VII. PembahasanPemurnian protein adalah suatu rangkaian proses isolasi jenis tunggal dari dari satu campuran kompleks.Pemurnian ini bertujuan untuk mengetahui lebih jauh mengenai struktur, sifat-sifat kimia maupun fisika suatu senyawa yang terdapat di bahan alam,sehingga diperoleh senyawa protein dalam keadaan murni.(Mayes, P.A et al,1990)Pada praktikum ini,dilakukan pemurnian protein laktat dehidrogenase (LDH) dari ayam dengan cara pengendapan protein oleh ammonium sulfat.Proses pengendapan protein dapat dilakukan dengan menggunakan amoniumsulfat berkonsentrasi tinggi atau larutan jenuhnya (salting out). Salting outmerupakan metode yang digunakan untuk memisahkan protein yang didasarkan pada prinsip bahwa protein kurang terlarut ketika berada pada daerah yang konsentrasi kadar garamnya tinggi.Kelarutan protein akan berkurang bila kedalam larutan protein ditambahkan garam- garam anorganik. Pengendapan terus terjadi karena kemampuan ion garam untuk menghidrasi, sehingga terjadi kompetisi antara garam anorganik dengan molekul protein untuk mengikat air.Hal ini terjadi karena garam anorganik mempunyai kemampuan untuk mengikat air maka jumlah air yang tersedia untuk molekul protein akan berkurang.(Bintang,2010)Laktat dehidrogenase (LDH) merupakan enzim intraseluler yang terdapat pada hampir semua sel yang bermetabolisme, dengan konsentrasi tinggi yang dapat ditemukan pada jantung, otot rangka, hati, ginjal, otak, dan sel darah merah.LDH juga dapat mengkatalisis perubahan piruvat menjadi laktat.(Girindra,1986)Langkah pertama yang dilakukan adalah penyiapan jaringan, dada ayam yang akan diambil LDHnya di buang jaringan ikat dengan lemaknya,yang digunakan hanya dagingnya karena LDH muncul atau dapat diambil jika ada kerusakan pada jaringan dan dapat disimpulkan bahwa adanya peningkatan LDH merupakan pertanda telah terjadinya kerusakan jaringan.(Girindra,1986)Kemudian daging ayam tersebut di gerus menggunakan blender dengan campuran dapar pengekstrasi yang telah dibekukan.Tujuan penggerusan ini untuk memperoleh protein dari organ jantung tersebut maka protoplasma akan keluar dan akan diperoleh protein,sedangkan tujuan dari penambahan dapar pengekstrasi yang telah dibekukan adalah agar protein tidak terjadi denaturasi,karena pada saat di blender suhu didalam menjadi panas jadi harus ditambahkan dapar dengan suhu dingin sehingga dapat menstabilkan suhu pada saat penggerusan dan juga bertujuan agar dapat menginaktivasi enzim yang bekerja pada sampel, LDH (protein dari ayam) mempunyai suhu aktif >800C.jika pada suhu aktif LDH akan tercerna oleh lisosom maka LDHnya tidak bisa diambil.(Girindra,1986)Larutan dapar pengekstraksi tersebut terdiri dari Tris-HCl,2-mercaptoethanol,phenylmetylsulfonyl florida (PMSF) dan ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA).Tris-HCL merupakan senyawa organik dengan rumus (HOCH2) 3CNH2.Tris secara luas digunakan dalam biokimia dan biologi molekuler. Dalam biokimia, Tris HCL banyak digunakan sebagai komponen larutan buffer.Tris HCL juga merupakan bahan kimia dengan sifat dasar, yang memiliki pKa 8,1. Hal ini dapat digunakan untuk penyangga dan solusi dari perubahan pH yang drastis, menjaga mereka di kisaran pH 7,0-9,0.sehingga dapat menjaga pHnya agar dapat bekerja dengan baik.Lalu terdiri dari EDTA yang berfungsi sebagai larutan buffer dan sebagai pengkelat yang dapat mengikat ikatan kation sehingga dapat menurunkan tegangan dan menghasilkan ion untuk menghantarkan arus, umumnya mengikat ion logam jika terdapat pada sample, sampel yang digunakan berupa dada ayam yang umumnya bnyak ion Ca2+ karena merupakan jaringan yang berotot,lalu terdiri dari 2-Mercaptoethanol yang berfungsi menghilangkan senyawa polifenol yang terkandung dalam daging tersebut, dan mendetarurasi protein yang mengkontaminasi LDH yang akan dimurnikan. (Hamid,2001).Setelah itu,campuran daging ayam dan dapar pengekstraksi yang telah homogen dimasukkan ke dalam 4 tabung sentrifugasi dan disentrifugasi selama 20 menit dengan kecepatan pengadukan 15000 rpm.Setelah disentrifugasi terjadi pemisahan,pada bagian atas berupa supernatant (cairan) yang tidak berwarna sedangkan pada bagian bawah berupa pellet (endapan) yang berwarna peach.Hal ini sesuai dengan literatur (Hendra,1989).Prinsip sentrifugasi didasarkan pada pemisahan molekular dari sel atau organel subselular. Pemisahan tersebut berdasarkan konsep bahwa partikel yang tersuspensi di sebuah wadah akan mengendap (bersedimentasi) ke dasar wadah karena adanya gaya gravitasi.Sehingga laju pengendapan suatu partikel yang tersuspensi tersebut dapat diatur dengan meningkatkan atau menurunkan pengaruh gravitasional terhadap partikel.Pengaturan laju pengendapan tersebut dapat dilakukan dengan cara menempatkan wadah yang berisi suspensi partikel kemesin sentrifugasi tepatnya pada bagian rotor yang kemudian akan berputar dengan kecepatan tertentu.Hal tersebut tergantung pada ukuran dan bobot jenis,Hasil sentrifugasi terbagi menjadi dua, yaitu supernatan dan pellet. Supernatan adalah substansi hasil sentrifugasi yang memiliki bobot jenis yang lebih rendah. Posisi dari substansi ini berada pada lapisan atas dan warnanya lebih jernih. Sementara pelet adalah substansi hasil sentrifugasi yang memiliki bobot jenis yang lebih tinggi. Posisi dari substansi ini berada pada lapisan bawah dan warnanya lebih keruh (Hendra,1989).Pada sentrifugasi ini digunakan kecepatan pengadukan 15.000 rpm dengan waktu 20 menit,hal ini menunjukan semakin besar kecepatan pengadukan semakin banyak pula endapan (pellet) yang dihasilkan dan semakin lama juga waktu yang dibutuhkan untuk memisahkan campuran antara supernatant dan pellet.Dapat disimpulkan bahwa kecepatan pengadukan (rpm) sebanding dengan waktu yang dibutuhkan.( Hendra,1989).Lalu langkah selanjutnya adalah filtrasi,supernatant disaring menggunakan kain kasa dan filtratnya di peras hingga tidak ada supernatant yang terkandung di dalamnya.Supernatant di ambil karena di dalam supernatan tersebut mengandung protein. Supernatan yang diambil kemudian ditambahkan dengan Amonium Sulfat/ (NH4)2SO4 sedikit demi sedikit sebanyak 5,07 gram dan di aduk secara perlahan.Pengerjaan tersebut dilakukan di dalam gelas kimia yang berisi es batu.Tujuan penambahan ammonium sulfat adalah untuk mengendapkan protein,ion garam tersebut mengikat air dan akan borkempetisi dengan molekul protein dalam mengkit air sehingga kelarutan protein akan berkurang dan protein akan mengendap.(Hamid,2001)Dalam pengerjaannya di aduk secara perlahan agar tidak terjadi denaturasi pada protein dan dilakukan di dalam gelas kimia yang berisi es batu yang bertujuan agar dengan suhu yang rendah akan memudahkan proses pengendapan dan mengakibatkan turunnya daya larut protein sehingga protein mudah berikatan dengan ammonium sulfat.(Bintang,2010)Kemudian langkah selanjutnya adalah disentrifugasi kembali,pada sentrifugasi kedua ini yang diambil adalah pelletnya karena pellet tersebut mengandung protein yang dihasilkan dari protein yang berikatan dengan ammonium sulfat lalu diresuspensi yaitu disuspensikan kembali dengan penambahan dapar.Tetapi protein tersebut masih belum murni,masih ada ammonium sulfat yang tersisa sehingga harus di lakukan kromatografi sebagai tahap pemurnian selanjutnya agar ammonium sulfat dapat dipisahkan dengan protein.(Bintang,2010)Kromatografi merupakan suatu teknik pemisahan molekul berdasarkan perbedaan pola pergerakan antara fase gerak dan fase diam untuk memisahkan komponen (berupa molekul) yang berada pada larutan.Kromatografi yang digunakan pada praktikum ini adalah kromatografi filtrasi gel.Prinsip dari kromatografi filtrasi gel adalah pemisahan berdasarkan perbedaan ukuran, molekul yang mempunyai ukuran besar yang tidak dapat masuk ke daerah gel yang merupakan rongga-rongga gel sehingga akan keluar dari kolom,sedangkan molekul yang mempunyai ukuran kecil akan terjerap pada fase diam yang berupa rongga/butiran berpori.(Poedjiadi,2005)Kemudian digunakan salting kolom,kolom kromatografi yang digunakan adalah sephadex G-150 dengan eluen buffer Tris-HCl pH 7,2. Sephadex terbuat dari protein berhidrat tinggi dengan pori-pori yang sangat halus. Kolom Sephadex G-150 yang terjadi dielusi dengan buffer pengembangnya dengan kecepatan tetesan 6 menit per tetes.(Williamson,1992)Lalu kolom tersebut digunting bagian bawahnya agar dapar keluar,setelah dapar keluar seluruhnya kemudian ditambahkan sample berupa pellet yang telah diresuspensi.Diperoleh sample (protein) adalah 4,1 mL.Sebenarnya protein yang di hasilkan masih belum murni,dan harus di lakukan dengan tahap selanjutnya yaitu dengan cibacron blue.Namun pengerjaannya tidak dilakukan karena di dalam laboratorium tidak memiliki cibacron blue,sehingga hanya dilakukan sampai tahap kromatografi filtrasi gel dan didapatkan protein yang belum murni seluruhnya.

DAPUS PEMBAHASAN Mayes, P.A., Granner, D.K., Rodwell, V.W., dan Martin, D.W., 1990, Biokimia Harper Edisi 20, Penerbit Buku Kedokteran. Jakarta Bintang, Maria.2010. Biokimia Teknik Penelitian. Jakarta: Erlangga Girindra, Aisjah. 1986. BIOKIMIA I. Jakarta: Gramedia Hamid,Abdul,2001.Biokimia Metabolisme Biomolekul.Jakarta:Penerbit Alfabeta Poedjiadi, A., 2005,Dasar-Dasar Biokimia,UI Press, Jakarta Hendra Adijuwana. 1989.Teknik pemisahan Dalam Analisis Biologis. Bogor: IPB Press Williamson,K.L & L.F.Fieser. (1992). Organic Experiment 7th Edition. D C Health ang Company. United States of America.