METABOLISME NITROGENNitrogen (N) diperlukan oleh semua organisme untuk sintesa protein, asam

amino, asam nukleat dan senyawa organik lain yang mengandung N. Keberadaan

nitrogen hampir 80% dari atmosfir dunia. dan diduga setiap are tanah subur

mengandung lebih dari 30.000 ton N2. Karena sebagian besar keberadaan nitrogen

dalam bentuk molekul gas, maka tidak satupun organisme eukaryotik mampu

menggunakannya secara langsung. Akan tetapi, N2 harus bersenyawa dengan

unsur lain seperti oksigen membentuk NO3- (ion nitrat) dan hidrogen membentuk

NH4+ (ion amonium) agar bisa dimanfaatkan oleh organisme. Kedua bentuk

senyawa ion di atas dapat digunakan oleh organisme yang bersifat autotrof.

Nitrogen yang terdapat dalam tanah sebagian besar berupa senyawa organik

hasil pembusukan organisme (tumbuhan, hewan, dll), sedangkan lainnya berasal

dari pclarutan batuan, air hujan (dalam bentuk nitrat, amonia) serta aktivitas

gunung berapi. Beberapa proses kimia dan fisika dalam tanah, air dan udara,

serta bersama-sama dengan aktivitas beberapa mikroorganisme tertentu

memainkan peranan penting untuk menjaga keberadaan (pengasimilasian dan

pengubahan) molekul nitrogen di alam dalam bentuk yang siap digunakan

oleh tumbuhan dan organisme lainnya. Semua proses dan kejadian tersebut di

atas berlangsung dalam suatu siklus yang disebut siklus nitrogen (gambar

4.1). Salah satu proses yang terjadi adalah peristiwa penambatan (fiksasi) N2

Gambar 4.1 Siklus Nitrogen (sumber: Enger & Ross, 2003)

Selama fase awal daur nitrogen, gas nitrogen dikonversi menjadi ammonia

dengan bantuan mikroorganisme tertentu, yang prosesnya dikenal dengan istilah

fiksasi nitrogen. Proses ini dapat dilakukan oleh dua jenis bakteri yang termasuk

dalam kelompok bakteri non-simbiotik dan simbiotik.

Bakteri pengikat N2 yang non-simbiotik dalam populasinya yang tinggi

ditemukan pada rhizosphere, daerah tempat terjadinya persentuhan antara

akar dan tanah. Azotobacter (bersifat aerob) adalah salah satu contoh bakteri

yang non-simbiotik. Beberapa contoh yang lain adalah Beijerinckia (obligate

aerob), Clostridium; C. fasteurianum (anaerob), dan Klebsiella, Enterobacter,

Bacillus termasuk kelompok yang bersifai fakultative anaerob. Contoh dari jenis

bakteri yang fotoautotrop adalah spesies tertentu yang termasuk dalam

kelompok Rhodospirillum dan Chlorobium. Beberapa spesies yang tennasuk ke

dalam Cyanobacteria (bersifat aerob) juga mampu mengikat N2 bebas karena

memiliki enzim nitrogenase dalam struktur khusus yang disebut heterocysts, yang

memiliki kondisi anaerob untuk fiksasi.

Semua kelompok bakteri di atas memberikan kontribusi penting

untuk penyediaan nitrogen pada daerah hutan basah, padang rumput dan daerah

tundra. Penambatan nitrogen secara simbiotik memiliki peranan yang sangat

penting untuk pertumbuhan tanaman produksi. Beberapa jenis bakteri dari

genus Rhizobium dan Bradyrhizohuim dapat melakukan penambatan gas

nitrogen dengan cara bersimbiosis dengan tanaman polong-polongan

(Leguminosae), seperti kedelai, buncis, kacang tanah, kacang ijo, alfalfa (sejenis

tanaman polong untuk makanan kuda dan sapi di USA) dan .semanggi. Bertolak

dari hal di atas, maka penambatan nitrogen sangat tergantung dari hubungan

simbiotik antara Leguminosae dengan strain Rhizobium yang efektif. Jumlah N2

yang tertambat dipengaruhi secara genetik baik oleh Rhizobium maupun inang

tanaman yang spesifik. Oleh karena itu bintil akar tanaman Leguminosae

mungkin gagal berkembang atau sebaliknya sangat efektif di dalam tanah.

Bintil akar adalah hasil simbiosis tanaman dari jenis Leguminosae dengan

Rhizobium yang mampu melakukan penambatan N2. Bintil akar terbentuk melalui

serangkaian proses yang diawali kolonisasi bakteri Rhizobium pada rambut akar

(gambar 4.2).

Gambar 4.2 Proses terjadinya bintil akar

Kolonisasi bakteri Rhizobium ini diduga bisa terjadi karena adanya suatu

protein tanaman yang disebut "lektin" yang rnungkin berinteraksi dengan

Rhizobium spesiifik sehingga memungkinkan tanaman untuk mengenal dan

menerima tipe Rhizobium yang cocok. Sebagai contoh, menurut Bhuvaneswari

dan Bauer (1978) reseptor lektin spesifik pada permukaan sel B. japonicum,

dikondisikan oleh lingkungan yang diberikan oleh akar tanaman inang.

Rhizobium masuk tumbuhan inang melalui rambut akar yang kemudian

berubah bentuk karena substansi seperti hormon yang dihasilkan oleh bakteri.

Kemudian bakteri bermigrasi ke dalam struktur seperti benang, memperbanyak

diri yang pada akhirnya bakteri tersebut tersebar di sepanjang rambut akar

sampai ke jaringan akar.

Kolonisasi sel-sel akar dalam jaringan tanaman inang terjadi apahila

bakteri dibebaskan dari benang infeksi dan hal ini melibatkan enzim pektinase dari

Rhizobium dan selulase dari sel tanaman. Dalam perkembangannya bakteri

secara terus menerus mengalami modifikasi baik struktur maupun fungsi dan

menjadi bakteroid yang kaya enzim nitrogenase, suatu enzim yang mampu

mengikat/menambat nitrogen. Satu atau beberapa bakteroid dilindungi oleh

struktur bermembran yang mungkin merupakan tempat terbentuknya pigmen

merah, leghaemoglobin. Pigmen ini menentukan ciri warna bintil akar yang aktif

menambat nitrogen.

Penambatan nitrogen umumnya mencapai puncak pada awal pengisian

polong dan menurun selama akhir fase reproduktif (Keyser dan Fudi, 1992).

Sebaliknya pada biji kedele yang mengandung 40% protein, menurut Salisbury

(1992) bahwa kira-kira 90% penambatan nitrogennya berlangsung selama periode

perkembangan reproduktif dan kira-kira 10% terjadi selama dua bulan pertama

pertumbuhan vegetatif. Bray (1993) mengatakan bahwa sistem simbiotik

mampu menambat nitrogen apabila memenuhi 3 persyaratan pokok seperti :

1. adanya bintil akar;

2. terjadinya diferenensiasi bakteri menjadi bakteroid;

3. menghasilkan leghaemoglobin

Selain hal tersebut di atas, menurut Sprent (1979) faktor lingkungan juga

dapat mempengaruhi penambatan nitrogen pada tanaman jenis legum seperti

temperatur, kelembaban, air, salinitas, pH, nutrien dan adanya bakteri Rhizobium

yang cocok.

Keseluruhan reaksi kimia penambatan nitrogen adalah sebagai berikut.

N2 + 8e- + 6 Mg ATP + 16 H2O 2 NH3 + H2 + 16 MgADP + 16 Pi + 8 H+

Proses tersebut membutuhkan sumber elektron dan proton, molekul ATP,

kompleks enzim nitrogenase. Sumber elektron dan proton berasal dari

karbohidrat yang ditranslokasikan dari daun kemudian di respirasikan oleh bakteri.

Respirasi karbohidrat dalam bakteroid menyebabkan reduksi NAD+ menjadi

NADH atau NADP+ menjadi NADPH dan juga terjadi reduksi flavodoksin. NADH,

NADPH dan flavodoksin kemudian mereduksi feredoksin atau protein yang

sama yang efektif mereduksi N2 menjadi NH4+

NH4+ yang terbentuk akan ditranslokasikan dari bakteroid sebelum

dapat dimetabolisme dan digunakan oleh tanaman inang. Dalam sitosol

sel-sel yang mengandung bakteroid, NH4+ diubah menjadi glutamin, asam

glutamat dan asparagin, sedangkan pada beberapa spesies tertentu NH4+ dapat

diubah menjadi senyawa-senyawa kaya nitrogen yang disebut ureida. Dua

macam ureida pokok pada tanaman legum adalah allantoin dan asam allantoik.

Asparagin dan ureida, lewat sel transfer masuk ke dalam saluran xilem kemudian

diangkut ke akar dan batang. Di sini senyawa-senyawa tersebut dipecah kembali

menjadi NH,+ dan secara cepat diubah menjadi asam-asam amino, amida dan

protein.

4.2 Reduksi NitratSecara umum reduksi nitrat mengikuti reaksi seperti di bawah ini:

NO3_ + 8e+10H + NH4+ + H2O

Meski demikian, pada dasarnya reaksi di atas berlangsung dalam dua tahap

dengan bantuan enzim yang berbeda. Tahapan reaksinya adalah sebagai berikut.

1. Reduksi nitrat : NO3- + NADH + H+ NO2-+ NAD+ + H2O

Reaksi ini berlangsung di dalam plasma dengan bantuan. enzim nitrat reduktase

(NR). Enzim ini merupakan enzim molibdoflavoprotein yang mampu mengatur

kecepatan pembentukan protein pada tumbuhan yang menggunakan NO3-

sebagai sumber nitrogennya.

2. Reduksi nitrit : NO2- + 3 H2O + 6Fd + 2 H+cahaya NH4+ + 1,5 O2 +2 H2O + 6Fd

Reaksi di atas terjadi pada kloroplas (pada daun) atau pada proplastida (pada

akar) dengan enzim nitrit reduktase sebagai katalisnya.

Reduksi nitrat yang dikatalis oleh NR sangat tergantung dari aktivitas NR

tersebut dan aktivitas NR itu sendiri ditentukan oleh konsentrasinya. Kadar NO3"

yang tinggi dalam sel dan cahaya juga dapat memacu aktivitas NR. Peranan

cahaya terhadap aktivitas NR dapat melalui beberapa cara, antara lain :

1. cahaya dapat mengaktifkan fotosintesis sehingga dihasilkan ATP untuk

menggerakkan NO3 dari vakuola ke plasma.

2. cahaya mengaktifkan sistem fitokrom yang berperan menaikkan

kemampuan ribosom membuat protein (termasuk NR).

3. cahaya menginaktifkan protein yang bersifat inhibitor bagi NR.

4. cahaya menaikkan penyediaan karbohidrat dan proses respirasi, dimana

dari proses ini dihasilkan NADH yang diperlukan untuk proses reduksi.

Selain kedua proses (fiksasi N dan reduksi nitrat) di atas, dalam siklus

nitrogen juga terjadi beberapa proses fisika/kimia lainnya, seperti amonifikasi,

nitrifikasi dan denitrifikasi.

4.2.1 AmonifikasiSebagian besar keberadaan N2 di dalam tanah dalam bentuk molekul

inorganik. Organisme yang sudah mati diuraikan melalui proses hidrolisis yang

menyebabkan protein terurai menjadi asam amino. Proses ini disebut deaminasi.

Proses selanjutnya, asam amino yang sudah terbentuk dikonversi menjadi

ammonia (NH3) dan proses ini disebut amonifikasi

Amonifikasi dibantu oleh beberapa mikroorganisme seperti bakteri dan

jamur. Kedua proses di atas secara sederhana dapat digambarkan sebagai

berikut.

mikroba penguraiProtein dari organism matidan sampah produksi

Bakteri /Jamur

Asam amino (Deaminasi)

Asam amino Amonia (NH3) (Amonifikasi)

Amonia merupakan senyawa dalam bentuk gas, pada tanah yang kering mudah

menguap, sebaliknya pada tanah yang lembab/basah ammonia terlarut dalam air

dan membentuk ion ammonium (NH4+ ). Reaksinya sebagai berikut.

NH3 + H20 NH4+ OH NH4+ + OH-

Selanjutnya ion amonium dapat digunakan oleh bakteri dan tumbuhan

untuk sintesa asam amino. Walaupun demikian, pemanfaatan nitrogen oleh

kebanyakan tumbuhan umumnya dalam bentuk NO3- karena NH4+ akan

dioksidasi menjadi NO3- oleh bakteri nitrifikasi. Disamping itu ammonium/amonia

ini bersifat racun bagi tumbuhan dan dapat menghambat pembentukan ATP di

kloroplas dan mitokondria.

4.2.2 NitrifikasiNitrifikasi merupakan proses oksidasi ion amonium menjadi nitrat(NO3-).

Proses ini dilakukan oleh bakteri autotrof yang termasuk ke dalam genus

Nitrosomonas dan Nitrobacter. Nitrosomonas akan mengoksidasi ion amonium

menjadi nitrit (NO2-) dan selanjutnya Nitrobacter akan mengoksidasi nitrit (NO2-)

menjadi nitrat (NO3-).

Tumbuhan cenderung menggunakan nitrat (NO3-) sebagai sumber

nitrogen untuk sintesa protein karena nitrat memiliki mobilitas yang lebih tinggi di

dalam tanah dan lebih mudah terikat dengan akar tanaman daripada amonium.

Meski sebenarnya ion amonium lebih efisien sebagai sumber nitrogen karena

memerlukan lebih sedikit energi untuk sintesa protein, tetapi karena bermuatan

positif maka lebih sulit dimanfaatkan karena sudah lebih dulu terikat oleh tanah

lempung yang bermuatan negatif.

4.2.3 DenitrifikasiDalam beberapa tahap selama berlangsungnya siklus nitrogen, terjadi

pembebasan dan pengikatan N2 bebas (atmospheric nitrogen). Terlepasnya N2

bebas akibat suatu proses yang terjadi dalam siklus nitrogen disebut

denitrifikasi, yang pada dasamya adalah konversi nitrat menjadi gas nitrogen.

NO3- NO2- N 20 N 2

Beberapa spesies dalam genus Pseudomonas merupakan kelompok bakteri

terpenting yang melaksanakan proses denitrifikasi dalam tanah. Sejumlah jenis

yang lain seperti Paracoccus, Thiobacillus, dan Bacillus juga mampu melakukan

proses denitrifikasi. Bakteri-bakteri yang termasuk ke dalam kelompok ini adalah

pada umumnya merupakan mikroorganisme yang aerob, tetapi pada kondisi

anaerob mereka juga mampu menggunakan nitrat dalam situasi dimana

oksigen berperan sebagai akseptor elektron akhir (anaerobic respiration).

Proses denitrifikasi tidak menguntungkan bagi kesuburan tanah karena terjadi

pembebasan N2 ke atmosfer dari senyawa nitrat.

4.3 Sintesa Asam AminoAsam amino merupakan senyawa organik dengan ukuran molekulnya yang

kecil, mempunyai gugus NH dan COOH sehingga dapat bersifat asam atau basa

tergantung pada pH lingkungannya. Selain dua jenis gugus di atas, beberapa

asam amino juga mengandung gugus SH, OH, atau CONH. Asam amino

biasanya ditemukan berdiri sendiri (bebas) dalam sel atau bersenyawa dengan

asam amino lain membentuk protein.

Tumbuhan dan mikroorganisme mampu mensintesis 20 asam amino

standar, tetapi hewan tingkat tinggi dari kelompok mammalia tidak mampu

mensintesis ke-20 asam amino tersebut. Oleh karena itu keperluan asam

amino tersebut diperoleh dari jenis makanan yang dikonsumsinya. Asam amino

yang tidak dapat disintesis tersebut termasuk ke dalam kelompok asam amino

esensial, sedangkan sisanya yang dapat disintesis disebut asam amino non-

esensial. Manusia tidak mampu mensintesis beberapa asam amino, yang

termasuk ke dalam asam amino esensial, seperti Histidin (His), Isolesin (lie), Lesin

(Leu), Lisin (Lys), Metionin (Met), Fenilalanin (Phe), Triptofan (Trp), Treonin (Thr),

dan Valin (Val). Sedangkan yang ternasuk dalam kelompok non-esensial

adalah Alanin (Ala), Arginin (Arg), Asam aspartat (Asp), Asparagin (Asn), Sistein

(Cys), Glutamin (Gin), Asam glutamat (Glu), Glisin (Gly), Prolin (Pro), Serin (Ser),

dan Tirosin (Tyr).

Proses biosintesis asam amino bermacam-macam dan biasanya bervariasi

antara satu organisme dengan organisme yang lain, tetapi semuanya memiliki

ciri-ciri yang umum yaitu merupakan turunan dari suatu daur metabolisme seperti

siklus asam sitrat, glikolisis atau pentosa phosfat. Berdasarkan hal mi, rnaka

asam amino dapat dikelompokkan menjadi enam berdasarkan cara

biosintesisnya yang tergantung dari siklus metabolisme mana kelompok asam

amino tersebut di turunkan/disintesis (gambar 4.3).

Gambar 4.3 Pengelompokan asam amino berdasarkan cara biosintesisnya

Kelompok utama asam amino selalu dihasilkan dari proses transaminasi

glutamat Meskipun demikian, sintesis asam amino asam glutamat, asam aspartat,

dan alanin terjadi dari reaksi aminasi reduksi. Transaminasi merupakan reaksi

dapat balik. Contoh reaksi transaminasi yang paling terkenal adalah

transfer/pemindahan gugus amino antara glutamat dan oksaloasetat

menghasilkan α-ketoglutarat dan aspartat, seperti terlihat di bawah ini.

COOH COOHCOOH COOH

H C NH2 + C O C O + H C NH2

CH2

CH2

COOH

Asam glutamat

CH2

COOH

Asam oksaloasetat

CH2

CH2

COOH

Asam-ketoglutarat

CH2

CH2

COOHAsam asparatat

Pada suatu rangkaian percobaan yang telah dilakukan menunjukkan

bahwa glutamat dapat memberikan gugus aminonya untuk pembentukan 17 asam

amino yang berbeda.

Tipe transaminasi yang lain adalah glutamin atau asparagin bertindak sebagai

donor gugus amino, seperti berikut ini.

transaminaseglutamin + asam α-ketoglutarat asam α-ketoglutarat-amida + asam α amino

Asam α-ketoglutarat-amida + H2O asam α-ketoglutarat + NH3

Reaksi aminasi reduksi untuk pembentukan asam glutamat dari asam α-

ketoglutarat memerlukan ion amonium. Reaksi ini dapat balik dan secara

fisiologis penting dalam respirasi asam amino yang terbentuk selama

penguraian protein. Pembentukan asam glutamat dikatalisis oleh enzim

glutamat dehidrogenase dan prosesnya terjadi di mitokondria.

COOH COOH

C=O HC NH2

C H2 + NH4+ + NADH2 C H2 + NAD + H2O

C H2 C H2

COOHAsam α-ketoglutarat

COOHAsam glutamate

Asam aspartat dan Alanin masing-masing terbentuk dari asam

oksaloasetat dan asam piruvat. Reaksi pembentukan kedua jenis asam amino di

atas dapat digambarkan sebagai berikut.

dehidrogenase(i) asam oksaloasetat + NH4 + NADH 2 asam aspartat + NAD + H 2O

(ii) asam piruvat + NH4+ + NADH2

alanin dehidrogenasealanin + NAD + H2O