PENGARUH POLIMORFISME GEN SITOKROM P450 2A6 ALEL … · 2018-03-24 · Indonesia merupakan salah...

PENGARUH POLIMORFISME GEN SITOKROM P450 2A6 ALEL *9

TERHADAP KETERGANTUNGAN ROKOK PADA SUBJEK UJI SUKU

TIONGHOA INDONESIA

SKRIPSI

Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat

Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)

Program Studi Farmasi

Oleh:

Jasvidianto Chriza Kotta

NIM : 148114143

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SANATA DHARMA

YOGYAKARTA

2018

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

i

PENGARUH POLIMORFISME GEN SITOKROM P450 2A6 ALEL *9

TERHADAP KETERGANTUNGAN ROKOK PADA SUBJEK UJI SUKU

TIONGHOA INDONESIA

SKRIPSI

Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat

Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)

Program Studi Farmasi

Oleh:

Jasvidianto Chriza Kotta

NIM : 148114143

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SANATA DHARMA

YOGYAKARTA

2018


iv

HALAMAN PERSEMBAHAN

“We have this hope as an anchor for the soul, firm and secure. It enters

the inner sanctuary behind the curtain”

-Hebrew 6: 19-

Dengan mengucap syukur pada Tuhan Yesus, saya persembahkan karya ini untuk:

- Ayah dan ibu, yang selalu memberi motivasi dan doa

- Adik-adik yang selalu memberi semangat

- Seluruh keluarga besar yang selalu memberikan nasihat dan semangat

- Teman-teman yang selalu membantu dalam proses belajar bersama

- Almamater Tercinta Universitas Sanata Dharma


vii

PRAKATA

Puji syukur penulis penjatkan kepada Tuhan Yang Maha Esa karena atas

penyertaan dan karunia-Nya, skripsi yang berjudul “Pengaruh Polimorfisme Gen

Sitokrom P450 2A6 Alel *9 terhadap Ketergantungan Rokok pada Subjek Uji

Suku Tionghoa Indonesia” dapat diselesaikan untuk memperoleh gelar Sarjana

Farmasi (S.Farm.) di Universitas Sanata Dharma Yogyakarta.

Keberhasilan dalam penulisan naskah skripsi ini tidak terlepas dari

dukungan berbagai pihak. Oleh karena itu, dengan kerendahan hati penulis

mengucapkan terima kasih sebesar-besarnya kepada:

1. Dekan Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta yang telah

mendukung penelitian.

2. Kepala Program Studi Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma

Yogyakarta yang telah mendukung penelitian.

3. Ibu Dr. Christine Patramurti, M. Si., Apt. selaku dosen pembimbing yang

telah membimbing dan memberi saran serta masukan dari awal hingga

terselesaikannya skripsi ini.

4. Bapak Maywan Hariono, Ph.D., Apt. dan Ibu Damiana Sapta Candrasari,

S.Si., M.Sc., selaku dosen penguji atas semua saran, dukungan, serta nasihat

yang diberikan.

5. Seluruh Dosen Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma yang telah

memberikan pengetahuan dan bimbingan kepada penulis selama proses

perkuliahan.

6. Bapak Kayat selaku Laboran Laboratorium Biokimia Universitas Sanata

Dharma Yogyakarta yang memberikan kontribusi dalam hal sarana dan

prasana.

7. Laboratorium Biokimia Universitas Sanata Dharma Yogyakarta yang telah

memfasilitas selama proses penelitian.

8. Laboratorium Penelitian dan Pengujian Terpadu (LPPT) Universitas Gadjah

Mada Yogyakarta yang telah membantu proses PCR (Polimerase Chain

Reaction).


viii

9. Bapak, ibu, adik Erza dan Karenia dan seluruh keluarga tercinta yang telah

memberikan dukungan secara moril maupun material, doa, motivasi dan kasih

sayang tanpa kenal lelah.

10. Sahabat penulis, Kefas Dwi Putra Zebua, Radix dan Yudistira Bagas yang

secara tidak langsung menjadi motivator penulis, selalu memberikan semangat

dan senantiasa membantu saat penulis dalam kesulitan.

11. Wisnu, Petrus Yadi, Elvina, Eko, Tito, Sara, Tosan, Danang yang selalu

memberi semangat dan selalu membantu selama proses belajar bersama.

12. Teman seperjuangan dalam melakukan penelitian serta penyusunan skripsi,

Evan, Nugroho, Dismas, Petrus Febrian, Chyntia, Pion, Dita, Denis dan Clara

yang telah membantu memperlancar proses pengerjaan skripsi dan sudah

melalui suka dan duka bersama.

13. Teman-teman FSMD 2014 dan semua angkatan 2014 Fakultas Farmasi

Universitas Sanata Dharma yang sudah berbagi pengalaman dan pengetahuan

selama proses perkuliahan.

14. Seluruh pihak yang sudah membantu dan memberi dukungan dan tidak dapat

penulis sebutkan satu per satu .

Akhir kata penulis menyadari masih banyak kekurangan dalam penulisan

skripsi ini mengingat keterbatasan kemampuan dan pengalaman yang dimiliki.

Oleh karena itu, penulis mengharapkan saran dan kritik yang dapat membantu

menyempurnakan karya tulis ini. Penulis berharap semoga karya tulis ini dapat

bermanfaat dalam perkembangan ilmu dan pengetahuan. Sekian dan terima kasih,

Tuhan Yesus memberkati.


ix

DAFTAR ISI

HALAMAN JUDUL ................................................................................................... i

HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING ........................................................ ii

HALAMAN PENGESAHAN SKRIPSI ................................................................... iii

HALAMAN PERSEMBAHAN ............................................................................... iv

LEMBAR PERNYATAAN KEASLIAN KARYA ................................................... v

LEMBAR PERNYATAAN PUBLIKASI ................................................................ vi

PRAKATA ............................................................................................................... vii

DAFTAR ISI ............................................................................................................. ix

DAFTAR TABEL ...................................................................................................... x

DAFTAR GAMBAR ................................................................................................ xi

DAFTAR LAMPIRAN ............................................................................................ xii

INTISARI ................................................................................................................ xiii

ABSTRACT .............................................................................................................. xiv

PENDAHULUAN ..................................................................................................... 1

METODE PENELITIAN ........................................................................................... 3

HASIL DAN PEMBAHASAN ................................................................................. 7

KESIMPULAN ....................................................................................................... 16

SARAN .................................................................................................................... 16

DAFTAR PUSTAKA .............................................................................................. 17

LAMPIRAN ............................................................................................................. 20

BIOGRAFI PENULIS ............................................................................................. 35


x

DAFTAR TABEL

Tabel I. Karakteristik Subjek Uji yang Terlibat dalam Penelitian ......................... 8

Tabel II. Total Skor FTND....................................................................................... 9

Tabel III. Pengaruh Alel CYP2A6*9 terhadap Ketergantungan Rokok ................ 11


xi

DAFTAR GAMBAR

Gambar 1. Elektroforegram hasil analisis kualitatif isolat DNA subjek uji .......... 9

Gambar 2. Elektroforegram produk PCR pada kondisi optimum dari berbagai

isolat DNA ......................................................................................... 11

Gambar 3. Grafik distribusi subjek uji perokok suku Tionghoa Indonesia ......... 13

Gambar 4. Kurva hubungan antara jumlah batang rokok dan lama merokok

terhadap skor FTND .......................................................................... 15


xii

DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran 1. Ethical Clearance Penelitian ............................................................ 21

Lampiran 2. Hasil Kuisioner ................................................................................. 22

Lampiran 3. Informed Consent Subjek Uji ........................................................... 24

Lampiran 4. Usage Information of FavorPrepTM

................................................. 25

Lampiran 5. Go Taq Green Master Mix Certificate of Analysis ........................... 26

Lampiran 6. Usage Information of Go Taq Green Master Mix ............................ 27

Lampiran 7. Product Datasheet of Primer Forward and Reverse CYP2A6*9 .... 28

Lampiran 8. Product Datasheet of DNA Ladder & Markers ................................ 29

Lampiran 9. Daftar Pertanyaan dan Tingkat Ketergantungan terhadap Nikotin

Berdasarkan Total Skor Menurut FTND ......................................... 30

Lampiran 10. Karakteristik Subjek Uji ................................................................... 31

Lampiran 11. Elektroforegram Hasil Analisis Kualitatif Isolat DNA Subjek Uji .. 32

Lampiran 12. Elektroforegram Produk PCR pada Kondisi Optimum dari Berbagai

Isolat DNA ....................................................................................... 33

Lampiran 13. Hasil Analisis dengan Metode Regresi Linear Berganda

Menunjukkan Nilai Uji t, Uji F dan Koefisien Korelasi (R) ............ 34


xiii

INTISARI

Indonesia merupakan salah satu negara dengan prevalensi perokok yang

terbesar di dunia. Menurut data World Health Organization (WHO), pada tahun

2012 persentase prevalensi perokok laki-laki yaitu 67% jauh lebih besar daripada

perokok perempuan yaitu 2,7%. Menurut perkiraan, permasalahan merokok pada

tahun 2010 hingga 2030 akan meningkatkan risiko kematian 8 juta orang per

tahun. Tembakau mengandung kurang lebih 3.000 senyawa kimia, tetapi yang

menimbulkan efek ketergantungan paling kuat adalah nikotin. Pada dasarnya, ada

dua macam faktor yang mempengaruhi ketergantungan fisik individu terhadap

rokok yaitu faktor genetik dan lingkungan. Tujuan penelitian ini adalah

menganalisis pengaruh polimorfisme gen sitokrom P450 2A6 alel*9 terhadap

ketergantungan rokok pada subjek uji suku Tionghoa Indonesia. Selain itu juga

diamati ada tidaknya pengaruh lingkungan berupa lama merokok dan jumlah

rokok yang dihisap per hari. Untuk menilai ketergantungan rokok digunakan

metode Fagerstrom Test for Nicotine Dependence (FTND) dengan analisis regresi

linier berganda. Hasil menunjukkan adanya alel CYP2A6*9 pada tingkat

ketergantungan rokok yang sangat rendah sebanyak 4 orang dan tingkat

ketergantungan rokok yang rendah sebanyak 3 orang. Berdasarkan nilai uji t, uji F

dan koefisien korelasi (R), faktor lingkungan berupa lama merokok dan jumlah

batang rokok yang dihisap perhari mempengaruhi tingkat ketergantungan rokok.

Kata kunci: CYP2A6*9, FTND, Perokok, Tionghoa


xiv

ABSTRACT

Indonesia is one of the countries with the largest prevalence of smokers in

the world. According to World Health Organization (WHO) data, in 2012, the

prevalence percentage of male smokers is 67% far greater than female smokers

that is 2.7%. According to forecasts, smoking problems in 2010 to 2030, will kill

eight million people per year. Tobacco, contains about 3,000 compounds, but the

ones with the strongest dependence effect are nicotine. Basically, there are two

kinds of factors that affect the physical dependence of individuals on cigarettes,

namely genetic and environmental factors. The aim of this study is to describe the

effect of polymorphism of cytochrome P450 2A6 allele *9 towards smoking

dependence in Indonesians Chinese ethnic. It is also observed that either the

presence or absence of environmental influences in the form of smoking and the

number of cigarettes has been smoked per day. To assess the dependence of

cigarettes, it was used Fagerstrom Test for Nicotine Dependence (FTND) method

with multiple linear regression analysis. The results showed the presence of

CYP2A6 *9 allele at a very low level of cigarette dependence in four subjects and

a low level of cigarette dependence in three subjects. Based on the t test value, the

F test and correlation coefficient (R) environmental factors such as a duration of

smoking and a number of cigarettes has been smoked per day affect the level of

cigarette dependence.

Keywords: CYP2A6*9, FTND, Smoker, Tionghoa


1

PENDAHULUAN

Merokok merupakan salah satu masalah yang dihadapi di bidang

kesehatan karena meningkatkan risiko 6 juta orang meninggal dalam setahun.

Lebih dari 5 juta orang meninggal karena menghisap langsung rokok, sedangkan

600 ribu lebih orang meninggal karena terpapar asap rokok (WHO, 2013).

Indonesia merupakan salah satu negara dengan prevalensi perokok yang terbesar

di dunia. Menurut data World Health Organization (WHO), pada tahun 2012

persentase prevalensi perokok laki-laki yaitu 67% jauh lebih besar daripada

perokok perempuan yaitu 2,7%. Diantara para perokok tersebut terdapat 56,7%

laki-laki dan 1,8% perempuan merokok setiap hari (The Organisation for

Economic Co-Operation and Development, 2014). Menurut perkiraan,

permasalahan merokok tahun 2010 hingga 2030 akan menigkatkan risiko 8 juta

orang meninggal per tahun (Hitchman, 2010).

Penghentian kebiasaan merokok masih sulit dilakukan karena adanya efek

adiktif dari senyawa-senyawa yang terkandung dalam tembakau. Dalam tembakau

terdapat kurang lebih 3.000 senyawa, tetapi yang menimbulkan efek adiktif paling

kuat adalah nikotin. Nikotin terikat sebagai agonis pada reseptor kolinergik yaitu

asetilkolin nikotinik (nAChR) yang terletak pada otak, ganglia otonom dan

neuromuscular junction. Efek ketergantungan nikotin diperantarai rewards

pathway di otak melibatkan jalur molekuler yang paling dominan adalah aktivasi

nAChR sehingga mengaktifkan saraf dopaminergik pada daerah nucleus

accumbens (NAc) (Setiawati, 2013). Apabila kadar nikotin dalam darah tinggi,

efek tidak langsung yang dapat timbul adalah terjadi kerusakan pada beberapa

sistem organ, yaitu sistem pernafasan, sistem kardiovaskular, sistem

gastrointestinal, sistem muskuloskeletal, kulit, sistem syaraf dan sistem imun yang

berujung pada kematian (Burns, 2005; Tyndale and Sellers, 2005; Hukkanen et

al., 2005; McPhee and Pignone, 2007).

Pada dasarnya, ada dua macam faktor yang mempengaruhi ketergantungan

fisik individu terhadap rokok yaitu faktor genetik dan lingkungan. Faktor genetik

memiliki kontribusi sebesar 50-70% (Tyndale and Sellers, 2005). Gen yang

berperan dalam ketergantungan fisik terhadap nikotin, terdapat gen sitokrom P450


2

2A6 (CYP2A6), yaitu gen yang mengkode enzim CYP2A6. Enzim ini

bertanggung jawab terhadap metabolisme nikotin dalam darah, sehingga

menghilangkan atau menurunkan efek nikotin untuk memberikan stimulus pada

brain reward system. Efek ketegantungan fisik genetik terhadap nikotin dapat

terjadi pada individu yang memiliki gen CYP2A6 yang normal. Hal ini terjadi

karena metabolisme nikotin dalam darah cepat, sehingga individu cenderung

mempertahankan kadar nikotin dalam darah dengan merokok (Gullstén, 2000;

Rao et al., 2000; Hukkanen et al., 2005; Davies and Soundy, 2009). CYP2A6 di

dalam tubuh akan memetabolisme nikotin menjadi kotinin, yang selanjutnya akan

diubah menjadi 3-hidroksikotinin sebagai metabolit tidak aktif (Park et al., 2016).

Metabolisme nikotin oleh CYP2A6 bervariasi di seluruh suku/ras, seperti

ragamnya suku di Indonesia yang salah satunya adalah suku Tionghoa. CYP2A6

diketahui merupakan gen yang memiliki polimorfisme yang tinggi (Maggert,

2012). Adanya polimorfisme CYP2A6 akan mempengaruhi aktivitas enzim pada

metabolisme nikotin dalam tubuh, yaitu dengan menurunkan, menghilangkan atau

meningkatkan aktivitas enzim (Raunio and Rahnasto-Rilla, 2012). Polimorfisme

CYP2A6 banyak ditemukan pada orang-orang Asia dengan frekuensi alel tidak

aktif yang tinggi (Yusof and Gan, 2009). Menurut penelitian Nakajima (2006),

adanya bentuk alel tidak aktif CYP2A6 antara lain: CYP2A6*4 (11-20%),

CYP2A6*7 (4-7%) dan CYP2A6*9 (20%) yang didapat dari sejumlah populasi

orang Asia. Penelitian ini juga diperkuat dengan adanya penelitian yang dilakukan

oleh Liu et al., 2011 pada perokok laki-laki dari Han suku dari Cina Selatan,

hasilnya menjelaskan adanya polimorfisme CYP2A6 berupa alel CYP2A6*4

(8,5%), CYP2A6*5 (1,2%), CYP2A6*7 (6,3%), CYP2A6*9 (13,5%) dan

CYP2A6*10 (2,4%) dari populasi N=1328.

Bentuk aktif dari CYP2A6 adalah alel CYP2A6*1 (wild type), sedangkan

salah satu bentuk tidak aktif yang lebih banyak ditemukan pada populasi Asia

adalah CYP2A6*9. Bentuk alel tidak aktif tersebut dapat mempengaruhi aktivitas

enzim menjadi lebih lambat daripada bentuk aktifnya (Liu et al., 2011).

Polimorfisme yang terjadi pada alel CYP2A6*9 merupakan single nucleotide


3

polymorphism (SNP) ditunjukkan dengan adanya perbedaan nukleotida tunggal di

dalam susunan rangkaian basa (Raunio and Rahnasto-Rilla, 2012).

Hubungan gen CYP2A6 terhadap perilaku merokok masih terdapat pro

dan kontra. Berdasarkan hasil penelitian Gambier (2005) dan Kwon (2001)

menunjukkan bahwa perilaku merokok seseorang individu tidak ada hubungannya

dengan gen CYP2A6. Hal ini juga diperkuat dengan meta analisis Munafo

(2004) yang menjelaskan bahwa masih perlu dilakukan studi lebih lanjut terkait

peran gen CYP2A6 dalam meningkatkan ketergantungan fisik perokok terhadap

nikotin.

Perokok dengan alel CYP2A6*9 tetap memiliki ketergantungan rokok

yang dipengaruhi oleh faktor lingkungan seperti lama merokok dan jumlah rokok

yang dihisap (Munafo et al., 2004). Tujuan penelitian ini adalah menganalisis

pengaruh polimorfisme gen sitokrom P450 2A6 alel* 9 terhadap ketergantungan

rokok pada subjek uji suku Tionghoa Indonesia. Selain itu juga diamati ada

tidaknya pengaruh lingkungan berupa lama merokok dan jumlah rokok yang

dihisap per hari. Untuk menilai ketergantungan rokok digunakan metode

Fagerstrom Test for Nicotine Dependence (FTND).

METODE PENELITIAN

Jenis Rancangan Penelitian

Penelitian ini merupakan penelitian analisis cross-sectional. Pada

penelitian ini dilakukan analisis polimorfisme gen CYP2A6 terhadap

ketergantungan rokok pada satu populasi. Pada penelitian terdapat faktor risiko

dan variabel efek. Faktor risiko dalam penelitian ini adalah lingkungan dan

genetik subjek uji. Variabel efek dalam penelitian ini adalah ketergantungan rokok

subjek uji.

Alat dan Bahan Penelitian

Alat yang digunakan berupa alat gelas, DNA isolasi kit (FavorPrepTM

),

Thermal cycler Perkin Elmer 2400, satu set elektroforesis horizontal (Sigma

Aldrich), UV Transilluminator (Fisher Scientific), dispossable gloves,

receivertubes (1,5 mL), hot plate (CimarecTM

Thermo Scientific), mikropipet,


4

sentrifuge (Fisher Scientific), kamera DSLR dan kuisioner FTND yang diacu dari

Heatherton (1991).

Bahan yang digunakan yaitu isolat DNA, primer forward: (5’-

GATTCCTCTCCCCTGGAAC-3’) dan primer reverse: (5’-

GGCTGGGGTGGTTTGCCTTTA-3’), blue tip, yellow tip, white tip, Promega Go

Taq Green Master Mix, Tris-Borate-EDTA (TBE) Buffer pH 8,8 (10x), 1% gel

agarose, Biotium gel red, 100 bp DNA Ladder (Geneaid), DNA loading dye

(Geneaid), etanol 96% (Sigma Chemical Co., St. Louis) dan aqua bidestilata steril

(Ikapharmindo).

Kriteria Subjek Uji

Penelitian ini menggunakan subjek uji dengan kriteria yaitu perokok laki-

laki berjumlah 30 subjek uji, keturunan suku Tionghoa asli minimal sampai third

degree relativies (kakek dan nenek orang Tionghoa asli) yang diketahui dari hasil

wawancara dan berumur 20-40 tahun yang tinggal di Yogyakarta. Perokok aktif

minimal 5 tahun yang menghisap baik rokok kretek dan rokok putih. Penelitian ini

juga mengeliminasi pasien yang sedang mengonsumsi obat rutin atau sedang

menjalani pengobatan untuk berhenti merokok dalam sebulan terakhir, pasien

dengan penyakit yang mengharuskan beristirahat total selama ≥ 10 hari dalam

sebulan terakhir, seperti heart diseases, renal failure, pulmonary diseases, pasien

dengan penyakit hepar seperti hepatitis, sirosis hati, dan hepatoma. Subjek uji

dengan sadar bersedia menandatangani informed consent. Penelitian yang

dilakukan di Labolatorium Biokimia Fakultas Biokimia Universitas Sanata

Dharma ini telah memenuhi Kode Etik yang disetujui oleh Komisi Etik Fakultas

Kedokteran Kristen Duta Wacana Yogyakarta.

Pengambilan Sampel Darah pada Subjek Uji

Sampel darah diambil oleh petugas dari labolatorium klinik “Sadewa”.

Sampel darah diambil dari pembuluh vena subjek uji dan ditampung dalam

vaccumtainer yang berisi EDTA (1,8 mg/mL darah). Darah segar yang diperoleh,

disimpan pada suhu ± 4°C sebelum dianalisis dan digunakan untuk identifikasi

alel CYP2A6*9.


5

Isolasi DNA

Pada penelitian ini isolasi DNA menggunakan DNA isolasi kit (merk

FavorPrepTM

). Prosedur yang dilakukan sesuai dengan protokol yang tertera pada

kit yang digunakan. Terdapat 3 tahap umum dalam proses isolasi yaitu proses

perusakan dinding sel, pemisahan DNA dari protein dan pemurnian DNA. Tujuan

isolasi DNA adalah untuk mendapatkan DNA yang murni (Muladno, 2010).

Analisis Kemurnian Isolat DNA

Hasil isolasi DNA dapat dilihat dengan dilakukan elektroforesis dengan

fase diam agarosa 1,0% yang telah ditambahkan dengan gel red dan dilihat

hasilnya dengan menggunakan lampu UV. DNA yang terekspresi didokumentasi

dengan kamera DSLR Canon 7D. Panjang pita DNA yang murni dapat diketahui

dengan cara menarik garis lurus pita sampel DNA dengan posisi pita DNA ladder

dan terbentuk hanya satu pita pada masing-masing sampel isolat DNA.

Amplifikasi Isolat DNA dengan Metode PCR

Fragmen DNA dari alel CYP2A6*9 dapat diperoleh dengan dilakukan

amplifikasi menggunakan primer yang diadopsi Yoshida et al. (2003), yaitu

primer forward: 5'-GAT TCC TCT CCC CTG GAA C-3', primer reverse: 5'-GGC

TGG GGT GGT TTG CCT TTA-3'. Amplifikasi DNA dengan PCR dilakukan

menggunakan Promega Go Taq Green Master Mix. Campuran DNA dengan

volume akhir 25 μL, yang terdiri dari reagent 12,5 μL, primer forward 1,25 μL,

primer reverse 1,25 μL, isolat DNA 5,0 μL, aquabides 5 μL. Penentuan rentang

suhu annealing dan jumlah siklus amplifikasi berdasarkan pada hasil optimasi

yang dilakukan oleh Cindy (2015). Amplifikasi dilakukan dengan mesin PCR.

Kondisi PCR digunakan adalah sebagai berikut; initial denaturasi pada suhu 94ºC

(3’); dilanjutkan dengan denaturasi pada suhu 94ºC (30”); annealing pada suhu

60ºC (30”) dan ekstensi pada suhu 70ºC (25”). Siklus amplifikasi tersebut

dilakukan sebanyak 30 kali dan selanjutnya diakhiri dengan final ekstensi pada

suhu 72ºC (5’).

Analisis Produk PCR dengan Elektroforesis

Hasil produk PCR dilihat dengan dilakukan elektroforesis menggunakan

fase diam agarosa 1,5% yang telah ditambahkan dengan gel red dan dilihat


6

hasilnya dengan menggunakan lampu UV. Hasil tersebut didokumentasi dengan

kamera DSLR Canon 7D. Produk PCR yang terbentuk pada penelitian ini berada

pada pita 368-bp (Yoshida et al., 2003).

Deskripsi Ketergantungan Rokok dengan Acuan Fagerstrom Test for Nicotine

Dependence (FTND) Berdasarkan Penelitian Heatherton (1991)

Fagerstrom Test for Nicotine Dependence (FTND) adalah instrumen

standar untuk menilai intensitas kecanduan fisik terhadap nikotin. Tes ini

dirancang untuk memberikan ukuran ordinal ketergantungan nikotin terkait

merokok. FTND berisi enam pertanyaan yang mengevaluasi lamanya waktu yang

dibutuhkan setelah bangun tidur untuk melakukan aktivitas merokok, kemampuan

menahan diri untuk tidak merokok di ruangan bebas rokok, waktu yang tidak

disukai untuk merokok, perbandingan jumlah hisap rokok antara pagi dan malam,

jumlah rokok perhari yang dihisap dan dorongan untuk menghisap rokok dalam

keadaan sakit. Dalam penilaian FTND, pertanyaan dengan jawaban Ya/Tidak

memiliki skor dari 0 sampai 1 dan beberapa pertanyaan pilihan diberi skor 0

sampai 3. Pertanyaan dalam FTND dilengkapi dengan skor pada masing-masing

jawaban dirangkum dalam Lampiran 9.

Keseluruhan hasil dijumlahkan untuk menghasilkan skor total 0-10.

Semakin tinggi skor Fagerstrom, semakin kuat ketergantungan fisik pasien

terhadap nikotin. Total skor dibawah 5 menggambarkan tingkat ketergantungan

terhadap nikotin yang rendah. Subjek uji disarankan untuk menghentikan kegiatan

merokok dengan melakukan aktivitas lain sebelum tingkat ketergantungan

terhadap nikotin meningkat. Total skor 5 menggambarkan tingkat ketergantungan

terhadap nikotin medium. Jika subjek uji tidak segera berhenti merokok, tingkat

ketergantungan terhadap nikotin akan meningkat sehingga menyebabkan

kecanduan yang serius. Total skor diatas 5 menggambarkan tingkat ketergantugan

terhadap nikotin tinggi. Kebiasaan merokok pada subjek uji menjadi tidak

terkendali, jika ingin membuat keputusan berhenti merokok perlu dilakukan

konsultasi dengan dokter tentang terapi penggantian nikotin atau medikasi lain

yang dapat membantu menghilangkan kecanduan.


7

Analisis Hasil

Faktor yang mempengaruhi seseorang terhadap aktivitas merokok dibagi

menjadi dua yaitu faktor genetik dan faktor lingkungan. Hubungan faktor genetik

terhadap ketergantungan rokok dianalisis dengan ada tidaknya alel CYP2A6*9

berdasarkan hasil identifikasi alel pada subjek uji perokok suku Tionghoa di

Indonesia. Faktor lingkungan berupa lama merokok dan jumlah batang rokok

yang dihisap per hari dianalisis dengan grafik yang menghubungkan antara total

skor FTND terhadap lama merokok dan jumlah batang rokok yang dihisap per

hari serta dilakukan analisis statistik regresi linear berganda.

HASIL DAN PEMBAHASAN

Pada penelitian pengaruh polimorfisme pada gen CYP2A6 terhadap

ketergantungan rokok dilakukan analisis identifikasi alel CYP2A6*9 dan analisis

ketergantungan rokok dengan mengacu pada FTND. Pemilihan alel CYP2A6*9

karena alel ini merupakan salah satu bentuk tidak aktif yang lebih banyak

ditemukan pada populasi Asia. Terjadinya polimorfisme CYP2A6*9 pada gen

CYP2A6 yang dapat mempengaruhi metabolisme nikotin yaitu dapat mengurangi

atau menurunkan metabolisme nikotin pada populasi Asia (Liu et al, 2011).

Polimorfisme gen CYP2A6 dapat menyebabkan penyakit kardiovaskular bagi

perokok. Indonesia merupakan salah satu negara dengan jumlah hisap rokok yang

cukup tinggi dan terdiri dari berbagai suku atau etnis.

Penentuan Subjek Uji pada Suku Tionghoa

Pada penelitian ini digunakan probandus berjenis kelamin laki-laki dengan

suku Tionghoa yang ada di Indonesia, berusia 20-40 tahun, menghisap rokok

kretek/filter minimal 5 batang/hari selama minimal 5 tahun dan berjumlah

sebanyak 30 orang. Pemilihan subjek uji dengan rentang usia 20-40 tahun

dianggap dapat menggambarkan ketergantungan rokok secara jelas. Usia subjek

uji berkisar antara 20-30 tahun dengan rata-rata usia 22 tahun. Rata-rata

keseluruhan subjek uji menghisap rokok sebanyak 13 batang dalam sehari dalam

rentang 5-25 batang rokok per hari. Data jumlah batang rokok yang dihisap per


8

hari oleh subjek uji menunjukkan adanya variasi pada masing-masing kelas

perokok. Sebanyak 14 subjek uji termasuk perokok ringan (1-10 batang per hari),

15 subjek uji termasuk perokok sedang (11-20 batang per hari), dan 1 subjek uji

termasuk perokok berat (lebih dari 20 batang per hari) (Bustan, 2007). Rata-rata

lama merokok subjek uji adalah selama 6 tahun dengan rentang antara 5-8 tahun.

Pemilihan subjek uji dengan lama merokok minimal 5 tahun dapat memberikan

gambaran ketergantungan terhadap rokok dengan jelas. Jumlah subjek uji yang

digunakan telah memenuhi syarat untuk penelitian genetik polimorfisme menurut

persamaan B-Rao (2001) yaitu minimal 29 orang. Persamaan yang digunakan

untuk menentukan jumlah sampel minimal pada penelitian genetik polimorfisme

menurut B-Rao (2001) adalah:

Nmin ≥ log (1 – π )/2log (1 – fmin) (1)

Dimana Nmin menunjukkan jumlah sampel minimal, π menunjukkan probabilitas

alel utama dan fmin menunjukkan frekuensi alel minor. Jenis alel yang akan diteliti

adalah dua macam, yaitu CYP2A6*1 (alel utama) dan CYP2A6*9 (alel minor).

Maka menurut B-Rao (2001), nilai π dan fmin untuk kedua alel tersebut berturut-

turut adalah: π = 0,95 dan fmin = 0,05. Berdasarkan persamaan maka jumlah

sampel minimal yang diperlukan untuk penelitian adalah 29 orang.

Keseluruhan karakteristik subjek uji yang digunakan dalam penelitian ini

disajikan pada Tabel I.

Tabel I. Karakteristik Subjek Uji yang Terlibat dalam Penelitian

Karakteristik Nilai

Umur (tahun) Rata-rata ± SD 21,9 ± 2,15

Rentang 20-30

Jumlah batang rokok

yang dihisap perhari

Rata-rata ± SD 12,96 ± 4,80

Rentang 5-25

Lama merokok

(tahun)

Rata-rata ± SD 5,9 ± 1,06

Rentang 5-8

Jumlah subjek uji 30 orang Keterangan :

SD = Standar deviasi

Analisis Kualitatif Isolat DNA

Hasil isolasi DNA diuji secara kualitatif untuk mengetahui kemurnian

DNA yang didapat dengan teknik elektroforesis menggunakan gel agarosa 1,0%


9

(Fatchiyah, 2011; Broeders et al., 2014). Hasil elektroforesis pada Gambar 1

menunjukkan isolat DNA dengan pita tunggal dan tebal berukuran lebih dari 3000

bp, sehingga hal ini menjelaskan bahwa isolat DNA yang digunakan murni dan

akan digunakan untuk amplifikasi (Patramurti et al., 2014).

Keterangan:

M : DNA ladder sebagai marker

1-7 : Isolat DNA

Kondisi Elektroforesis : Fase diam agarose 1%; Fase Gerak Larutan TBE 1%; Kecepatan

125 V/cm selama 30 menit

Gambar 1. Elektroforegram hasil analisis kualitatif isolat DNA subjek uji

Deskripsi Ketergantungan Rokok dengan Fagerstrom Test for Nicotine

Dependence (FTND)

Penelitian ini menggunakan FTND untuk memberikan penilaian tehadap

suatu ketegantungan seorang perokok dan dari total skor penilaian ditentukan

tingkatan ketegantungannya. Menurut hasil kuisioner didapatkan data yang

dirangkum dalam Tabel II.

Tabel II. Total Skor FTND

Total Skor Keterangan Jumlah Subjek Uji

0-2 Ketergantungan sangat rendah 8

3-4 Ketergantungan rendah 15

5 Ketergantungan medium 5

6-7 Ketergantungan tinggi 2

8-10 Ketergantungan sangat tinggi -

Berdasarkan total skor FTND subjek uji yang memiliki total skor di

bawah 5 adalah sebanyak 23 orang yang menggambarkan tingkat ketergantungan


10

terhadap nikotin yang rendah. Subjek uji yang memiliki total skor 5 adalah

sebanyak 5 orang dan menggambarkan tingkat ketergantungan terhadap nikotin

medium. Jumlah subjek uji dengan total skor di atas 5 sebanyak 2 orang dan

menggambarkan tingkat ketergantungan terhadap nikotin tinggi. Hasil total skor

FTND yang diperoleh menggambarkan ketergantungan rokok selanjutnya

dilakukan analisis pengaruh alel CYP2A6*9 dan faktor lingkungan (lama

merokok dan jumlah batang rokok yang dihisap perhari). Rangkuman data yang

diperoleh disajikan dalam pada Lampiran 10.

Pengaruh Alel CYP2A6*9 terhadap Ketergantungan Rokok

Berdasarkan teori, faktor genetik memiliki kontribusi sebesar 50-70%

(Tyndale and Seller, 2005). Pada analisis ketergantungan oleh faktor genetik

dilakukan dengan metode PCR (Polymerase Chain Reaction). Primer yang

digunakan untuk mengamplifikasi alel CYP2A6*1 adalah primer forward: 5'-

GAT TCC TCT CCC CTG GAA C-3' dan primer reverse: 5'-GGC TGG GGT

GGT TTG CCT TTA-3'. Spesifisitas primer akan menentukan keberhasilan proses

PCR, karena spesifisitas menentukan kemampuan primer untuk menempel pada

pasang basa nukleotida target pada isolat DNA (McPherson and Moller, 2006).

Amplifikasi gen CYP2A6 menggunakan primer tersebut menghasilkan produk

PCR yang berukuran 368-bp yang merupakan produk dari alel CYP2A6*1. Letak

penempelan primer pada urutan basa potongan gen CYP2A6*9 tidak sesuai

dengan pasangan basa primer yang digunakan karena ada perbedaan 1 pasangan

basa (SNP), sehingga produk PCR gen CYP2A6*9 tidak terjadi amplifikasi dan

tidak terdapat band pada gel agarosa.

Hasil produk PCR dilihat dengan dilakukan elektroforesis menggunakan

fase diam agarosa. Hasil dari elektroforesis menunjukkan panjang pita dari produk

PCR yang berupa amplifikasi DNA dengan dilihat pada UV transilluminator dan

didokumentasikan dengan menggunakan kamera DSLR Canon 7D yang

ditunjukkan pada Gambar 2.


11

Keterangan:

M : DNA Ladder

1-7 : Produk PCR

Kondisi Elektroforesis : Fase diam agarose 1,5 %; Fase Gerak Larutan TBE 1%;

Total volume injeksi 6 μL, yaitu terdiri dari 1 μL loading

dye dan 5 μL produk PCR; Kecepatan 125 V/cm selama 30

menit.

Gambar 2. Elektroforegram produk PCR pada kondisi optimum dari berbagai isolat

DNA

Pada Gambar 2 dapat dilihat pada band terdapat pita pada panjang 368-bp,

hal menunjukkan bahwa sampel DNA tersebut merupakan CYP2A6*1 (wild type)

dan sebaliknya pada band yang kosong menunjukkan bahwa sampel DNA

mengalami polimorfisme dan dikatakan memiliki alel CYP2A6*9.

Dari produk PCR yang telah dielektroforesis, data yang disajikan pada Tabel III.

Tabel III. Pengaruh Alel CYP2A6*9 terhadap Ketergantungan Rokok

Tingkat Ketergantungan

Rokok

Jumlah Subjek Uji

Alel CYP2A6*1 Alel CYP2A6*9

Sangat Rendah 4 4

Rendah 12 3

Medium 5 -

Tinggi 2 -

Sangat Tinggi - -

Adanya polimorfisme CYP2A6 akan mempengaruhi aktivitas enzim pada

metabolisme nikotin dalam tubuh, yaitu dengan menurunkan, menghilangkan atau


12

meningkatkan aktivitas enzim (Raunio and Rahnasto-Rilla, 2012). Bentuk aktif

dari CYP2A6 adalah alel CYP2A6*1 (wild type), sedangkan salah satu bentuk

tidak aktif adalah CYP2A6*9. Bentuk alel tidak aktif tersebut dapat

mempengaruhi aktivitas enzim menjadi lebih lambat daripada bentuk aktifnya

(Liu et al., 2011). Hasil penelitian menunjukkan adanya alel CYP2A6*9 pada

tingkat ketergantungan rokok yang sangat rendah sebanyak 4 orang dan tingkat

ketergantungan rokok yang rendah sebanyak 3 orang. Dari data tersebut dapat

disimpulkan bahwa subjek uji yang memiliki alel CYP2A6*9 memiliki tingkat

ketergantungan rokok cenderung rendah. Hal ini sesuai dengan teori bahwa

adanya alel CYP2A6*9 pada individu akan menurunkan kerja enzim CYP2A6

dalam memetabolisme nikotin sehingga menjadi lebih lambat. Berdasarkan hal

ini, maka untuk mempertahankan kadar nikotin di dalam darah, individu

menghisap rokok dalam jumlah yang sedikit.

Pengaruh Jumlah Batang Rokok dan Lama Merokok terhadap

Ketergantungan Rokok

Pada penelitian ini digambarkan grafik subjek uji dengan menunjukkan

distribusi skor FTND, jumlah batang rokok yang dihisap perhari dan lama

merokok untuk masing-masing subjek uji yang disajikan pada Gambar 3.

Berdasarkan grafik distribusi tersebut menunjukkan bahwa subjek uji 2, 7, 8 dan

26 memiliki tingkat ketergantungan rokok yang rendah dengan lama merokok

yang berbeda beda yaitu secara berurut-turut 6, 5, 6 dan 5 tahun dengan jumlah

batang rokok yang dihisap tiap hari secara berturut-turut 11, 7, 10 dan 20. Selain

itu, subjek uji yang memiliki tingkat ketergantungan rokok medium yaitu pada

subjek uji 3, 17, 18, 20 dan 28 dengan lama merokok secara berturut–turut 8, 7,

7, 7 dan 8 tahun serta menghisap 7, 19, 13, 16 dan 14 batang rokok tiap hari.

Sedangkan subjek uji yang memiliki tingkat ketergantungan rokok yang tinggi

ditunjukkan pada subjek uji 6 dan 16 dengan lama merokok masing-masing 5

tahun dan menghisap 25 dan 18 batang rokok tiap hari.


13

Gambar 3. Grafik distribusi subjek uji perokok suku Tionghoa Indonesia

Pada grafik yang disajikan pada Gambar 3, ditunjukkan bahwa adanya

variasi pada lama merokok dan jumlah rokok yang dihisap perhari pada tiap

tingkatan kertergantungan merokok. Hal ini dapat dipengaruhi oleh beberapa

faktor antara lain faktor lingkungan seperti seseorang memiliki kecenderungan

untuk merokok terus apabila berada di lingkungan perokok dan faktor genetik.

Analisis pengaruh lama merokok dan jumlah batang rokok yang dihisap

perhari terhadap nilai ketergantungan rokok subjek uji dilakukan dengan

menggunakan Microsoft Excel 2007. Hasil analisis dengan metode regresi linear

berganda menunjukkan nilai uji t, uji F dan koefisien korelasi (R) yang disajikan

pada Lampiran 13. Hasil yang diperoleh menunjukkan nilai uji t (uji koefisisen

regresi secara parsial) masing-masing variabel yaitu t nilai hitung lama merokok >

t tabel (2,11 > 2,06) dengan signifikansi < 0,05 (0,04 < 0,05). Sedangkan pada

hasil analisis uji t menunjukkan t hitung jumlah batang rokok > t tabel (2,77 >

2,06) dengan signifikansi < 0,05 (0,01 < 0,05). Pada uji t disimpulkan bahwa lama

merokok dan jumlah batang rokok yang dihisap perhari mempengaruhi secara

signifikan terhadap nilai ketergantungan rokok pada subjek uji.

0

5

10

15

20

25

30

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30

Nil

ai

Subjek Uji

Distribusi Subjek Perokok Suku Tionghoa Indonesia

Total Skor FTND Lama Merokok (tahun) Jumlah Batang Rokok (per hari)


14

Hasil analisis menunjukan nilai uji F (Uji Anova) untuk melihat pengaruh

lama merokok dan jumlah batang rokok yang dihisap perhari terhadap nilai

ketergantungan rokok subjek uji. Nilai uji F yang didapat adalah F hitung > F

tabel 5,85 > 3,35 dengan nilai signifikansi yang diperoleh < 0,05 (0,01 < 0,05)

menunjukkan adanya pengaruh lama merokok dan jumlah batang rokok yang

dihisap perhari terhadap nilai ketergantungan merokok.

Nilai R yang menunjukkan korelasi berganda yaitu korelasi antara lama

merokok dan jumlah batang rokok yang dihisap perhari terhadap nilai

ketergantungan rokok subjek uji.Berdasarkan teori nilai R berkisar antara 0

sampai 1. Jika nilainya mendekati 0, maka hubungan semakin lemah dan jika nilai

mendekati 1, maka hubungan semakin erat. Nilai R yang diperoleh adalah 0,55

sehingga disimpulkan bahwa lama merokok dan jumlah batang rokok yang

dihisap perhari memiliki hubungan terhadap nilai ketergantungan rokok subjek uji

(Dahlan, 2014). Nilai R pada penelitian ini bernilai positif, hal ini menunjukkan

bahwa semakin lama dan semakin banyak jumlah batang rokok yang dihisap

perhari, maka nilai ketergantungan semakin tinggi. Selain itu didapatkan nilai R

square sebesar 0,30 hal yang menunjukkan bahwa persentase sumbangan lama

merokok dan jumlah batang rokok yang dihisap perhari terhadap nilai

ketergantungan sebesar 30%, sedangkan sisanya sebesar 70% dipengaruhi faktor-

faktor lain yang tidak dimasukan pada penelitian ini.

Berdasarkan hubungan antara lama merokok dan jumlah batang rokok

yang dihisap perhari terhadap skor FTND (tingkat ketergantungan) didapatkan

persamaan statistik berikut ini:

Y= -1,03 + 0,46*X1 + 0,14*X2 (2)

Diketahui nilai Y merupakan skor FTND, X1 merupakan lama merokok, X2

merupakan jumlah batang rokok yang dihisap tiap hari, serta nilai -1,03

merupakan nilai intersep. Berdasarkan persamaan ini, maka dapat diketahui

bahwa besarnya kontribusi jumlah batang dan lama merokok terhadap nilai FTND

masing-masing sebesar 0,46 dan 0,14. Jika lama merokok tetap maka

menyebabkan kenaikan nilai ketergantungan sebesar 46% dan jika jumlah batang

rokok yang dihisap per hari tetap maka menyebabkan kenaikan nilai


15

ketergantungan sebesar 14%. Kurva hubungan antara lama merokok dan jumlah

batang rokok terhadap skor FTND (tingkat ketergantungan) ditunjukan pada

Gambar 4.

Gambar 4. Kurva hubungan antara jumlah batang rokok dan lama merokok terhadap

skor FTND

Analisis data ini dalam hubungannya dengan skor FTND menyimpulkan

bahwa jumlah batang rokok yang dihisap per hari dan lamanya kebiasaan

merokok yang dimiliki seseorang termasuk faktor risiko yang dapat meningkatkan

ketergantungan fisik perokok terhadap nikotin. Hasil analisis data menunjukkan

bahwa ketergantungan fisik terhadap nikotin terbukti bersifat dose dependent,

artinya bahwa jumlah rokok yang banyak dapat meningkatkan risiko

ketergantungan rokok. Data juga menunjukkan bahwa ketergantungan fisik

terhadap nikotin terbukti bersifat time dependent, artinya bahwa lama merokok

dapat meningkatkan risiko ketergantungan rokok. Hasil ini sesuai dengan

penelitian O‟Brian (2006), bahwa sifat nikotin dalam menimbulkan

ketergantungan sebanding dengan waktu dan dosis (time and dose dependent).

5 7 8 9 10 10 10 13 15161718201925

0

1

2

3

4

5

6

7

5 5 5 5 5 5 6 6 6 6 67

78

8Lama Merokok

(X1)

Sk

or

FT

ND

Jumlah Batang Rokok

(X2)

Kurva Hubungan Antara Lama Merokok dan Jumlah Batang

Rokok Terhadap skor FTND (Tingkat Ketergantungan)

6-7

5-6

4-5

3-4

2-3

1-2

0-1


16

KESIMPULAN

Alel CYP2A6*9 pada subjek uji suku Tionghoa Indonesia teridentifikasi

sebanyak 23% dari 30 subjek uji yang menurut Fagerstrom Test for Nicotine

Dependence (FTND) termasuk dalam tingkatan ketergantungan rokok sangat

rendah dan tingkatan ketergantungan rokok rendah.

Hubungan lama merokok dan jumlah batang rokok yang dihisap perhari

terhadap nilai ketergantungan rokok mendapatkan nilai uji t, uji F dan koefisien

korelasi (R) menyimpulkan bahwa lama merokok dan jumlah batang rokok yang

dihisap perhari mempengaruhi tingkat ketergantungan rokok.

SARAN

1. Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut untuk melihat pengaruh lingkungan

CYP2A6 terhadap ketergantungan rokok pada subjek uji perokok suku

Tionghoa Indonesia dengan jumlah subjek uji yang lebih banyak.

2. Perlu dilakukan penelitian tentang polimorfisme CYP2A6 pada alel yang

berbeda.


17

DAFTAR PUSTAKA

B-Rao, C., 2001. Sample Size Considerations in Genetic Polymorphism Studies.

Human Heredity, 52, 191-200.

Broeders, S., Huber, I., Grohmann, L., Berben, G., Taverniers, I., Mazzara, M.,

Roosens, N., and Morisset, D., 2014. Guidelines for Validation of

Qualitative Real-Time PCR Methods. Trends in Food Science &

Technology, 37 (June), 115-126.

Burns, D. M., 2005. Nicotine Addiction. In: D.L. Kasper, Braunwalds, A.S. Fausi,

S.L. hauser, D.L. longo, and J.L. Jameson, eds. Harrison’s Principles of

Internal Medicine. New York, NY: McGraw-Hill, 2573-2577.

Cindy, 2017. Optimasi dan Validasi Kondisi Polymerase Chain Reaction padea

Identifikasi CYP2A6 *9. Skripsi. Yogyakarta: Universitas Sanata Dharma.

3-10.

Dahlan, M.S., 2014. Statistik untuk Kedokteran dan Kesehatan: Deskriptif,

Bivariat, dan Multivariat, Dilengkapi Aplikasi Menggunakan SPSS. 6eds,

Jakarta: Epidemiologi Indonesia, 23-35.

Davies, G.E., and Soundy, T.J., 2009. The Genetics of Smoking and Nicotine

Addiction. South Dakota Medicine (Online),

www.sdsma.org/documents/Davies.pdf accessed 3 December 2017.

Fatchiyah, 2005. PCR: Dasar teknik Amplifikasi DNA dan Aplikasinya: Panduan

Praktikum.

Gambier, N., Batt, A.M., Marie, B., Pfister., Siest G., Visvikis-Siest, S., 2005.

Association of CYP2A6*1B Genetic Variant with the Amount of Smoking

in French Adults From the Stanislas Cohort. Pharmacogenomics Journal, 5,

271-275.

Gullstén, H., 2000. Significance of Polymorphism in CYP2A6 Gene. Disertation.

Oulu: Department of Pharmacology and Toxicology University of Oulu.

Heatherton, T.F., Kozlowski L.T., Frecker R.C., and Fagerstrom, K., 1991. The

Fagerstrom Test for Nicotine Dependence : A Revision of the Fagerstrom

Tolerance Quiestionnaire. British Journal of Addiction, 86, 1119-1127.

Hitchman, S.C., Fong, G.F., 2011. Gender Empowerment and Female to Male

Smoking Prevalence Ratios, Bulletin of the World Health Organization

(Online), http://www.who.int/bulletin/volumes/89/3/10079905/en/ accessed

22 November 2017.

Hukkanen, J., Jacob III, P. and Benowitz, N.L., 2005. Metabolism and Disposition

Kinetics of Nicotine. The American Society for Pharmacology and

Experimental Therapeutics, 57 (1), 79-115.

Kwon, J.T., Nakajima, M., Chai, S., Yom, Y.K., Kim, H.K., Yamazaki, H., Sohn,

D.R., Yamamoto, T., Kuroiwa, Y., Yokoi, T., 2001. Nicotine Metabolism

and CYP2A6 Allele Frequencies in Koreans. Pharmacogenetics, 11, 317-

323.

Liu, T., David, S.P., Tyndale, R.F., Wang, H., Zhou, Q., Ding, P., He, Y., Yu, X.,

Chen, W., Crump, C., Wen, X., and Chen, W., 2011. Associations of

CYP2A6 Genotype With Smoking Behaviors In Southern China. National

of Health Institutes, 106 (5), 985-994.


18

Maggert, K. A., 2012. Genetics: Polymorphisms, Epigenetics, and Something In

Between. Genetic Research International, 1-9.

McPhee, S.J., and Pignone, M., 2007. Disease {revention and Health Promotion.

In: S.J. McPhee, M.A, Papadakis and L.M. Tierney Jr, eds. Current Medical

Diagnosis and Treatment. New York, NY: McGraw-Hill, 1-16.

McPherson, M.J., and Moller, S.G., 2006. PCR, 2nd

eds. New York, NY: Taylor

and Francis, 292.

Muladno., 2010. Teknologi Rekayasa Genetika. Edisi Ke-2. Bogor: IPB Press, 89-

93.

Munafo, M.R., Clark, T.G., Johnstone, E.C., Murphy, M.F.G., and Walton, R.T.,

2004. The Genetic Basis for Smoking Behavior: A Systematic Review and

Meta-Analysis. Nicotine and Tobaco Research, 6 (4), 583-597.

Nakajima, Miki., Fukami, T., Yamanaka, H., Higashi, E., Sakai, H., Yoshida,

R.,Kwon, J. T., McLeod, H. L., Yokoi, T., 2006. Comprehensive Evaluation

of Variability in Nicotine Metabolism and CYP2A6 Polymorphic Alleles in

Four Ethnic Populations. Clinical Pharmacology and Therapeutics, 80(3):

282-29.

Park, L.S., Tiirikainen, M.I., Patel, Y.M., Wilkens, L. R., Stram, D.O., Marchand,

L.L., 2016. Genetic Determinants of CYP2A6 Activity Across Racial

Ethnic Groups with Different Risks of Lung Cancer and Effect on Their

Smoking Intensity. Carcinogenesis, 37(3), 269-279.

Patramurti, C., Sugiyanto, Nurrochmad, A., and Martono, S., 2014. Polymorphism

of Cytochrome P450 2A6 (CYP2A6*1 and CYP2A6*4) Among Javanese

Indonesian Smoker and Non Smoker. Indonesian Journal of Pharmacy,

26(1), 11-19.

Rao, Y., Hoffmann, E., Zia, M., Bodin, L., Zeman, M., Sellers, E.M. & Tyndale,

R.F. 2000. Duplications and Defects in The CYP2A6 Gene: Identification,

Genotyping, and In Vivo Effects on Smoking. The American Society for

Pharmacology and Experimental Therapeutics, 58 (4), 747-755.

Raunio, H., and Rahnasto-Rilla, M., 2012. CYP2A6: Genetics, Structure,

Regulation, and Function. Drugs Metabolism and Drug Interactions, 27(2),

73-88.

Setiawati, A., 2013. Suatu Kajian Molekuler Ketergantungan Nikotin. Jurnal

Farmasi Sains Dan Komunitas, 10 (2), 118-127.

The Organisation for Economic Co-Operation and Development (EOCD), 2014.

OECD Factbook 2014; Economic, Enviromental and Social Statistics,

OECD accessed http://dx.doi.org/10.1787//factbook-2014-en, p. 242.

Tyndale, R.F., and Sellers, E., 2005. Variable CYP2A6-Mediated Nicotine

Metabolism Alters Smoking Behavior and Risk. The American Society for

Pharmacology and Experimental Therapeutics, 29 (4). 548-552.

WHO, 2013. About: Media Centre- Tobacco Fact sheet Updated June 2016,

http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs339/en/ accesed 10 November

2017.

Yoshida, R., Nakajima, M., Nishimura, K., Tokudome, S., Kwon, J-T., and

Yokoi, T., 2003. Effects of Polymorphism in Promoter Region of Human

CYP2A6 gene (CYP2A6*9) on Expression Level of Messenger Ribonucleic


19

Acid and Enzymatic Activity In Vivo and In Vitro. Clinical Pharmacology

and Therapeutics, 74(1), 69-76.

Yusof, W. and Gan, S.H., 2009. High Prevalence of CYP2A6*4 and CYP2A6*9

Alleles Detected Among a Malaysia Population. Clinica Chimica Acta:

International Journal of Clinical Chemtistry, 403(1-2), 105-9.


20

LAMPIRAN


21

Lampiran 1. Ethical Clearance Penelitian


22

Lampiran 2. Hasil Kuisioner


23


24

Lampiran 3. Informed Consent Subjek Uji


25

Lampiran 4. Usage Information of FavorPrepTM


26

Lampiran 5. Go Taq Green Master Mix Certificate of Analysis


27

Lampiran 6. Usage Information of Go Taq Green Master Mix


28

Lampiran 7. Product Datasheet of Primer Forward and Reverse CYP2A6*9


29

Lampiran 8. Product Datasheet of DNA Ladder & Markers


30

Lampiran 9. Daftar Pertanyaan dan Tingkat Ketergantungan terhadap Nikotin

Berdasarkan Total Skor Menurut FTND

No. Pertanyaaan Pilihan Skor

1. Dalam waktu berapa lama setelah bangun

tidur anda melakukan aktivitas merokok?

< 5 menit

6 – 30 menit

31 – 60 menit

> 60 menit

□ 3

□ 2

□ 1

□ 0

2. Apakah anda dapat menahan diri untuk tidak

merokok jika berada pada ruangan bebas

rokok?

Ya

Tidak

□ 1

□ 0

3. Kapan anda merasa paling benci untuk tidak

merokok?

Pagi hari

Setiap saat

□ 1

□ 0

4. Apakah jumlah rokok yang anda hisap lebih

banyak di pagi hari dibandingkan pada malam

hari?

Ya

Tidak

□ 1

□ 0

5. Berapa banyak batang rokok perhari yang

anda hisap?

21 – 30

11 – 20

< 10

□ 2

□ 1

□ 0

6. Apakah anda tetap akan merokok, walaupun

dalam keadaan sakit berat?

Ya

Tidak

□ 1

□ 0

TOTAL SKOR

0-2 : Ketergantungan sangat rendah

3-4 : Ketergantungan rendah

5 : Ketergantungan medium

6-7 : Ketergantungan tinggi

8-10 : Ketergantungan sangat tinggi


31

Lampiran 10. Karakteristik Subjek Uji

Subyek

Uji

Umur

(tahun)

Total Skor

FTND

Lama Merokok

(tahun)

Jumlah Batang

Rokok (per hari)

1 20 2 5 10

2 26 1 6 11

3 22 5 8 7

4 23 2 6 7

5 23 4 6 17

6 22 6 5 25

7 23 1 5 7

8 20 1 6 10

9 26 4 6 16

10 21 4 5 18

11 22 4 5 9

12 20 2 5 9

13 22 4 5 10

14 23 3 8 5

15 20 4 5 8

16 21 6 5 18

17 21 5 7 19

18 21 5 7 13

19 20 4 8 20

20 21 5 7 16

21 22 4 6 10

22 21 2 5 13

23 22 3 6 8

24 21 4 7 15

25 20 3 5 13

26 30 1 5 20

27 22 4 6 12

28 22 5 8 14

29s 20 3 5 14

30s 22 4 6 15


32

Lampiran 11. Elektroforegram Hasil Analisis Kualitatif Isolat DNA Subjek Uji

14 13 12 11 10 9 8 15 16 17 18 20 19 21

30 29 28 27 26 25 24

M M

M

22 23 M


33

Lampiran 12. Elektroforegram Produk PCR pada Kondisi Optimum dari

Berbagai Isolat DNA

1s

14 13 12 11 10 9 8 21 20 19 18 17 16 15

30 29 28 27 26 25 24

22 23

M M

M

M


34

Lampiran 13. Hasil Analisis dengan Metode Regresi Linear Berganda

Menunjukkan Nilai Uji t, Uji F dan Koefisien Korelasi (R)

Uji t (Koefisisen Regresi Secara Parsial)

Coefficients Standard

Error

t Stat P-value

Intercept -1.02782 1.497093 -0.68655 0.498224

Lama Merokok

(tahun) 0.464617 0.219761 2.114193 0.043877

Jumlah Batang

Rokok (per

hari)

0.135394 0.048858 2.771169 0.009988

Uji F (Anova)

df SS MS F Significance F

Regression 2 18.58391 9.291955 5.845891 0.007772

Residual 27 42.91609 1.589485

Total 29 61.5

Koefisien Korelasi (R)

Regression Statistics

Multiple R 0.549707

R Square 0.302177

Adjusted R Square 0.250487

Standard Error 1.260748

Observations 30


35

BIOGRAFI PENULIS

Skripsi dengan judul “Pengaruh Polimorfisme Gen

Sitokrom P450 2A6 Alel *9 terhadap Ketergantungan

Rokok Pada Subjek Uji Suku Tionghoa Indonesia”

ditulis oleh penulis dengan nama lengkap Jasvidianto

Chriza Kotta. Penulis dilahirkan di Kupang, Provinsi

Nusa Tenggara Timur pada 7 April 1996. Penulis

merupakan anak kandung pertama dari tiga bersaudara

pasangan Herry Zadrak Kotta dan Christiana

Suhartingsih. Penulis menempuh pendidikan mulai dari

TK Bopkri Gondolayu Yogyakarta (2000-2002) melanjutkan ke tingkat Sekolah

Dasar di SD Bopkri Gondolayu Yogyakarta (2002-2008), tingkat Sekolah

Menengah Pertama di SMP Pangudi Luhur 2 Yogyakarta (2008-2011), tingkat

Sekolah Menengah Atas di SMA Bopkri 1 Yogykarta (2011-2014). Penulis

kemudian menempuh sarjana 1 di Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma

Yogyakarta pada tahun 2014. Penulis merupakan anggota advokasi dalam

Organisasi Dewan Perwakilan Mahasiswa Fakultas Farmasi Periode 2015/2016.

Selama kuliah penulis aktif dalam kegiatan Jaringan Mahasiswa Kesehatan

Indonesia (JMKI), Unit Kegiatan mahasiswa Fakultas (UKF) Futsal periode

2014/2015 dan Unit Kegiatan mahasiswa Fakultas (UKF) Voli periode

2014/2015. Dalam berbagai acara kampus, penulis aktif dalam acara Pharmacy

Performance 2014-2016 sebagai humas, Desa Mitra I sebagai anggota divisi

perlengkapan dan Titrasi 2016 sebagai anggota divisi keamanan. Dengan motivasi

dan ketekunan untuk belajar dan pengalaman yang dimiliki, penulis dapat

menyelesaikan tugas akhir ini dan semoga penulisan skripsi ini dapat menambah

pengetahuan bagi pembaca.


PENGARUH POLIMORFISME GEN SITOKROM P450 2A6 ALEL … · 2018-03-24 · Indonesia merupakan salah...

Documents

Transcript of PENGARUH POLIMORFISME GEN SITOKROM P450 2A6 ALEL … · 2018-03-24 · Indonesia merupakan salah...