrit

menjadi ammonia melalui proses disimilasi, dan gas nitrogen yang dihasilkan

sangat besar. Hal iniah yang menyebabkan beberapa produk denitrifikasi

seperti N2O dan NO di lingkungan sangat signifikan. N2O berubah menjadi

NO akibat adanya sinar matahari dan nitrit terbentuk akibat NO bereaksi

dengan ozon di atmosfer. Ketika hujan, nitrit akan menyebabkan hujan asam

(Madigan, 2015)

Proses denitrifikasi tidak lepas dari peranan bakteri denitrifikasi

(denitrifier). Bakteri denitrifikasi adalah kelompok bakteri yang memiliki

kemampuan untuk melakukan reaksi reduksi senyawa nitrat (NO3-) menjadi

senyawa nitrogen bebas (N2). Pada beberapa kelompok bakeri denitrifikasi,

dapat ditemukan senyawa nitrogen oksida (NO) sebagai hasil sampingan

metabolisme. Proses ini pada umumnya berlangsung secara anaerobik (tanpa

melibatkan molekul oksigen, O2).

Contoh bakteri yang mampu melakukan metabolisme ini

adalah Pseudomonas stutzeri, Pseudomonas aeruginosa, dan Paracoccus

denitrificans (Calrson & Ingraham, 1983). Sumber lain menyebutkan Bakteri

yang melakukan proses denitrifikasi meliputi Achromobacter, aerobacter,

alcaligenes, bacillus, brevibacterium, flavobacterium, micrococcus, proteus,

pseudomona dan spirillum.

Gambar 2. Proses reduksi nitrat menjadi gas nitrogen

(sumber: Brock Biology of Microorganism)

Denitrifikasi dipengaruhi oleh beberapa faktor yaitu: kelembapan tinggi,

pH netral (6,8-8,0), ketersediaan karbon, kadar oksigen terlarut dan temperatur

yang tinggi.

Gambar 3. Bakteri Denitrifikasi: Pseudomonas aeruginosa

IV. ALAT DAN BAHAN

ALAT BAHAN

1. Tabung reaksi 4 + Tabung

Durham 4

2. Pembakar Bunsen

3. Jarum inokulasi

4. Pipet tetes

5. Inkubator

1. Kultur bakteri Pseudomonas

dan bakteri Bacillus sp berumur

24 jam.

2. Sampel tanah subur dah tidak

subur.

3. Kaldu nitrat

V. HASIL PENGAMATAN

Tanggal Pengamatan : 25 Maret 2015 dan 1 April 2015

No. Jenis Sampel Gambar Hasil Pengamatan Keterangan

1. Bakteri

Pseudomonas

Gambar 34C-1. KondisiBakteri Pseudomonas Hari ke-7

(Sumber: Kelompok 17)

Gambar 34C-2. Kondisi BakteriPseudomonas Hari ke-14(Sumber: Kelompok 17)

Warna medium

kaldu nitrat

menjadi keruh dan

terdapat sedikit

gelembung gas

pada tabung

durham.

Pengamatan H+7

hingga H+14

menunjukkan

peningkatan

kekeruhan pada

medium.

2. Bakteri

Bacillus sp

Gambar 34C-3. Kondisi BakteriBacillus Hari ke-7

(Sumber: Kelompok 14)

Gambar 34C-4. Kondisi BakteriBacillus Hari ke-14

(Sumber: Kelompok 14)

Warna medium

kaldu nitrat

menjadi keruh dan

terdapat sedikit

gelembung gas

pada tabung

durham.

Pengamatan H+7

hingga H+14

menunjukkan

peningkatan

kekeruhan pada

medium serta

penambahan

jumlah gas di

tabung durham.

3. Tanah Subur

Gambar 34C-5. Kondisi SampelTanah Subur Hari ke-7(Sumber: Kelompok 7)

Warna medium

(kaldu nitrat)

menjadi keruh dan

terdapat sedikit

gelembung gas

pada tabung

durham. Muncul

pula endapan tanah

serta beberapa

tanah yang

mengambang di

permukaan.

Pengamatan H+7

hingga H+14

Gambar 34C-6. Kondisi SampelTanah Subur Hari ke-14(Sumber: Kelompok 7)

menunjukkan

peningkatan

kekeruhan

medium.

4. Tanah Tidak

Subur

Gambar 34C-7. Kondisi SampelTanah Tidak Subur Hari ke-7

(Sumber: Kelompok 12)

Warna medium

(kaldu nitrat)

menjadi keruh dan

terdapat

gelembung gas.

Terdapat endapan

tanah.

VI. ANALISIS

Tabel 1. Produksi gas Nitrogen pada beberapa Bakteri berdasarkan Hasil

Pengamatan

No. Sampel Produksi gas Nitrogen

1. Pseudomonas +

2. Bacillus +

3. Tanah subur +

4. Tanah tidak subur ++

Keterangan : + Positif terdapat gelembung (teramati secara kualitatif)

Pada percobaan 34-C ini, akan ditunjukkan proses denitrifikasi oleh

beberapa jenis bakteri uji, diantaranya Pseudomonas, Bacillus, serta sampel

tanah subur dan tidak subur. Bakteri yang dapat melakukan proses

denitrifikasi adalah bakteri yang mengeluarkan gas Nitrogen dari senyawa

nitrat. Percobaan ini menggunakan kaldu nitrat sebagai sumber nutrisi bakteri

untuk diubah secara bertahap menjadi nitrit, ammonia, nitrooksida, dan gas

nitrogen.

Medium yang digunakan untuk semua jenis bakteri berupa kaldu nitrat.

Medium ini akan menjadi sumber energi bagi bakteri untuk kemudian diubah

menjadi gas nitrogen. Pengamatan tidak dilakukan untuk hasil nitrit, ammonia,

dan nitrooksida. Hanya gas nitrogen yang akan diamati sebagai hasil akhir

reduksi nitrat. Gas nitrogen ditangkap oleh tabung durham. Aktivitas reduksi

nitrat menjadi gas nitrogen ini dapat diukur secara kualitatif dari banyaknya

gas nitrogen yang tertangkap di tabung durham.

Bakteri pertama yang diuji adalah Pseudomonas. Hasil pengamatan

pertama (H+7) menunjukkan terjadinya perubahan warna medium. Medium

menjadi keruh akibat adanya pertumbuhan Pseudomonas. Selain itu, pada

tabung durham ditunjukkan adanya sedikit gelembung gas. Dari hasil

pengamatan tersebut, dapat disimpulkan bahwa Pseudomonas merupakan

bakteri denitrifier. Pernyataan ini sesuai dengan literatur bahwa bakteri

bergenus Pseudomonas adalah bakteri denitrifier utama.

Bakteri selanjutnya adalah Bacillus sp. Seperti halnya Pseudomonas,

bakteri ini pun merupakan golongan bakteri denitrifier. Adanya gas yang

tertangkap di tabung dirham menunjukkan bakteri ini mampu melakukan

denitrifikasi. Hasil pengamatan sesuai dengan literatur bahwa Bacillus

merupakan bakteri denitrifier. Selain itu, kekeruhan medium kaldu nitrat

bertambah yang menunjukkan adanya aktivitas pertumbuhan bakteri Bacillus.

Idealnya, terdapat suatu kondisi yang menunjukkan pengurangan cadangan

nitrat sehingga aktivitas pertumbuhan bakteri menjadi terhenti (parameter ini

tidak diamati karena modul XII ini belum membahas pertumbuhan bakteri).

Objek yang akan diamati selanjutnya adalah sampel tanah subur. Tanah

merupakan reservoar yang baik bagi berbagai macam bakteri. Terdapat dua

jenis tanah yang diamati, yaitu tanah subur dan tanah tidak subur. Tanah subur

merupakan tanah yang bersifat sedikit asam. Percobaan terhadap tanah subur

memperoleh hasil adanya gelembung gas dan perubahan warna kaldu nitrat

menjadi lebih kuning dan keruh. Adanya gelembung gas mengindikasikan

bahwa terdapat bakteri denitrifier pada sampel tanah.

Terakhir, percobaan yang dilakukan pada tanah tidak subur diperoleh

adanya gelembung gas dan perubahan warna kaldu menjadi lebih kuning.

Adanya gelembung gas ini menandakan adanya perubahan nitrat menjadi gas

gas nitrogen (N2). Artinya, sampel tanah tidak subur yang diamati

mengandung bakteri yang mampu melakukan denitrifikasi.

Produksi gas yang teramati pada tabung durham menunjukkan jumlah gas

yang sedikit. Pengamatan terhadap tabung ini dilakukan secara kualitatif dan

subjektif, tergantung pengamat. Sebagaimana dijelaskan pada teori dasar, pH

yang dibutuhkan untuk proses denitrifikasi berkisar 6,8-8.

Inkubasi terhadap bakteri dilakukan pada suhu 25°C dan pH yang tidak

diketahui. Faktor ini dapat memengaruhi produksi gas yang dihasilkan.

Namun, adanya gas dalam jumlah sedikit ini sudah membuktikan bahwa ada

beberapa bakteri yang mampu mereduksi nitrat menjadi gas nitrogen. Dari

hasil pengamatan pula diperoleh bahwa jumlah gelembung pada tanah tidak

subur (sedikit basa) lebih banyak dibandingkan dengan tanah subur. Proses

denitrifikasi membutuhkan pH sekitar 6,8-8 atau sedikit basa. Selain pH,

ketersediaan oksigen dapat menentukan terjadinya proses denitrifikasi atau

tidak. Karena denitrifikasi terjadi dalam kondisi anaerob, maka bakteri

denitrifier pun bersifat anaerob pula. Hasil literature menunjukkan bahwa

Pseudomonas merupakan bakteri denitrifikasi. (Tchobanoglous, FL, & HD,

2003). Padahal, Pseudomonas merupakan bakteri aerobik obligat. Setelah

dikaji lebih lanjut, referensi lain menyebukan bahwa beberapa bakterti

denitrifier melakukan respirasi aerobic pula jika oksigen tersedia, meskipun

ion nitrat pun ada (Madigan, 2015). Bakteri denitrifier mayoritas nereduksi

akseptor electron lain secara anaerobik, misalnya Fe3+ dan akseptor organik

lain.

Bakteri yang mampu mendenitrifikasi nitrat menjadi gas nitrogen mampu

menghasilkan beberapa enzim, yaitu nitrat reductase, nitrite reductase, nitric

oxide reductase, dan nitrous ocxide reductase. Adanya perbedaan jumlah

gelembung pada tabung durham dipengaruhi faktor-faktor berikut:

1. Jumlah tanah atau bakteri yang diinokulasikan.

Semakin banyak bakteri atau tanah yang diinokulasi, maka semakin intens

proses denitrifikasi yang terjadi sehingga jumlah gas nitrogen yang

dihasilkan semakin banyak.

2. Suhu

Semakin optimum suhu inkubator, maka semakin optimum aktivitas

bakteri denitrifier.

3. Kondisi anaerobik

Semakin rendah oksigen, maka semakin besar probabilitas terjadinya

proses denitrifikasi. Bakteri denitrifier akan menggunakan nitrat sebagai

akseptor elektron akibat terbatasnya jumlah oksigen.

4. Waktu inkubasi

Semakin lama waktu inkubasi, maka semakin banyak pula gas nitrogen

yang dihasilkan akibat penambahan jumlah bakteri yang melakukan proses

denitrifikasi.

VII. KESIMPULAN

1. Proses denitrifikasi secara umum merupakan proses reduksi nitrat (NO3)

secara bertahap menjadi nitrit (NO2), Nitrouse Dioxide (N2O), Nitrouse

oxide (NO), sampai menjadi N2 dalam kondisi anaerobik. Proses ini

seringkali melibatkan bakteri, yaitu bakteri kelompok denitrifier.

2. Aktivitas denitrifikasi dapat dilihat dari adanya produksi gas nitrogen pada

tabung durham. Semakin banyak jumlah gas yang terbentuk, semakin aktif

pula aktivitas denitrifikasi. Jumlah sampel yang diinokulasi pun

memengaruhi produksi gas nitrogen, selain pH, suhu, kelembapan, dan

ketersediaan oksigen. Jumlah gas diamati secara kualitatif dan bersifat

subjektif.

3. Sampel yang diuji (Pseudomonas, Bacillus, tanah subur, tanah tidak subur)

menunjukkan hasil positif, yaitu adanya gas nitrogen yang tertangkap pada

tabung durham. Artinya, Pseudomonas dan Bacillus merupakan bakteri

denitrifier. Pada sampel tanah tidak subur dan subur terdapat jenis bakteri

denitrifier.

VIII. DAFTAR PUSTAKA

Calrson, C., & Ingraham, J. (1983). Comparison of denitrification byPseudomonas stutzeri, Pseudomonas aeruginosa, and Paracoccus denitrificans.USA: Appl Environ Microbiol.

Madigan, M. T. (2015). Brock Biology of Microorganism. USA: PearsonEducation.

Tchobanoglous, G., FL, B., & HD, S. (2003). Waste water engineering:Treatment an reuse 4th edition. Boston: McGraw-Hill.