Pembuatan Sediaan Hapus Darah Tepi-revisi

PEMBUATAN SEDIAAN HAPUS

DARAH TEPI

dr.Agustyas Tjiptaningrum

BAHAN 1. Darah tanpa antikoagulan (darah vena atau kapiler) bila

darah kapiler digunakan maka tempak jelas agregasi trombosit, sedangkan pada darah vena tdpt agregasi ringan

2. Darah dgn antikoagulan (EDTA) chelasi kalsium shg mencegah agregasi trombosit dan trombosit akan tersebar merata

ANTIKOAGULAN K2EDTA direkomendasikan oleh ICSH (International

Committee for Standardization in Haematology) 1,5-2,2 mg/mL

K3EDTA ukuran sel mengecil hematokrit rendah Na2EDTA kurang larut dibandingkan garan kalium EDTA yg berlebihan mempengaruhi morfologi sel saat pewarnaan ALAT Gelas obyek Kaca penghapus

PEMBUATAN SEDIAAN HAPUS DARAH TEPI

PEMBUATAN SEDIAAN HAPUS DARAH TEPI

CARA PEMBUATAN HAPUSAN DARAH TEPI

1. Wedge spread film hapusan manual diatas gelas obyek

Gelas obyek harus bersih dan bebas minyak

Spreader untuk membuat hapusan ukurannya lebih sempit dibandingkan ukuran slide

Teteskan satu tetes darah didekat ujung slide

Letakkan spreader dgn sudut 25-30 di depan tetesan darah

Dorong spreader kebelakng kemudian hapuskan ke depan dengan halus dan cepat sehngga terbentuk hapusan tipis menyebar di atas gelas obyek

Keringkan di udara kemudian difiksasi dgn metanol absolut selama 10-20 menit kemudian diwarnai

Bain, BJ.Blood Cells: apractical guide.4th ed.London.Blackwell Publishing.2006.

2. Hapusan otomatis Hapusan cara Wedge dapat dilakukan dengan spreader mekanik

yang diintegrasikan dalam mesin pewarnaan atau automated full blood counter

3. Hapusan dari darah dgn Ht tinggi Bila Ht>60%, Hb>20g/dL sulit untuk membuat sediaan

hapus yang baik sehingga untuk pembuatan sediaan campurkan setetes darah dengan setetes saline fisiologis atau plasma darah gol AB untuk menurunkan viskositas sehingga dapat dibuat sediaan hapus yang baik

4. Buffy coat film Digunakan untuk mengkonsentrasikan sel yang berinti (misalnya

pada jumlah lekosit yang rendah). Darah dengan antikoagulan disentrifugasi kemudian diambil buffy coatnya (setetes) dan dicampur dgn setetes plasma EDTA autolog dan dilakukan hapusan seperti biasa

PEMBUATAN SEDIAAN DARAH HAPUS


Sediaan yang baik


PEWARNAAN SEDIAAN HAPUS DARAH TEPI

PRINSIP PEWARNAAN Prinsip pewarnaan Romanowsky:

1. Basic dye atau cationic dye (spt Azure B) biru atau biru violet mewarnai asam nukleat (berikatan dgn phosphat dari DNA dan RNA), nukleoprotein, granula basofil, dan berikatan secara lemah dgn granula netrofil

2. Acidic dye atau anionic dye (seperti eosin) merah atau orange hemoglobin, granula eosinofil, dan juga berikatan dgn protein inti kationik (mewarnai inti)

REAGEN: 1. Metanol absolut untuk fiksasi 2. Pewarnaan Romanowsky :

MGG (May Grunwald Giemsa) Wright Wright Giemsa

3. Bufer fosfat (pH 6,4) Bain, BJ.Blood Cells: apractical guide.4th ed.London.Blackwell Publishing.2006.

CARA PERWARNAAN

1. Dilakukan fiksasi dgn metanol absolut selama 10 menit

2. Teteskan wright diatas hapusan sehingga seluruh hapusan tertutup merata minimum 1 menit

3. Teteskan buffer phosphat dlm jumlah yang sama pada sediaan dan diamkan selama 4-6 menit

4. Dicuci dgn air mengalir untuk menghilangkan sisa zat warna dan bersihkan bagian belakang slide

5. Keringkan di udara

PEWARNAAN SEDIAAN HAPUS DARAH TEPI

1. Bain, BJ.Blood Cells: apractical guide.4th ed.London.Blackwell Publishing.2006.

2. Shafer, JA. Preparation of blood film examination.In: Martin, AS, Steininger, CL, Koepke, JA editors. Clinical haematology: Principles, Procedure, Correlations. 2nd ed.

Philadelphia.Lippincott.1998.p.20-33

MENILAI SEDIAAN HAPUS DARAH TEPI

Cek label pd slide (identitas pasien dan tanggal)

Menilai sediaan secara makroskopis

Menilai tepi, ekor, dan keseluruhan hapusan dgn perbesaran 100X (10X obyektif), dinilai apakah penyebaran sel-sel darah cukup merata, dapat dilihat jumlah lekosit dan kelompok trombosit

Menilai eritrosit, lekosit, dan platelet dgn perbesaran 400X (40X obyektif)

Bila ada keadaan khusus perbesaran 1000X (100X obyektif) dgn menggunakan minyak emersi

MENILAI SEDIAAN HAPUS DARAH TEPI

Sediaan hapus darah vena dengan antikoagulan menunjukkan distribusi platelet merata


Wirawan, R. Pemeriksaan laboratorium hematologi sederhana. Edisi kedua. Jakarta. Balai Penerbit FKUI.1996. hal:35

Sediaan darah vena tanpa antikoagulan

Agregasi platelet Bain, BJ.Blood Cells: apractical guide.4th ed.London.Blackwell Publishing.2006.

Sediaan hapus darah kapiler tanpa antikoagulan

Agregasi trombosit



KARAKTERISTIK WARNA DARI BERBAGAI KOMPONEN SEL PADA PEWARNAAN ROMANOWSKY

EVALUASI MORFOLOGI SEL DARAH PD SHDT

ERITROSIT

Dievaluasi distribusi, ukuran (size), shape (bentuk), konsentrasi Hb (staining), dan inklusi

Distribusi:

o Terdapat bagian yang tipis sel terpisah satu dgn lainnya dan tidak ada overlapping di daerah ini dilakukan penilaian eritrosit. Bagian tipis tersebut 1/3 dari panjang hapusan

o Pada bagian tepi dan ujung hapusan distribusi ireguler disertai bentuk artifaktual dan distorsi ukuran serta warna

o Jgn dilakukan penilaian di bagian yg saling menumpuk atau jarang-jarang

o Distribusi abnormal :

Rouleaux eritrosit tidak terpisah satu dgn lainnya, tampak tumpukan panjang atau pendek menyerupai koin. Rouleaux terbentuk karena permukaan bikonkaf eritrosit beraposisi. Formasi ini bisa terbentuk pada hiperproteinemia dan mieloma multipel

Aglutinasi terjadi bila terdapat antibodi eritrosit sehingga terjadi aglutinasi

Miwa, S. Atlas of blood cell.Tokyo. Bunkodo Co.Ltd. 1998.

Evaluasi Morfologi eritrosit

Eritrosit normal berbentuk bikonkaf, berdiameter 7-8 m, dan terdapat bagian yang pucat di tengah (central pallor)

Central pallor kurang lebih 1/3 dari eritrosit Evaluasi morfologi eritrosit meliputi size (ukuran), shape(bentuk),

dan staining Ukuran: Dinilai apakah ukurannya normositik, makrositik, atau mikrositik Ukuran eritrosit kurang lebih sebesar inti limfosit kecil sehingga

untuk menilai ukuran dapat diperbandingkan ukuran eritrosit dgn ukuran inti limfosit kecil

Bentuk: Dinilai apakah terdapat bermacam-macam bentuk (poikilositosis) Staining: Normokrom/hipokrom/polikrom Normokrom maka central pallor 1/3 eritrosit, hipokrom maka

CP>1/3, bila polikromasi tidak tdpt CP

Bain, BJ.Blood Cells: apractical guide.4th ed.London.Blackwell Publishing.2006 Miwa, S. Atlas of blood cell.Tokyo. Bunkodo Co.Ltd. 1998.

Evaluasi Morfologi eritrosit

Badan Inklusi:

Dilaporkan ada tidaknya badan inklusi seperti basophilic stippling, Howell-Jolly bodies, cincin Cabot, Nucleated RBC atau eritrosit berinti, atau parasit (seperti Plasmodium spp)

Central pallor

Eritrosit normal



Mikrositik hipokrom

CP > 1/3

Basophilic stippling Howell Jolly bodies

Papanheimer

Heinz bodies

Badan Inklusi

EVALUASI LEKOSIT

Dinilai kesan jumlah, hitung jenis, dan morfologi

Jumlah

Dinilai apakah jumlah normal/meningkat/atau menurun

Kesan jumlah normal lekosit berkisar 1 lekosit/500 eritrosit hal ini kurang praktis shg pengalaman memudahkan untuk memperkirakan jumlah lekosit

Morfologi

1. Kriteria untuk identifikasi lekosit :

Ukuran sel

Ratio inti-sitoplasma

Ratio tinggi : Inti besar, sitoplasma sedikit

Ratio rendah : inti lebih kecil dibandingkan volume sitoplasma

Karakteristik sitoplasma

Warna sitoplasma

Ada tidaknya granula

Warna dan ukuran granula

Karakteristik inti

Bentuk Kromatin

Warna Ada tidaknya nukleoli Lawrence, LW. The phagocytic leucocytes: morphology, kinetics, and function. In:Martin, EA, Steineger, CA, Koepke, JA editors. Clinical hematology: Principles,

Procedures, Correlations.Philadelphia. Lippincott. 1998.p:303-316

EVALUASI LEKOSIT

2. Klasifikasi lekosit: 1. Granulosit (neutrofil, eosinofil, basofil) dan nongranulosit

(limfosit dan monosit)

2. PMN (Netrofil, eosinofil, basofil) dan MN (limfosit dan monosit)

3. Fagosit (Netrofil, eosinofil, basofil, monosit) dan imunosit (limfosit)

Urutan diff coun lekosit: basofil, eosinofil, batang, segmen, limfosit, monosit

Lawrence, LW. The phagocytic leucocytes: morphology, kinetics, and function. In:Martin, EA, Steineger, CA, Koepke, JA editors. Clinical hematology: Principles,

Procedures, Correlations.Philadelphia. Lippincott. 1998.p:303-316

Netrofil segmen Netrofil-batang

Eosinofil Ukuran 10-15 m Sitoplasma mengandung granula besar, berwarna merah, homogen,granula tidak menutupi inti Kromatin inti padat Inti berlobus dua 1-3 % di darah tepi Meningkat : infestasi parasit (eosinofilia berat > 50%), alergi (eosinofilia ringan 5-15%),asma brokiale, infiltrat paru, hay fever, penyakit kulit, penyembuhan dari infeksi, HES, CML, Myelomonositik leukemia dg eosi nofilia, setelah radiasi. Kadang juga ditemukan pd pasi en AIDS Terdapat variasi diurnal (rendah pd pagi hari dan tinggi pada malam hari)

Basofil

Basofil Ukuran 10-15 m sitoplasmanya mengandung granula besar, warna biru kehitaman, heterogen (ukuran:0,2-1 m), gra nula menutupi inti Granula basofil mengsekresi histamin, heparin bila terstimu lasi eksositosis 0-1% di darah tepi Meningkat: CML fase akselerasi dan blast, myksedem, kolitis ulseratif, sinusitis kronik, smallpox, chicken pox, dan setelah injeksi dg protein asing

Netrofil-batang

Netrofil Batang Diameter berkisar 15 m Sitoplasma mengandung granula halus, warna ungu muda Inti : kromatin inti padat, kasar, menggumpal, berwar na merah keunguan, inti membentuk lekukan > jarah pinggir inti ke garis tengah, membentuk tapal kuda, huruf U atau C, 1-5% di darah tepi (digsum)/5-10% (shiro miwa) Bila meningkat shift to the left respon pejamu

Netrofil segmen

Netrofil Segmen ukuran berkisar 10-15 m sitoplasma merah muda mengandung granula kecil, ha lus, warna merah muda Inti: warna ungu tua,terdiri dari bbrp lobus (3-5)di sertai dgn filamen menghubg antara lobus satu dg lainnya, kromatin inti padat, 50-70% didarah tepi Netrofilia: infeksi akut, proses inflamasi, intoksikasi, hemoragik akut, hemolisis akut, olahraga berlebihan, neoplasma dan myeloproliferatif Neutropenia : infeksi, syok anafilaktik, hemodialisis, obat, zat kimia, atau penggunaan alkohol berlebihan

Limfosit kecil Limfosit besar

LIMFOSIT Limfosit kecil 7-10 m, inti limfosit kecil seban ding dgn ukuran eritrosit normal, sitoplasma lebih sedikit Limfosit besar 9-15 m, sitoplasma lebih banyak Inti: kromatin inti padat, dibandingkan dgn limfo sit kecil maka kromatin inti l. besar kurang padat, warna biru tua Sitoplasma : warna biru, pd l. kecil sitoplasma tdk bergranula, L. besar terkadang ditemukan granula azurophilik N : 20-40% Limfositosis : infeksi virus akut, TBC, parotitis (Mumps), HCL, Limfosit kecil matur : CLL, smudge cell CLL

Monosit

MONOSIT: Ukuran berkisar : 12-20 m,tepi iregular Inti:iregular atau

Eosinofil Basofil

Limfosit kecil Limfosit besar

Eosinofil Monosit

Diff Count:

1. Basofil 0-1 %

2. Eosinofil 1-3%

3. Netrofil Segmen 40-60%

4. Limfosit 20-40%

5. Monosit 2-8%

EVALUASI TROMBOSIT

Dinilai jumlah dan morfologi trombosit

Jumlah normal trombosit : 1 trombosit dalam 15-20 eritrosit (4-8 trombosit dalam 100 eritrosit)

Morfologi dinilai apakah morfologi normal atau tidak

Ukuran normal berkisar 1-4 um

Terdapat 2 bagian yaitu kromomer yang bergranula di tengah, dan hialomer yang mengelilingi kromomer

Bentuk abnormal antara lain giant trombosit, clumping

DIAGNOSIS SEL DARAH TEPI PATOLOGIK

Lichtman,MA.Beutler E. Kaushansky K. editors. Williams Hematology.6th ed. New York. McGrawHill-Medical.2007

Anemia makrositik

Jumlah retikulosit

RPI < 2 RPI > 2

Serum B12 dan Folat

Menurun Normal/

Defisiensi vit B12 atau Def. Folat

lekosit dan trombosit

Menurun N/ sedikit

Sumsum Tulang: Anemia aplastik Myelodisplasia

Inhibisi obat Pemeriksaan Fs.Hati

Abnormal: Peny.Hati Alkoholism

Normal Pem. endokrin

Mikrosferosit/Schistosit

Ada Tidak Ada

Hemolisis

Intravaskuler Ekstravaskuler

Perdarahan

Pembuatan Sediaan Hapus Darah Tepi-revisi

Documents

Transcript of Pembuatan Sediaan Hapus Darah Tepi-revisi