PAPER ANALISA KIMIA AIR, MAKANAN & MINUMAN

METODE UJI ANALISIS PROTEIN

Oleh

Kelompok I (Ganjil) :

Ni Wayan Windy Ferina (P07134012001)

Luh Putu Suastari (P07134012009)

Nyoman Gede Ngardiana (P07134012017)

Wahyu Surya Candra Eka Prapti (P07134012025)

I Putu Paramartha Wicaksana Aji (P07134012033)

Luh De Trisna Dewi (P07134012041)

Dwi Karunia Wulandari (P07134012049)

Disampaikan kepada :

Dosen Pengampu Mata Kuliah Analisa Kimia Air, Makanan & Minuman

POLITEKNIK KESEHATAN DENPASAR

DIII JURUSAN ANALIS KESEHATAN

2014

BAB IPENDAHULUAN

1) Latar Belakang

Protein adalah senyawa penting menyusun sel hidup. Senyawa ini tedapat semua jaringan

hidup baik tumbuhan maupun tumbuhan. Fungsi protein sangat beragam  antara lain sebagai

pembangun, pengatur, pertahanan, dan sebagai sumber energi. Dalam bahasa yunani protein

berarti “pengikat satu” dan “yang utama”. Asam amino adalah satu golongan senyawa karbon

yang setidaknya Mengandung satu karboksil (-COOH) dan satu gugusan animo (-NH2). (Addi

Krisbyanto, 2008)

Protein merupakan biopolimer yang bersifat multifungsi yaitu dapat sebagai enzim atau

biokatalis,  sebagai pembawa zat, sebagai bahan penyusun struktural pada sel maupun jaringan

dan organ, serta sebagai antibodi tubuh yang melindungi organisme terhadap organisme lain

yang berasal dari luar tubuh. (Hawab, 2004: 201).

Seperti yang kita ketahui, semua molekul protein mengandung nitrogen gabungan dengan

karbon, hidrogen, dan oksigen. Akan tetapi, beberapa juga mengandung belerang dan fosfor. Bila

protein dididihkan dalam asam atau basa encer dikenal kerja enzim. Enzim spesifik dalam

pencernaan, molekulnya (protein) dihidrolisis menjadi asam amino. Oleh karena itu, protein

serupa dengan pati atau selulosa, dalam arti molekul mereka terdiri dari banyak molekul

sederhana. Molekul sederhana penyusun protein adalah asam amino. (Keenan, 1999: 210).

Protein dapat larut dalam air dan jika dipanaskan dapat membeku. (Abdi, 2001).

Protein bersifat amfoter, yaitu dapat beraksi dengan larutan asam maupun basa. Daya larut

protein berbeda didalam air, asam dan basa sebagian ada yang mudah larut . dan ada pula yang

sukar laut. Apabila protein tidak larut lemak seperti eter atau kloroform. Apabila protein

dipanaskan atau diditambahkan etanol absolut maka protein menggumpul (terkoagulasi). Hal ini

disebabkan etanol menarik mental air yang melengkapi molekul-molekul protein. (Fetien Yarid,

2006).

Protein memiliki molekul besar dengan berat molekul yang bervariasi antara 5000 hingga

jutaan dengan hidrolisis oleh asam atau oleh enzim protein akan menghasilkan asam amino, ada

20 jenis asam amino yang terdapat dalam molekul protein. (Riawan, 1990).

Kadar protein dalam suatau bahan dapat diketahui dengan berbagai metode uji. Ada

berbagai cara untuk dapat mengetahui kandungan protein pada suatu sampel baik secara

kualitatif maupun kuantitatif. Melalui paper ini penulis akan menjelaskan metode-metode uji

protein baik secara kualitatif dan kuantitatif.

Analisis protein secara kualitatif terdiri atas reaksi Xantoprotein, reaksi Hopkins-Cole,

reaksi Millon, reaksi Nitroprusida, dan reaksi Sakaguchi.  Sedangkan analisis protein secara

kuantitatif terdiri dari metode Kjeldahl, metode titrasi formol, metode Lowry, metode

spektrofotometri visible (Biuret), dan metode spektrofotometri UV(Poedjiadi, 2007).

2) Rumusan Masalah

a) Apa saja metode uji protein?

b) Apa prinsip dari masing-masing metode uji protein?

c) Bagaimana cara kerja dari masing-masing metode uji protein ?

3) Tujuan

a) Untuk mengetahui apa saja metode uji protein.

b) Untuk mengetahui apa prinsip dari masing-masing metode uji protein.

c) Untuk mengetahui bagaimana cara kerja dari masing-masing metode uji protein.

4) Manfaat

a) Mengetahui apa saja metode uji protein.

b) Mengetahui apa prinsip dari masing-masing metode uji protein.

c) Mengetahui bagaimana cara kerja dari masing-masing metode uji protein.

BAB IIISI

Adanya protein dapat diidentifikasi dengan menggunakan berbagai macam metode.

Berikut teori beberapa metode analisis kualitatif dan kuantitatif protein.

1. Metode Analisis Protein Secara Kualitatif

Test Biuret

Tujuan :

Merupakan uji umum protein yang membuktikan adanya molekul peptide

Prinsip :

Pada uji biuret ion cu2+ yang di hasilkan dari Cu2SO4 dari pereaksi biuret dalam

suasana basa kan bereaksi dengan polipeptida atau ikatan ikatan peptide yang menyusun

protein membentuk senyawa kompleks berwarna ungu atau violet.

Cara Kerja :

1. Disiapkan tabung reaksi dan diberi label

2. Dimasukkan 2ml sampel ke dalam tabung reaksi

3. Ditambahkan pereaksi NaOH 10% sebanyak 2ml

4. Ditambahkan larutan CuSO4 0.5% sebanyak 3-5 tetes

5. Diamati perubahan dan mencatat hasilnya

Test Xantoprotein

Tujuan :

Membuktikan adanya asam amino tiroson, tripton dan fenilalanin yang terdapat

dalam protein

Prinsip :

Test ini di gunakan untuk membuktikan asam amino yang mengandung cincin

benzene (tirosin, triptofan, fenilalalnin) yang terdapat dalam protein , reaksi uji

xantoprotein di dasarkan di dasarkan pada nitrasi inti benzene yang terikat pada molekul

protein . hasil positif di tandai denga terbentuknya warna jingga.

Cara Kerja :

1. Disiapkan tabung reaksi dan diberi label

2. Memasukkan 2ml sampel ke dalam tabung reaksi

3. Ditambahkan 2ml asam nitrat pekat

4. Dipabaskan pada api hingga mendidih

5. Didinginkan dan ditambah 2ml NaOH 20%

6. Diamati perubahan dan dicatat hasilnya

Test Nynhdrin

Tujuan :

Membuktikan adanya asam amino bebas dan terikat dalam protein.

Prinsip :

Semua asam amino atau peptide yang mengandung senyawa asam amino bebas

akan bereaksi dengan nynhidrin (triketohidridin hidrat ) membentuk senyawa kompleks

Cara Kerja :

1. Disiapkan tabung reaksi dan deberi label

2. Dimasukkan 2 ml sampel yang telah disiapkan

3. Ditambah 5 tetes larutan ninhydrin

4. Dipanaskan dalam air mendidih selama 10 menit, kemudian didinginkan

5. Diamati perubahan yang terjadi dan dicatat hasilnya

Test pengendapan oleh asam kuat

Tujuan :

Mengetahui pengaruh asam organik terhadap protein (presipitasi)

Prinsip :

Protein adalah suatu molekul organik yang tersusun dari asam asam amino

dengan ikatan peptide . Apabila protein berada pada lingkungan yang tidak sesuai pH

yang rendah akibat maka protein akan mengalami denaturasi (perubahan sifat asli

protein) sehingga protein akan mengendap.

Cara Kerja :

1. Disiapkan tabung reaksi dan diberi label

2. Dimasukkan 2ml sampel ke dalam tabung reaksi

3. Ditambahkan 5 tetes asam pikrat

4. Diamati perubahan dan dicatat hasilnya

Test Pengendapan Oleh Alcohol

Tujuan :

Mengetahui pengaruh alcohol terhadap protein

Prinsip :

Protein dapat di endapkan oleh alcohol konsentrasi tinggi, alcohol menurunkan

muatan molekul akibat denaturasi dan fatsoluen yang bersifat ireversibel

Cara Kerja :

1. Disiapkan tabung reaksi dan diberi label

2. Dimasukkan 10ml etanol 95% ke tabung reaksi

3. Dimasukkan 2ml sampel pada tabung reaksi

4. Diamati perubahan dan dicatat hasilnya

Test Pengendapan Oleh Anion Kompleks

Tujuan :

Mengetahui presipitasi protein yang terjadi akibat anion kompleks

Prinsip :

Reaksi yang terjadi adalah antara kation protein dengan anion kompeks reaksi ini

di gunakan untuk mengetahui sifat-sifat protein yang dapat dipresipitasikan oleh anion

kompleks dan untuk mengetahui kestabilan protein

Cara Kerja :

1. Disiapkan tabung reaksi dan diberi label

2. Dimasukkan 2ml sampel pada masing-masing tabung

3. Ditambahkan 5 tetes TCA 1%

4. Diamati perubahan dan dicatat hasilnya

  Uji reduksi Sulfur

Tujuan :

Untuk mengetahui suatu protein yang mengandung asam amino dengan atom S,

misalnya cystein dan methionin.

Prinsip :

Pada uji ni dalam suasanan basa,Pb asetat aka bereaksi dengan S dari asam amino

membentuk garam PbS berwarna hitam.

Cara Kerja :

1. Tabung reaksi disiapkan

2. Tetesi 5 pipet sampel ke dalam tabung reaksi.

3. Ditambah 3 pipet NaOH 40%

4. Dicampur dangan 5 tetes CH3COO

5. Panasi dalam waterbath selama 3 menit

6. Amati warna pada endapan yang terjadi.

  Uji Millon Nasse

Tujuan :

Untuk mengetahui adanya asam amino Tyrosin. Tetapi tidak terlalau spesifik

karena fenoljuga memberikan uji positif.

Prinsip :

Jenis reaksi dari uji kualitatif protein ini terjadi apabila larutan protein

ditambahkan dengan pereaksi berupa larutan merkuri serta merkuri nitrat yang ada di

dalam asam nitrat. Sebagai hasilnya, akan muncul endapan berwarna putih yang akan

berubah menjadi warna merah apabila terjadi pemanasan.

Cara kerja

1. Tabung reaksi disiapkan

2. Tetesi 5 tetes pipet sampel ke dalam tabung reaksi

3. Campur 5 pipet Reagen Millon Nasse.

4. Panaskan di penangas air

5. Amati adanya endapan

6. Dinginkan dengan air mengalir.

7. Tambahkan 3 tetes larutan NaNO2 10%.

8. Amati perubahan warna dan pembentukan endapan yang terjadi.

Uji Pengendapan oleh Logam

Tujuan :

Untuk mengetahui pengaruh garam logam terhadap protein

Prinsip :

Garam logam seperti Ag, Pb dan Hg akan membentuk endapan logam proteinat.

Ikatan amat kuat dan akan memutuskan jembatan garam, sehingga protein mengalami

denaturasi.proses deanturasi tersebut akan menimbulkan endapan

Cara kerja :

1. Tabung reaksi disiapkan

2. Tetesi 5 tetes pipet sampel ke dalam tabung reaksi

3. Tetesi 5 tetes larutan HgCI2 2%.

4. Amati perubahan yang terjadi.

 

Rekasi Hopkins Case

Tujuan :

Untuk mengetahui adanya asam amino triptofan dalam protein.

Prinsip :

Reaksi ini terjadi apabila larutan senyawa protein yang mengandung unsur

triptofan bereaksi dengan pereaksi yang disebut dengan istilah Hopkins cole. Pereaksi ini

mengandung beberapa senyawa antara lain asam glikosilat.

Cara kerja :

1. Larutan protein yang mengandung triptofan dapat direaksikan dengan pereaksi

Hopkins-Cole yang mengandung asam glioksilat.

2. Pereaksi ini dibuat dari asam oksalat dengan serbuk magnesium dalam air.

3. Setelah dicampur dengan pereaksi Hopkins-Cole, asam sulfat dituangkan

perlahan-lahan sehingga membentuk lapisan di bawah larutan protein.

4. Beberapa saat kemudian akan terjadi cincin ungu pada batas antara kedua lapisan

tersebut

2. Metode Analisis Karbohidrat Secara Kuantitatif

A. Metode Kjeldahl

Metode Kjeldahl merupakan metode yang sederhana untuk penetapan

nitrogen total pada asam amino, protein dan senyawa yang mengandung nitrogen.

Sampel didestruksi dengan asam sulfat dan dikatalisis dengan katalisator yang

sesuai sehingga akan menghasilkan amonium sulfat. Setelah pembebasan dengan

alkali kuat, amonia yang terbentuk disuling uap secara kuantitatif ke dalam

larutan penyerap dan ditetapkan secara titrasi. Metode ini telah banyak mengalami

modifikasi. Metode ini cocok digunakan secara semimikro, sebab hanya

memerlukan jumlah sampel dan pereaksi yang sedikit dan waktu analisa yang

pendek.

Prinsip kerja dari metode Kjeldahl adalah protein dan komponen organic

dalam sampel didestruksi dengan menggunakan asam sulfat dan katalis. Hasil

destruksi dinetralkan dengan menggunakan larutan alkali dan melalui destilasi.

Destilat ditampung dalam larutan asam borat. Selanjutnya ion- ion borat yang

terbentuk dititrasi dengan menggunakan larutan HCl.

Cara Kjeldahl pada umumnya dapat dibedakan atas dua cara, yaitu cara

makro dan semimakro. Cara makro Kjeldahl digunakan untuk contoh yang sukar

dihomogenisasi dan besar contoh 1-3 g, sedang semimikro Kjeldahl dirancang

untuk contoh ukuran kecil yaitu kurang dari 300 mg dari bahan yang homogen.

Cara analisis tersebut akan berhasil baik dengan asumsi nitrogen dalam bentuk

ikatan N-N dan N-O dalam sampel tidak terdapat dalam jumlah yang besar.Ada

tiga cara yang mengkhusus yaitu tahap destruksi,tahap destilasi dan tahap titrasi.

B. Metode Lowry

Reagen pendeteksi gugus-gugus fenolik seperti reagen folin dan ciocalteu

telah digunakan dalam penentuan konsentrasi protein oleh Lowry (1951) yang

kemudian dikenal dengan metode Lowry. Dalam bentuk yang paling sederhana

reagen folin ciocalteu apat mendeteksi residu tirosin (dalam protein) karena

kandungan fenolik dalam residu tersebut mampu mereduksi fosfotungsat dan

fosfomolibdat, yang merupakan konstituen utama reagen folin ciocalteu, menjadi

tungsten dan molibdenum yang berwarna biru.  Hasil reduksi ini menunjukkan

puncak absorbsi yang lebar pada daerah merah. Sensitifitas dari metode folin

ciocalteu ini mengalami perbaikan yang cukup signifikan apabila digabung

dengan ion-ion Cu.

Penetapan Kadar

a. Pembuatan kurva baku

Siapkan larutan bovin serum albumin dengan konsentrasi 300 µg/ml (Li).

Buat seri konsentrasi dalam tabung reaksi, misal dengan komposisi berikut :

Tambahkan ke dalam masing-masing tabung 8 ml reagen Lowry B dan

biarkan selama 10 menit, kemudian tambahkan 1 ml reagen Lowry A. Kocok dan

biarkan selama 20 menit. Baca absorbansinya pada panjang gelombang 600 nm

tehadap blanko. (Sebagai blanko adalah tabung reaksi no.1 pada tabel di atas)

b. Penyiapan Sampel

Ambil sejumlah tertentu sampel protein yang terlarut misal albumin,

endapkan dahulu dengan penambahan amonium sulfat kristal (jumlahnya

tergantung dari jenis proteinnya, kalau perlu sampai mendekati kejenuhan

amonium sulfat dalam larutan). Pisahkan protein yang mengendap dengan

sentrifus 11.000 rpm selama 10 menit, pisahkan supernatannya. Presipitat yang

merupakan proteinnya kemudian dilarutkan kembali dengan dapar asam asetat pH

5 misal sampai 10,0 ml. Ambil volume tertentu dan lakukan penetapan

selanjutnya seperti pada kurva baku mulai dari penambahan 8 ml reagen Lowry A

sampai seterusnya.

C. Metode Titrasi Formol

Prinsip :

Larutan protein dinetralkan dengan basa (NaOH) lalu ditambahkan

formalin akan membentuk dimethilol. Dengan terbentuknya dimethilol ini berarti

gugus aminonya sudah terikat dan tidak akan mempengaruhi reaksi antara asam

dengan basa NaOH sehingga akhir titrasi dapat diakhiri dengan tepat. Indikator

yang digunakan adalah p.p., akhir titrasi bila tepat terjadi perubahan warna

menjadi merah muda yang tidak hilang dalam 30 detik.

Cara kerja :

1. Menimbang kurang lebih 3-5 gram sampel uji

2. Mengencerkan dalam Labu Ukur 100 ml dan menambahkan aquades hingga

tanda tera, menghomogenkan dalam beaker glass (L1)

3. Mengambil 10 ml Larutan L1, memasukkan ke dalam Erlenmeyer

4. Menambahkan 20 ml aquades, 0,4 ml Kalium Oksalat Jenuh (1:3), dan 3-4

tetes Indikator PP 1%

5. Mentitrasi menggunakan NaOH 0,1 N terstandardisasi hingga berubah warna

menjadi merah jambu muda (mencatat volume titrasi)

6. Menambahkan 2 ml Formalin 40% dan 3-4 tetes Indikator PP 1%

7. Mentitrasi kembali menggunakan NaOH 0,1N yang telah digunakan di awal

(mencatat volume titrasi (A ml = V.titrasi awal + V.titrasi akhir)

8. Membuat blanko pengujian dengan mengulangi prosedur No. 4 s/d 7, yaitu

dengan mengganti 10 ml Larutan L1 dengan 10 ml aquades (V.titrasi blanko =

B ml)

9. Menghitung kadar protein susu dengan rumus :

Kadar Nitrogen (%N) = (A ml – B ml) / Bobot contoh (mg) x 10 x Normalitas

NaOH x 14,008 x 100%

Kadar Protein = %N x Faktor Konversi

D. Metode spektrofotometri visible (Biuret)

Prinsip:

Penentuan kadar protein secara biuret didasarkan pada pengukuran

serapan cahaya berwarna ungu dari protein yang bereaksi dengan pereaksi biuret

dimana yang membentuk kompleks adalah protein dengan ion Cu2+ yang terdapat

dalam pereaksi biuret dalam suasana basa. Semakin tinggi intensitas cahaya yang

diserap oleh spektrofotometer maka semakin tinggi pula kandungan protein yang

terdapat dalam zat tersebut. Keuntungan dari metode biuret ini adalah bahan yang

digunakan relative murah akan tetapi kelemahan dari metode ini adalah

sensitivitas terhadap bahan yang diidentifikasi rendah sehingga diperlukan bahan

dalam jumlah yang tidak sedikit.

Cara kerja:

Pembuatan reagen Biuret :

1. Larutkan 150 mg tembaga (II) sulfat (CuSO4. 5H2O) dan kalium

natrium tartrat (KNaC4H4O6. 4H2O) dalam 50 ml aquades dalam

labu takar 100 ml. Kemudian tambahkan 30 ml natrium hidroksida

10% sambil dikocok-kocok, selanjutnya tambahkan aquades sampai

garis tanda.

Pembuatan larutan induk bovin serum albumin (BSA):

1. Ditimbang 500 mg bovin serum albumin dilarutkan dalam aquades

sampai 10,0 ml sehingga kadar larutan induk 5,0% (Li).

Pembuatan kurva baku :

1. Dalam kuvet dimasukkan larutan induk, reagen Biuret dan aquades

misal dengan komposisi sebagai berikut:

2. Setelah tepat 10 menit serapan dibaca pada ë 550 nm terhadap blanko

yang terdiri dari 800 µL reagen Biuret dan 200 µL aquades.

Cara mempersiapkan sampel :

1. Ambil sejumlah tertentu sampel protein yang terlarut misal albumin,

endapkan dahulu dengan penambahan amonium sulfat kristal

(jumlahnya tergantung dari jenis proteinnya, kalau perlu sampai

mendekati kejenuhan amonium sulfat dalam larutan).

2. Pisahkan protein yang mengendap dengan sentrifus 11.000 rpm

selama 10 menit, pisahkan supernatannya. Presipitat yang merupakan

proteinnya kemudian dilarutkan kembali dengan dapar asam asetat

pH 5 misal sampai 10,0 ml.

3. Ambil sejumlah µL larutan tersebut secara kuantitatif kemudian

tambahkan reagen Biuret dan jika perlu tambah dengan dapar asetat

pH 5 untuk pengukuran kuantitatif.

4. Setelah 10 menit dari penambahan reagen Biuret, baca absorbansinya

pada panjang gelombang 550 nm terhadap blanko yang berisi reagen

Biuret dan dapar asetat pH 5. Perhatikan adanya faktor pengenceran

dan absorban sampel sedapat mungkin harus masuk dalam kisaran

absorban kurva baku.

DAFTAR PUSTAKA

Apriyanto, A. 1999. Petunjuk Laboratorium Analisis Pangan. Bogor: Graha Utama

Apriyantono, A. dkk. 1989. Analisis Pangan. Bogor: Departemen Pendidikan dan

Kebudayaan 

Enasari, Novi. 2012. Praktikum Kimia Identifikasi Asam Amino. (online):

http://novienasri.blogspot.com/2012/10/praktikum-kimia-identifikasi-asam-amino.html

Fessendden, Ralph. Dan Fessenden, Joans. 1989. Kimia Organik Edisi ke-3. Jakarta :

Erlangga.

Khopkar, S. 1999. Konsep Dasar Kimia Analitik. Jakarta: UI Press

Rivai, H. 2005. Asas Pemeriksaan Kimia. Jakarta: Penerbit UI

Underwood. 1996. Analisa Kimia Kuantitatif. Jakarta : Erlangga

Kristiani, Elizabeth. 2010. Petunjuk Praktikum Kimia. Salatiga: UKSW.

Poedjiadi, Anna. 2007.  Dasar Biokimia. Jakarta: UI Press

Sari. 2013. Penentuan Kadar Protein Secara Lowry. (online):

http://indhpsari.blogspot.com/2013/06/penentuan-kadar-protein-secara-lowry.html

Wilbraham Antony, C and Matta Michael S. Kimia Organik dan Hayati. Bandung: ITB,

1992.

Winarno. 1997. Kimia Pangan dan Gizi. Jakarta: PT. Gramedia Pustaka Utama