Penetapan kadar/potensi dengan cara mikrobiologi
-
Upload
phungthuan -
Category
Documents
-
view
224 -
download
7
Transcript of Penetapan kadar/potensi dengan cara mikrobiologi
Penetapan kadar/potensi
antibiotik dengan cara
mikrobiologi
Slamet Ibrahim
Marlia Singgih
School of Pharmacy ITB
Pendahuluan
• Antibiotik : sintetik, semi-sintetik
• Kasus retensi mikroba patogen
menaikkan dosis nya atau mengganti
dengan antibiotik baru
• banyak penemuan2 antibiotik baru,
sehingga perlu ditetapkan potensi nya
Acuan
• Farmakope Indonesia
• CLSI
• USP (United States
Pharmacopoeia),
• EP (European Pharmacopoeia),
• BP (British Pharmacopoeia),
• JP (Japanese Pharmacopoeia),
• AOAC (American Association of
Analytical Chemists),
• US-CFR (Code of Federal Registry)
and a custom single plate method.
Skrining antimikroba dari mikroorganisme di alam
Pengertian kadar vs potensi
• Kadar jumlah per satuan berat/volume
• Potensi ukuran kekuatan /daya hambat
atau daya bunuh zat aktif terhadap
mikroorganisme tertentu
Mengapa harus dengan cara
mikrobiologi?
• Respons mikroba terhadap antibiotik
berbeda-beda
• Spesifik
• Sensitif
Metode penetapan potensi suatu
senyawa
• Antibiotik
• Hormon
• Vitamin
Penetapan Potensi Antibiotik
Secara Mikrobiologi
• Dilakukan untuk senyawa antibiotik baru
atau untuk tujuan konfirmasi
• Tidak semua antibiotik ditentukan
potensinya secara mikrobiologi
• Penetapan dilakukan terhadap Bahan
baku dan sediaan
Estimasi dari potensi antibiotik melalui
perbandingan langsung antara sampel
(antibiotik uji) dengan antibiotik standar yang
telah disahkan penggunaannya, terkalibrasi
dengan baik, dan umum digunakan sebagai
rujukan.
Prinsip uji potensi antibiotik berdasarkan
Farmakope Indonesia edisi IV 1995
Metode Umum
1. Lempeng (silinder /
kertas cakram)
2. Turbidimetri (tabung)
Metode Lempeng Silinder
Difusi antibiotik dari silinder yang dipasang
tegak lurus pada lapisan agar padat dalam
cawan petri atau lempeng yang berisi biakan
mikroba uji pada jumlah tertentu
Mikroba dihambat pertumbuhannya
Desain pengujian 5+1
• Larutan baku pembanding yang dibuat
pengenceran S1, S2, S3, S4 dan S5
dengan tingkat perbandingan 1,25.
• Dosis tengah ditetapkan dulu, misalnya 10
IU/mL, maka: S2=8,0 IU/mL, S1=6,4
IU/mL, S4=12,5 IU/mL dan S5=15,6 IU/mL
Dosis baku
Dosis sampel
• Masing-masing larutan dimasukkan ke dalam
selinder atau serapkan pada kertas cakram
sebanyak 100 μL di atas media agar yang telah
diinokulasikan mikroba uji.
• Pre-inkubasi selama 1 jam, lalu inkubasi pada
35-37 ºC selama 18-24 jam.
• Setelah masa inkubasi, daerah hambat yang
terbentuk diukur garis tengahnya.
Pola letak uji pada desain (5+1)
Dosis S3
Dosis lainnya S3
S1 S3 S3
S3 S3
S2 S4
S5 U
Desain pengujian (5+1)
• Sebelum menghitung potensi , dilakukan
terlebih dahulu koreksi garis tengah rata-
rata diameter daerah hambat dosis larutan
baku S1, S2, S4 dan S5
• Cara :
• Hitung diameter rata-rata S3 di semua
cawan (Y3T)
• Hitung diameter rata-rata S3 pada masing-
masing cawan larutan baku S1,2,4 dan 5
(Y31, Y32, Y34 dan Y35)
• Hitung diameter S1,2,4 dan 5 (Y1, Y2, Y4
dan Y5)
Maka diameter koreksi masing-masing
larutan baku adalah :
• S1 (a) = Y1 + (Y3T – Y31)
• S2 (b) = Y2 + (Y3T – Y32)
• S3 (c) = Y3T
• S4 (d) = Y4 + (Y3T – Y34)
• S5 (e) = Y5 + (Y3T – Y35)
Untuk kurva baku, dihitung diameter dosis
terendah dan tertinggi yaitu :
YT = (3e + 2d + c – a )
5
YR = (3a + 2b + c – e )
5
YR = diameter hambat
dosis terendah
YT = diameter hambat
dosis tertinggi
• Selanjutnya dibuat kurva baku pada kertas
semilog :
• Sumbu X : log dosis
• Sumbu Y : diameter hambat
• Hubungkan titik-titik untuk S1 (YR) sampai
S5 (YT)
Sebelum Perhitungan potensi sediaan uji,
dilakukan koreksi diameter larutan sampel U:
YU koreksi = YS + (YU – Y3U)
Y3U = diameter rata-rata S3 pada pengujian
larutan U
YU = diameter rata-rata U pada cawan larutan
U
YS = Hasil interpolasi S3 pada kurva baku
Cara Perhitungan potensi sampel
Perhitungan Potensi sampel
• Potensi sediaan uji ditentukan dengan
menginterpolasi YU pada sumbu Y ke garis
kurva baku dan tarik garis ke sumbu X
(diperoleh XU)
• Dosis U = XU/S3 x dosis S3
• Potensi U = dosis U x faktor pengenceran
Linearity (Kelinieran) (lanjutan)
Perhitungan Kadar
Diameter
Hambat
Log Ci
x
x
x
x
x
a. Menggunakan persamaan garis
D = b log C + a
log Cs = Ds – a/ b
dimana :
Cs = kons. analit dlm sampel
Ds = Diameter hambat
b. Menggunakan satu larutan baku dan
larutan blangko
log Cs = (Ds – a)/(Db – a) . log Cb
dimana :
Cb = kons. analit dlm lar.baku
Membandingkan hasil pengukuran
diameter hambat
Limit value m
m
20
15
10
5
11 14 11 14
DIFFERENT SAME
Interpretasi hasil
Pengukuran diameter hambat
Contoh hasil uji potensi antibiotik
Contoh BMC Clin Pharmacol. 2009; 9: 1.
Published online 2009 January 16. doi: 10.1186/1472-6904-9-1.
PMCID: PMC2640365
Copyright © 2009 Zuluaga et al; licensee BioMed Central Ltd.
Application of microbiological assay to determine pharmaceutical equivalence of generic intravenous antibiotics
Andres F Zuluaga,1,2 Maria Agudelo,1 Carlos A Rodriguez,1,2 and Omar Vesga1,3
1GRIPE: Grupo Investigador de Problemas en Enfermedades Infecciosas, University of Antioquia, Medellín, Colombia 2Department of Pharmacology and Toxicology, University of Antioquia, Medellin, Colombia 3Section of Infectious Diseases, Department of Internal Medicine, University of Antioquia, Medellin, Colombia
Corresponding author.
Andres F Zuluaga: [email protected] ; Maria Agudelo: [email protected] ; Carlos A Rodriguez: [email protected] ; Omar Vesga: [email protected]
Received June 14, 2008; Accepted January 16, 2009.
Metode
• Pengujian dilakukan berdasarkan variasi konsentrasi
terhadap efek inhibisi pada bakteri uji : Bacillus subtilis
ATCC 6633, Staphylococcus aureus ATCC 6538p dan
Staphylococcs epidermidis ATCC 12228, yang
ditumbuhkan pada media agar (Difco™ Antibiotic
Media), menghasilkan hubungan linear antara
konsentrasi zat -respons e linear dengan dua parameter
: y-intercept (concentration) and slope (potency).
• Dibandingkan dua parameter tersebut dari 22 product
generik (amikacin 4, gentamicin 15, and vancomycin 3
produk) dengan sediaan pembanding by Overall Test for
Coincidence of the Regression Lines (Graphpad Prism
5.0).
Pengolahan data dalam proses
validasi
• Ditentukan linearity, limit of quantification, precision, accuracy, dan specificity utk menvalidasi method for testing pharmaceutical equivalence.
• Untuk tujuan tersebut, log-transformed concentrations (x-axis, log10 mg/L) dari setiap produk diplot terhadap masing-masing diameter hambat nya (y-axis, rata-rata diameter dalam mm); intercept (perpotongan dan kemiringan/slope garis regresi linear yang diekspresikan dengan persamaan y = b + mx, dengan b sebagai nilai y-intercept dan m sebagai nilai kemiringan nya
• 5 Konsentrasi yang digunakan untuk masing-
masing antibiotik : 0.5 – 256 mg/L (amikacin),
0.125 – 64 mg/L (gentamicin), dan 0.25 – 128
mg/L (vancomycin)
• The goodness of fit to the model (linearity) :
dinyatakan dalam coefficient of determination
(r2) dan standard error of estimate (Syx).
• Dihitung pula x-intercept (log10 mg/L) dan
kemiringan garis regresi dengan kepercayaan
95% confidence intervals (95% CI)
Results
• Validasi metode menghasilkan linearitas (r2 ≥ 0.98),
precision (intra-assay variation ≤ 11%; inter-assay
variation ≤ 10%), accuracy, and specificity tests , sesuai
dengan syarat international pharmacopoeial .
• Kecuali pada vancomycin yang ditambahkan 25% API
(Py-intercept = 0.001), penentuan potensi antibiotik
menunjukkan hasil yang ekuivalen. 21 sediaan generik
memberikan undistinguishable slopes dan intercepts
(P > 0.66).
• Estimasi potensi antibiotik: amikacin 99.8 - 100.5 ,
gentamisin 99.7 - 100.2, dan vancomycin 98.5 - 99.9%
Vancomycin
concentration (mg/L)
Inhibition zone
diameters (mean in
mm ± SD)
Coefficient of variation
(%) Intra-day
Coefficient of variation
(%) Inter-day
128 18.00 ± 0.04 8.3 10.3
64 16.33 ± 0.02 5.6 10.5
32 14.16 ± 0.11 11.0 1.0
16 11.62 ± 0.37 7.4* 2.3
8 9.59 ± 0.00 4.6 6.5
Precision of the vancomycin bioassay
*An outlier value was excluded from the calculations (we only used five data to compute the CV) BMC Clin Pharmacol. 2009; 9: 1.
Published online 2009 January 16. doi: 10.1186/1472-6904-9-1.
Copyright © 2009 Zuluaga et al; licensee BioMed Central Ltd.
Kurva baku masing2 antibiotik
Penetapan nilai potensi antibiotik