Pengukuran Kadar Asam Sialat

Pengukuran kadar asam sialat dilakukan dengan modifikasi metode Warren.28

Prinsipnya adalah membebaskan terlebih dahulu asam sialat dari protein plasma atau jaringan

dengan cara hidrolisis ringan, kemudian dioksidasi dengan natrium metaperiodat dalam asam

sulfat pekat. Hasil oksidasi direaksikan dengan asam tiobarbiturat sehingga terbentuk

kromofor yang dilarutkan dalam sikloheksanon dan diukur serapannya pada panjang

gelombang 549-550 nm.

Pereaksi yang digunakan antara lain: TCA (asam trikloro asetat) 10 % dan 5%,

H2SO4 0,1 N, larutan natrium periodat, larutan natrium arsenit 10%, larutan TBA (asam

tiobarbiturat) 0,6% dalam Na2SO4 0,5 M, dan larutan sikloheksanon. Mula-mula

dioptimalisasi panjang gelombang maksimal serapan dan dibuat kurva kalibrasinya

menggunakan standar NANA (N-Asetil Neuraminic Acid).

Sebanyak 25 µL plasma/homogenat payudara ditambahkan 125 µL akuades dan 250

µL TCA 10% kemudian larutan divorteks sampai campuran merata dan disentrifugasi dengan

kecepatan 5000 rpm selama 10 menit. Setelah disentifugasi, supernatan dibuang lalu ke

dalam endapan yang tersisa ditambahkan 250 µL TCA 5%, divorteks sampai campuran

merata dan disentrifugasi dengan kecepatan 5000 rpm selama 10 menit. Setelah

disentrifugasi, supernatan dibuang, lalu dihidrolisis dengan menambahkan larutan H2SO4 0,1

N sebanyak 125 µL. Tabung ditutup dan dikocok kemudian diletakkan di penangas air suhu

80oC selama 1 jam. Setelah itu disentrifugasi sebentar untuk mendapatkan hidrolisatnya.

Larutan natrium periodat sebanyak 12,5 μL ditambahkan ke dalam 12,5 µL hidrolisat

dan langsung divorteks kemudian didiamkan selama 20 menit pada suhu kamar. Setelah

ditambahkan 125 µL natrium arsenit 10%, dan divorteks lalu ditambahkan 375 µL larutan

TBA 0,6% dalam Na2SO4 0,5 M. Tabung ditutup dan dikocok lalu diletakkan dalam

penangas air mendidih selama 20 menit. Setelah didinginkan dalam penangas es selama 5

menit, ditambahkan 540 μL larutan sikloheksanon (Sigma) dan disentrifugasi selama 3 menit

dengan kecepatan 5000 rpm. Fasa sikloheksanon yang terbentuk pada bagian atas larutan

diperiksa densitas optiknya dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 549 nm.