SOAL :

1. Pengikatan biomolekul terhadap substrat padat pada berbagai deteksi dapat melalui

berbagai jalur diantaranya:

1. Pengikatan covalent antara polysterene microplate pada ELISA/poly-l-lysin

glass slide pada imunohistokimia dengan antibodi/antigen yang diuji.

2. Direct ionic binding

3. Perantaraan avidin biotin complex

Jelaskan perbedaan ketiga jalur diatas dengan menitikberatkan pada skema interaksi yang

terjadi, kelebihan, dan kelemahan masing-masing!

2. Bagaimana pelabelan antibody dan enzim dapat dilakukan? Jelaskan jawaban

saudara serta berikan contoh teknik pelabelan antibody dan enzim yang saudara

ketahui.

JAWABAN :

1. a) Pengikatan covalent antara polysterene microplate pada ELISA/poly-l-lysin glass slide

pada imunohistokimia dengan antibodi/antigen yang diuji.

Imunohistokimia merupakan metode visualisasi/pewarnaan sel dan jaringan dalam

penelitian yang digunakan dengan dasar ikatan reaksi antigen – antibody. Salah satu

metodenya ialah ELISA. Antibodi atau antigen pada ELISA agar tidak bergerak atau

berpindah maka diletakkan pada bahan padat. Bahan padat yang dipakai dalam ELISA

terbuat dari selulosa, dextran cross linked, poliacrilamide, polistiren dan polipropilen.

Bahan padat tersebut dapat berupa butiran, lempeng(microplate) atau tabung. Microplate

yang sering digunakan yaitu yang terbuat dari polysterene atau poliolefin. Microplate dari

bahan tersebut mampu mengikat biomolekul seperti antigen atau antibody. Interaksi antara

antigen atau antibodi membentuk ikatan kovalen mengikat dengan bahan padat seperti

adanya protein target  yang telah berikatan dengan microplate akan membuat ikatan

dengan antibodi spesifik yang ditambahakan ke dalam microplate. Selanjutnya kompleks

protein yang telah berikatan dengan antibodi spesifiknya tersebut akan dapat berikatan

dengan antibodi lain yang telah dilabel (antibodi sekunder). setelah antibodi sekunder

sudah terikat pada bahan padat maka untuk menghasilkan perubahan warna perlu 

ditambahkan subsrat

Kelebihan : dapat digunakan untuk banyak sampel

Kekurangan : waktu yang dibutuhkan lama

b)        Direct ionic binding

Ikatan ion didefinisikan sebagai kekuatan elektro statik antara gugusan bermuatan positif

dan terjadi didalam dan diantara biomolekul. Sebagaian besar gugusan fungsional dari

biomolekul merupakan asam atau basa Bronsted-Lowry dan terionisasi pada pH fisiologis.

Proses ikatan ionik langsung  terjadi ketika inti atom yang bermuatan positif secara

dominan melebihi muatan positif inti atom lainnya, sehingga secara efektif menyebabkan

satu atom mentransfer elektronnya ke atom yang lain. Hal ini menyebabkan satu atom

bermuatan positif dan yang lainnya bermuatan negatif secara keseluruhan. Ikatan ionik

terjadi antara gugusan bermuatan positif dan negatif dalam molekul protein yang sangat

berpengaruh dalam menentukan bentuk dan fungsi. Interaksi biologis terjadi antara

makromolekul( protein: antigen/antibodi) dengan enzim.

Kelebihan : bagus untuk senyawa yang cenderung berikatan ion

Kekurangan : hasil dipengaruhi konsentrasi ion larutan substrat dan pH

c)        Avidin-biotin kompleks

Biotin, juga dikenal sebagai vitamin H, adalah molekul kecil (BM 244,3) yang terdapat

dalam jumlah kecil dalam semua sel mahkluk hidup dan sangat penting untuk sejumlah

proses biologis. Sisi rantai asam valeric dari molekul biotin dapat diderivatisasi untuk

menggabungkan pada berbagai kelompok reaktif  yang digunakan untuk mengikatkan

biotin dengan molekul lain. Dalam konteks Imunohistokimia, biotin adalah konjugasi

antibodi atau enzim yang digunakan untuk mendeteksi antigen target.

Avidin memiliki Afinitas yang tinggi untuk membentuk komplek  avidin biotin. Yang

memungkinkan biotin yang mengandung molekul dalam campuran kompleks untuk secara

khusus terikat untuk avidin. Avidin adalah glikoprotein ditemukan dalam putih telur dan

jaringan burung, reptil dan amfibi. Ini berisi empat subunit identik. Setiap subunit terdiri

dari 128 asam amino dan mengikat satu molekul biotin, dengan demikian, total empat

molekul biotin dapat mengikat molekul avidin tunggal. Luasnya glikosilasi pada avidin

sangat tinggi; karbohidrat mencapai sekitar 10% dari massa total tetramer tersebut. Avidin

memiliki titik isoelektrik dasar (PI) 10 sampai 10,5 dan stabil melalui berbagai pH dan

suhu. Modifikasi kimia yang luas memiliki sedikit efek pada aktivitas avidin, sehingga

sangat berguna untuk pemurnian protein. Namun, karena kandungan karbohidrat dan pi

dasar, avidin akan cenderung  membentuk ikatan nonspesifik.

Kompleks avidin-biotin dikenal sebagai interaksi antara protein dan ligan secara non

kovalen yang  terkuat. Pembentukan ikatan antara biotin dan avidin sangat cepat, dan

apabila telah terbentuk tidak akan terpengaruh oleh pH ekstrem, suhu, pelarut organik dan

agen denaturing lainnya. Avidin memiliki kemampuan mendeteksi atau memurnikan

protein berlabel biotin atau molekul lain sangat berguna untuk sejumlah aplikasi biomedis.

proses terbentuknya avidin dan biotin ialah Antibodi primer diinkubasi dengan sampel

jaringan untuk memungkinkan mengikat antigen target. Lalu diinkubasi selama 1  jam

pada suhu ruang atau selama 24 jam pada suhu 4o C. Lalu Sebuah antibodi sekunder

terbiotinilasi, dengan spesifisitas terhadap antibodi primer, diinkubasi dengan sampel

jaringan untuk memungkinkan mengikat antibodi primer. Lalu di inkubasi selama 1 jam

pada suhu kamr. Sebuah enzim terbiotinilasi (HRP atau AP)  prainkubasi dengan avidin

bebas untuk membentuk avidin-biotin-enzim kompleks. Biasanya, avidin dan enzim

terbiotinilasi dicampur bersama dalam rasio tertentu untuk mencegah kejenuhan avidin dan

diinkubasi selama 15 menit pada suhu kamar untuk membentuk kompleks.

Sebuah alikuot larutan ini kemudian ditambahkan ke dalam sampel jaringan, dan seluruh

situs biotin-binding di avidin mengikat untuk biotinylated antibodi yang sudah terikat

untuk jaringan . Hasilnya adalah terbentuknya enzim dengan konsentrasi yang besar

(molekul enzim 3-1 molekul avidin) di lokasi antigen dan karena itu  terjadi peningkatan

intensitas sinyal dan sensitivitas ketika ditambahkan  penambahan substrat. Perubahan

warna akan terjadi apabila ditambahkan streptavidin sebagai substrat.

Kelebihan : Sangat sensitive karena tempat ikatan substrat lebih banyak dan afininitas

kompleks avidin-biotin tinggi maka lebih stabil. Ikatan yang terbentuk sangat kuat tidak

terpengaruh oleh pH ekstrem, temperatur, pelarut organik dan agen denaturing yang lain.

Kekurangan : Membutuhkan waktu yang cukup lama, avidin dapat menempel

pada bahan padat sehingga apabila ditambahkan substart akan terjadi perubahan

warna.

Bagaimana Pelabelan antibodi dan enzim dilakukan? Jelaskan jawaban saudara serta

berikan contoh pelabelan antibodi dan enzim yang diketahui

2. Pelabelan Antibody dan Enzim

Struktur molekul antibodi pada daerah konstan akan memungkinkan untuk berikatan secara

kovalen dengan berbagai jenis label. Ikatan ini tidak akan mempengaruhi ikatan antigen-

antibodi yang terjadi pada daerah variabel. Pelabelan antibodi pada umumnya

menggunakan  enzim( enzim imunoasay). Enzyme immunoassay(EIA) adalah tes untuk

mendeteksi antigen atau antibodi dengan penambahan enzim yang dapat mengkatalisa

substrat sehingga terjadi perubahan warna. Metode  enzim imunoassy menggunakan sifat

katisa dari enzim untuk mendeteksi dan menghitung jumlah reaksi imunologi. Enzim  dan

substratnya berfungsi mendeteksi jumlah antigen atau antibodi yang terdapat  pada sampel.

Enzim yang berlabel yang sering digunakan ialah alkaline phosphatase, Glocose-6-

phosphatase dehydrogenase dan β-galactosidase.

Pelabelan antigen dengan enzim menggunakan prinsip konjugasi untuk menghasilkan

ikatan kovalen. Pelabelan antibody menghasilkan deteksi direct dan indirect dari antigen.

Pada deteksi direct, label berikatan kovalen dengan antibodi primer. Sedangkan pada

deteksi indirect label berikatan kovalen dengan antibodi sekunder. Bahan kimia yang

dipakai untuk label antibody ada empat yaitu NHS ester (berupa tinta fluorosense),  reagen

heterobifunctional (berupa molekul protein seperti HRP, fosfatase alkali, atau

phycoerythrin) , carbodiimides dan sodium periodate

Langkah dari enzim imunoassay ialah  sebuah plat plastik dilapisi dengan antigen . Antigen

bereaksi dengan antibodi pada serum sampel. plat kemudian diinkubasi dengan sebuah

gabungan enzim-antibodi berlabel. Jika terdapat antibodi,gabungan tersebut bereaksi

dengan kompleks antigen-antibodi pada  plate.Aktivitas enzim diukur dengan

spektrofotometer setelah penambahan substratkromogenik spesifik. Misalnya, peroksidase

mengkatalisa substratnya,o-dianisidine,menyebabkan perubahan warna. Pada beberapa kit ,

tes EIA dapat dibaca secara langsung(visual).

Enzim imunoasay terbagi menjadi dua jenis yaitu heterogen dan homogen. Enzim

imunoasay yang heterogen aktifitas label enzim tidak dipengaruhi oleh reaksi antigen dan

antibodi dan diperlukan pemisahan fraksi terikat dan tidak terikat  hal ini dikarenakan Pada

sistim heterogen, sifat label sebelum dan sesudah reaksi tetap sama, jadi perlu pemisahan

komponen reaktan yang berlebih dengan kompleks Ag-Ab yang terbentuk, sebab kuantitas

kompleks ini yang akan dihitung.Sedangkan pada enzim imunoasay homogen aktivitas

enzim sebagai label bergantung pada reaksi antigen-antibodi sehingga tidak  diperlukan

pemisahan karena sifat label sebelum dan sesudah reaksi sangat berbeda, jadi tidak perlu

lagi pemisahan komponen reaktan secara fisis.

1.    Teknik ELISA kompetitif

Teknik ELISA kompetitif yang menggunakan konjugat antigen-enzim atau konjugat 

antibodi-enzim.

2.    Teknik ELISA nonkompetitif / ELISA Sandwich

Teknik ELISA nonkompetitif yaitu yang menggunakan dua antibodi (primer dan

sekunder). Pada teknik ELISA nonkompetitif, antibodi kedua  (sekunder) akan

dikonjugasikan dengan enzim yang berfungsi sebagai signal.  Teknik ELISA

nonkompetitif ini seringkali disebut sebagai teknik ELISA  sandwich.

3.    ELISA Direct

Teknik ELISA ini merupakan  teknik ELISA yang paling sederhana. Teknik ini seringkali

digunakan untuk  mendeteksi dan mengukur konsentrasi  antigen pada sampel. ELISA

direct  menggunakan suatu antibodi spesifik  (monoklonal)  untuk  mendeteksi keberadaan

antigen yang diinginkan pada sampel yang diuji.

 4.    ELISA Indirect

Teknik ELISA indirect ini pada dasarnya juga merupakan teknik ELISA  yang paling

sederhana, hanya saja dalam teknik ELISA indirect yang dideteksi  dan diukur

konsentrasinya merupakan antibodi. ELISA indirect menggunakan suatu antigen spesifik

(monoklonal) serta antibodi sekunder spesifik tertaut enzim signal untuk mendeteksi

keberadaan antibodi yang diinginkan pada sampel yang diuji.

Contoh  dari pelabelan antibodi menggunakan enzim:

ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay)

Elisa adalah tehnik imunoassay yang menggunakan enzim sebagai label untuk amplifikasi

dan visualisasi reaksi primer ikatan antigen-antibodi. Pelabelan dapat dilakukan baik pada

antigen atau antibodi. Antibodi yang digunakan dalam ELISA dapat berupa antibodi

poliklonal atau antibodimonoklonal. ELISA pada umumnya menggunakan solid phase dan

untuk reaksi kompetitif.

IEMA (immunoenzymetric assay)

Berdasarkan teknik sandwich untuk reaksi non-kompetitif.

Tujuan dari tehnik ini mendeteksi antibodi dalam serum (berbeda dengan model

sebelumnya). Antigen yang digunakan biasanya berlebih dan terikat pada matrix tertentu,

serum yang akan dideteksi jenis antibodinya (antibodi primer) biasanya merupakan

antibodi poliklonal direaksikan dengan antigen tersebut. Reaksi ini memerlukan suatu anti-

antibodi (antibodi sekunder) terhadap antibodi yang akan dideteksi tadi. Antibodi sekunder

inilah yang biasanya dilabel dan dapat bereaksi dengan bagian Fc dari molekul antibodi

primer, sehingga kandungan antibodi dalam serum dapat ditentukan..

EMIT (enzyme-multiplied immunoassay technique)

Metode tanpa pemisahan dengan menggunakan label enzim terkonjugasi pada hapten

disertai reaksi deteksi menggunakan perubahan substrat membentuk produk reaksi

enzimatik.