Organophosphate-degradating Snail

7/26/2019 Organophosphate-degradating Snail

1/13

KARYA ILMIAH BIOTEKNOLOGI HEWAN (BI3203)

Keong Mas Pendegradasi Organofosfat: Insersi Gen Fosfotriesterase

(PTE) Sintetik ke Dalam Kromosom Keong Mas (Pomacea

canaliculata)

Disusun oleh:

Mhd Fauzi Ramadhani Nasution

10612025

Diajukan sebagai ujian akhir semester (UAS) mata kuliah Bioteknologi Hewan (BI3203)

PROGRAM STUDI BIOLOGI

SEKOLAH ILMU DAN TEKNOLOGI HAYATI

INSTITUT TEKNOLOGI BANDUNG

BANDUNG

2015


2/13

BAB I

PENDAHULUAN

1.1

Latar Belakang

Salah satu cara pengontrolan hama adalah dengan menggunakan pestisida. Salah

satu golongan pestisida yang paling banyak digunakan adalah organofosfat. Berdasarkan

data dari Departemen Kesehatan Republik Indonesia pada tahun 1994, penggunaan

pestisida yang ditujukan untuk serangga (insektisida) mencapai 55,42% di seluruh

Indonesia. Penggunaan pestisida golongan organofosfat sebanyak 23,29% di seluruh

Indonesia berdasarkan data dari Departemen Kesehatan Republik Indonesia pada tahun

1998. Organofosfat dapat terakumulasi di dalam tubuh dan merupakan salah satu

penyebab utama keracunan dan kematian akibat keracunan di dunia. Organofosfat

merupakan senyawa yang dapat menghambat kerja enzim asetilkolin esterase. Hal ini

dapat menyebabkan munculnya berbagai efek samping bahkan kematian (Titah, 2003;

Costa, 2013).

Keong mas (Pomacea canaliculata) merupakan spesies invasif yang banyak

ditemukan di sawah di negara-negara Asia. Saat ini, keong mas hanya dimanfaatkan

sebagai bahan makanan untuk hewan ternak dan manusia di beberapa negara, seperti

Indonesia, Malaysia, dan Cina (Dong et al., 2012). Berdasarkan data yang diperoleh dari

Ditjen Sarana dan Prasarana, Kementerian Pertanian RI pada tahun 2012, luas lahan

sawah di seluruh Indonesia sekitar 8,1 juta Ha.

Salah satu cara untuk mengurangi pencemaran organofosfat pada lahan sawah

sekaligus meningkatkan daya guna keong mas adalah melalui pembuatan keong mas

transgenik yang dapat mendegradasi organofosfat. Keong transgenik ini dikembangkan

dengan cara menyisipkan gen yang mengkode enzim pendegradasi organofosfat, yaitu

fosfotriesterase (PET), pada zigot keong mas (Rochu et al., 2002). Harapannya, keong

tersebut dapat mensekresikan enzim PET ke saluran pencernaan untuk dibuang bersama

feses. Enzim PET kemudian bekerja di dalam air untuk mendegradasi organofosfat yang

terlarut di dalam air. Keong mas transgenik ini sangat potensial untuk dikembangkan di

Indonesia karena Indonesia memiliki sawah yang sangat luas (8,1 juta Ha) dan tingginya


3/13

penggunaan organofosfat pada lahan pertanian, termasuk sawah. Selain itu, keong mas

yang bersifat invasif juga mendukung pengembangan teknologi ini.

1.2

Tujuan

Tujuan yang diharapkan dari penulisan gagasan ini adalah tulisan ini dapat dimanfaatkan

sebagai acuan dalam pengembangan salah satu metode untuk mengurangi pencemaran

organofosfat pada lahan pertanian (sawah) berbasis organisme transgenik.


4/13

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

1.1Organofosfat

Organofosfat merupakan sekelompok senyawa yang banyak digunakan sebagai

insektisida. Organofosfat banyak digunakan sebagai insektisida setelah salah satu jenis

organofosfat, yaitu parathion, berhasil disintesis pada tahun 1994. Secara umum, struktur

organofosfat seperti yang ditunjukkan pada gambar 2.1. X pada gambar tersebut disebut

sebagai leaving group yang akan digantikan oleh gugus lain ketika organofosfat

mengalami reaksi. R1 dan R2 merupakan gugus alkoksi, seperti OCH3. Jenis-jenis

organofosfat yang banyak digunakan sebagai insektisida meliputiparathion, malathion,

chlorpyrifos, metamidophos, diazinon,guthion, dan dichlorvos(Costa, 2013).

Gambar 2.1 Struktur Umum Organofosfat (Costa, 2013)

Sebagai insektisida, organofosfat bekerja dengan cara menghambat kerja enzim

asetilkolin esterase (AchE) dengan cara memfosforilasi enzim tersebut. Hal ini

menyebabkan AchE yang seharusnya menghidrolisis asetilkolin menjadi tidak dapat

bekerja dengan semestinya. Hal ini menyebabkan terjadinya akumulasi asetilkolin pada

sinapsis kolinergik. Efek yang dapat ditimbulkan dari peristiwa tersebut adalah terjadinya

overstimulasi reseptor asetilkolin, tipe muskarinik dan nikotinik, yang dapat memicu

terjadinya kejang-kejang, kegagalan pernafasan, dan lain-lain bahkan kematian (Costa,

2013).

Hal yang sama juga terjadi pada kasus keracunan organofosfat pada manusia.

Organofosfat merupakan salah satu penyebab utama terjadinya keracunan dan kematian

akibat keracunan. Di dalam tubuh, organofosfat mengalami biotransformasi di dalam hati

oleh enzim sitokrom P450 (CYP). CYP dapat menyebabkan aktivasi (melalui

desulfurasi) menjadi metabolit aktif (oxon) maupun detoksikasi (organofosfat dan oxon


5/13

mengalami dealkilasi dan dearilasi). Keracunan akut organofosfat terjadi pada berbagai

organ dan menyebabkan berbagai efek, seperti bronkokonstriksi dan peningkatan sekresi

bronkus pada saluran pernafasan. Hal ini dapat menyebabkan sulit bernafas. Selain itu,

efek keracunan akut organofosfat adalah paralisis, pandangan kabur, peningkatan

produksi saliva, air mata, urin, dan keringat, hipotensi, pusing, koma, bahkan kematian

(Costa, 2013).

1.2Keong Mas (Pomacea canali culata)

Keong mas (Pomacea canaliculata) atau yang dalam bahasa Inggris disebut sebagai

golden apple snailmerupakan hama utama bagi tanaman padi di negara-negara Asia.

Spesies invasif ini merupakan hewan yang berasal dari Amerika Selatan. Keong mas

memiliki cangkang yang berbentuk globular dengan ukuran tinggi, lebar, dan panjang

masing-masing 40-60 mm, 45-75 mm, dan 150 mm. Cangkang keong mas berwarna

kuning, hijau, atau coklat. Tubuh keong mas dilengkapi dengan operculum yang dapat

ditarik (retractable). Warna tubuh keong mas bervariasi mulai dari kuning hingga coklat

dan hampir hitam (Holswade & Kondapalli, 2013).

Keong mas mencapai masa kematangan seksual mulai dari umur 2 bulan hingga 3

tahun dan ketika diameter tubuh mencapai 25 mm. Keong mas mampu menghasilkan

telur sebanyak 200-600 telur setiap minggunya. Keong mas meletakkan telurnya yang

berwarna kemerahan di atas suatu permukaan objek. Setelah berumur 1-2 minggu, telur

keong mas menetas dan menjadi juvenil selama 15-25 hari. Reproduksi keong mas

dipengaruhi oleh ketersediaan makanan dan kondisi lingkungan (Holswade & Kondapalli,

2013).

Makanan keong mas berupa alga, tumbuhan yang mengapung atau tenggelam,

detritus, dan serangga mati. Keong mas memiliki perilaku yang unik di mana keong mas

akan mencari makan di darat pada malam hari dan bersembunyi di dekat permukaan air

selama siang hari. Keong mas menyukai lingkungan dengan suhu di atas 25oC (Holswade

& Kondapalli, 2013).


6/13

Gambar 3.2 Keong Mas dan Telurnya (Holswade & Kondapalli, 2013)

1.3Enzim Fosfotriesterase(PTE)

Fosfotriesterase (PTE) merupakan enzim yang dapat mengkatalisis hidrolisis

berbagai macam senyawa organofosfat, seperti parathion, VX, soman, dan sarin. PTE

ditemukan pada bakteri tanah yang disebut Pseudomonas diminuta. PTE memiliki

potensi yang sangat besar sebagai agen dekontaminasi senyawa organofosfat, mulai dari

insektisida yang dipakai di dalam pertanian hingga nerve agent. Saat ini, telah banyak

metode yang digunakan untuk mendegradasi organofosfat, seperti biokomposit PTE-silikon dan biodegradasi in situ (Roodvelt & Tawfik, 2005).

PTE merupakan protein homodimer yang tersusun atas (/)8barreldengan pusat

katalitik berupa dua ion zink (Zn2+) yang dihubungkan ke bagian protein melalui interaksi

dengan asam amino dan air (Roodvelt & Tawfik, 2005). Mekanisme aksi PTE diawali

dengan deprotonasi molekul air menjadi molekul air aktif yang siap menyerang atom

fosfor sentral pada molekul organofosfat (gambar 2.3). Ion zink berperan sebagai tempat

pengikatan ion hidroksida dan katalis dalam pelepasan leaving group. Aktivitas PTE

dapat dihambat oleh dithiothreitol, dithioerithritol, dan -merkaptonetanol (Dumas et al.,

1989).


7/13

Gambar 2.3 Mekanisme Aksi PTE (Dumas et al., 1989)


8/13

BAB III

PENGEMBANGAN

3.1 Metode Pengembangan

Untuk mendapatkan keong mas pendegradasi organofosfat, diperlukan serangkaian

penelitian. Penelitian yang perlu dilakukan meliputi konstruksi vektor insersi yang

mengandung gen yang akan diinsersi ke kromosom keong mas, transformasi vektor

insersi ke zigot keong mas, dan screening keong mas transgenik. Setelah keong mas

transgenik didapatkan, galur murni keong mas transgenik tersebut dikembangkan dengan

cara mengawinkan sesama keong transgenik. Selanjutnya, dilakukan serangkaian

pengujian parameter keberhasilan pengembangan keong mas transgenik yang meliputi

uji aktivitas enzim fosfotriesterase yang dihasilkan oleh keong mas transgenic tersebut.

3.1.1 Konstruksi Vektor Insersi

Vektor insersi yang digunakan adalah vektor sintesik yang didasarkan pada

sekuens vektor retrovirus. Semua gen fungsional dan oripada sekuens vektor tersebut

dihilangkan sehingga menyisakan sekuens nonfungsional. Konstruksi vektor insersi

yang digunakan adalah seperti yang terlihat pada gambar 3.1. Pada vektor tersebut akan

ditambahkan sekuens cDNA gen GHF10-Pc1 dan terminator gen tersebut (TGHF10-Pc1)

dari keong mas (Pomacea canaliculata) (Imjongjirak et al., 2008), Co2+/Co2+-PTE dari

bakteriPseudomonas diminuta (Rochu et al., 2002), dan GFP dari ubur-uburAequorea

victoria (Haseloff et al, 1997). Gen GHF10-Pc1 merupakan gen yang mengkode enzim

selulase pada keong mas. Kedua gen tersebut hanya diekspresikan pada saluran

pencernaan dan hepatopankreas keong mas (Imjongjirak et al., 2008). Gen Co2+/Co2+-

PTE merupakan gen yang mengkode enzim fosfotriesterase yang berfungsi untuk

mendegradasi organofosfat (Rochu et al., 2002). GFP digunakan sebagai reporter gene

(Haseloff et al, 1997). Pada gen Co2+

/Co2+

-PTE dan GFP ditambahkan sekuens yang

mengkode signal peptide agar enzim fosfotriesterase dan GFP yang dihasilkan dapat

disekresikan ke luar sel.


9/13

Gambar 3.1 Konstruksi Vektor Insersi

Selanjutnya, vektor didesain sedemikian rupa menggunakan software tertentu.

Dari desain yang didapatkan, sekuens vektor insersi tersebut dibagi-bagi menjadi

beberapa potongan (tergantung ukuran vektor tersebut) dengan panjang masing-masing

potongan sebesar 300-400 bp. Potongan-potongan nukleotida tersebut kemudian

disintesis. Potongan nukleotida hasil sintesis tersebut diamplifikasi menggunakan PCR.

Primerforward dan reverse yang digunakan spesifik untuk setiap potongan dan pada

primer reverse setiap potongan ditambahkan beberapa nukleotida (>15 nukleotida)

dengan urutan yang sama dengan beberapa nukleotida pertama dari ujung 5 potongan

DNA yang akan diletakakkan setelah masing-masing potongan DNA, kecuali pada

potongan terakhir. Hal ini bertujuan untuk membuat sekuens yang saling tumpang

tindih antarpotongan nukleotida yang bersebelahan. Selanjutnya, potongan-potongan

tersebut digabungkan menggunakan prosedur Gibson DNA assembly. Teknik

penggabungan merupakan salah satu teknik penggabungan potongan DNA berdasarkan

overlapping sequence (Gibson et al., 2009; Gibson, 2011). Hasilnya adalah vektor

sintetik linear.

3.1.2 Transformasi Vektor Insersi

Transformasi vektor insersi dilakukan dengan cara menginjeksi zigot keong mas.

Injeksi dilakukan menggunakan prosedur yang sama dengan prosedur in vitro

fertilization. Insersi pada zigot bertujuan untuk memperbesar kemungkinan gen

Co2+/Co2+-PTE dan GFP terinsersi ke kromosom sel-sel penyusun dinding saluran

pencernaan dan sel-sel sekretoris hepatopankreas.

Di dalam zigot keong mas, vektor insersi diharapkan mengalami insersi di antara

gen GHF10-Pc1 dan terminatornya. Desain vektor insersi yang sedemikian rupa

bertujuan agar gen Co2+/Co2+-PTE dan GFP dapat terinsersi di antara gen GHF10-Pc1

dan terminatornya melalui rekombinasi homolog yang melibatkan protein-protein yang


10/13

dimiliki oleh sel keong mas (Adams, 2004). Proses rekombinasi homolog yang

diharapkan terjadi dijelaskan secara diagramatis pada gambar 3.2. Setelah rekombinasi

terjadi diharapkan gen Co2+/Co2+-PTE dan GFP mengalami transkripsi ketika gen

GHF10-Pc1 mengalami transkripsi. Diharapkan, enzim fosfotriesterase dan GFP dapat

disekresikan ke dalam saluran pencernaan keong mas dan ikut dibuang bersama feses.

Hal ini bertujuan agar enzim fosfotriesterase dapat mendegradasi organofosfat yang

terdapat di dalam air. Selain itu, GFP dapat dijadikan indikator untuk mengetahui

apakah gen Co2+/Co2+-PTE dan GFP berhasil diinsersi.

Gambar 3.2 Proses Insersi Vektor Melalui Rekombinasi Homolog

3.1.3 Screening dan Perbanyakan Keong Mas Transgenik

Screening keong transgenik dilakukan terhadap semua keong yang telah

ditransformasi. Screening dilakukan pada keong juvenil yang berumur 1 hari

(Imjongjirak et al., 2008). Masing-masing keong juvenil tersebut dimasukkan ke dalam

wadah tertentu yang berisi air dan didiamkan beberapa saat. Kemudian, setiap wadah

disinari sinar UV untuk melihat apakah terdapat fluorosensi sinar UV. Keberadaan

fluoresensi menunjukkan bahwa insersi gen PTE dan GFP berhasil dilakukan pada


11/13

keong yang dimasukkan ke dalam wadah tersebut. Dengan kata lain, keong tersebut

merupakan keong transgenik. Setelah keong transgenik didapatkan, dilakukan

perbanyakan individu transgeni dengan cara mengawinkan sesama keong transgenik

(Lipinski et al., 2012).

3.2 Parameter Keberhasilan

Parameter keberhasilan pengembangan keong mas transgenik pendegradasi

organofosfat adalah kemampuan keong tersebut untuk menghasilkan dan mensekresikan

enzim PET serta aktivitas enzim PET untuk mendegradasi organofosfat di dalam air.


12/13

DAFTAR PUSTAKA

Adams, D. J., P. J. Biggs, T. Cox, R. Davies, L. van der Weyden, J. Jonkers, J. Smith, B.

Plumb, R. Taylor, I. Nishijima, Y. Yu, J. Rogers, & A. Bradley. 2004. Mutagenic

Insertion and Chromosome Engineering Resource (MICER). Nature Genetics, 36(8):1-5.

Costa, L. G. 2013. Toxic Effects of Pesticides.In: Klaassen, C. D. (ed.). Casarett and Doulls

Toxicology: The Basic Science of Poisons. New York: McGraw-Hill.

Ditjen Sarana dan Prasarana Kementerian Pertanian RI. 2012. Audit Lahan Pertanian.

[Online]http://psp.pertanian.go.id/index.php/page/lahan_audit diakses tanggal 13 Mei

2015.

Dong, S., G. Zheng, X. Yu, & C. Fu. 2012. Biological Control of Golden Apple Snail,

Pomacea canaliculataby Chinese Soft-Shelled Turtle,Pelodiscus sinensisin the Wild

Rice,Zizania latifoliaField. Scientia Agricola, 69(2): 142-146.

Dumas, D. P., S. R. Caldwell, J. R. Wild, & F. M. Raushel. 1989. Purification and Properties

of the Phosphotriesterase from Pseudomonas diminuta. The Journal of Biological

Chemistry, 264(33): 19659-19665.

Gibson, D. G., L. Young, R. Y. Chuang, J. C. Venter, C. A. Hutchison, & H. O. Smith. 2009.

Enzymatic Assembly of DNA Molecules up to Several Hundred Kilobases. Nature

Methods(6)5: 343-345.

Gibson, D. G. 2011. Enzymatic Assembly of Overlapping DNA Fragments. Methods in

Enzymology498: 349-361.

Haseloff, J., K. R. Siemering, D. C. Prasher, & S. Hodge. 1997. Removal of a Cryptic Intron

and Subcellular Localization of Green Fluorescent Protein are Required to Mark

TransgenicArabidopsisPlants Brightly.PNAS, 94: 2122-2127.

Holswade, E. & A. Kondapalli. 2013. Pomacea canaliculata. [Online]

http://animaldiversity.org/accounts/Pomacea_canaliculata/ diakses pada tanggal 13

Mei 2015.

Imjongjirak, C., P. Amparyup, & S. Sittipraneed. 2008. Cloning, Genomic Organization and

Expression of Two Glycosyl Hydrolase Family 10 (GHF10) Genes from Golden Apple

Snail (Pomacea canaliculata).DNA Sequence, 19(3): 224-236.

Lipinski, D., J. Zeyland, M. Szalata, A. Plawski, M. Jarmuz, J. Jura, A. Korcz, Z. Smorag,

M. Pienkowski, & R. Slomski. 2012. Expression of Human Growth Hormone in the

Milk of Transgenic Rabbits with Transgene Mapped to the Telomere Region of

Chromosome 7q.Journal of Applied Genetics, 53: 435-442.
http://psp.pertanian.go.id/index.php/page/lahan_audithttp://animaldiversity.org/accounts/Pomacea_canaliculata/http://animaldiversity.org/accounts/Pomacea_canaliculata/http://psp.pertanian.go.id/index.php/page/lahan_audit


13/13

Rochu, D., N. Beaufet, F. Renault, N. Viguie, & P. Masson. 2002. The Wild Type Bacterial

Co2+/Co2+-Phosphotriesterase Shows a Middle-Range Thermostability. Biochimica et

Biophysica Acta, 1594(2): 207-218.

Roodveldt, C. & D. S. Tawfik. 2005. Directed Evolution of Phosphotriesterase from

Pseudomonas diminuta for Heterologous Expression in Escherichia coli Results in

Sabilization of the Metal-Free State. Protein Engineering, Design & Selection, 18(1):

51-58.

Titah, H. S. 2003. Pengaruh Pajanan Inhalasi Campuran Insektisida Klorpirifos dan

Profenofos terhadap Aktivitas Enzim Asetilkolinesterase pada Tikus Putih (Rattus

novergicus) Galur Wistar. Tesis Program Pasca Sarjana Teknik Lingkungan, ITB,

Bandung.

Organophosphate-degradating Snail

Documents

Transcript of Organophosphate-degradating Snail