OSTEOINMUNOLOGIA: BASES CELULARES Y MOLECULARES DEL REMODELAMIENTO ÓSEO

ROSAHYRA MILENA SANDOVAL COTE

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA CIENCIAS EXACTAS Y NATURALES

ESPECIALIZACIÓN EN LABORATORIO DE INMUNOLOGIA CLINICA SANTA FÉ DE BOGOTA

2005

OSTEOINMUNOLOGIA: BASES CELULARES Y MOLECULARES DEL REMODELAMIENTO ÓSEO

ROSAHYRA MILENA SANDOVAL COTE

Monografía

Director, Dr. EDGAR GARAVITO Profesor Especialización en Laboratorio de Inmunología Clínica

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA CIENCIAS EXACTAS Y NATURALES

ESPECIALIZACIÓN EN LABORATORIO DE INMUNOLOGIA CLINICA SANTA FÉ DE BOGOTA

2005

Nota de Aceptación: ______________________________ ______________________________ ______________________________ ______________________________

_____________________________ Director, Dr. EDGAR GARAVITO

Santa Fe de Bogota Noviembre 15 de 2005

CONTENIDO

Pág.

INTRODUCCIÓN 13

1. CELULAS ÓSEAS 15

1.1 OSTEOBLASTOS 15

1.2 OSTEOCLASTOS 17

2. REMODELAMIENTO ÓSEO 19

3. REGULACIÓN DE LA HOMEOSTASIS ÓSEA 20

4. VIAS DE SEÑALIZACIÓN CELULAR INVOLUCRADAS EN

OSTEOCLASTOGÉNESIS 21

4.1 TRANCE 22

4.2 TRANCE – R 25

4.3 OPG 27

4.4 PTH/VITAMINA D3/CALCITONINA 29

5. SISTEMA INMUNE EN OSTEOCLASTOGÉNESIS 31

6. UTILIDAD CLINICA DE LOS MARCADORES DE

REMODELAMIENTO ÓSEO 35

6.1 TIPOS DE MARCADORES 38

6.1.1 Marcadores de Formación Ósea 38

6.1.1.1 Fosfatasa Alcalina Total y Fosfatasa Alcalina Ósea 38

6.1.1.2 Osteocalcina 38

6.1.1.3 Propenopéptidos Amino y Carboxiterminal del Procolágeno I 38

6.1.2 Marcadores de Resorción Ósea 39

6.1.2.1 Hidroxiprolina 39

6.1.2.2 Puentes de Piridinolina y Deoxipiridinolina 39

6.1.2.3 Péptidos Terminales o Telopéptidos del Colágeno 39

6.1.2.4 Fosfatasa Ácida Resistente a Tartrato 40

5. CONCLUSIONES 41

BIBLIOGRAFIA 42

LISTA DE TABLAS

pág.

Tabla 1 Moléculas que regulan los niveles de TRANCE y OPG 24

Tabla 2 Marcadores de Remodelamiento Óseo 37

LISTA DE FIGURAS

pág.

Figura 1 Diferenciación de células óseas 16

Figura 2 Interacción RANK – RANKL 29

Figura 3 Papel de la célula T activada en la formación y diferenciación

de osteoclastos 32

RESUMEN

El hueso es un tejido dinámico que brinda un soporte mecánico, protección

física y la capacidad de movimiento. Además el hueso es el sitio de

almacenamiento para diferentes minerales, y es allí donde se producen las

células sanguíneas. La masa ósea depende del balance entre síntesis y

destrucción del hueso mediada por osteoblastos y osteoclastos. Los

osteoblastos se derivan de células primitivas mesenquimales por acción del

factor de crecimiento trasformante β (TGF-β), el factor de crecimiento de

fibroblastos (FGF) y proteínas morfogenéticas óseas (BMPs). Los

osteoclastos se originan de precursores hematopoyéticos y en su

diferenciación participan el GM-CSF (Factor estimulador de colonias

granulocito-monocito) y el M-CSF (factor estimulador de colonias manocito-

macrófago). Diferentes estudios han establecido la relación entre

osteoblastos y sus células precursoras estromales con los precursores

hematopoyeticos de los osteoclastos y los mediadores solubles que modulan

estas interacciones incluyendo el factor de diferenciación de los osteoclastos

ODF o TRANCE y la Osteoprotegerina (OPG). Factores solubles como la

hormona paratiroidea (PTH), la vitamina D3 y la calcitonina también son

críticos en el mantenimiento de este balance. El hueso es un tejido

metabolicamente muy activo; mediante la cuantificación en el suero y en la

orina de moléculas derivadas del hueso, se ha logrado detectar trastornos en

el recambio óseo, estas moléculas son productos que resultan de la actividad

enzimática de las células durante la formación o la resorción, o son también

componentes de la matriz ósea liberados durante la síntesis o la degradación

del hueso.

DEFINICIÓN DEL PROBLEMA

La morfogénesis de los huesos y su modelación dependen de la producción

de matriz ósea mediada por los osteoblastos y su resorción por los

osteoclastos. Los osteoblastos se derivan de una célula precursora

mesenquimal pluripotencial que se diferencia en unidades formadoras de

colonias fibroblastos (CFU-F). La diferenciación ocurre en un microambiente

donde participan hormonas, factores de crecimiento y citocinas (Baylink,

1993). Entre las citocinas las más importantes son el factor de crecimiento

trasformante beta (TGF-β), el cual estimula la quimiotaxis de precursores de

osteoblastos (Alliston, 2001), y el factor de crecimiento de fibroblastos (FGF),

el cual activa al osteoblasto para favorecer la formación de hueso (Yu, 2003).

Otras moléculas de importancia que modulan este proceso son las proteínas

morfogenéticas óseas (BMPs) (Canalis, 2003), las cuales participan en el

crecimiento esquelético durante la embriogénesis y la reparación de las

fracturas (Canalis, 2003). A medida que el hueso se mineraliza el osteoblasto

deja de tener actividad de síntesis de material osteoide y se convierte en

osteocito, el cual va quedando incluido en el hueso rígido y empieza a tener

funciones de receptor de fuerzas externas principalmente determinadas por

la actividad muscular (Mackie, 2003).

Los osteoclastos son las células más importantes en el proceso de resorción

ósea y se caracterizan por su gran tamaño y por sus múltiples núcleos

resultantes de la fusión de células precursoras (Boyle, 2003 y Miyamoto,

2003). Se originan a partir de precursores hamatopoyéticos de la línea que

da lugar a los monocitos/macrófagos. Al igual que los osteoblastos, el

reclutamiento y diferenciación de los osteoclastos está mediado por

hormonas, factores de crecimiento y citocinas. Dentro de los factores que

están involucrados en el reclutamiento de las células precursoras de los

osteoclastos figuran el GM-CSF (factor estimulante de colonias de

granulocitos y monocitos) (Sarma, 1996) y el M-CSF (factor estimulante de

colonias de macrófagos). El GM-CSF induce resorción ósea y la formación

de osteoclastos, mientras que el M-CSF actúa sobre la célula madre del

sistema hematopoyético para mantener la sobrevida de los monocitos

precursores de osteoclastos (Sarma, 1996).

En años recientes se ha avanzado significativamente en el entendimiento de

los mecanismos celulares y moleculares que regulan el remodelamiento

óseo. Estos estudios han permitido establecer la relación entre los

osteoblastos y sus células precursoras estromales, con los precursores

hematopoyéticos de los osteoclastos y los mediadores solubles que modulan

estas interacciones. Está relación fue establecida claramente en estudios

realizados in vitro e in vivo, los cuales demostraron que era necesaria la

presencia de osteoblstos/células estromales y su interacción con los

precursores de los osteoclastos, para que se produjera la diferenciación y

activación de estos últimos.

El remodelamiento óseo es un proceso dinámico que ocurre en diferentes

proporciones a lo largo de la vida. Este proceso se coloca de manifiesto en el

momento de reparar microfracturas u otros daños que afecten el esqueleto.

Además, como los huesos son el lugar de almacenamiento de calcio, este

proceso por consiguiente regula las concentraciones de este mineral en el

rango necesario para mantener su equilibrio. Este proceso se refleja en la

liberación de una serie de moléculas, las cuales pueden ser medidas en

suero o sangre, que sirven como marcadores bioquímicos de la formación y

resorción ósea. Entre estos están los telopéptidos del procolágeno tipo I; el

precursor del constituyente más abundante de la matriz ósea, el colágeno I

(Delmas, 2000).

JUSTIFICACIÓN

En los últimos años se ha demostrado la estrecha relación que existe entre el

Sistema Inmune y el Tejido Óseo, en particular como las células de ambos

tejidos se originan a partir de precursores comunes y a su vez como las

citocinas producidas por diferentes células tienen efectos regulatorios

importantes sobre células tanto del sistema inmunitario como óseas.

Por lo anterior es importante revisar y analizar los mecanismos celulares y

moleculares involucrados en el remodelamiento óseo. Con está información

se espera tener un mejor entendimiento de la patogénesis de las alteraciones

óseas, su relación con la Inmunología y valorar la utilidad potencial que

puedan tener los diferentes marcadores biológicos de la remodelación ósea

en el diagnostico y seguimiento de dichas alteraciones.

OBJETIVO

Analizar los mecanismos celulares y moleculares involucrados en el

remodelamiento óseo, haciendo énfasis en los marcadores con potencial

utilidad clínica.

INTRODUCCIÓN El termino Osteoinmunología ha sido propuesto para describir la

interdisciplinariedad que existe entre el sistema Inmune y el Sistema

Esquelético (Arron, 2000). Recientemente se ha observado que tanto el

sistema inmune y esquelético se regulan el uno al otro en mucho mas grado

que lo que previamente se pensaba (Rho, 2004). En particular varias

condiciones patológicas las cuales se acompañan de una excesiva perdida

ósea, tales como artritis reumatoidea, enfermedad periodontal y algunas

anormalidades óseas asociadas a tumores muestras estar influenciadas por

componentes celulares (por ejemplo linfocitos T) y por factores solubles

(interferón) (Rho, 2004).

El papel de las células T en la biología ósea ha sido ampliamente aceptado

desde el descubrimiento de miembros de la familia del factor de necrosis

tumoral (TNF), como la citocina de activación relacionada con el TNF

(TRANCE), también conocida como ligando para el receptor de activación de

NF-κB (RANKL), ligando para osteoprotegerina (OPGL) y factor de

diferenciación de osteoclastos (ODF) (Rho, 2004). TRANCE fue inicialmente

identificado como una molécula de expresión en células T activadas (Wong

1997). Posteriormente se demostró que TRANCE es expresado sobre

osteoblastos activos y que es esencial para la osteoclastogenesis (Wong,

1999). Los receptores y ligandos en esta superfamilia tienen una estructura

única que les permite acoplarse directamente a vías de señalización para

proliferación celular, sobrevida y diferenciación (Theill, 2002).

Los miembros de la familia del TNF son dos proteínas trasmembrana que se

ensamblan en trímeros funcionales. El receptor de TNF (TNFR) es una

13

glicoproteína trasmembrana tipo 1 que presenta dominios extracelulares ricos

en cisteína. Existen dos subgrupos de TNFR homólogos, el primero contiene

dominios extracelulares de muerte que se une a TRADD o FADD los cuales

permiten la activación de la caspasa 8 e inducen apoptosis. El otro grupo se

une a factores asociados al receptor de TNF (TRAFs) los cuales son

moléculas adaptadoras que permiten la señalización corriente abajo,

permitiendo la activación de JNK y NF-κB promoviendo el crecimiento y

sobrevida celular (Theill, 2002).

De otra parte las células del sistema inmune son derivadas a partir de

células progenitoras de la medula ósea. Las citocinas producidas por estas

células regulan el metabolismo óseo. Por consiguiente el papel del sistema

inmune en la homeostasis ósea ha generado gran interés.

14

1. CELULAS ÓSEAS

La formación de los huesos y su modelación dependen de la producción de

matriz ósea mediada por osteoblastos y su resorción por los osteoclastos.

1.1 OSTEOBLASTOS

Los osteoblastos son células de origen mesodérmico cuya función primaria

es la formación de hueso (Figura 1). Los osteoblastos se derivan de una

célula precursora mesenquimal pluripotencial que se diferencia en unidades

formadoras de colonias de fibroblastos (CFU-F). La diferenciación ocurre en

un microambiente donde participan hormonas, factores de crecimiento y

citocinas (BaylinK, 1993). Entre las citocinas las más importantes son el

factor de crecimiento trasformante beta (TGF-β), el cual estimula la

quimiotaxis de precursores de los osteoblastos (Alliston, 2001) y el factor de

crecimiento de fibroblastos (FGF) el cual activa el osteoblasto para favorecer

la formación de hueso (Yu, 2003). Otras moléculas de importancia que

modulan este proceso son las proteínas morfogenéticas óseas (BMPs)

(Canalis, 2003), las cuales participan en el crecimiento esquelético durante la

embriogénesis y la reparación de fracturas (Canalis, 2003). A medida que el

hueso se mineraliza el osteoblasto deja de tener actividad de síntesis de

material osteoide, se rodea de matriz ósea y se convierte en osteocito que

adquiere la capacidad para responder a fuerzas externas principalmente

determinadas por la actividad muscular (Mackie, 2003). Una vez los

osteocitos son atrapados pierden su habilidad para producir matriz ósea. Sin

embargo los osteocitos pueden sintetizar ciertas moléculas de la matriz ósea

como la osteocalcina, y depositar minerales en la matriz ósea, además

forman una red con los osteocitos adyacentes y los osteoblastos de la

superficie ósea a través de prolongamientos celulares que viajan en el

15

interior de canalículos fraguados en el espesor de la matriz (Rho, 2004).

Figura 1. Diferenciación de Células Óseas

Rho, J., Takami, M. and Choi Y. (2004). Osteoimmunology: Interactions of the

Immune and Skeletal System. Molecules and Cells. 17, 1-9

16

1.1 OSTEOCLASTOS

Los osteoclastos difieren dramáticamente de los osteoblastos, se

caracterizan por su gran tamaño y por sus múltiples núcleos resultantes de la

fusión de las células precursoras (Boyle, 2003). Se originan a partir de

precursores hematopoyeticos de la línea monocito/macrófago (Figura 1). Al

igual que los osteoblastos, el reclutamiento y diferenciación de los

osteoclastos esta mediado por hormonas, factores de crecimiento y citocinas.

Dentro de los factores que regulan el proceso de diferenciación de los

osteoclastos figuran el factor estimulante de colonias granulocito/monocito

(GM-CSF) (Sarma, 1996) y el factor estimulante de colonias de macrófagos

(M-CSF). El GM-CSF induce resorción ósea y la formación de osteoclastos,

mientras que el M-CSF actúa sobre la célula madre del sistema

hematopoyético para mantener la sobrevida de los monocitos precursores de

osteoclastos (Sarma, 1996).

Los osteoclastos resorben matriz ósea mineralizada modulando la formación

ósea y el crecimiento. La cantidad de osteoclastos en la matriz ósea es

relativamente pobre, de alrededor de 2 a 3 por µm3, con una vida media de 8

a 7 semanas (Suda, 1997). Se localizan sobre la superficie ósea, alojados en

lagunas de resorción del hueso trabecular o en túneles cilíndricos del hueso

cortical. Las lagunas de resorción y los túneles de estas áreas son creadas

por la propia actividad del osteoclasto (Suda, 1997).

Los osteoclastos poseen diferentes características que lo hacen células

particulares como son su forma discoide con borde irregular y zonas claras.

El borde rugoso contiene elementos que resorben componentes orgánicos e

inorgánicos del hueso. Los osteoclastos secretan enzimas, tales como la

fosfatasa ácida resistente a tartrato (TRAP) por consiguiente decalcifican el

hueso, y otras enzimas tales como catepsina K, que degradan proteínas de

17

la matriz ósea (Roodman, 1996). Los osteoclastos pueden liberar protones

directamente vía H+ATPasa localizada en el borde irregular. El resultado de

la acidificación favorece la disolución del mineral óseo en las áreas de

resorción (Zaide, 2003). Varias enzimas proteolíticas tales como enzimas

lisosomales y proteasas de cisteína, son también liberadas a través del borde

irregular en las zonas de resorción (Rho, 2004).

Los osteoclastos expresan además altos niveles de αvβ3 integrina, receptor

para la vitronectina (Helfrich, 1999), que le permite a los osteoclastos

adherirse a una variedad de constituyentes de la matriz ósea in vitro, pero su

papel en la función de los osteoclastos in vivo aun no es claro. Se ha

observado altos niveles de expresión de αvβ3 integrina en el borde rugoso.

Este receptor es necesario para la adhesión firme y progresiva a la matriz en

la medida en que el osteoclasto excava la matriz ósea durante la resorción

(Helfrich, 1999).

18

2. REMODELAMIENTO ÓSEO

La morfogénesis y remodelamiento óseo implican la síntesis de matriz ósea

por parte del osteoblasto y la coordinada resorción ósea por el osteoclasto.

Se estima que alrededor del 10% del total de masa ósea en humanos es

recambiada anualmente. Un imbalance entre la actividad de los osteoclastos

y osteoblastos puede resultar de cambios hormonales o perturbaciones

inflamatorias, resultando en anormalidades esqueléticas caracterizadas por

disminución (osteoporosis) o incremento (osteopetrosis) de la masa ósea

(Theill, 2002).

El incremento de la actividad osteoclastica es observado en muchos

desordenes osteopenicos, incluyendo osteoporosis posmenopáusica,

enfermedad de Paget, metástasis ósea lítica o artritis reumatoidea; en los

cuales hay un incremento en la resorción ósea. Además existen varios

factores como M-CSF, IL-1, TGF-β, TGF-α, TNF-β, IL-6 Vitamina D3,

calcitonina, prostaglandina E2 (PGE2), hormona paratiroidea (PTH), los

cuales pueden afectar la osteoclastogenesis a diferente nivel. Sin embargo

observaciones experimentales han mostrado que estos factores no son

esenciales para el desarrollo de osteoclastos in vivo (Theill, 2002).

19

3. REGULACIÓN DE LA HOMEOSTASIS ÓSEA La homeostasis ósea es regulada por el balance de la función de

osteoblastos y osteoclastos. La formación ósea por osteoblastos y la

resorción ósea por osteoclastos están firmemente acopladas para el

manteniemiento de la salud ósea. La actividad de formación ósea por

osteoblastos incrementa la masa ósea, mientras la actividad de resorción

ósea de los osteoclastos reduce la masa ósea (Suda, 2001). La acción de

estas células esta regulada por factores de crecimiento y citocinas. La

alteración de este balance generalmente lleva a enfermedades óseas, tales

como osteoporosis y osteopetrosis (Helfrich, 2003).

La osteoporosis es una enfermedad metabólica en la cual la masa ósea y la

densidad mineral ósea continuamente disminuye debido a una incrementada

actividad de los osteoclastos. La osteoporosis guía a un alto riesgo de

fracturas óseas. De forma diferente, la osteopetrosis hace referencia a una

condición heterogénea generalmente caracterizada por incremento de la

densidad ósea a causa de un daño en la resorción ósea. En condiciones

normales, la resorción ósea por los osteoclastos, en sitios específicos, activa

los osteoblastos para remplazar el hueso perdido; cuando este balance se

altera se presenta alguna de las enfermedades mencionadas anteriormente.

Este disbalance puede resultar de cambios relacionados con las hormonas,

citocinas, nutrición, metabolismo, factores mecánicos, o una combinación de

cualquiera o de todos estos factores (Rho, 2004).

20

4. VIAS DE SEÑALIZACIÓN CELULAR INVOLUCRADAS EN

OSTEOCLASTOGENESIS

Los osteoblastos que regulan el metabolismo óseo están relacionados con

las hormonas osteotrópicas, con las citocinas que regulan la formación ósea

y además, con el desarrollo de osteoclastos y la activación de la resorción

ósea (Rho, 2004). Los osteoclastos son derivados del linaje monocito-

macrófago en respuesta a las acciones coordinadas de diferentes hormonas

osteotropicas incluyendo la vitamina D3 (1,25(OH)2D3) y hormona

paratiroidea (PTH). Estas hormonas han sido identificadas en estudios

genéticos de enfermedades que causan anormalidades esqueléticas en

ratones, ratas y humanos (Zelzer, 2003).

Ratones con una disrupción en el gen del M-CSF (ratones op/op) exhiben un

fenotipo osteopetropico (Yoshida, 1990). Estudios en estos ratones han

claramente mostrado que el M-CSF juega un importante papel en

osteoclastogenesis. M-CSF es requerido para diferenciación de los

osteoclastos. Los osteoblastos derivados de ratones op/op no favorecen la

formación de osteoclastos in vitro (Suda, 1997). Adicionalmente se ha

observado que el M-CSF participa en el mantenimiento de osteoclastos

maduros. Esto sugiere que el M-CSF participa en los estados tempranos de

diferenciación de los osteoclastos así como en la movilidad y sobrevida de

osteoclastos maduros. Ahora bien, el factor de crecimiento endotelial

vascular recombinante humano (VEGF) puede inducir formación de

osteoclasto en ratones op/op (Kaku, 2001). El ligando para FLT3 también

sustituye al M-CSF para inducir el desarrollo de osteoclastos bajo

condiciones especificas (Lean, 2001).

21

4.1 TRANCE En 1997, varios grupos de investigadores estudiando moléculas de unión en

una línea de células estromales identificaron una molécula que favorecía la

osteoclastogenesis, por lo cual recibió el nombre de ODF (del ingles factor de

diferenciación de osteoclastos) (Tsuda, 1997). Posteriormente en una librería

de cADN de una línea celular mielomonocitica de ratón 32D se aisló una

molécula que se unía a la osteoprotegerina (OPG) y se le denomino ligando

de la OPG (OPGL), la cual resulto ser idéntica al ODF (Suda, 1999). Mas

aun, otro factor de la familia del ligando del TNF fue clonado en forma casi

simultanea durante la búsqueda de genes que regulan la apoptosis en

hibridomas de células T de ratón (Tsuda, 1997); este factor se denomina

citocina inducida por activación relacionada con el TRANCE (Tsuda, 1997).

Otros investigadores identificaron un factor implicado en la diferenciación de

los monocitos y células dendríticas por clonación de una librería de cADN de

células dendríticas humanas, y lo denominaron RANKL (Tsuda, 1997). Por

consiguiente las moléculas ODF, OPGL, TRANCE resultaron ser la misma

que el RANKL.

TRANCE es expresado en la superficie de osteoblastos y células epiteliales

de glándulas mamarias y en células T activadas (Rho, 2004). La expresión

de TRANCE es inducida en respuesta a citocinas osteotrópicas secretadas

por células inmunes, incluyendo interleucina – 1 (IL-1), IL-6 e IL-11 (Walsh,

2003). Ratones deficientes en TRANCE exhiben un fenotipo similar a

osteopetrosis y no desarrollan nódulos linfoides y glándulas mamarias (Theill,

2002).

Una combinación de TRANCE y M-CSF induce formación de osteoclastos a

partir de monocitos derivados de bazo y medula ósea en ausencia de

osteoblastos (Kim, 2002). Aunque el M-CSF ha sido identificado como un

22

factor crucial para el desarrollo de osteoclastos no lo es de forma única. Esto

sugiere que TRANCE debe estar participando en la diferenciación y

formación de los osteoclastos además de su intervención en la formación de

lagunas de resorción ósea (Rho, 2004).

TRANCE regula la comunicación entre célula T y célula dendrítica, la

sobrevida de la célula dendrítica y organogénesis de nodos linfoides (Theill,

2002). La producción de TRANCE por células T activadas puede

directamente regular, como ya se menciono, la osteoclastogénesis y el

remodelamiento óseo. Esto explica porque las enfermedades autoinmunes,

el cáncer, leucemias, asma, infecciones virales crónicas y enfermedades

periodontales resultan en una perdida ósea local y sistémica (Theill, 2002).

La expresión de TRANCE puede ser aumentada por factores de resorción

ósea tales como glucorticoides, vitamina D3, IL-1, IL-6, IL11, IL17, TNF-α,

PGE2 y PTH (Tabla 1). Usando sistemas de cultivos in vitro se ha observado

que TRANCE puede activar osteoclastos maduros y mediar

osteoclastogénesis en presencia de M-CSF. Ratones trance-/- presentan

osteopetrosis severa, crecimiento atrofiado y defectos en la erupción de los

dientes, además sus osteoblastos no participan en la osteoclastogénesis. Sin

embargo estos ratones contienen precursores hematopoyéticos que pueden

diferenciarse en osteoclastos maduros in vitro en presencia de TRANCE

recombinante y M-CSF (Theill, 2002).

23

Tabla 1. Moléculas que regulan los niveles de TRANCE y OPG

TRANCE

OPG

Hormonas

Vitamina D3 Aumenta Aumenta

PTH Aumenta Disminuye

Estradiol No cambia Aumenta

Citocinas

TNF-α Aumenta Aumenta

IL-1 Aumenta Aumenta

IL-6 Aumenta -

IL-11 Aumenta -

IL-17 Aumenta -

Factores de Crecimiento

TGF-β Disminuye Aumenta

BMP-2 - Aumenta

Otros

Prostaglandina E2 Aumenta Disminuye

Glucorticoides Aumenta Disminuye

CD40L Aumenta -

Theill, L. E., Boyle, J. W. and Penniger, M. J. (2002). RANK-L and RANK: T

cells, bone loss and mammalian evolution. Annu. Rev. Immunol. 20, 795 –

823.

24

4.2 TRANCE – R El receptor de TRANCE, también llamado TRANCE-R, RANK, OPGLR,

ODFR, es expresado como un heterotrímero trasmembrana en progenitores

de osteoclastos, células B, células dendríticas y células epiteliales de

glándula mamaria. TRANCE-R es un miembro de la superfamilia de

receptores del TNF y presenta alta homología con CD40. TRANCE-R es una

proteína trasmembrana con una cola citoplasmática de alrededor de 383

aminoácidos que contienen tres dominios de unión (I, II, III) (Walsh, 2003).

In vitro la unión de TRANCE – TRANCE-R resulta en osteoclastogénesis de

células progenitoras y la activación de osteoclastos maduros. La activación

de TRANCE-R depende de la señal dada por TRANCE la cual es mediada

por una molécula adaptadora denominada factor asociado al receptor para

TNF (TRAFs) de las cuales se conocen alrededor de seis (TRAF 1-6). TRAF

1, 2, 3, 5 y 6 interactúan con la cola citoplasmática de TRANCE en regiones

específicas (Darnay 1999). Aunque cinco diferentes TRAFs interactúan con

la cola citoplasmática de TRANCE-R, la señalización mediada por TRAF6 en

particular parece ser crucial para la formación de osteoclastos. Ratones

deficientes en TRAF6 presentan defectos en la formación de osteoclastos y

muestran osteopetrosis (Lomaga, 1999).

NFκ-B es una molécula de señalización y un factor de activación que actúa

corriente abajo de TRAF6. La señal de activación de NFκ-B está

completamente bloqueada en ratones deficientes de TRAF6. Sin embargo se

ha observado que la activación de c-Jun kinasa solo esta parcialmente

disminuida en ratones deficientes de TRAF6 ya que TRAF2 puede mediar

esta señalización (Lomaga, 1999). Estas observaciones son muy similares a

las vistas en ratones deficientes de TRANCE-R (Dougall, 1999). Ratones

25

deficientes de NFκ-B muestran un fenotipo de osteopetrosis y presentan

defectos en la formación de osteoclastos (Iotsova, 1997).

Otros estudios han mostrado que TRANCE activa la serin-treonin-kinasa

antiapoptotica Akt/PKB a través del complejo de señalización c-Src y TRAF6

e induce la cascada de señalización a través de TAB2/Tak1 (Lee, 2002). c-

Src y TRAF6 interactúan el uno con el otro y con TRANCE-R, deficiencias en

c-Src o la adición de inhibidores de kinasas de la familia Src bloquean la

activación de Akt/PKB en osteoclastos. TRAF6 aumenta la actividad de c-Src

guiando a una fosforilación corriente abajo de moléculas de señalización

tales como c-Cb1 (Theill, 2002).

Con base en los datos presentados se puede afirmar que TRAF6 juega un

papel importante en la señalización dada por la interacción de TRANCE-

TRANCE-R ya que activa corriente abajo otras moléculas como Src/Cb1/Akt

y TAB2/TAK1. De esta forma TRAF6 es un factor crítico en la activación de

osteoclastos maduros, pero otros TRAFs pueden compensar parcialmente la

perdida de TRAF6 durante el desarrollo de osteoclastos.

Ratones con una mutación genética a nivel de TRANCE-R presentan un

bloqueo en el desarrollo de los osteoclastos que se ve reestablecido una vez

se introduce TRANCE-R recombinante en células progenitoras de medula

ósea, similar a lo que se observa en ratones trance-/- . Así la interacción entre

TRANCE expresado por células estromales/osteoblastos y su receptor

TRANCE-R expresado sobre precursores de osteoclastos es esencial para la

osteoclastogénesis Ratones con defectos en TRAF6 tienen un fenotipo óseo

similar al de ratones trance-/- y trance-r-/- por un bloqueo parcial de la

osteoclastogénesis y defectos en la activación de osteoclastos maduros

(Theill, 2002).

26

4.3 OPG En 1997, varios grupos de investigadores identificaron de forma simultánea

una proteína que interfería con la diferenciación de osteoclastos. El grupo de

Simonet y colaboradores identificaron una proteína que en cultivos de células

hematopoyéticas y estromales inhibió la formación de los osteoclastos de

forma dependiente de la dosis, y su administración subcutánea en ratones

indujo un aumento de masa ósea y previno la perdida ósea tras ooforectomia

(Simonet, 1997). Debido a esa habilidad de proteger el hueso, los

investigadores denominaron a esta molécula osteoprotegerina (OPG) y en

ratones trasgénicos para OPG, la sobreexpresión de la OPG indujo

osteopetrosis asociada a reducción significativa del numero de osteoclastos,

sin reducción concomitante del numero de macrófagos (Simonet, 1997).

Coincidencialmente otros grupos aislaron un factor similar en medio de

cultivo de fibroblastos humanos, el cual era capaz de inhibir la formación de

los osteoclastos; un grupo la denomino factor inhibidor de la

osteoclastogénesis (OCIF), mientras otro grupo la denomino molécula-1

similar al TNF (TR1) (Tan, 1997). Posteriormente se demostró que la

secuencia del ácido dexosirribonucleico (ADN) de la OPG era idéntica a la

OCIF y se estableció que OCIF, TR1 Y OPG eran la misma molécula (Tsuda,

1998). Él termino que hoy en día se emplea para designar al ligando soluble

que inhibe la diferenciación de los osteoclastos es la OPG.

La OPG es un miembro de la superfamilia del TNFR que regula

negativamente la formación y activación de osteoclastos. La OPG es

producida primariamente por osteoblastos y/o células estromales y sus

precursores, pero también puede ser expresada por células B y células

dendríticas. La OPG es un receptor señuelo, el cual interrumpe la interacción

entre TRANCE y TRANCE - R ya que se une a este ultimo. Por lo tanto la

27

OPG es un inhibidor efectivo de la maduración de osteoclastos y su

activación in vitro (Theill, 2002).

OPG se produce en respuesta a proteína morfogénica ósea 2 (BMP-2), IL-1,

IL-6, IL-11, TGFβ y estrógenos (Ahlen, 2002). La inducción de OPG es

inhibida por PTH, glucocorticoides y prostaglandina E2 (PGE2). La

sobreexpresión de OPG en ratones trasgénicos resulta en osteopetrosis,

ratones deficientes en OPG muestran una marcada osteoporosis como

resultado de un incremento en él numero de osteoclastos funcionales,

indicando que los niveles de masa ósea correlacionan con los niveles de

OPG en ratones (Ahlen, 2002)

Estos hallazgos sugieren que la OPG regula negativamente la formación y

función de los osteoclastos. Así la señalización de TRANCE/TRANCE-

R/OPG junto con el M-CSF juega un papel importante en la homeostasis

ósea.

La relación entre osteoblastos y osteoclastos en la regulación del

remodelamiento óseo podría entonces resumirse así: TRANCE, que se

expresa en la superficie del osteoblasto/célula estromal, se une al TRANCE-

R expresado en la superficie de la célula precursora del osteoclasto e induce

la diferenciación y activación del osteoclasto. La OPG que se encuentra en

forma soluble o que es secretada por los osteoblastos, puede unirse al

TRANCE bloqueando la interacción entre el osteoblasto y los precursores de

osteoclasto e inhibiendo la formación de osteoclastos. TRANCE tiene la

capacidad de activar los osteoclastos y estimular osteoclastos inactivos para

iniciar la resorción ósea e inhibir su apoptosis (Figura 2).

28

Figura 2. Interacción RANK – RANKL, permite la diferenciación a

osteoclastos maduros.

Teitelbaum, S. L. And Ross, F. P. (2003). Genetic Regulation of Osteoclast

Development and Function. Nature. Vol.4. 638 – 649.

4.4 PTH/ Vitamina D3/ Calcitonina

Además de estas citocinas implicadas en el mantenimiento del equilibrio

óseo, existen otros factores solubles cuya actividad modula

significativamente la masa ósea; los más importantes de estos son la

hormona PTH, la vitamina D3 y la calcitonina (Bakker, 2003; Suda, 2003 y

Zaidi, 2002). Sin embargo, la acción de las mismas en el remodelamiento

29

óseo parece ser secundaria al mantenimiento del equilibrio del calcio y el

fósforo plasmático. De todas formas, el papel de la PTH y de la vitamina D3

en la patogénesis de la osteoporosis es interesante ya que ambas hormonas

son potentes moduladores de la actividad osteoclastica, a la vez que regulan

la absorción intestinal de calcio y su excreción renal (Ahmad, 2003).

El aumento en la concentración de PTH en la circulación, promueve la

resorción ósea al incrementar el número de osteoblastos y la tasa de

actividades entre las células osteoclasticas individuales, aunque el efecto de

la PTH parece ser multifactorial, ya que estimula los osteoblastos, aumenta la

producción de proteasas y disminuye la actividad de los inhibidores de

osteoclastos. Tiene acción directa sobre los osteoclastos mediada por el

AMP cíclico y promueve la fusión de células mononucleares favoreciendo la

formación de células gigantes multinucleadas (Bakker, 2003).

La principal función de la vitamina D3 es la de aumentar la actividad resortiva

de los osteoclastos presentes sin aumentar su numero (Suda, 2003).

El papel fisiológico de la calcitonina es menos conocido aunque se sabe que

participa en la embriogénesis del esqueleto (etapa de formación y

crecimiento acelerado del hueso) ya que es un agente con gran potencia

anti-resortiva (antiosteoclastica). La calcitonina produce inhibición de la

actividad osteoclastica e induce la apoptosis de los osteoclastos (Zaidi,

2002).

30

5. SISTEMA INMUNE EN OSTEOCLASTOGÉNESIS

Muchos estudios han investigado la relación entre el sistema inmune y el

sistema óseo en varios modelos animales de enfermedades humanas. Sin

embargo las bases moleculares y celulares de la unión entre estos dos

sistemas es aún desconocida. Aunque actualmente se tiene conocimiento de

que los osteoclastos, los cuales son mediadores importantes del balance

óseo, se originan a partir de precursores hematopoyéticos que también dan

origen a células inmunes (Rho, 2004).

La osteoclastogénesis es positivamente regulada por la interacción de

TRANCE – TRANCE-R y negativamente regulada por OPG (Walsh, 2003).

Muchos estudios muestran que células T activadas pueden inducir

osteoclastogénesis a través de la expresión de TRANCE. De otra parte

células T activadas que producen interferón - γ (INF-γ) pueden inhibir la

osteoclastogénesis por interferir con la vía de señalización TRANCE-

TRANCE-R (Figura 3). Esto sugiere que células T activadas regulan, tanto

positiva como negativamente, la osteoclastogénesis (Rho, 2004). El papel

de las células T activadas en la osteoclastogénesis puede depender de la

acción de TRANCE y la acción negativa del INF-γ. Este balance además

puede verse afectado por factores sistémicos y locales, incluyendo

infecciones de origen microbiano, nutrición, metabolismo, factores

mecánicos, hormonas y citocinas tales como TNFs e Interleucinas (Rho,

2004).

31

Figura 3. Papel de la célula T activada en la formación y diferenciación de

osteoclastos

Rho, J., Takami, M. and Choi Y. (2004). Osteoimmunology: Interactions of

the Immune and Skeletal System. Molecules and Cells. 17, 1-9

32

Varias citocinas inflamatorias han mostrado jugar un papel importante en la

osteoclastogénesis, incluyendo INF-α, INF-β e INF-γ. El efecto negativo de

esta ultima citocina en la osteoclastogénesis ha sido mostrado y bien

caracterizado. Ratones inyectados con INF-γ muestran defectos en la

formación de osteoclastos multinucleados. Estos hallazgos fueron

observados por Takayanagi quien mostró que INF-γ producido por células T

bloquea la osteoclastogénesis al interferir con la señalización

TRANCE/TRANCE-R (Figura 3). INF-γ además induce degradación de

TRAF6, una molécula como ya se menciono critica en la vía de señalización

TRANCE/TRANCE-R, bloqueando corriente abajo NF-κB y JNK. Se ha

observado que ratones que carecen de INFGR1, un componente del receptor

del INF-γ, muestran perdida de masa ósea debido a un aumento en la

formación de osteoclastos y de la resorción ósea (Takanayanagi, 2002). INF-

α pueden también funcionar como un modulador negativo de la señalización

de TRANCE/TRANCE-R al bloquear la activación de NF-κB y JNK

(Takayanagi, 2000). Otros estudios han mostrado que INF-β también inhibe

la osteoclastogénesis por interferir con la expresión de c-Fos inducida por

TRANCE, un factor de trascripción que es esencial para la formación de

osteoclastos (Takayanagi, 2002). Ratones que carecen de IFNAR, un

componente del receptor de INFα/β, presentan osteoclastos con una mayor

capacidad funcional resultando en un fenotipo como el de osteoporosis

(Takayanagi, 2002).

La inflamación incrementa la osteoclastogénesis. Citocinas inflamatorias

secretadas por células inmunes tales como TNF-α o IL-1, pueden inducir la

expresión de TRANCE en osteoblastos jugando un papel central en perdida

ósea por inflamación (Walsh, 2003). La IL-7 pueden actuar como un potente

factor osteoclastogénico en condiciones de perdida ósea asociada a

inflamación (Toraldo, 2003). Se ha observado que la concentración de

33

TRANCE soluble secretado por células T se encuentra elevado en respuesta

a IL-7 (Toraldo, 2003).

Se ha demostrado que numerosas citocinas y hormonas osteotrópicas

regulan la formación y función de osteoclastos in vitro, pero su relevancia

funcional in vivo no ha sido establecida. Por ejemplo citocinas derivadas de

células T o macrófagos, tales como, IL-4, IL-6, IL-10, IL-12, IL-17, IL-18,

CD40L factor estimulante de colonias granulocito-macrófago (GM-CSF) y

proteína inflamatoria del macrófago (MIP-1), han mostrado regular la

formación y función de osteoclastos in vitro (Toraldo, 2003). El papel de

estas citocinas in vivo no ha sido claramente diferenciado. Ahora bien, IL-6

potencialmente estimula la formación de osteoclastos a través de la

inducción de TNF-α e IL-1 las cuales son secretadas en mieloma múltiple y

llevan a un incremento de la expresión de TRANCE (Toraldo, 2003)

La hipercalcemia es una de las manifestaciones clínicas más frecuentes y

serias asociadas con la acumulación de osteoclastos y marcadores de

resorción ósea (Stewart, 2002). IL-4 suprime el desarrollo de los osteoclastos

y la función de osteoclastos maduros por un mecanismo dependiente de

STAT6, que inhibe de manera irreversible la diferenciación programada de

osteoclatos activados vía TRANCE (Wei, 2002).

IL-18 e IL-12 pueden también sinergicamente inhibir la actividad de resorción

ósea pero el mecanismo no ha sido identificado in vivo. En conclusión existe

evidencia que sugiere que las células T juegan un papel crítico en el

desarrollo y función de los osteoclastos, a través de la señalización cruzada

entre INF y TRANCE en remodelamiento óseo (Horwood, 1998)

34

6. UTILIDAD CLINICA DE LOS MARCADORES DE REMODELAMIENTO

ÓSEO

Los marcadores de recambio óseo son sustancias presentes en la sangre y

la orina, que son producidas o liberadas durante la renovación ósea.

Básicamente son de dos tipos enzimas o proteínas secretadas por los

osteoblastos o los osteoclastos y sustancias producidas durante la formación

o destrucción del colágeno tipo I, la principal proteína de la matriz ósea

(Srivastava, 2005).

El remodelamiento óseo depende de los procesos de resorción y formación

ósea, acoplados en una secuencia orquestada, iniciada por los osteoclastos

y seguida por los osteoblastos. Grupos de osteoblastos y osteoclastos,

trabajando sincrónicamente se organizan formando las llamadas unidades

remodeladoras del hueso (BMU), las cuales se encargan de recambiar una

cantidad determinada de hueso en un sitio especifico del esqueleto. Una

BMU mantiene su integridad funcional por 4 a 8 meses, con un rango de 3

meses a 2 años. Aproximadamente un millón de BMU están activas en el

esqueleto de un adulto sano, en un momento dado, con una tasa de

recambio óseo anual de alrededor del 8-10%. En el calcáneo, las BMU crean

lagunas y ellas se mueven a través de la superficie; en hueso cortical, BMU

se mueven a través de la matriz ósea incrementando la porosidad

(Srivastava, 2005).

Durante la resorción ósea, los osteoclastos crean lagunas de resorción ósea

con microambientes de pH bajos, donde se disuelve la matriz inorgánica

exponiendo la matriz orgánica (mas del 90% de la matriz orgánica esta

compuesta de colágeno tipo I). A medida que la resorción ósea avanza las

enzimas de los osteoclastos digieren la matriz ósea orgánica liberando

35

productos de colágeno tipo I, los cuales incluyen fragmentos de péptidos de

ambos extremos, es decir telopéptidos N-terminales del colágeno tipo I

llamados NTx y telopéptidos C-terminales del colágeno tipo I llamados CTx

y anillos estructurales llamados crosslink de piridinolina (Bonde, 1994).

Normalmente la laguna de resorción creada por los osteoclastos es

completamente llena por material osteoide secretado por los osteoblastos.

Las células mesenquimales son atraídas por las BMU a los sitios de

resorción y estas finalmente se diferencian a osteoblastos. Los osteoblastos

activos secretan osteocalcina (OC), péptidos del pro-colágeno tipo I (N-

terminal – PINP y C – terminal – PICP) y fosfatasa alcalina especifica de

hueso (ALP); la concentración de OC, PINP, PICP y ALP en suero se

correlaciona con la tasa de formación ósea (Miller, 1999).

La formación ósea se completa con la mineralización, la cual ocurre en dos

fases. La primera fase ocurre inmediatamente después de la formación del

osteoide, cuando los cristales de hidroxiapatita son depositados entre la

matriz orgánica. La segunda fase incluye un proceso de mineralización más

lento que se extiende por meses a medida que más mineral es adicionado.

Secundario a la mineralización incrementa la densidad mineral ósea, pero no

el volumen de hueso nuevo (Agerback, 1991).

La formación y resorción ósea se encuentra en equilibrio en un individuo

sano. El pico máximo de masa ósea se alcanza a los 30 años tanto en

mujeres como en hombres y aproximadamente 0.4% de hueso es perdido

por año después de esta edad. Adicionalmente del 1% al 2% de hueso es

perdido por año en los primeros 5 años de la menopausia (Manolagas,

2000).

36

Desde el punto de vista clínico es útil distinguir los marcadores de formación

(expresión de la actividad osteoblastica) y los marcadores de la resorción

(índice de la actividad osteoclastica) (Tabla 2), aun cuando debe tenerse en

cuenta que algunos marcadores reflejan, al menos en parte, ambas fases del

ciclo de renovación ósea.

Tabla 2. Marcadores de Remodelamiento Óseo

FORMACIÓN RESORCIÓN

Marcador Origen Marcador Origen

Fosfatasa Alcalina Total Hueso, hígado,

intestino, riñón,

placenta

TRAP Hueso, plaquetas

Fosfatasa Alcalina Ósea Hueso Piridinolina Hueso, cartílago,

tendón, vasos

sanguíneos

Osteocalcina Hueso Plaquetas Deoxipiridinolina Hueso, Dentina

Péptidos del procolágeno 1 Hueso, tejidos

blandos, piel

N-telopéptidos Hueso (colágeno

1)

C-telopéptidos Hueso (colágeno

1)

Hidroxiprolina Hueso, cartílago,

tejidos blando,

piel

Sialoproteína Hueso, dentina

Delmas, P. D., Eastell, R. and Garmero, P. (2000). The use of biochemical

markers of bone turnover in osteoporosis. Osteoporosis. Suppl. 6. 2 – 17.

37

Por otra parte, la mayoría de los marcadores se encuentran no solo en el

hueso, si no en otros tejidos lo que les resta especificidad. Además, los

marcadores bioquímicos no son específicos de enfermedad pero reflejan

alteraciones en el metabolismo esquelético (Srivastava, 2005).

6.1 TIPOS DE MARCADORES 6.1.1 Marcadores de Formación Ósea 6.1.1.1 Fosfatasa Alcalina Total y Fosfatasa Alcalina Ósea. La fosfatasa

alcalina (FA) es una enzima que interviene en la formación ósea y en la

mineralización del osteoide. Aunque puede originarse en muchos tejidos, en

condiciones normales 50% de la FA sérica proviene del hígado y el otro 50%

es de procedencia ósea (Delmas, 2000).

6.1.1.2 Osteocalcina. La osteocalcina es una proteína con tres residuos de

ácido gamma-carboxiglutámico, que le proporcionan una característica de

apetencia por el calcio. Cuando se forma, parte de ella no se deposita en el

hueso, sino que pasa a la sangre, donde su determinación proporciona un

índice de la actividad osteoblástica (Woitge, 2001).

6.1.1.3 Propéptidos amino y carboxiterminal del procolágeno I. El

colágeno del hueso procede de una molécula de procolágeno sintetizada por

los osteoblastos. Al ser liberada sufre una escisión de sus extremos amino y

carboxiterminal, que resulta en la formación de la molécula de colágeno por

un lado y de los péptidos de los extremos amino y carboxilo por el otro. Estos

se conocen como “protelopéptidos amino y carboxiterminal del colágeno I”

(PINP – PICP respectivamente), y constituyen también un índice de actividad

osteoblástica (Delmas, 2000).

38

6.1.2 Marcadores de Resorción

La mayor parte de los mismos son productos de la degradación de la

molécula de colágeno.

6.1.2.1 Hidroxiprolina. La hidroxiprolina (HYP) es un aminoácido procedente

de la destrucción del colágeno presente en los diferentes tejidos, e incluso

del colágeno de la dieta. Lo primero le confiere una enorme inespecificidad, y

lo segundo obliga a hacer una dieta especial cuando se le quiere determinar.

La HYP se mide en orina; una alternativa a la realización de la dieta exenta

de colágeno, es su determinación en la orina de la segunda micción de la

mañana, con el sujeto en ayunas. En la actualidad, la medición de HYP es de

poca utilidad (Delmas, 2000).

6.1.2.2 Puentes de Piridinolina y Deoxipiridinolina (o puentes piridínicos). La piridinolina (Pid) y la deoxipiridinolina (Dpid) son puentes

formados entre las regiones terminales de las fibras de colágeno, durante su

maduración. La degradación del colágeno origina la liberación de los puentes

y de los distintos péptidos, constituye en consecuencia un índice de la

resorción ósea. Son marcadores mucho más específicos que la HYP, porque

son independientes de la dieta y también porque se encuentran en pocos

tejidos diferentes al hueso (la Pid se encuentra también en el cartílago, los

ligamentos y los vasos. La Dpid en la dentina). Los puentes piridínicos (Pid –

Dpid) se determinan en la orina (Woitge, 2001).

6.1.2.3 Péptidos Terminales o Telopéptidos del Colágeno. Los péptidos

terminales o telopéptidos se pueden medir en sangre o en orina. El

telopéptido carboxiterminal se puede determinar en dos formas, la primera el

octapéptido CTX (Carboxi – Terminal), también conocido como crosslaps; la

segunda, el ICTP (Colagen TeloPeptide I) o CTX-MMP (péptido

39

Carboxiterminal generado por metaloproteasas de la Matriz). El telopéptido

aminoterminal constituye el NXT u osteomark. Actualmente los N o C

telopéptidos se consideran los mejores índices de recambio óseo (Woitge,

2001).

6.1.2.4 Fosfatasa Ácida Resistente a Tartrato. Es una enzima implicada

en la actividad osteoclastica; se determina en la sangre. La complejidad de la

técnica y su relativa inespecificidad la hacen de poca utilidad (Delmas, 2000).

40

5. CONCLUSIONES

Los osteoclastos son componentes críticos en el mantenimiento de la

homeostasis ósea, y se originan a partir de precursores hematopoyéticos que

dan origen a células del Sistema Inmune. Existe una clara relación entre el

Sistema Inmune y el Sistema Óseo dependiente en ocasiones de diferentes

citocinas. De estas citocinas las cuales inicialmente se creía tenían un papel

único en la regulación del sistema inmune ahora se conoce que participan en

la diferenciación y función de los osteoclastos, de manera positiva o negativa

en la homeostasis ósea.

41

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