OPTIMASI PEMBUATAN EKSTRAK ETANOLIK KAYU … PDF/F. Farmasi/Farmasi/068114164_full.pdf ·...
Transcript of OPTIMASI PEMBUATAN EKSTRAK ETANOLIK KAYU … PDF/F. Farmasi/Farmasi/068114164_full.pdf ·...
OPTIMASI PEMBUATAN EKSTRAK ETANOLIK
(Caesalpinnia sappan
APLIKASI METODE DESAIN FAKTORIAL
Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat
Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm)
UNIVERSITAS SANATA DHARMA
i
PEMBUATAN EKSTRAK ETANOLIK KAYU SECANG
Caesalpinnia sappan L.) SECARA SOXHLETASI :
APLIKASI METODE DESAIN FAKTORIAL
SKRIPSI
Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat
Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm)
Program Studi Ilmu Farmasi
Oleh:
Dyah Shaula Yalapuspa
NIM : 068114164
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS SANATA DHARMA
YOGYAKARTA
2010
KAYU SECANG
SECARA SOXHLETASI :
ii
OPTIMASI PEMBUATAN EKSTRAK ETANOLIK KAYU SECANG (
iii
OPTIMASI PEMBUATAN EKSTRAK ETANOLIK KAYU SECANG
iv
HALAMAN PERSEMBAHAN
Tanpa pengetahuan kerajinanpun tidak baik
Orang yang tergesa-gesa akan salah langkah
Amsal 19 : 2Amsal 19 : 2Amsal 19 : 2Amsal 19 : 2
Seek His will in all you do, and Seek His will in all you do, and Seek His will in all you do, and Seek His will in all you do, and
He will direct your paths He will direct your paths He will direct your paths He will direct your paths
Proverbs 3 : 6Proverbs 3 : 6Proverbs 3 : 6Proverbs 3 : 6
Kupersembahkan buat :
Tuhanku, Papa,Mama, mbak, adek,teman-teman
dan almamaterku
v
vi
PRAKATA
Puji syukur ke hadirat Tuhan atas berkat, hikmat, kekuatan dan kasih
karunia-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi yang berjudul
“Optimasi Pembuatan Ekstrak Etanol Kayu Secang (Caesalpinnia Sappan L.)
Secara Soxhletasi : Aplikasi Metode Desain Faktorial” ini dengan baik.
Skripsi ini disusun untuk memenuhi salah satu persyaratan agar dapat
memperoleh gelar S. Farm Program Studi Farmasi Fakultas Farmasi Universitas
Sanata Dharma Yogyakarta.
Skripsi ini dapat terselesaikan karena adanya dukungan dari berbagai
pihak. Pada kesempatan ini penulis hendak mengucapkan terimakasih kepada:
1. Rita Suhadi, M.si., Apt. selaku Dekan Fakultas Farmasi Universitas Sanata
Dharma
2. Christine Patramurti, M.si., Apt. selaku Dosen Pembimbing atas perhatian,
arahan, dan bimbingannya selama penelitian dan penyusunan skripsi
3. Yohanes Dwiatmaka, M.Si. selaku dosen penguji yang telah berkenan menguji
dan memberikan masukan serta saran kepada penulis
4. Jeffry Julianus, M.Si. selaku dosen penguji yang telah berkenan menguji dan
memberikan masukan serta saran kepada penulis
5. Romo Sunu atas bantuan dan sarannya yang menginspirasi penulis
6. Papa, Mama, Mbak Nunki, dan Carin atas doa, cinta, dukungan moril, dan
materiil yang telah diberikan selama ini
vii
7. Uthie dan Astina atas semua tawa dan tangis yang dilewati bersama selama
penelitian, lembur bersama kalian sangat menyenangkan
8. Pak Parlan, Mas Bimo, dan Mas Kunto atas bantuan dan bimbingannya selama
penelitian
9. Dela, Riri, Grace, Yoki, Anton, Win, Rani, Cica, Lina, Aan, Iwan, Yakub, Iren
dan teman-teman farmasi angkatan 2006 yang tidak bisa penulis sebutkan satu
persatu atas kebersamaan kita selama ini
10. Berbagai pihak yang terlibat dalam penyusunan skripsi, terimakasih atas
kerjasamanya
Penulis menyadari bahwa dalam penulisan skripsi ini terdapat banyak
kekurangan, oleh karena itu penulis sangat terbuka atas kritik dan saran serta
masukan demi kebaikan di masa yang akan datang.
Akhir kata penulis berharap semoga skripsi ini dapat berguna bagi
pembaca sekalian.
Penulis
viii
ix
INTISARI
Secang (Caesalpinnia sappan L.) merupakan tanaman yang mengandung
senyawa utama sub tipe struktur brazilin, yaitu brazilin, brazilein, dan 3-O-metil
brazilin. Kumpulan senyawa tersebut disebut komposit brazilin.
Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui pengaruh konsentrasi cairan
penyari, jumlah sirkulasi ekstraksi, dan interaksinya terhadap area under curve
(AUC) komposit brazilin dan untuk mengetahui titik optimum dari hubungan
konsentrasi cairan penyari dan jumlah sirkulasi ekstraksi yang menghasilkan AUC
komposit brazilin optimum.
Penelitian dilakukan dengan rancangan desain faktorial 2 faktor 3 level.
Faktor konsentrasi cairan penyari level rendah yaitu 4 %, level tengah 50 % dan
level tinggi 100 % dan faktor jumlah sirkulasi level rendah yaitu 1 kali, level
tengah 3 kali dan level tinggi 5 kali. Metode ekstraksi yang digunakan adalah
soxhletasi. Komposit brazilin diisolasi dari ekstrak dengan menggunakan
kromatografi lapis tipis lalu diukur AUC nya menggunakan TLC densitometric
scanner.
Hasil penelitian menunjukkan bahwa konsentrasi cairan penyari, jumlah
sirkulasi ekstraksi, dan interaksinya berpengaruh secara signifikan terhadap AUC
komposit brazilin. Faktor yang paling dominan adalah konsentrasi cairan penyari.
Titik optimum berada pada konsentrasi cairan penyari 68, 22 % dengan jumlah
sirkulasi 1,57 kali yang menghasilkan AUC prediksi teoritis sebesar 16.835,62
sampai 19.311,48.
Kata Kunci : Secang, brazilin, brazilein, 3-O-metil brazilin, soxhletasi, optimum,
desain faktorial, AUC, densitometri
x
ABSTRACT
Sappan wood (Caesalpinnia sappan L.) is a plant that contains brazilin
sub-type structure as the main compounds, namely brazilin, brazilein, and 3-O-
methyl brazilin. Collection of this compounds is called brazilin composite.
This study aims to determine the effect of fluid concentration, the number
of circulating extraction, and their interaction to the area under curve (AUC) of
brazilin composite and to determine the optimum concentration and the optimum
number of fluid circulation extraction yield optimum AUC of brazilin composite.
Research carried out by factorial design with 2 factors 3 level, low level of
fluid concentration factor is 4 %, middle level is 50 % and high level is 100 % and
the low-level of circulation factor is 1 times, middle level is 3 times and high level
is 5 times. Extraction method used is soxhletation. Brazilin composite isolated
from extracts by using thin layer chromatography and its AUC was measured
using TLC scanner densitometric.
The results showed that the fluid concentration, number of circulating
extraction, and their interaction significantly affect the AUC brazilin composite.
The most dominant factor is the fluid concentration. Optimum point is at 68, 22 %
fluid concentration with 1,57 times the number of circulation that produces AUC
theoretical predictions 16.835,62 to 19.311,48.
Keywords: Sappan wood, brazilin, brazilein, 3-O-methyl brazilin, soxhletation,
optimum, factorial design, AUC, densitometry
xi
DAFTAR ISI
HALAMAN JUDUL.......................................................................................... i
HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING................................................. ii
HALAMAN PENGESAHAN............................................................................ iii
HALAMAN PERSEMBAHAN......................................................................... iv
PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI ............................................ v
PRAKATA......................................................................................................... vi
PERNYATAAN KEASLIAN KARYA............................................................ viii
INTISARI........................................................................................................... ix
ABSTRACT......................................................................................................... x
DAFTAR ISI...................................................................................................... xi
DAFTAR TABEL.............................................................................................. xv
DAFTAR GAMBAR......................................................................................... xvi
DAFTAR LAMPIRAN..................................................................................... xviii
BAB I PENGANTAR........................................................................................ 1
A. Latar Belakang............................................................................................. 1
1. Perumusan masalah.................................................................................. 2
2. Keaslian penelitian................................................................................... 3
3. Manfaat penelitian................................................................................... 3
B. Tujuan............................................................. ............................................. 4
BAB II PENELAAHAN PUSTAKA................................................................. 5
A. Secang........................................................................................................... 5
xii
1. Keterangan botani.................................................................................... 5
2. Nama daerah............................................................................................ 5
3. Kegunaan................................................................................................. 5
4. Kandungan kimia..................................................................................... 6
5. Komposit brazilin..................................................................................... 6
B. Penyarian...................................................................................................... 7
1. Ekstrak...................................................................................................... 7
2. Cairan penyari.......................................................................................... 7
3. Metode ekstraksi secara soxhletasi........................................................... 8
C. Kromatografi Lapis Tipis (KLT) ................................................................. 10
D. Densitometri.................................................................................................. 11
E. Desain Faktorial............................................................................................ 13
F. Landasan Teori............................................................................................. 15
G. Hipotesis....................................................................................................... 16
BAB III METODE PENELITIAN..................................................................... 17
A. Jenis dan Rancangan Penelitian.................................................................... 17
B. Variabel dan Definisi Operasional................................................................ 17
1. Identifikasi variabel.................................................................................. 17
2. Definisi operasional.................................................................................. 18
C. Bahan dan Alat............................................................................................. 18
1. Bahan penelitian....................................................................................... 18
2. Alat penelitian .......................................................................................... 19
D. Tata Cara Penelitian...................................................................................... 19
xiii
1. Pengumpulan bahan.................................................................................. 19
2. Identifikasi tanaman dan kayu.................................................................. 19
3. Pembuatan simplisia................................................................................. 20
4. Pembuatan serbuk kayu secang................................................................ 21
5. Analisis kualitatif komposit brazilin........................................................ 21
6. Penyarian secara soxhletasi...................................................................... 22
7. Pembuatan ekstrak kering........................................................................ 23
8. Isolasi komposit brazilin dengan KLT..................................................... 23
9. Pengukuran AUC komposit brazilin dengan
TLC scanner densitometric...................................................................... 24
E. Analisis Hasil............................................................................................... 24
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN……………………………………... 25
A. Pengumpulan Bahan.................................................................................... 25
B. Identifikasi Tanaman dan Kayu................................................................... 26
C. Pembuatan Simplisia................................................................................... 31
D. Pembuatan Serbuk Kayu Secang................................................................ 33
E. Analisis Kualitatif Komposit Brazilin......................................................... 33
F. Penyarian secara Soxhletasi........................................................................ 40
G. Pemisahan Komposit Brazilin dengan KLT................................................ 43
H. Pengukuran AUC Komposit Brazilin dengan
TLC Scanner Densitometric......................................................................... 45
BAB V KESIMPULAN DAN SARAN............................................................. 53
A. KESIMPULAN............................................................................................ 53
xiv
B. SARAN........................................................................................................ 53
DAFTAR PUSTAKA....................................................................................... 54
LAMPIRAN...................................................................................................... 56
BIOGRAFI PENULIS...................................................................................... 75
xv
DAFTAR TABEL
Tabel I Rancangan percobaan berdasarkan desain faktorial..................... 23
Tabel II Hasil identifikasi secara kimia pada filtrat serbuk kayu................ 28
Tabel III Warna masing-masing bercak hasil pemisahan dengan
KLT sebelum dan sesudah disemprot bufer fosfat pH 7.............. 36
Tabel IV Hasil penelusuran panjang gelombang serapan maksimum
bercak komposit brazilin menggunakan
spektrofotometer visibel................................................................ 39
Tabel V Rendemen hasil penyarian secara soxhletasi................................. 42
Tabel VI Hasil pengukuan Rf bercak berbagai percobaan............................. 44
Tabel VII Hasil penelusuran panjang gelombang serapan maksimum
bercak komposit brazilin menggunakan
TLC Scanner Densitometric.......................................................... 46
Tabel VIII Hasil pengukuran AUC komposit brazilin................................... 46
Tabel IX Hasil perhitungan nilai efek hubungan
antara faktor dan respon................................................................ 48
Tabel X Hasil perhitugan Yate’s treatment.................................................. 52
xvi
DAFTAR GAMBAR
Gambar 1. Struktur brazilein, struktur 3-O-metil brazilin,
dan brazilin.................................................................................. 6
Gambar 2. Diagram soxhlet extractor .......................................................... 9
Gambar 3. Diagram prinsip kerja TLC scanner............................................. 12
Gambar 4. Desain penelitian 2 faktor 3 level................................................. 14
Gambar 5. Batang secang segar...................................................................... 25
Gambar 6. Biji secang, daun secang, dan bunga secang................................. 27
Gambar 7. Reaksi asam basa brazilin berwarna kuning menjadi
brazilein berwarna merah saat ditambah basa............................ 29
Gambar 8. Reaksi pembentukan senyawa kompleks brazilin
dengan timbal (II) asetat.............................................................. 31
Gambar 9. Reaksi pembentukan senyawa kompleks brazilin
brazilin dengan FeCl3................................................................... 31
Gambar 10. Simplisia kayu secang................................................................ 32
Gambar 11. Profil KLT analisis kualitatif komposit brazilin sebelum
disemprot bufer fosfat dan setelah disemprot
bufer fosfat................................................................................. 35
Gambar 12. Reaksi asam basa 3-O-metil brazilin berwarna kuning menjadi
3-O-metil brazilein berwarna merah saat ditambah basa........... 36
Gambar 13. Interaksi brazilin, 3-O-metil brazilin dengan fase gerak........... 38
Gambar 14. Interaksi brazilin, 3-O-metil brazilin dengan fase diam............ 39
xvii
Gambar 15. Spektra hasil penetapan panjang gelombang serapan
maksimum bercak komposit brazilin menggunakan
spektrofotometer visibel........................................................... 40
Gambar 16. Profil kromatogram KLT berbagai percobaan.......................... 44
Gambar 17. Spektrum hasil penetapan panjang gelombang serapan
maksimum bercak komposit brazilin menggunakan
TLC Scanner Densitometric..................................................... 46
Gambar 18. Kurva hasil pengukuran AUC komposit brazilin..................... 47
Gambar 19. Grafik hubungan antara konsentrasi penyari dengan
AUC komposit brazilin............................................................. 49
Gambar 20. Grafik hubungan antara jumlah sirkulasi dengan
AUC komposit brazilin.............................................................. 49
Gambar 21. Countour plot 3D AUC komposit brazilin............................... 51
xviii
DAFTAR LAMPIRAN
Lampiran 1. Foto hasil identifikasi secara kimia pada
filtrat serbuk kayu................................................................... 57
Lampiran 2. Foto proses soxhletasi dan ekstrak kering.............................. 58
Lampiran 3. Foto KLT isolasi komposit brazilin........................................ 59
Lampiran 4. Kurva hasil pengukuran AUC komposit brazilin................... 61
Lampiran 5. Data rendemen hasil penyarian secara soxhletasi.................. 64
Lampiran 6. Contoh cara menghitung rendemen....................................... 65
Lampiran 7. Contoh cara menghitung standard error
dan coeffitient of variance...................................................... 66
Lampiran 8. Data hasil perhitungan Rf berbagai percobaan...................... 67
Lampiran 9. Contoh cara menghitung persamaan desain faktorial............ 68
Lampiran 10. Contoh cara menghitung nilai efek
menggunakan yate’s treatment.............................................. 70
Lampiran 11. Contoh cara menghitung signifikansi
dengan yate’s treatment......................................................... 72
Lampiran 12. Cara menghitung titik optimum............................................ 74
1
BAB I
PENGANTAR
A. Latar Belakang
Kayu secang merupakan tanaman pagar yang banyak tumbuh di Indonesia.
Biasanya ekstrak cair kayu secang digunakan sebagai pewarna merah pada
makanan dan minuman. Ekstrak secang juga sudah sejak lama dipakai untuk
pelancar sirkulasi darah, antioksidan, obat diare, dan agen imunosupresif (Fu et
al., 2008). Selain itu, ekstrak secang juga berkhasiat sebagai analgetik, antipiretik,
desinfektan, tonikum, dan obat penyakit kulit (Chairul dkk., 1995) serta dapat
menjadi kontrasepsi bagi pria karena bersifat antifertilitas pada sperma (Shih,
1990).
Kayu secang memiliki banyak kegunaan sehingga sangat mungkin untuk
dikembangkan menjadi obat tradisional seperti jamu, obat herbal terstandar,
maupun fitofarmaka. Untuk menjadi bahan awal obat tradisional, tumbuhan diolah
terlebih dahulu menjadi ekstrak. Syarat mutlak mutu ekstrak adalah kandungan zat
aktif yang stabil (Anonim, 2000). Kandungan zat aktif dalam ekstrak stabil jika
proses pembuatan ekstrak terkendali. Oleh karena itu, penulis tertarik untuk
melakukan optimasi pembuatan ekstrak kayu secang.
Metode ekstraksi yang dipilih adalah soxhletasi karena pengerjaannya
mudah, cepat, dan cairan penyari yang digunakan lebih sedikit dibandingkan
metode ekstraksi lainnya (Anonim, 1986).
2
Optimasi yang hendak dilakukan adalah optimasi konsentrasi cairan
penyari. Cairan penyari yang dipilih adalah etanol karena brazilin yang
merupakan senyawa utama dalam kayu secang sangat larut dalam etanol. Etanol
juga dipertimbangkan sebagai penyari karena kapang dan kuman sulit tumbuh
dalam etanol 20 % ke atas, tidak beracun, inert, dan panas yang diperlukan untuk
pemekatan relatif kecil namun belum diketahui konsentrasi etanol yang dapat
mengekstraksi brazilin secara optimal sehingga perlu dioptimasi. Selain itu agar
proses pembuatan ekstrak terkendali, penulis juga tertarik untuk mengoptimasi
jumlah sirkulasi ekstraksi yang optimum untuk mengekstraksi brazilin secara
optimal.
Dalam penelitian ini penulis menggunakan aplikasi desain faktorial dalam
merancang penelitian karena lebih efisien dan memperkecil trial and error serta
dapat diperkirakan faktor yang dominan dalam menentukan respon (dalam hal ini
jumlah komposit brazilin yang dihasilkan) (Armstrong dan James, 1996).
1. Perumusan masalah
Berdasarkan latar belakang di atas, maka timbul permasalahan :
a. Bagaimana pengaruh konsentrasi cairan penyari, jumlah sirkulasi
ekstraksi, dan interaksinya terhadap area under curve komposit brazilin?
b. Apakah diperoleh titik optimum dari hubungan konsentrasi cairan penyari
dan jumlah sirkulasi ekstraksi yang menghasilkan area under curve
komposit brazilin optimum?
3
2. Keaslian penelitian
Penelitian mengenai optimasi konsentrasi cairan penyari dan jumlah
sirkulasi ekstraksi kayu secang (Caesalpinnia sappan L.) secara soxhletasi
menggunakan aplikasi metode desain faktorial belum pernah dilakukan. Adapun
penelitian yang telah dilakukan sebelumnya adalah tentang stabilitas warna zat
aktifnya (brazilin) pada perbedaan pH dan suhu pemanasan, cara sintesis brazilin,
modifikasi menjadi pewarna oily, aktivitas antioksidan, serta isolasi dan
karakterisasi brazilin (Putrandana, 2003 ; Ramdhan, 2004 ; Penpun, 2005 ; Huang
et al., 2005 ; Dong-Kyu et al., 2007).
3. Manfaat penelitian
a. Manfaat metodologis
Penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi mengenai pengaruh
konsentrasi penyari, jumlah sirkulasi dan interaksi keduanya terhadap
AUC komposit brazilin dan titik optimum hubungan konsentrasi cairan
penyari dan jumlah sirkulasi ekstraksi yang menghasilkan komposit
brazilin secara optimum dari kayu secang secara soxhletasi.
b. Manfaat praktis
Penelitian ini diharapkan dapat mempermudah proses ekstraksi secara
soxhletasi dalam memperoleh komposit brazilin optimum.
4
B. Tujuan
Penelitian ini dilakukan untuk mengetahui :
1. Pengaruh konsentrasi cairan penyari, jumlah sirkulasi ekstraksi, dan
interaksinya terhadap area under curve komposit brazilin.
2. Titik optimum dari hubungan konsentrasi cairan penyari dan jumlah sirkulasi
ekstraksi yang menghasilkan area under curve komposit brazilin optimum.
5
BAB II
PENELAAHAN PUSTAKA
A. Secang
1. Keterangan botani
Secang merupakan suatu tanaman yang biasa tumbuh di daerah tropis.
Secang biasa dijumpai sebagai tanaman pagar dan biasa hidup pada ketinggian
500-1000 m diatas permukaan laut. Tanaman secang termasuk dalam famili
Caesalpiniaceae, suku Caesalpinia dan jenis Caesalpinia sappan (Anonim, 1985;
Tjitrosoepomo, 1994).
2. Nama daerah
Tanaman secang mempunyai beberapa nama daerah, diantaranya adalah
Sumatra : Seupang (Aceh), Sopang (Batak), Cacang (Minangkabau).
Jawa : Secang (Sunda), Kayu Cang (Madura)
Nusa Tenggara : Cang (Bali), Sepang (Sasak), Sepe (Roti)
Sulawesi : Kayu Sema (Manado), Sapang (Makasar)
Maluku : Sunyiha (Ternate), Roro (Tidore) (Anonim, 1986).
3. Kegunaan
Secang biasa dipakai dalam bentuk ekstrak cair sebagai pewarna alami
merah. Selain itu secang juga dipakai sebagai obat tradisional, yaitu untuk
pelancar sirkulasi darah, antioksidan, obat diare, dan agen imunosupresif (Fu et
al., 2008). Secang juga berkhasiat sebagai analgetik, antipiretik, desinfektan,
tonikum, dan obat penyakit kulit (Chairul dkk., 1995). Penelitian menyatakan
6
secang juga dapat menjadi kontrasepsi bagi pria karena bersifat antifertilitas pada
sperma (Shih, 1990).
4. Kandungan kimia
Kayu tanaman secang mengandung asam galat, asam tanat, saponin,
minyak atsiri, resin, dan senyawa fenolik (Perry, 1980). Senyawa fenolik dalam
batang secang dibagi dalam empat sub tipe struktur, yaitu brazilin, kalkon,
protosapanin, dan homoisoflavonoid. Derivat protosapanin antara lain
protosapanin B dan isoprotosapanin B, 10-O-metilprotosapanin B dan 10-O-
metilisoprotosapanin B, epimernya adalah protosapanin E1 dan protosapanin E2.
Epimer homoisoflavonoid adalah sapanol dan episapanol, 4-O-metilsapanol dan
4-O-metilepisapanol, 3'-O-metilsapanol dan 3'-O-metilepisapanol. Derivat kalkon
adalah sapankalkon dan 3-deoksisapankalkon. Derivat brazilin adalah brazilein
dan 3-O-metilbrazilin (Fu et al., 2008).
5. Komposit brazilin
Komposit brazilin adalah kumpulan senyawa yang memiliki sub tipe
struktur brazilin, yang terdiri dari brazilin, brazilein, dan 3-O-metil brazilin.
brazilein 3-O-metil brazilin brazilin
Gambar 1. Struktur brazilein, 3-O-metil brazilin, dan bra/zilin (Fu et al., 2008)
Brazilin adalah zat warna secang yang berwarna kuning pada pH asam.
Jika teroksidasi atau dalam pH basa akan berubah menjadi brazilein yang
7
berwarna merah, reaksi ini berlangsung bolak-balik, sedangkan 3-O-metil brazilin
adalah turunan brazilin (Fu et al., 2008).
Komposit brazilin merupakan senyawa identitas kayu secang, merupakan
senyawa yang tahan terhadap pemanasan, larut dalam air, dan sangat larut dalam
etanol (Anonim, 1976). Untuk analisis kualitatif, panjang gelombang maksimum
komposit brazilin dalam buffer fosfat pH 7,4 berada pada 541 nm (Penpun, 2005).
B. Penyarian
Penyarian atau ekstraksi adalah kegiatan penarikan kandungan kimia yang
terlarut supaya terpisah dari bahan yang tidak dapat larut dengan pelarut cair.
Faktor yang mempengaruhi kecepatan penyarian adalah kecepatan difusi cairan
penyari (Anonim, 1986).
1. Ekstrak
Ekstrak adalah sediaan kental yang diperoleh dengan mengekstraksi
senyawa aktif dari simplisia nabati atau hewani menggunakan pelarut yang sesuai,
kemudian semua atau hampir semua pelarut diuapkan menjadi ekstrak kental atau
ekstrak kering (Anonim, 1986). Ekstrak cair adalah sediaan dari simplisia nabati
yang mengandung etanol sebagai pelarut atau sebagai pengawet ( Anonim, 2000 ).
2. Cairan penyari
Cairan penyari yang digunakan dalam proses pembuatan ekstrak adalah
pelarut yang optimal untuk senyawa kandungan yang berkhasiat atau aktif, dengan
demikian senyawa tersebut dapat terpisahkan dari bahan dan dari senyawa
kandungan lainnya. Ekstrak yang diperoleh hanya mengandung sebagian besar
8
senyawa yang diinginkan. Dalam hal ekstrak total, maka cairan pelarut dipilih
yang melarutkan hampir semua metabolit sekunder yang terkandung (Anonim,
2000).
Pemilihan cairan penyari harus mempertimbangkan banyak faktor. Cairan
penyari yang baik harus memenuhi kriteria berikut ini :
a. murah dan mudah diperoleh
b. stabil secara fisika dan kimia
c. bereaksi netral
d. tidak mudah menguap dan tidak mudah terbakar
e. selektif yaitu hanya menarik zat berkhasiat yang dikehendaki
f. tidak mempengaruhi zat berkhasiat
g. diperbolehkan oleh peraturan
Farmakope Indonesia menetapkan sebagai cairan penyari digunakan air,
etanol air atau eter. Etanol dapat melarutkan alkaloid basa, minyak menguap,
glikosida, kurkumin, kumarin, antrakuinon, flavonoid, steroid, damar, dan klorofil
lemak, malam, tanin, dan saponin hanya sedikit larut. Dengan demikian zat
penggangu yang larut hanya terbatas (Anonim, 1986).
3. Metode ekstraksi secara soxhletasi
Soxhletasi merupakan metode penyarian berkesinambungan. Prinsipnya
adalah pelarut di labu penampung diuapkan, uap naik ke atas melalui pipa
samping dan diembunkan kembali oleh pendingin tegak lalu menetes turun ke
tabung berisi serbuk simplisia yang dibungkus kertas saring. Cairan penyari yang
menetes akan melarutkan zat aktif dan bila volumenya telah mencapai permukaan
9
sifon, seluruh cairan akan turun kembali lagi ke labu penampung dan diuapkan
kembali. Proses sirkulasi ini berlangsung terus-menerus sehingga zat aktif yang
hendak diekstraksi harus tahan terhadap pemanasan (Anonim, 1986).
Kelebihan metode soxhletasi :
a. Uap panas tidak melalui serbuk simplisia tetapi melalui pipa samping.
b. Cairan penyari yang diperlukan lebih sedikit daripada metode ekstraksi
lainnya dan secara langsung diperoleh hasil ekstrak yang lebih pekat
c. Serbuk simplisia disari dengan cairan penyari yang murni sehingga dapat
menyari zat aktif lebih banyak, dan
d. Penyarian dapat diteruskan sesuai keperluan tanpa menambah volume
cairan penyari
Gambar 2. Diagram soxhlet extractor (Mitra, 2003)
Kekurangan metode soxhletasi :
a. Larutan dipanaskan terus-menerus sehingga kurang cocok untuk zat aktif
yang tidak tahan pemanasan
b. Cairan penyari dididihkan terus-menerus sehingga penyari yang baik harus
murni atau campuran azeotrop (Anonim, 1986).
10
C. Kromatografi Lapis Tipis (KLT)
Kromatografi lapis tipis adalah metode pemisahan fisikokimia. Lapisan
yang memisahkan terdiri dari butiran padat (fase diam) yang ditempatkan pada
penyangga dari pelat gelas atau penyangga yang cocok. Campuran yang akan
dipisahkan berupa larutan, ditotolkan pada salah satu bagian tepi pelat sebanyak
0,01-10 µg zat (Khopkar, 1990). Totolan dapat berupa bercak atau pita (untuk
KLT-preparatif). Lalu pelat diletakkan dalam bejana tertutup rapat yang telah
jenuh berisi larutan pengembang yang cocok (fase gerak), pemisahan terjadi
selama perambatan kapiler (pengembangan) (Stahl, 1985).
Bercak yang terjadi dapat dideteksi dengan cara fisika maupun kimia. Cara
fisika untuk substansi yang berfluoresensi maupun yang tidak berfluoresensi pada
lampu ultra violet. Untuk senyawa yang tidak berfluoresensi, pada penjerap
ditambahkan indikator fluoresensi sehingga bercak akan kelihatan gelap dengan
latar belakang yang berfluoresensi. Deteksi secara kimia dapat dilakukan dengan
penyemprotan. Bercak disemprot atau diuapi dengan pereaksi tertentu, kemudian
diamati di bawah sinar tampak atau lampu UV. Setelah penyemprotan, kadang-
kadang perlu dilakukan pemanasan (Stahl, 1969).
Metode KLT dapat digunakan untuk analisis baik yang bersifat kualitatif
maupun kuantitatif. Dasar analisis yang bersifat kualitatif adalah dengan
membandingkan jarak Rf dan warna bercak dengan zat baku.
Rf gerakfaseolehditempuhyangjarak
zatolehditempuhyangjarak=
11
Harga Rf adalah tetapan fisika yang dipengaruhi oleh beberapa faktor, seperti tebal
lapisan penjerap, kejenuhan bejana, kelembapan udara, fase gerak, bahan
penjerap, dan suhu (Sastroamidjojo, 1985).
Untuk analisis kuantitatif dapat dilakukan dengan dua cara. Pertama,
ditetapkan secara tidak langsung, yaitu mengambil bercak pada pelat, kemudian
disari dengan penyari yang cocok dan selanjutnya ditetapkan kadarnya dengan
metode spektrofotometri (Stahl, 1969).
Cara yang kedua, yaitu ditetapkan secara langsung dengan
membandingkan luas bercak dan kerapatan noda sampel yang telah di-klt dengan
densitometri. Dengan cara ini kadar zat ditetapkan dengan mengukur luas dan
intensitas bercak yang dibandingkan dengan zat pembandingnya (Stahl, 1969).
Berdasarkan penelitian sebelumnya yang dilakukan oleh Putrandana, 2003
fase gerak yang dapat menghasilkan komposit brazilin dari ekstrak kayu secang
adalah kloroform : metanol : aquadest (64 : 50 : 10 v/v) dengan fase diam selulosa.
D. Densitometri
Kromatogram hasil kromatografi lapis tipis biasanya dievaluasi secara
densitometri, yaitu mengukur kadar senyawa dengan mengukur kerapatan bercak
senyawa pada pelat KLT. Penetapan kadar dengan alat ini dapat dilakukan dengan
dua cara. Pertama, setiap kali penetapan ditotolkan sediaan baku dari senyawa
yang bersangkutan, yang di elusi bersama sampel dalam satu lempeng kemudian
dibandingkan nilai AUC-nya. Kedua, dengan membuat kurva baku hubungan
antara zat baku dengan AUC (Mintarsih, 1990).
Alat TLC Scanner
bercak-bercak yang ada di lempeng tipis atau lempeng tipisnya yang dapat
digerakkan menyusuri berkas sinar yang be
1990).
Teknik pengukurannya dapat didasarkan atas sinar yang diserap
(absorbansi), sinar yang dipantulkan (reflaktansi) atau sinar yang difluoresensikan
(fluoresensi). Teknik pengukuran berdasarkan reflaktansi, dimana sinar datang
sebagian diserap dan sebagian dipantulkan. Banyaknya sinar yang diserap
sebanding dengan jumlah zat pada ber
1990).
Gambar 3.
Keterangan :
1 : Lampu
2 : Lensa
3 : Slit monokromator
4 : Monokromator grating
5 : Cermin
6 : Piringan celah slit
7 : Sistem lensa
Sifat pemantulan ini menjadi sensitif dan selektif jika sinar yang datang
adalah sinar monokromatis. Biasanya dipilih sinar pada panjang gelombang yang
diserap atau dipantulkan paling banyak oleh bercak yang diteliti. Banyaknya sinar
TLC Scanner mempunyai sumber sinar yang dapat digerakkan di atas
bercak yang ada di lempeng tipis atau lempeng tipisnya yang dapat
digerakkan menyusuri berkas sinar yang berasal dari sumber sinar (Mintarsih,
Teknik pengukurannya dapat didasarkan atas sinar yang diserap
sinar yang dipantulkan (reflaktansi) atau sinar yang difluoresensikan
(fluoresensi). Teknik pengukuran berdasarkan reflaktansi, dimana sinar datang
sebagian diserap dan sebagian dipantulkan. Banyaknya sinar yang diserap
sebanding dengan jumlah zat pada bercak yang terkena sinar tersebut (Mintarsih,
Gambar 3. Diagram prinsip kerja TLC scanner
8 : Cermin
9 : Beam splitter
10 : Reference photomultiplier
grating 11 : Objek yang di scan
12 : Photomultiplier pengukur
13 : Photodiode (transmisi)
(Sherma dan Fried, 2003)
Sifat pemantulan ini menjadi sensitif dan selektif jika sinar yang datang
adalah sinar monokromatis. Biasanya dipilih sinar pada panjang gelombang yang
diserap atau dipantulkan paling banyak oleh bercak yang diteliti. Banyaknya sinar
12
at digerakkan di atas
bercak yang ada di lempeng tipis atau lempeng tipisnya yang dapat
rasal dari sumber sinar (Mintarsih,
Teknik pengukurannya dapat didasarkan atas sinar yang diserap
sinar yang dipantulkan (reflaktansi) atau sinar yang difluoresensikan
(fluoresensi). Teknik pengukuran berdasarkan reflaktansi, dimana sinar datang
sebagian diserap dan sebagian dipantulkan. Banyaknya sinar yang diserap
cak yang terkena sinar tersebut (Mintarsih,
Sifat pemantulan ini menjadi sensitif dan selektif jika sinar yang datang
adalah sinar monokromatis. Biasanya dipilih sinar pada panjang gelombang yang
diserap atau dipantulkan paling banyak oleh bercak yang diteliti. Banyaknya sinar
13
yang direfleksikan akan ditangkap oleh photomultiplier yang akan diteruskan ke
pencatat atau kromatogram. Luas puncak atau tinggi puncak sesuai dengan
konsentrasi senyawa pada bercak yang diukur kerapatannya. Bercak yang kecil
dan intensif akan menghasilkan puncak yang lebar dan tumpul (Mintarsih, 1990).
Prinsip TLC Scanner terlihat pada gambar 3 (Sherma dan Fried, 2003).
Pada umumnya, tebal lapisan tipis pada lempeng yang digunakan adalah
0,20-0,25 mm, maksimal 0,30 mm untuk mengurangi efek hamburan sinar yang
disebabkan oleh fase diam terhadap linearitas hubungan serapan dan konsentrasi
dari senyawa yang diteliti. Kurva serapan-konsentrasi ditentukan oleh harga
parameter hamburan yang disebabkan oleh fase diam. Harga parameter hamburan
tersebut tergantung ukuran dan distribusi partikel fase diam pada lempeng tipis
(Mintarsih, 1990).
E. Desain Faktorial
Desain faktorial merupakan teknik untuk memberikan model hubungan
antara variabel respon dengan satu atau lebih variabel bebas. Desain faktorial
merupakan suatu pilihan desain untuk menentukan berbagai efek dari faktor dan
interaksinya. Di dalam desain faktorial, level dari faktor yang digunakan termasuk
dalam variabel bebas (Bolton, 1990).
Metode ini dimulai dengan menentukan faktor dan level yang akan diteliti,
serta respon yang akan diukur. Respon yang didapat harus dapat diukur secara
kuantitatif sehingga ada tidaknya interaksi dan faktor yang berefek dominan dapat
diketahui (Bolton,1990).
14
Level desain faktorial yang biasa digunakan adalah dua level. Namun
kelemahannya adalah jika hubungan antara faktor dan respon tidak linear, maka
nilai maksimum dan minimum sesungguhnya tidak dapat terdeteksi sehingga
perlu digunakan lebih dari dua level (Armstrong dan James, 1996).
Notasi percobaan yang biasa dipakai dalam desain faktorial tiga level
adalah secara numerik, notasi 0 untuk level rendah, 1 untuk level tengah, 2 untuk
level tinggi. Bila digunakan dua faktor maka notasi menjadi dua digit nomor.
Sebagai contoh, 00 berarti kedua faktor berada pada level rendah dan 12 berarti
faktor pertama pada level tengah dan faktor ke dua pada level tinggi (Armstrong
dan James, 1996).
Gambar 4. Desain penelitian 2 faktor 3 level
Optimasi dua faktor tiga level dengan desain faktorial dilakukan
berdasarkan rumus :
Y = bo + b1X1 + b2X2 + b11X12 + b22X2
2 + b12X1X2)..............................................(1)
Keterangan :
Y : respon hasil atau sifat yang diamati
X1,X2 : faktor 1, faktor 2
bo ,b1 ,b2 ,b12 : koefisien, dapat dihitung dari hasil percobaan
15
Dari rumus (1) dan data yang diperoleh dapat dibuat contour plot suatu
respon tertentu yang sangat berguna dalam memilih komposisi campuran
optimum. Berdasarkan persamaan di atas, dengan substitusi secara matematis,
dapat dihitung besarnya efek masing-masing faktor, maupun efek interaksinya
Desain faktorial 2 faktor 3 level juga dapat dianalisis dengan ANOVA atau Yate’s
treatment untuk mengetahui besarnya efek dan signifikansi pengaruh tiap faktor
dan interaksinya terhadap respon (Bolton, 1990).
F. Landasan Teori
Senyawa identitas kayu secang adalah komposit brazilin yang pada pH
asam berwarna kuning dan pada pH basa berwarna merah. Komposit brazilin
terdiri dari brazilin, brazilein, dan 3-O-metil brazilin. Ketiga senyawa ini tahan
terhadap pemanasan sehingga dapat diekstraksi secara soxhletasi namun belum
diketahui jumlah sirkulasi yang dapat mengekstrak komposit brazilin secara
optimum sehingga perlu dioptimasi. Komposit brazilin larut dalam air dan sangat
larut dalam etanol sehingga cairan penyari yang cocok adalah air, etanol, dan
campuran air dan etanol, namun belum diketahui konsentrasi yang dapat
mengekstrak komposit brazilin secara optimum sehingga perlu dioptimasi.
Kromatografi lapis tipis dengan fase diam selulosa dan fase gerak
kloroform : metanol : aquadest (64 : 50 : 10 v/v) dapat digunakan untuk
memisahkan komposit brazilin dari senyawa lainnya. Bercak yang terdeteksi
sebagai komposit brazilin dapat diukur AUC nya dengan TLC scanner secara
densitometri pada panjang gelombang serapan maksimumnya.
16
Analisis yate’s treatment dapat digunakan untuk mengetahui pengaruh tiap
faktor dan interaksinya terhadap AUC komposit brazilin. Titik optimum
konsentrasi cairan penyari dan jumlah sirkulasi ekstraksi terhadap area under
curve (AUC) komposit brazilin dapat ditentukan dengan merumuskan persamaan
desain faktorial dan pembuatan countour plot. Hubungan antara faktor dan respon
sangat mungkin tidak linear sehingga lebih cocok digunakan desain faktorial dua
faktor tiga level.
G. Hipotesis
1. Konsentrasi cairan penyari, jumlah sirkulasi ekstraksi, dan interaksinya
mempengaruhi area under curve komposit brazilin secara signifikan.
2. Titik optimum yang menghasilkan AUC komposit brazilin optimum dapat
diperoleh dari rumus persamaan Y = bo + b1X1 + b2X2 + b11X12 + b22X2
2 +
b12X1X2 dan countour plot konsentrasi cairan penyari dan jumlah sirkulasi
ekstraksi terhadap AUC.
17
BAB III
METODE PENELITIAN
A. Jenis dan Rancangan Penelitian
Penelitian yang dilakukan termasuk jenis penelitian eksperimental quasi
menggunakan aplikasi desain faktorial. Penelitian dilakukan di Laboratorium
Kimia Organik dan Laboratorium Kimia Analisis Instrumen Fakultas Farmasi
Universitas Sanata Dharma Yogyakarta.
B. Variabel dan Definisi Operasional
1. Identifikasi variabel
a. Variabel bebas
Variabel bebas dalam penelitian ini adalah konsentrasi cairan penyari dan
jumlah sirkulasi ekstraksi.
b. Variabel tergantung
Variabel tergantung dalam penelitian ini adalah area under curve (AUC)
yang dihasilkan oleh bercak di pelat KLT yang mengandung komposit
brazilin.
c. Variabel pengacau terkendali
Variabel pengacau terkendali dalam penelitian ini adalah waktu panen dan
lingkungan tempat tumbuh tanaman secang.
18
2. Definisi operasional
a. Konsentrasi cairan penyari adalah konsentrasi air dalam etanol
b. Level rendah, level tengah, dan level tinggi konsentrasi cairan penyari
berturut-turut adalah 4%, 50%, dan 100%.
c. Jumlah sirkulasi ekstraksi adalah jumlah perputaran cairan penyari dari
labu penampung, menguap melewati pipa samping, mengembun,
melarutkan zat aktif di tabung soxhlet, dan kembali lagi ke labu
penampung.
d. Level rendah, level tengah, dan level tinggi jumlah sirkulasi ekstraksi
berturut-turut adalah 1 kali, 3 kali, dan 5 kali.
e. Soxhletasi adalah metode penyarian berkesinambungan menggunakan
soxhlet extractor yang suhunya disesuaikan agar penyari tetap mendidih.
f. Komposit brazilin adalah kumpulan senyawa yang memiliki sub tipe
struktur brazilin, yang terdiri dari brazilin, brazilein, dan 3-O-metil
brazilin.
g. Titik optimum adalah titik dimana proses soxhletasi menghasilkan AUC
komposit brazilin secara maksimal dengan konsentrasi cairan penyari
maksimum dan jumlah sirkulasi ekstraksi minimum.
C. Bahan dan Alat
1. Bahan penelitian
Bahan yang digunakan adalah simplisia dari kayu tanaman secang
(Caesalpinia sappan L.) yang diperoleh dari Desa Kemuning, Wonosari,
19
Yogyakarta, aquadest, air bebas CO2, etanol 96 %, FeCl3, Pb(CH3COOH)2,
KH2PO4, NaOH, KOH, pelat selulosa (E Merck), kloroform, metanol derajat pro
analisis (E Merck).
2. Alat penelitian
Alat yang digunakan dalam penelitian adalah blender (Retsch bv tipe ZM
1), ayakan 12 mesh dan 50 mesh, soxhlet extractor, alat-alat gelas, pelat tetes,
perangkat KLT, oven (Termaks, Salm en kipp bv), mantel heater (Pilz Heraeus-
Wittmann Heidelberg), waterbath (Salm en kipp bv), TLC densitometric scanner
(CAMAG TLC Scanner 3), neraca analitik (Mettler Toledo), detektor UV
(Minuvis Desaga Heidelberg), spektrofotometer (Perkin Elmer Lambda 20) dan
kuvet.
D. Tata Cara Penelitian
1. Pengumpulan bahan
Batang secang dikumpulkan pada hari yang sama sebanyak 20 kg dari
Desa Kemuning, Wonosari, Yogyakarta pada bulan Februari 2009 dalam keadaan
utuh, segar, dan masih basah.
2. Identifikasi tanaman dan kayu
a. Identifikasi morfologis pada tanaman
Identifikasi morfologis dilakukan dengan cara mencocokkan morfologi
tanaman dengan pertelaan pada monografi Caesalpinnia sappan L.
menurut Materia Medika Indonesia edisi I.
20
b. Identifikasi makroskopis kayu
Identifikasi makroskopis kayu dilakukan dengan cara mencocokkan
makroskopi kayu dengan ciri makroskopis simplisia kayu pada monografi
Caesalpinnia sappan L. menurut Materia Medika Indonesia edisi I.
c. Identifikasi secara kimia
Serbuk kayu sebanyak 100 mg dikocok dengan 5 ml metanol P selama 5
menit menghasilkan filtrat berwarna kuning kejinggaan kemudian
dilakukan percobaan sebagai berikut :
i. Tiga tetes filtrat diteteskan ke pelat tetes dan ditambah 1 tetes larutan
kalium hidroksida P 5 % b/v kemudian diamati warnanya.
ii. Tiga tetes filtrat diteteskan ke pelat tetes dan ditambah 1 tetes larutan
natrium hidroksida P 5 % b/v kemudian diamati warnanya.
iii. Tiga tetes filtrat diteteskan ke pelat tetes dan ditambah 1 tetes larutan
timbal (II) asetat P 5 % b/v kemudian diamati warnanya.
iv. Tiga tetes filtrat diteteskan ke pelat tetes dan ditambah 1 tetes larutan
besi (III) klorida P 5 % b/v kemudian diamati warnanya.
3. Pembuatan simplisia
Batang secang yang telah dikumpulkan disortasi basah, yaitu dipisahkan
dari bahan lainnya seperti daun dan bahan asing lainnya. Batang secang kemudian
dicuci dengan air bersih yang mengalir sampai kotoran yang melekat hilang.
Batang secang yang telah bersih dibuang kulitnya dan diserut tipis dengan
ketebalan 3-5 mm. Pengeringan dilakukan menggunakan oven pada suhu 60 oC.
Selama pengeringan kayu secang dibolak-balik posisinya supaya pemanasan
21
merata. Akhir pengeringan ditandai dengan mudah dipatahkannya simplisia dan
menimbulkan bunyi gemerisik jika diremas.
4. Pembuatan serbuk kayu secang
Pembuatan serbuk dilakukan dengan cara menghaluskan simplisia dengan
menggunakan blender selama 5 menit atau serbuk telah memenuhi 2/3 blender.
Serbuk yang dihasilkan kemudian diayak dengan ayakan 12/50 mesh.
5. Analisis kualitatif komposit brazilin
a. Pembuatan buffer fosfat. Kalium dihidrogen fosfat 0,2 M sebanyak
50,0 ml dimasukkan ke dalam labu ukur 200,0 ml dan ditambah dengan 29,1 ml
natrium hidroksida 0,2 N. Air bebas karbondioksida P ditambahkan sampai tanda.
b. Ekstraksi kayu secang secara soxhletasi. Tujuh gram serbuk simplisia
dibungkus dengan kertas saring dan dimasukkan ke dalam tabung soxhlet
extractor. Cairan penyari (50 % aquadest dalam etanol) sebanyak 150 ml
ditambahkan dan soxhlet extractor dipanaskan dengan mantel heater hingga
penyari mendidih. Suhu dijaga dan disesuaikan agar cairan penyari tetap
mendidih. Sirkulasi ekstraksi dilakukan sebanyak 5 kali. Ekstrak cair yang didapat
lalu dikeringkan di atas waterbath.
c. Isolasi dengan KLT preparatif. Ekstrak kering yang didapat dilarutkan
dalam etanol kemudian ditotolkan pada lempeng kromatografi 20 x 20 cm dengan
fase diam selulosa setebal 2 mm. Penotolan dilakukan sesempit mungkin berupa
pita atau garis lurus. Lempeng kromatografi dimasukkan ke dalam bejana yang
sebelumnya telah dijenuhkan dengan fase gerak berupa kloroform : metanol :
aquadest (64 : 50 : 10 v/v ). Pengembangan dilakukan sepanjang 15 cm. Lempeng
22
dikeringkan dan bercak disemprot dengan buffer fosfat. Bercak yang berwarna
merah kemudian dikerok dan dikumpulkan. Hasil kerokan ini dilarutkan dengan
etanol lalu disentrifugasi dengan kecepatan 2500 rpm selama 15 menit.
Supernatan yang didapat diuapkan hingga kering di atas waterbath.
d. Penetapan panjang gelombang serapan maksimum. Supernatan yang
telah kering dimasukkan ke dalam labu ukur kemudian ditambahkan buffer fosfat
sampai tanda, dikocok, dan disaring. Serapannya dibaca pada rentang panjang
gelombang yaitu 400-800 nm dengan menggunakan spektrofotometer dan
dilakukan replikasi sebanyak 3 kali dengan 3 konsentrasi yang berbeda.
6. Penyarian secara soxhletasi
Serbuk simplisia kurang lebih sebanyak 7,0 g ditimbang seksama lalu
dibungkus dengan kertas saring dan dimasukkan ke dalam tabung soxhlet
extractor. Cairan penyari sebanyak 150 ml ditambahkan dan soxhlet extractor
dipanaskan dengan mantel heater hingga penyari mendidih. Suhu soxhletasi
dijaga dan disesuaikan agar cairan penyari tetap mendidih. Soxhletasi dilakukan
menurut tabel I dan dilakukan replikasi sebanyak 3 kali.
23
Tabel I. Rancangan percobaan berdasarkan desain faktorial
Faktor
Percobaan
Konsentrasi
cairan penyari
(%)
Jumlah
sirkulasi
(kali)
00 4 1
10 50 1
20 100 1
01 4 3
11 50 3
21 100 3
02 4 5
12 50 5
22 100 5 Keterangan :
00 : konsentrasi cairan penyari level rendah jumlah sirkulasi level rendah
10 : konsentrasi cairan penyari level tengah jumlah sirkulasi level rendah
20 : konsentrasi cairan penyari level tinggi jumlah sirkulasi level rendah
01 : konsentrasi cairan penyari level rendah jumlah sirkulasi level tengah
11 : konsentrasi cairan penyari level tengah jumlah sirkulasi level tengah
21 : konsentrasi cairan penyari level tinggi jumlah sirkulasi level tengah
02 : konsentrasi cairan penyari level rendah jumlah sirkulasi level tinggi
12 : konsentrasi cairan penyari level tengah jumlah sirkulasi level tinggi
22 : konsentrasi cairan penyari level tinggi jumlah sirkulasi level tinggi
7. Pembuatan ekstrak kering
Ekstrak cair hasil soxhletasi diuapkan di atas waterbath pada suhu 80 oC
hingga diperoleh ekstrak kering. Berat ekstrak kering yang diperoleh dari tiap
percobaan dicatat dan dihitung rendemennya.
8. Pemisahan komposit brazilin dengan KLT
Ekstrak kering dilarutkan dalam etanol sampai 10 ml, diambil sebanyak 4
ml dan dimasukkan ke dalam labu 10 ml kemudian ditambah etanol hingga tanda.
Ekstrak tersebut kemudian ditotolkan pada lempeng kromatografi 20 cm x 10 cm
dengan fase diam selulosa setebal 0,25 mm. Penotolan dilakukan sebanyak 0,5
µL. Lempeng kromatografi kemudian dimasukkan ke dalam bejana yang
sebelumnya telah dijenuhkan dengan fase gerak berupa kloroform : metanol :
aquadest (64 : 50 : 10 v/v). Pengembangan dilakukan sepanjang 15 cm.
24
9. Pengukuran AUC komposit brazilin dengan TLC scanner densitometric
a. Penentuan panjang gelombang serapan maksimum
Lempeng KLT disemprot dengan buffer fosfat pH 7 hingga berwarna
merah merata. Serapan bercak kemudian ditelusuri pada rentang panjang
gelombang yaitu 400-600 nm dengan menggunakan TLC scanner
densitometric. Replikasi dilakukan sebanyak 2 kali.
b. Penetapan AUC komposit brazilin dengan KLT-densitometri
Bercak yang berwarna merah diukur AUC nya dengan TLC scanner
densitometric pada panjang gelombang serapan maksimum yang
didapatkan.
E. Analisis Hasil
1. Data AUC komposit brazilin yang telah diperoleh dianalisis dengan
menggunakan yate’s treatment untuk mengetahui signifikansi pengaruh tiap
faktor dan interaksinya terhadap AUC komposit brazilin dan untuk melihat
besarnya efek konsentrasi cairan penyari, jumlah sirkulasi, dan efek
interaksinya, sehingga dapat diketahui faktor yang paling dominan
mempengaruhi AUC komposit brazilin.
2. Data AUC komposit brazilin dianalisis berdasarkan metode desain faktorial
untuk mendapatkan nilai koefisien bo, b1, b2, b11, b22, b12 pada rumus
persamaan Y = bo + b1X1 + b2X2 + b11X12 + b22X2
2 + b12X1X2. Persamaan yang
didapat digunakan untuk pembuatan countour plot dan menentukan titik
optimum yang menghasilkan AUC komposit brazilin optimum.
25
BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
A. Pengumpulan Bahan
Batang secang diperoleh dari Desa Kemuning, Wonosari, Yogyakarta pada
bulan Februari 2009 dalam keadaan utuh, segar, dan masih basah. Hasil
pengumpulan batang secang diperoleh sebanyak 20, 6 kg.
Gambar 5. Batang secang segar
Pengumpulan dilakukan pada hari yang sama, kebun yang sama, dipanen
secara bersamaan dan dikumpulkan dalam jumlah yang cukup banyak karena
batang secang ini akan digunakan untuk keseluruhan proses penelitian dari awal
hingga akhir agar variabel pengacau seperti lingkungan tempat tumbuh dan waktu
panen dapat dikendalikan. Umur kayu secang yang dikumpulkan tidak diketahui,
namun menurut penelitian yang telah dilakukan pada kayu secang umur 2, 4, 6,
10, dan 30 tahun, umur kayu secang tidak mempengaruhi kadar brazilin dan
senyawa turunannya yang terkandung di dalamnya (Penpun, 2005).
26
B. Identifikasi Tanaman dan Kayu
Identifikasi tanaman dilakukan untuk memastikan bahwa identitas
tanaman yang digunakan dalam penelitian adalah Caesalpinnia sappan L. Hal ini
dilakukan berdasarkan Materia Medika Indonesia (MMI) edisi I. Identifikasi
dilakukan secara morfologis pada tanaman, secara makrokopis pada kayu, dan
secara kimia.
Hasil pengamatan morfologis tanaman adalah sebagai berikut : ranting-
ranting berduri, bentuk duri bengkok dan tersebar. Daun majemuk, panjang 20 cm
sampai 40 cm, bersirip, panjang sirip 7,5 cm sampai 15 cm; setiap sirip
mempunyai 10 sampai 20 pasang anak daun yang berhadapan. Anak daun tidak
bertangkai, bentuk lonjong, pangkal hampir rompang, ujung bundar serta sisinya
agak sejajar, panjang anak daun 10 mm sampai 25 mm, lebar 3 mm sampai 11
mm. Beberapa daun berada di luar kisaran yang ditetapkan MMI edisi I yaitu
panjang daun 25 cm sampai 40 cm dan panjang sirip 9 cm sampai 15 cm. Hal ini
dapat disebabkan oleh umur daun yang masih muda atau masih bertumbuh saat
dipanen sehingga panjang daun dan panjang sirip belum memenuhi kisaran yang
ditetapkan MMI edisi I.
Perbungaan berupa malai, terdapat di ujung, panjang malai 10 cm sampai
40 cm, panjang gagang bunga 15 cm sampai 20 cm, pinggir kelopak berambut,
panjang daun kelopak yang terbawah lebih kurang 10 mm, lebar lebih kurang 4
mm, empat daun kelopak lainnya panjang lebih kurang 7 mm, lebar lebih kurang 4
mm, panjang benang sari lebih kurang 15 mm, panjang putik lebih kurang 18 mm.
Polong berwarna hitam, panjang 8 cm sampai 10 cm, lebar 3 cm sampai 4 cm,
27
berisi 3 sampai 4 biji, panjang biji 15 mm sampai 18 mm, lebar 8 mm sampai 11
mm, tebal 5 mm sampai 7 mm. Hal ini sesuai dengan pertelaan pada monografi
Caesalpinnia sappan L berdasarkan Materia Medika Indonesia (MMI) edisi I.
Gambar 6. Bagian tanaman secang
Keterangan : a : polong secang c : bunga secang
b : daun secang
Hasil pengamatan makroskopis kayu adalah sebagai berikut : kayu keras
dan padat, berwarna merah jingga. Hal ini sesuai dengan pemerian makroskopis
pada monografi Caesalpinnia sappan L berdasarkan Materia Medika Indonesia
(MMI) edisi I.
Hasil identifikasi secara kimia seperti yang tersaji pada tabel II
menunjukkan bahwa dihasilkan warna ungu kemerahan dan ungu kecoklatan.
Adanya warna ungu merupakan reaksi positif menurut MMI edisi I. Warna yang
dihasilkan ini agak berbeda dengan pustaka yang diacu. Hal ini disebabkan oleh
perbedaan lingkungan tumbuh dan waktu panen antara tanaman penelitian dengan
tanaman yang dipakai sebagai acuan dalam pustaka, sehingga ada perbedaan
kandungan senyawa dalam tanaman dan mempengaruhi warna yang dihasilkan.
(c)
(a)
(b)
28
Tabel II.Hasil identifikasi secara kimia pada filtrat serbuk kayu
Identifikasi Reaksi positif
(menurut MMI) Hasil
KOH P 5 % b/v Ungu Ungu
kemerahan
NaOH P 5 % b/v Ungu Ungu
kemerahan
Timbal (II) asetat P
5 % b/v Ungu
Ungu
kecoklatan
Besi (III) klorida P
5 % b/v Ungu
Ungu
kecoklatan
Pada proses identifikasi kimia, penambahan metanol berfungsi untuk
mengekstraksi senyawa sub tipe struktur brazilin dari serbuk sehingga filtrat yang
dihasilkan berwarna kuning karena mengandung brazilin. Ketika filtrat yang
mengandung brazilin ditambah pereaksi basa (NaOH dan KOH) akan terjadi
reaksi asam basa yang menghasilkan brazilein yang berwarna ungu kemerahan
karena kromofornya semakin panjang (gambar 7). Kromofor adalah ikatan
berseling (terkonjugasi) antara ikatan tunggal dan ikatan ganda. Cahaya yang
mengenai kromofor akan diabsorbsi dengan mengeksitasi elektron dari ground
state menuju excited state.
Orbital molekul berpasangan yang tertinggi (the highest occupied
molecular orbital) sering disingkat HOMO adalah orbital pi ikatan. Orbital
molekul tak berpasangan yang terendah (the lowest unoccupied molecular orbital,
LUMO) adalah orbital pi anti-ikatan. Semakin banyak ikatan rangkap terkonjugasi
(kromofor semakin panjang) maka perbedaan energi antara orbital-orbital HOMO
dan LUMO makin kecil. Perbedaan ini menyebabkan energi yang diperlukan
untuk mengeksitasi elektron pada brazilein lebih rendah daripada brazilin.
Semakin rendah energi yang diperlukan untuk eksitasi elektron akan menggeser
29
panjang gelombang sinar tampak menjadi lebih panjang dan menyebabkan
intensitas warna yang lebih kuat. Hal ini yang menyebabkan perpanjangan
kromofor brazilin menjadi brazilein menghasilkan warna ungu kemerahan.
Na
HO
HO O-
OH
+ H2O
HO
HO O-
OH
+ Na
Na+OH
+
brazilein berwarna merah
Gambar 7. Reaksi asam basa brazilin menjadi brazilein saat ditambah basa
Keterangan : kromofor auksokrom
Filtrat yang ditambah dengan pereaksi timbal (II) asetat memiliki prinsip
reaksi yang sama saat filtrat ditambah pereaksi besi (III) klorida, yaitu membentuk
senyawa kompleks berwarna ungu seperti yang terlihat pada gambar 8 dan 9.
Senyawa kompleks adalah senyawa dengan ion logam sebagai atom pusat yang
memiliki orbital kosong berikatan dengan ion atau molekul yang memiliki
pasangan elektron bebas sebagai ligan. Menurut teori medan kristal ikatan antara
ion pusat dan ligan didasarkan atas gaya tarik elektrostatik. Medan listrik dari ion
pusat akan mempengaruhi ligan-ligan sekelilingnya dan medan gabungan dari
brazilin berwarna kuning
30
ligan-ligan akan mempengaruhi elektron-elektron dari ion pusat. Pengaruh ligan
ini terutama mengenai elektron di orbital d dari ion pusat. Ketika ligan mendekati
ion logam, elektron dari ligan akan berdekatan dengan beberapa orbital d logam
dan menjauhi yang lainnya, menyebabkan hilangnya kesamaan tingkat energi.
Elektron dari orbital d dan dari ligan akan saling tolak menolak. Oleh karena itu,
elektron d yang berdekatan dengan ligan akan memiliki energi yang lebih besar
dari pada elektron orbital d yang berjauhan dengan ligan, menyebabkan
pemisahan energi orbital d. Hal ini menyebabkan orbital terbagi menjadi 2 yaitu
orbital yang membentuk duplet berenergi lebih tinggi dan orbital yang
membentuk triplet berenergi lebih rendah maka ketika molekul tersebut menyerap
foton dari cahaya tampak, satu atau lebih elektron yang berada dalam orbital
tersebut akan meloncat dari orbital d yang berenergi lebih rendah ke orbital d yang
berenergi lebih tinggi, menghasilkan keadaam atom yang tereksitasi. Perbedaan
energi antara atom yang berada dalam keadaan dasar dengan yang berada dalam
keadaan tereksitasi sama dengan energi foton yang diserap dan berbanding
terbalik dengan gelombang cahaya. Hanya gelombang-gelombang cahaya (λ)
tertentu saja yang dapat diserap (gelombang yang memiliki energi sama dengan
energi eksitasi), sehingga senyawa kompleks akan memperlihatkan warna yang
berbeda-beda.
31
HO
O
HO
HO
Pb
HO
HO OH
OH
Pb (CH3COO)2
2
+ 2 CH3COOH
OH
O
OH
OH
2+
+
Gambar 8. Reaksi brazilin dengan timbal (II) asetat membentuk senyawa kompleks
berwarna ungu
HO
O
OH
OH
HO
O
OH
OH
OH
OHO
HO
Fe
HO
HO OH
OH
FeCl33
+ 3 HCl
3+
+
Gambar 9. Reaksi brazilin dengan besi (III) klorida membentuk senyawa kompleks
berwarna ungu
Hasil identifikasi secara morfologis, makroskopis, dan kimia yang didapat
telah sesuai dengan pustaka yang diacu, sehingga dapat disimpulkan bahwa
tanaman dan kayu yang akan digunakan pada penelitian merupakan Caesalpinnia
sappan L.
C. Pembuatan Simplisia
Proses pembuatan simplisia melewati beberapa tahap yaitu sortasi basah,
pencucian, perajangan, pengeringan, sortasi kering, dan penyimpanan. Batang
secang yang telah dikumpulkan disortasi basah agar terpisah dari bahan asing dan
brazilin
brazilin
timbal (II) asetat
kompleks berwarna ungu
asam asetat
kompleks berwarna ungu
besi (III) klorida asam klorida
32
kotoran lainnya. Pencucian batang secang dengan air bersih yang mengalir
dilakukan untuk membersihkan batang secang dari kotoran yang melekat.
Perajangan batang secang dilakukan dengan ketebalan 3-5 mm agar mudah
dikeringkan dan mempercepat waktu pengeringan. Pengeringan dilakukan dengan
oven pada suhu 60 oC. Pengeringan simplisia kayu dapat dilakukan pada suhu 30-
90 oC, namun suhu pengeringan yang terbaik adalah tidak melebihi 60
oC
(Anonim, 1985). Selama pengeringan bahan dibolak-balik posisinya supaya
pemanasan merata. Tujuan pengeringan adalah untuk meminimalkan kadar air
agar jamur dan kapang tidak dapat tumbuh sehingga simplisia dapat disimpan
tanpa mengalami penurunan kualitas. Selain itu, pengeringan juga dilakukan
untuk mempermudah difusi cairan penyari ke dalam simplisia saat proses
ekstraksi sehingga mempermudah proses penyarian komposit brazilin. Akhir
pengeringan ditandai dengan mudah dipatahkannya simplisia dan menimbulkan
bunyi gemerisik jika diremas, dengan asumsi kadar air ± 8 – 10 %. Hasil
pengeringan didapat simplisia kayu secang sebanyak 20 kg.
Gambar 10. Simplisia kayu secang
Simplisia kayu yang telah kering disortasi kering, yaitu dipisahkan dari
bagian tanaman lain yang tidak dinginkan dan disimpan. Penyimpanan dilakukan
dalam wadah bertutup rapat dan terlindung dari cahaya matahari langsung untuk
menjaga mutu simplisia selama penyimpanan.
33
D. Pembuatan Serbuk Kayu Secang
Simplisia yang telah kering dibuat menjadi serbuk dengan menggunakan
blender, dan diayak dengan ayakan 12 mesh dan 50 mesh. Hal ini dilakukan untuk
memperoleh serbuk yang tidak terlalu kasar dan tidak terlalu halus. Apabila
serbuk terlalu halus, dikuatirkan akan dapat menembus celah antar jahitan pada
kantung kertas saring saat proses soxhletasi namun jika serbuk terlalu kasar, maka
permukaan serbuk akan sulit ditembus oleh cairan penyari. Menurut ketentuan
umum Materia Medika Indonesia 4/18 adalah derajat halus serbuk yang optimum
namun pada penelitian digunakan ayakan 12 mesh dan 50 mesh. Perbedaan nomor
ayakan ini dikarenakan perbedaan satuan pada MMI dan alat yang tersedia. Pada
MMI jenis pengayak dinyatakan dengan nomor yang menunjukkan jumlah lubang
tiap 1 cm sedangkan pada alat yang tersedia jenis pengayak dinyatakan dengan
nomor yang menunjukkan jumlah lubang tiap 1 inch atau 2, 54 cm.
Menurut Farmakope Indonesi edisi III derajat halus serbuk yang
dinyatakan dengan 2 nomor dimaksudkan bahwa semua serbuk dapat melalui
pengayak dengan nomor terendah dan tidak lebih dari 40 % melalui pengayak
dengan nomor tertinggi. Hasil penyerbukan didapat serbuk kayu secang dengan
derajat halus serbuk 4/18.
E. Analisis Kualitatif Komposit Brazilin
Tujuan analisis kualitatif adalah untuk memastikan bahwa bercak yang
dianalisis merupakan bercak komposit brazilin. Analisis kualitatif dilakukan
34
berdasarkan hasil penelitian sebelumnya (Penpun, 2005) yaitu panjang gelombang
maksimum komposit brazilin dalam buffer fosfat pH 7 berada pada 541 nm.
Serbuk simplisia diekstraksi secara soxhletasi dengan cairan penyari 50 %
air dalam etanol, dan jumlah sirkulasi 5 kali. Konsentrasi yang dipilih adalah 50 %
karena pada konsentrasi tersebut jumlah air dan etanol sama banyak sehingga
dapat menjamin brazilin terekstraksi dan ekstrak yang didapat merupakan
representasi dari kelarutan brazilin dalam air dan etanol. Jumlah sirkulasi yang
dipilih adalah 5 kali supaya komposit brazilin terekstraksi seluruhnya dari serbuk
simplisia.
Isolasi komposit brazilin dilakukan dengan kromatografi lapis tipis, fase
diam selulosa dan fase gerak berupa kloroform : metanol : aquadest (64 : 50 : 10
v/v) dan pengembangan dilakukan sepanjang 15 cm. Pemilihan fase diam dan fase
gerak dilakukan berdasarkan penelitian sebelumnya (Putrandana, 2003). Sistem
kromatografi ini merupakan fase normal dimana fase diam lebih polar
dibandingkan fase geraknya. Fase diam yang digunakan adalah selulosa yang
merupakan polimer yang terdiri dari monomer D-glukopiranosa yang digabung
oleh ikatan β-glikosida pada posisi 1 dan 4 oleh atom oksigen. Selulosa bersifat
lebih polar dibandingkan dengan fase gerak yang dipergunakan karena banyaknya
atom dengan keelektronegatifan tinggi yaitu atom O yang terikat pada rantai
selulosa.
Fase diam yang dipakai setebal 2 mm agar komposit brazilin yang
terisolasi cukup banyak untuk dapat menghasilkan absorbansi 0,2-0,8 saat
ditelusuri serapannya untuk mengetahui panjang gelombang serapan
35
maksimumnya dengan spektrofotometer . Penotolan dilakukan seperti pita supaya
tidak terjadi pelebaran bercak dan tailing.
a b c d
Gambar 11. Profil KLT analisis kualitatif komposit brazilin
Keterangan :
a : sebelum disemprot bufer fosfat secara visibel
b : sebelum disemprot bufer fosfat dibawah UV 365 nm
c : setelah disemprot bufer fosfat secara visibel
d : setelah disemprot bufer fosfat dibawah UV 365 nm
Bercak diamati secara visibel dan dibawah 365 nm. Hal ini dilakukan
untuk memeriksa keberadaan bercak baik yang terlihat maupun tidak terlihat
secara visibel. Pengamatan di bawah sinar UV 365 nm untuk melihat bercak yang
mengandung senyawa yang berfluoresensi. Pengamatan dilakukan sebelum dan
sesudah disemprot dengan buffer fosfat pH 7. Hal ini dilakukan untuk mengetahui
perubahan warna dan perubahan pendar setelah disemprot bufer fosfat. Hasil
B
A
C
36
pengamatan tersaji pada tabel III dan profil kromatografi lapis tipisnya tersaji
pada gambar 11.
Tabel III. Warna masing-masing bercak hasil pemisahan dengan KLT sebelum dan
sesudah disemprot bufer fosfat pH 7
Bercak Rf Sebelum disemprot
bufer fosfat
Setelah disemprot
bufer fosfat
Secara
Visibel
UV
365 nm
Secara
Visibel
UV
365 nm
A 0,36 - Ungu - Ungu
B 0,76 Kuning Kuning Merah Kuning
C 0,83 Kuning Hijau Merah Hijau
Gambar 11 menunjukkan bahwa saat diamati di bawah sinar UV 365 nm
sebelum disemprot bufer fosfat terdapat 3 bercak yaitu bercak A berpendar ungu
dengan Rf 0,36, bercak B berpendar kuning dengan Rf 0,76 dan bercak C
berpendar hijau dengan Rf 0,83. Bercak yang secara visibel berwarna merah dalam
bufer fosfat pH 7, yaitu bercak B dan C diduga sebagai bercak komposit brazilin.
Gambar 12. Reaksi asam basa 3-O-metil brazilin menjadi 3-O-metil brazilein
saat ditambah basa
Keterangan : kromofor auksokrom
37
Bercak B dan C sebelum disemprot bufer fosfat secara visibel berwarna
kuning, karena terdapat senyawa sub tipe struktur brazilin namun setelah
disemprot bufer fosfat, bercak berubah menjadi merah karena senyawa sub tipe
struktur brazilin berubah menjadi sub tipe struktur brazilein yang berwarna merah
(reaksi asam basa brazilin terlihat pada gambar 7 sedangkan reaksi asam basa 3-
O-metil brazilin terlihat pada gambar 12).
Bercak B dan C yang diduga memiliki sub tipe struktur brazilin, sebelum
disemprot bufer fosfat sama-sama berwarna kuning secara visibel namun di
bawah sinar UV 365 nm bercak B berpendar kuning dan bercak C berpendar
hijau. Perbedaan warna pendar bercak menunjukkan bahwa bercak B dan C
mengandung senyawa yang berbeda walaupun tidak memisah secara sempurna.
Diduga bercak B mengandung brazilin dari kayu secang dan brazilin dari brazilein
yang berubah menjadi brazilin saat dilarutkan dalam etanol yang cenderung asam
sedangkan bercak C diduga mengandung 3-O-metil brazilin. Dugaan ini
berdasarkan kepolaran senyawa tersebut. Sistem kromatografi adalah fase normal,
yaitu fase diam lebih polar daripada fase gerak, maka senyawa yang lebih polar
akan menghasilkan bercak dengan Rf lebih kecil. Brazilin lebih polar daripada 3-
O-metil brazilin karena adanya penambahan gugus alkil pada 3-O-metil brazilin
menambah sifat lipofilisitasnya sehingga Rf bercak brazilin lebih kecil. Perbedaan
warna pendar dapat terjadi karena gugus auksokrom brazilin berbeda dengan
gugus auksokrom 3-O-metil brazilin.
38
OO
O
O
3-O-metil brazilin
H
O
H
H3C O H
H
OH
H3C O H
HH
H
H3C
metanolaquadest
aquadest
metanol
ClCl
Cl
kloroform
CH3OH
metanol
CH3OH
metanol
ClCl
Cl
kloroform
ClCl
Cl
kloroform
ClCl
Cl
kloroform
ClCl
Cl
kloroform
OO
O
O
H
O
H
H3C O H
H
OH
H3C O H
HH
H
H
metanol
CH3OH
CH3OH
ClCl
Cl
ClCl
Cl
kloroform
ClCl
Cl
ClCl
Cl
brazilin
kloroform
metanol
aquadest
metanol
kloroform
kloroform
metanol
aquadest
δ-
δ- δ-
δ-
δ-
δ-
δ-
δ-
δ- δ-
δ-
δ-
δ-
δ-
δ-
δ-
δ-
δ- δ-
δ-
δ- δ-
δ-
δ-
δ-
δ-
δ-
δ-
δ-
δ- δ-
δ-
δ-
δ-
δ-
δ-
δ+
δ+
δ+
δ+
δ+
δ+
δ+
δ+
δ+
Gambar 13. Interaksi brazilin dan 3-O-metil brazilin dengan fase gerak
Keterangan : : ikatan hidrogen : interaksi dipol-dipol
Komposit brazilin dapat dipisahkan dari senyawa lain dalam ekstrak secara
KLT karena memiliki interaksi dengan fase diam dan fase gerak. Interaksi brazilin
dan 3-O-metil brazilin dengan fase gerak tersaji pada gambar 13. Gambar 13
memperlihatkan bahwa brazilin dan 3-O-metil brazilin berinteraksi dengan
metanol, aquadest, dan kloroform pada fase gerak dengan membentuk suatu
ikatan hidrogen dan interaksi dipol-dipol. Interaksi brazilin dan 3-O-metil brazilin
dengan fase diam tersaji pada gambar 14. Gambar 14 menunjukkan bahwa gugus
hidroksil brazilin dan 3-O-metil brazilin berinteraksi dengan selulosa dengan
membentuk ikatan hidrogen.
39
O O O
O O
HO OH
CH2 CH2OH H2C
HOHO OH OH
O
O O
OCH3
O
H H
H
OHO H
O O O
O O
HO OH
CH2 CH2OH H2C
HOHO OH OH
O
O O
OH
O
H H
H
OHO H
nn
Gambar 14. Interaksi brazilin dan 3-O-metil brazilin dengan fase diam
Keterangan : : ikatan hidrogen
Bercak yang diduga sebagai komposit brazilin dikerok, dilarutkan etanol,
dan ditelusuri serapannya dengan spektrofotometer visible pada 400-600 nm. Hal
ini dilakukan 3 kali dengan 3 konsentrasi yang berbeda untuk melihat konsistensi
bentuk spektra. Hasilnya tersaji pada tabel IV.
Tabel IV. Hasil penelusuran panjang gelombang serapan maksimum bercak
komposit brazilin menggunakan spektrofotometer
Absorbansi
Panjang gelombang
serapan maksimum
(nm)
Replikasi 1 0,357 539
Replikasi 2 0,622 539
Replikasi 3 0,680 539
Panjang gelombang serapan maksimum bercak adalah 539 nm, yaitu
berbeda 2 nm dari panjang gelombang teoritis (541 nm menurut Penpun,W.,
2005). Menurut Farmakope Indonesia edisi III, panjang gelombang serapan
maksimum pada daerah di atas 320 nm tidak lebih dari ± 2 nm dari panjang
gelombang teoritis sehingga panjang gelombang serapan maksimum masih
memenuhi syarat.
selulosa
brazilin
selulosa
3-O-metil
brazilin
40
Gambar 15. Spektra hasil penetapan panjang gelombang serapan maksimum
bercak komposit brazilin menggunakan spektrofotometer
Keterangan : A : absorbansi 0,357
B : absorbansi 0,622
C : absorbansi 0,680
Spektra yang didapat dari hasil penelusuran memiliki bentuk yang
konsisten di ketiga konsentrasi, hal ini terlihat dari gambar 15. Dari hasil analisis
kualitatif dapat disimpulkan bahwa bercak B dan C adalah bercak komposit
brazilin.
F. Penyarian secara Soxhletasi
Serbuk simplisia diekstraksi secara soxhletasi. Prinsip soxhletasi pelarut di
labu penampung diuapkan, uap naik ke atas melalui pipa samping dan
diembunkan kembali oleh pendingin tegak lalu menetes turun ke tabung berisi
serbuk simplisia yang dibungkus kertas saring. Cairan penyari yang menetes akan
melarutkan zat aktif dan bila volumenya telah mencapai permukaan sifon, seluruh
cairan akan turun kembali lagi ke labu penampung dan diuapkan kembali. Proses
sirkulasi ini berlangsung terus-menerus sehingga zat aktif yang hendak diekstraksi
41
harus tahan terhadap pemanasan. Komposit brazilin dapat diekstraksi secara
soxhletasi karena merupakan senyawa yang tahan terhadap pemanasan, menurut
Merck Index degradasi brazilin terjadi pada suhu 130 oC.
Aplikasi desain faktorial yang digunakan adalah desain 2 faktor 3 level,
karena hubungan yang terjadi antara faktor dan respon sangat mungkin tidak
linear. Jika digunakan desain faktorial 2 level, persamaan hasil yang diperoleh
kemungkinan besar tidak akan mencerminkan kondisi yang sebenarnya.
Faktor pertama yang dioptimasi adalah konsentrasi cairan penyari air
dalam etanol karena menurut Merck Index komposit brazilin sangat larut dalam
etanol dan larut dalam air, namun tidak disebutkan secara pasti konsentrasinya
sehingga ingin diketahui konsentrasi air dalam etanol yang dapat mengekstrak
brazilin secara optimal.
Dalam percobaan ini definisi konsentrasi cairan penyari dikonversi
menjadi air dalam etanol karena level tinggi yang dipakai adalah air 100 %. Jika
definisi konsentrasi cairan penyari adalah konsentrasi etanol dalam air maka
nilainya adalah 0 % untuk air 100 %. Hal ini dihindari karena dalam desain
faktorial tidak diperbolehkan ada faktor yang bernilai 0. Level rendah konsentrasi
penyari adalah 4 %, artinya konsentrasi etanol dalam air adalah 96 %. Level ini
dipilih karena konsentrasi etanol yang biasa dipakai untuk mengekstrak brazilin
adalah 96 %. Level tengah yang dipilih adalah 50 % karena merupakan
konsentrasi dimana jumlah etanol dan air sama banyak.
Faktor kedua yang dioptimasi adalah jumlah sirkulasi ekstraksi, bukan
lama ekstraksi karena lama ekstraksi tiap percobaan akan menghasilkan jumlah
42
sirkulasi yang berbeda-beda apabila cairan penyari yang digunakan memiliki
konsentrasi yang berbeda. Hal ini akan mempersulit proses jika saat batas waktu
ekstraksi sudah selesai namun cairan penyari belum mencapai sifon. Jumlah
sirkulasi ekstraksi penting untuk dioptimasi karena diharapkan dapat diketahui
jumlah sirkulasi yang minimum untuk mendapatkan brazilin yang maksimal.
Level rendah yang dipilih adalah 1 kali karena sirkulasi minimum yang dapat
terjadi adalah 1 kali. Sedangkan level tingginya adalah 5 kali karena hasil
orientasi sebelumnya didapat bahwa dengan konsentrasi penyari 50 % dan
sirkulasi 5 kali, cairan penyari pada sirkulasi terakhir sudah hampir tidak
berwarna jingga. Hal ini menunjukkan bahwa dengan sirkulasi sebanyak 5 kali
brazilin dalam serbuk kayu secang sudah dapat terekstrak hampir seluruhnya.
Level tengah yang dipilih adalah 3 kali karena merupakan titik tengah antara 1
dan 5.
Tabel V. Rendemen hasil penyarian secara soxhletasi
Percobaan Replikasi
1
Replikasi
2
Replikasi
3
Rata-
rata SE
CV
(%)
00 2,8144 2,8562 2,9269 2,8658 0,0328 1,1462
01 4,2125 4,6966 4,1962 4,3684 0,1641 3,7573
02 5,9623 5,4752 4,8656 5,4344 0,3172 5,8377
10 4,4086 4,8824 4,1422 4,4778 0,2164 4,8337
11 6,1714 6,5005 5,8333 6,1684 0,1927 3,1242
12 7,7112 7,1040 6,8284 7,2146 0,2607 3,6146
20 2,9907 2,7735 3,2881 3,0174 0,1491 4,9421
21 4,3530 4,2174 5,1312 4,5672 0,2846 6,2332
22 4,5798 4,8976 6,0138 5,1637 0,4347 8,4201
Tabel V menunjukkan bahwa hasil penyarian secara soxhletasi dapat
menghasilkan rendemen ekstrak sebanyak 2,8658 ± 0,0328 % sampai 7,2146 ±
0,2607 %. Rendemen paling sedikit diperoleh saat konsentrasi penyari 4% dan
43
jumlah sirkulasi 1 kali, sedangkan rendemen paling banyak saat konsentrasi
penyari 50% dan jumlah sirkulasi 5 kali.
G. Pemisahan Komposit Brazilin dengan KLT
Saat memisahkan brazilin dengan KLT, konsentrasi, volume yang
ditotolkan, dan diameter bercak totolan diusahakan dibuat sedemikian rupa supaya
tidak terjadi tailing agar dapat dianalisis AUC nya dengan densitometer sehingga
ekstrak diencerkan dengan etanol hingga konsentrasinya berada pada range 0,02-
0,2 %. Penotolan dilakukan sebanyak 0,5 µL dengan diameter bercak 2 mm. Hal
ini sesuai dengan parameter aplikasi yang direkomendasikan untuk analisis
menggunakan densitometer menurut Rohman (2009).
Fase diam yang dipakai adalah selulosa setebal 0, 25 mm dan fase gerak
berupa kloroform : metanol : aquadest (64 : 50 : 10 v/v) dan pengembangan
dilakukan sepanjang 15 cm. Pemilihan fase diam dan fase gerak dilakukan
berdasarkan penelitian sebelumnya (Putrandana, 2003). Tebal pelat kromatografi
yang dipakai adalah 0,25 mm karena menurut Mintarsih (1990) tebal pelat yang
biasa digunakan untuk analisis dengan densitometer adalah 0,20-0,25 mm,
maksimal 0,30 mm untuk mengurangi efek hamburan sinar yang diakibatkan oleh
ketebalan fase diam terhadap linearitas hubungan serapan dan konsentrasi
senyawa.
44
Gambar 16. Profil kromatogram KLT berbagai percobaan setelah
disemprot bufer fosfat
Tabel VI. Hasil perhitungan Rf bercak komposit brazilin berbagai percobaan
Percobaan Bercak Rata-rata Rf SE CV (%)
00 B 0,7567 0,0088 1,1655
C 0,8467 0,0088 1,0416
01 B 0,7900 0,0058 0,7308
C 0,8967 0,0033 0,3717
02 B 0,7967 0,0033 0,4184
C 0,8900 0,0058 0,6487
10 B 0,8033 0,0033 0,4149
C 0,8800 0,0058 0,6561
11 B 0,7700 0,0058 0,7498
C 0,8567 0,0033 0,3891
12 B 0,7900 0,0058 0,7308
C 0,8900 0,0058 0,6487
20 B 0,7667 0,0033 0,4348
C 0,8633 0,0033 0,3861
21 B 0,7700 0,0058 0,7498
C 0,8733 0,0067 0,7633
22 B 0,7800 0,0058 0,7402
C 0,8767 0,0033 0,3802
00 01 02 10 11 12 20 21 22
B
C
45
Gambar 16 menunjukkan bahwa bercak B dan C tidak memisah secara
sempurna. Hal ini sesuai dengan hasil dari analisis kualitatif. Tabel VI
menunjukkan Rf masing-masing bercak dalam berbagai percobaan dan nilai CV
tiap replikasinya. Rf masing-masing percobaan tidak berbeda jauh dan saling
berdekatan. Semua nilai CV Rf bercak kurang dari 2 %, hal ini memenuhi
persyaratan presisi menurut Harmita (2004) sehingga dapat dikatakan bahwa Rf
bercak dapat dihasilkan secara reprodusibel.
H. Pengukuran AUC Komposit Brazilin dengan TLC Scanner Densitometric
Analisis kuantitatif yang dipilih adalah pengukuran area under curve
(AUC) dengan densitometer karena cara ini adalah cara pengukuran secara in situ,
yaitu pengukuran langsung di pelat, tanpa proses preparasi yang panjang sehingga
kemungkinan hilangnya senyawa yang hendak diukur selama preparasi sangat
kecil. Penelusuran serapan bercak untuk memastikan panjang gelombang serapan
maksimum dilakukan pada panjang gelombang 400-600 nm dengan TLC Scanner
Densitometric sebelum pengukuran AUC. Pengukuran panjang gelombang
serapan maksimum perlu dilakukan lagi walaupun sudah pernah dilakukan saat
analisis kualitatif dengan spektrofotometer karena instrumen yang digunakan
berbeda sehingga ada kemungkinan akan menghasilkan panjang gelombang
serapan maksimum yang berbeda. Hasil penelusuran tersaji pada tabel VII.
46
Tabel VII. Hasil penelusuran panjang gelombang serapan maksimum
bercak komposit brazilin menggunakan TLC Scanner Densitometric
Panjang gelombang
serapan maksimum
(nm)
Replikasi 1 539
Replikasi 2 539
Gambar 17. Spektrum hasil penetapan panjang gelombang serapan maksimum
bercak komposit brazilin menggunakan TLC Scanner Densitometric
Panjang gelombang serapan maksimum bercak hasil penelusuran adalah
539 nm, sehingga pengukuran AUC komposit brazilin dilakukan pada panjang
gelombang 539 nm. Hasil pengukuran AUC komposit brazilin dengan 3 replikasi
tersaji pada tabel VIII.
Tabel VIII. Hasil pengukuran AUC komposit brazilin
Percobaa
n
Replikasi
1
Replikasi
2
Replikasi
3 Rata-rata SE
CV
(%)
00 12.090,6 12.035,5 12.008,5 12.044,8
7
24,157
8
0,200
5
01 20.450,3 20.260,6 20.185,5 20.298,8
0
78,789
0
0,388
1
02 22.712,6 22.729,1 22.752,3 22.731,3
3
11,514
3
0,050
6
10 18.664,6 18.535,0 18.781,3 18.660,3
0
71,131
1
0,381
1
11 23.412,5 23.431,8 23.408,1 23.417,4 7,2781 0,031
47
7 0
12 33.906,6 33.916,2 33.975,8 33.932,8
7
21,644
1
0,063
7
20 3.501,0 3.474,7 3.493,7 3.489,80 7,8383
0,224
6
21 13.765,3 13.701,6 13.700,9 13.722,6
0
21,350
3
0,155
5
22 17.605,9 17.585,2 17.590,2 17.593,7
7 6,2358
0,035
4
Gambar 18. Kurva hasil pengukuran AUC komposit brazilin berbagai percobaan
Keterangan :
00 10 20
01 11 21
02 12 22
Gambar 18 memperlihatkan bahwa kurva yang terbentuk tidak
menghasilkan 1 puncak tetapi 2 sampai 3 puncak. Hal ini terjadi karena bercak
yang diukur AUC nya adalah 2 bercak yang tidak memisah secara sempurna.
Gambar 18 juga memperlihatkan bahwa kurva yang dihasilkan oleh percobaan
dengan konsentrasi penyari 50 % dan jumlah sirkulasi 5 kali menghasilkan puncak
paling tinggi dan AUC paling besar. Hal ini terjadi karena polaritas cairan penyari
dengan konsentrasi 50 % semakin mendekati polaritas brazilin sehingga brazilin
yang terekstrak jumlahnya banyak sedangkan percobaan dengan konsentrasi
48
penyari 100 % dan jumlah sirkulasi 1 kali menghasilkan puncak paling rendah dan
AUC paling kecil. Hal ini terjadi karena kelarutan brazilin dalam air kurang baik
dibandingkan dalam etanol.
49
Tabel IX. Hasil perhitungan nilai efek hubungan antara faktor dan respon
Keterangan :
AL : konsentrasi penyari-linear
AQ : konsentrasi penyari-kuadratik
BL : jumlah sirkulasi-linear
BQ : jumlah sirkulasi-kuadratik
ALBL : interaksi kedua faktor linear
AQBL : interaksi konsentrasi penyari-kuadratik
dengan jumlah sirkulasi-linear
ALBQ : interaksi konsentrasi penyari-linear
dengan jumlah sirkulasi-kuadratik
AQBQ : interaksi kedua faktor kuadratik
Tabel IX menunjukkan hasil perhitungan nilai efek hubungan antara faktor
dan respon. Hubungan antara faktor dan respon dapat bersifat linear maupun
kuadratik. Bila hubungannya bersifat linear, maka efek yang bernilai negatif
berarti seiring dengan naiknya faktor akan dapat menurunkan respon namun jika
efek bernilai positif berarti seiring dengan naiknya faktor akan dapat menaikkan
respon. Bila hubungannya bersifat kuadratik maka hal ini berarti seiring dengan
naiknya faktor akan dapat menaikkan respon sampai titik puncak tertentu dan
kemudian menurunkan respon. Tabel IX menunjukkan bahwa nilai efek yang
paling besar dimiliki oleh faktor konsentrasi cairan penyari yang bersifat
kuadratik (AQ). Hal ini menunjukkan bahwa hubungan antara konsentrasi cairan
penyari dengan AUC komposit brazilin cenderung bersifat kuadratik, dan paling
dominan dalam mempengaruhi besarnya AUC yang dihasilkan dibandingkan
jumlah sirkulasi dan interaksi keduanya.
Efek Nilai
AL 93.744.103,8
AQ 405.518.363,2
BL 307.282.792,4
ALBL 8.759.479,7
AQBL 8.279.143,0
BQ 24.737.716,8
ALBQ 72.963,0
AQBQ 46.805.525,0
50
Gambar 19. Grafik hubungan antara konsentrasi penyari dengan AUC komposit
brazilin
Gambar 20. Grafik hubungan antara jumlah sirkulasi dengan AUC komposit
brazilin
Konsentrasi cairan penyari paling dominan mempengaruhi AUC komposit
brazilin karena jumlah komposit brazilin yang terekstrak sangat bergantung pada
kelarutannya dalam cairan penyari. Kelarutan komposit brazilin dalam etanol
adalah sangat mudah larut (Anonim, 1976) yakni, kurang dari 1 bagian pelarut
diperlukan untuk melarutkan 1 bagian zat (Anonim, 1979), sedangkan kelarutan
komposit brazilin dalam air adalah larut (Anonim, 1976), yakni, 10 sampai 30
bagian pelarut diperlukan untuk melarutkan 1 bagian zat (Anonim, 1979).
0
10000
20000
30000
40000
0 50 100
Konsentrasi penyari (%)
AUC
jumlah
sirkulasi 1 kali
jumlah
sirkulasi 3 kali
jumlah
sirkulasi 5 kali
0
10000
20000
30000
40000
0 1 2 3 4 5 6
jumlah sirkulasi (kali)
AUC
konsentrasi
penyari 4%
konsentrasi
penyari 50%
konsentrasi
penyari 100%
51
Hubungan faktor dengan respon bersifat kuadratik (terlihat dari nilai efek AQ
pada tabel IX) karena jumlah brazilin yang terekstrak bergantung pada polaritas
penyari, jika polaritas penyari mendekati polaritas brazilin, brazilin yang
terekstrak jumlahnya banyak begitu pula sebaliknya sehingga semakin
meningkatnya konsentrasi bisa menaikkan AUC dan juga menurunkan AUC.
Nilai efek terbesar kedua dimiliki oleh faktor jumlah sirkulasi yang
bersifat linear (BL). Hal ini menunjukkan bahwa hubungan antara jumlah sirkulasi
dengan AUC komposit brazilin cenderung bersifat linear, dan juga dominan dalam
mempengaruhi besarnya AUC yang dihasilkan walaupun tidak sebesar pengaruh
dari konsentrasi penyari.
Jumlah sirkulasi ekstraksi cukup dominan mempengaruhi AUC komposit
brazilin karena jumlah komposit brazilin yang terekstrak sangat bergantung pada
lama serbuk kontak dengan penyari. Hubungan yang terjadi antara jumlah
sirkulasi dengan AUC komposit brazilin cenderung linear (terlihat dari nilai efek
BL pada tabel IX) karena semakin banyak jumlah sirkulasi berarti semakin lama
serbuk kontak dengan penyari maka semakin banyak pula komposit brazilin yang
terekstrak.
Dari gambar 19 dan 20 terlihat bahwa tiap garis tidak sejajar sehingga
disimpulkan bahwa ada interaksi antar faktor. Adanya interaksi juga dibuktikan
dari nilai efeknya yang terlihat pada tabel IX. Gambar 19 menunjukkan bahwa
hubungan antara konsentrasi penyari dengan AUC komposit brazilin bersifat
cenderung kuadratik (dibuktikan dari nilai efek BL pada tabel IX), hal ini terjadi
di semua level jumlah sirkulasi sedangkan gambar 20 menunjukkan bahwa
hubungan antara jumlah sirkulasi dengan
cenderung linear (dibuktikan dari nilai efek BL pada tabel IX)
di semua level konsentrasi penyari.
Hasil pengukuran
faktorial dan didapat persamaan Y = 6.489,71 + 365,5 X
X1X2 – 4,442 X12 – 267,7 X
Gambar
Persamaan yang didapat
pembuatan countour plot
ekstraksi komposit brazilin dari kayu secang secara soxhletasi
konsentrasi cairan penyari 68, 22 % dengan jumlah sirkulasi 1,
menghasilkan AUC prediksi teoritis sebesa
jika hendak diaplikasikan jumlah sirkulasi dapat dibulatkan menjadi 2 kali karena
tidak mungkin untuk melakukan sirkulasi sebanyak 1,57 kali. Maka
nya menjadi 18.591,78 sampai 21.137,72.
hubungan antara jumlah sirkulasi dengan AUC komposit brazilin bersifat
(dibuktikan dari nilai efek BL pada tabel IX), hal ini juga terjadi
di semua level konsentrasi penyari.
pengukuran AUC dihitung persamaannya berdasarkan metode
faktorial dan didapat persamaan Y = 6.489,71 + 365,5 X1 + 4.498,873 X
267,7 X22.
Gambar 21. Countour plot 3D AUC komposit brazilin
ersamaan yang didapat dipakai untuk analisis titik optimum dengan
plot. Hasil yang didapat menunjukkan bahwa titik optimum
ekstraksi komposit brazilin dari kayu secang secara soxhletasi
konsentrasi cairan penyari 68, 22 % dengan jumlah sirkulasi 1,
prediksi teoritis sebesar 16.835,62 sampai 19.311,48 n
jika hendak diaplikasikan jumlah sirkulasi dapat dibulatkan menjadi 2 kali karena
tidak mungkin untuk melakukan sirkulasi sebanyak 1,57 kali. Maka
nya menjadi 18.591,78 sampai 21.137,72.
52
komposit brazilin bersifat
, hal ini juga terjadi
dihitung persamaannya berdasarkan metode desain
+ 4.498,873 X2 + 8,687
komposit brazilin
analisis titik optimum dengan
bahwa titik optimum
ekstraksi komposit brazilin dari kayu secang secara soxhletasi berada pada
konsentrasi cairan penyari 68, 22 % dengan jumlah sirkulasi 1,57 kali yang
5,62 sampai 19.311,48 namun
jika hendak diaplikasikan jumlah sirkulasi dapat dibulatkan menjadi 2 kali karena
tidak mungkin untuk melakukan sirkulasi sebanyak 1,57 kali. Maka AUC prediksi
53
Tabel X. Hasil perhitugan Yate’s treatment
Hasil AUC yang didapat juga dianalisis dengan yate’s treatment untuk
mengetahui signifikansi pengaruh tiap faktor terhadap respon. Hipotesis alternatif
(Hi) menyatakan bahwa konsentrasi cairan penyari, jumlah sirkulasi ekstraksi, dan
interaksinya mempengaruhi area under curve komposit brazilin secara signifikan,
sedangkan Ho merupakan negasi dari Hi. Hi diterima dan Ho ditolak jika nilai F
hitung lebih besar dari F tabel. F tabel diperoleh dari Fα (numerator,denominator)
dengan taraf kepercayaan 95%. Derajat bebas faktor dan interaksi sebagai
numerator, yaitu 1, dan derajat bebas experimental error sebagai denominator,
yaitu 18, sehingga diperoleh harga F tabel untuk semua faktor dan interaksi adalah
F0,05(1,18) = 4,41.
Tabel X memperlihatkan bahwa F hitung lebih besar dari F tabel maka
dapat disimpulkan konsentrasi penyari, jumlah sirkulasi penyari dan interaksi
keduanya berpengaruh signifikan terhadap AUC komposit brazilin.
Source
of
variation
Sum of squares
Degree
of
freedom
Mean square F hitung
A
AL 93744103,8 1 93744103,8 24951,47
AQ 405518363,2 1 405518363,2 107935,1
B
BL 307282792,4 1 307282792,4 81788,17
BQ 24737716,87 1 24737716,87 6584,334
AB
ALBL 8759479,688 1 8759479,688 2331,474
AQBL 8279143,022 1 8279143,022 2203,625
ALBQ 72963,01361 1 72963,01361 19,42026
AQBQ 46805525,02 1 46805525,02 12458,03
Error 67627,02444 18 3757,056914
Total 26
53
BAB V
KESIMPULAN DAN SARAN
A. Kesimpulan
Berdasarkan hasil penelitian, dapat disimpulkan bahwa:
1. Konsentrasi cairan penyari, jumlah sirkulasi ekstraksi, dan interaksinya
mempengaruhi area under curve komposit brazilin secara signifikan.
2. Titik optimum ekstraksi komposit brazilin dari kayu secang secara soxhletasi
dapat diperoleh dari persamaan Y = 6.489,71 + 365,5 X1 + 4.498,873 X2 +
8,687 X1X2 – 4,442 X12 – 267,7 X2
2 yaitu pada konsentrasi cairan penyari 68,
22 % dengan jumlah sirkulasi 1,57 kali yang menghasilkan AUC prediksi
teoritis sebesar 16.835,62 sampai 19.311,48.
B. Saran
Berdasarkan penelitian yang telah dilakukan, maka saran yang dapat
diberikan adalah perlu dilakukan pembuktian titik optimum untuk mengetahui
kesesuaian AUC prediksi teoritis hasil perhitungan dengan nilai AUC sebenarnya.
54
DAFTAR PUSTAKA
Anonim, 1976, The Merck Index 9th ed, 1362, Merck&Co Rahway, New York
Anonim, 1977, Materia Medika Indonesia, Jilid I, 29-33, Departemen Kesehatan
Republik Indonesia, Jakarta
Anonim, 1979, Farmakope Indonesia, edisi III, 9 ,773, Departemen Kesehatan
Republik Indonesia, Jakarta
Anonim, 1985, Tanaman Obat Indonesia, Jilid I, 72, Departemen Kesehatan
Republik Indonesia, Jakarta
Anonim, 1986, Sediaan Galenik, 1-5, 10-16, 25-28, Departemen Kesehatan
Republik Indonesia, Jakarta
Anonim, 2000, Parameter Standar Umum Ekstrak Tumbuhan Obat, Cetakan I, 1-
12, Departemen Kesehatan Republik Indonesia, Jakarta
Armstrong, A.N. dan James, K.C., 1996, Pharmaceutical Experimental Design
and Interpretation, Edisi II, 146, Taylor& Francis, New York
Bolton, 1990, Pharmaceutical Statistics and Clinical Applications, Edisi 3, 553,
Marcell Dekker Inc, NewYork
Chairul, S. R., Agusta, A., dan Handoko S., 1995, Uji Antifiretik Ekstrak Kayu
Secang pada Tikus Putih Jantan. Seminar Nasional Tumbuhan Obat
Indonesia IX, Yogyakarta.
Dong-Kyu et al., 2007, Fabrication of Nontoxic Natural Dye from Sappan Wood,
Korean J. Chem. Eng., 25(2), 354-358
Fu et al., 2008, A New 3-Benzylchroman Derivative from Sappan Lignum
(Caesalpinia sappan), http://www.mdpi.org/molecules diakses tanggal
14 Oktober 2009
Hardjono, S., 1983, Kromatografi, 26-36, Laboratorium Kimia Fisika, Pusat
Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta
Harmita, 2004, Petunjuk Pelaksanaan Validasi Metode dan Cara Perhitungannya,
http://jurnal.farmasi.ui.ac.id/pdff/2004/v01n03/harmita010301.pdf
diakses tanggal 14 Oktober 2009
55
Huang et al., 2005, Synthesis of (±)-Brazilin Using IBX, http://pubs.acs.org,
diakses tanggal 17 Februari 2009
Khopkar, S. M., 1987, Konsep Dasar Kimia Analitik, diterjemahkan oleh A.
Saptoraharjo, Cet 1, 155, 156, Penerbit UI, Jakarta
Mitra, S., 2003, Sample Preparation Techniques in Analytical Chemistry, 143,
Wiley, NewYork
Perry, L. M., 1980, Medicinl Plants of East and South Asia, 190, The MIT Press,
Cambridge, Massachussets and London England
Penpun, W., 2005, The Antioxidant Activity of Caesalpinia sappan L. Heartwood
in Various Ages, Naresuan University Journal, Nakorn-Pathom
Putrandana, F.H., 2003, Isolasi dan Karakterisasi Brazilin dari Kayu Secang
(Caesalpinia sappan), Skripsi, Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta
Ramdhan, T., 2004, Stability of Sappan Wood's Pigment as Natural Food Color,
Balai Besar Litbang Pascapanen Pertanian, Bogor
Sastrohamidjoyo, H., 1985, Kromatografi, Edisi I, 26-30, Liberty, Yogyakarta
Sherma, J. dan Fried, B.,2003, Handbook of Thin layer Chromatography, Edisi 3,
146-148, Marcell Dekker, Inc., New York
Shih, I.M., 1990, Antimotility Effects of Chinese Herbal Medicines on Human
Sperm, Journal of Medical Associates
Stahl, E., 1985, Drug Analysis by Chromatography and Microscopy : A Practical
Supplement to Pharmacopoias, 1-8, terjemahan Kosasih Padmawinata,
Iwang Soediro, Penerbit ITB Bandung
Tjitrosoepomo, G., 1994, Taksonomi Tumbuhan Obat-obatan, Edisi 1, Gadjah
Mada University Press, Yogyakarta
Wijayakusuma, H., Dalimarta, S., dan Wirian, A.S., 1994, Tanaman Berkhasiat
Obat di Indonesia, Jilid IV, 144-146, Penerbit Pustaka Kartini, Jakarta
56
57
Lampiran 1. Foto hasil identifikasi secara kimia pada filtrat serbuk kayu
Keterangan:
a : saat ditambah dengan KOH
b : saat ditambah dengan NaOH
c : saat ditambah dengan Pb asetat
d : saat ditambah dengan FeCl3
b a c d
58
Lampiran 2. Foto proses soxhletasi (a) dan ekstrak kering (b)
(a)
(b)
59
Lampiran 3. Foto KLT isolasi komposit brazilin
Replikasi I Replikasi II Replikasi III
Sebelum disemprot bufer fosfat secara visibel
Replikasi I Replikasi II Replikasi III
Setelah disemprot bufer fosfat secara visibel
Replikasi I Replikasi II Replikasi III
Sebelum disemprot bufer fosfat di bawah UV 365 nm
Replikasi I
Setelah disemprot bufer fosfat di bawah UV 365 nm
Replikasi II Replikasi III
Setelah disemprot bufer fosfat di bawah UV 365 nm
60
Replikasi III
61
Lampiran 4. Kurva hasil pengukuran AUC komposit brazilin
Replikasi I
Kurva hasil pengukuran AUC komposit brazilin dengan konsentrasi penyari
4 % dan jumlah sirkulasi 1 kali (a), 3 kali (b), 5 kali (c)
Kurva hasil pengukuran AUC komposit brazilin dengan konsentrasi penyari
50 % dan jumlah sirkulasi 1 kali (d), 3 kali (e), 5 kali (f)
(a) (b) (c)
(d) (e) (f)
62
Kurva hasil pengukuran AUC komposit brazilin dengan konsentrasi penyari
100% dan jumlah sirkulasi 1 kali (g), 3 kali (h), 5 kali (i)
(g) (h) (i)
63
Replikasi II
Kurva hasil pengukuran AUC komposit brazilin dengan konsentrasi penyari
4 % dan jumlah sirkulasi 1 kali (a), 3 kali (b), 5 kali (c)
Kurva hasil pengukuran AUC komposit brazilin dengan konsentrasi penyari
50 % dan jumlah sirkulasi 1 kali (d), 3 kali (e), 5 kali (f)
Kurva hasil pengukuran AUC komposit brazilin dengan konsentrasi penyari
100% dan jumlah sirkulasi 1 kali (g), 3 kali (h), 5 kali (i)
(a) (b) (c)
(d) (e) (f)
(g) (h) (i)
64
Replikasi III
Kurva hasil pengukuran AUC komposit brazilin dengan konsentrasi penyari
4 % dan jumlah sirkulasi 1 kali (a), 3 kali (b), 5 kali (c)
Kurva hasil pengukuran AUC komposit brazilin dengan konsentrasi penyari
50 % dan jumlah sirkulasi 1 kali (d), 3 kali (e), 5 kali (f)
Kurva hasil pengukuran AUC komposit brazilin dengan konsentrasi penyari
100% dan jumlah sirkulasi 1 kali (g), 3 kali (h), 5 kali (i)
(a) (b) (c)
(d) (e) (f)
(g) (h) (i)
65
Lampiran 5. Data rendemen hasil penyarian secara soxhletasi
Percobaan
Replikasi 1
Berat serbuk
(g)
Berat ekstrak
(g)
Rendemen
(%)
00 7,0140 0,1974 2,8144
01 7,0101 0,2953 4,2125
02 7,0543 0,4206 5,9623
10 6,9999 0,3086 4,4086
11 7,0097 0,4326 6,1714
12 7,0002 0,5398 7,7112
20 7,0017 0,2094 2,9907
21 7,0067 0,3050 4,3530
22 7,0134 0,3212 4,5798
Percobaan
Replikasi 2
Berat serbuk
(g)
Berat ekstrak
(g)
Rendemen
(%)
00 7,0022 0,2000 2,8562
01 7,0987 0,3334 4,6966
02 7,0043 0,3835 5,4752
10 7,0088 0,3422 4,8824
11 7,0118 0,4558 6,5005
12 7,0087 0,4979 7,1040
20 7,0057 0,1943 2,7735
21 7,0091 0,2956 4,2174
22 7,0116 0,3434 4,8976
Percobaan
Replikasi 3
Berat serbuk
(g)
Berat ekstrak
(g)
Rendemen
(%)
00 7,0075 0,2051 2,9269
01 7,0040 0,2939 4,1962
02 7,0002 0,3406 4,8656
10 7,0011 0,2900 4,1422
11 7,0012 0,4084 5,8333
12 7,0016 0,4781 6,8284
20 7,0040 0,2303 3,2881
21 7,0023 0,3593 5,1312
22 6,9972 0,4208 6,0138
66
Lampiran 6. Contoh cara menghitung rendemen
Untuk menghitung % rendemen digunakan rumus sebagai berikut :
%100serbukberat
keringekstrakberatx
Misalnya hendak menghitung % rendemen percobaan 00 replikasi 1, maka
perhitungannya adalah sebagai berikut :
%8144,2%1007,0140
0,1974=x
67
Lampiran 7. Contoh cara menghitung standard error dan coeffitient of
variance
Untuk menghitung Standard Error dan Coeffitient of Variance digunakan rumus
sebagai berikut :
N
SDSE = %100x
x
SECV =
Keterangan :
SE : Standard Error CV : Coeffitient of Variance
SD : standard deviation x : rata-rata rendemen
N : jumlah replikasi
Percobaan Rata-rata
rendemen SD 3 SE CV(%)
00 2,8658 0,0569 1,7321 0,0329 1,1463
01 4,3684 0,2843 1,7321 0,1641 3,7573
02 5,4344 0,5495 1,7321 0,3172 5,8378
10 4,4778 0,3749 1,7321 0,2164 4,8337
11 6,1684 0,3338 1,7321 0,1927 3,1242
12 7,2146 0,4517 1,7321 0,2608 3,6147
20 3,0174 0,2583 1,7321 0,1491 4,9421
21 4,5672 0,4931 1,7321 0,2847 6,2332
22 5,1637 0,7531 1,7321 0,4348 8,4201
Misalnya hendak menghitung SE untuk percobaan 00 replikasi 1, maka
perhitungannya adalah sebagai berikut :
0329,03
0,0569==SE
%1463,1%1008658,2
0329,0== xCV
68
Lampiran 8. Data hasil perhitungan Rf berbagai percobaan
Percobaan bercak Replikasi 1 Replikasi 2 Replikasi 3
00 B 0,76 0,77 0,74
C 0,85 0,86 0,83
01 B 0,79 0,80 0,78
C 0,89 0,9 0,9
02 B 0,79 0,8 0,8
C 0,89 0,9 0,88
10 B 0,8 0,81 0,8
C 0,88 0,89 0,87
11 B 0,77 0,78 0,76
C 0,85 0,86 0,86
12 B 0,79 0,8 0,78
C 0,89 0,9 0,88
20 B 0,76 0,77 0,77
C 0,87 0,86 0,86
21 B 0,76 0,77 0,78
C 0,86 0,88 0,88
22 B 0,78 0,79 0,77
C 0,88 0,88 0,88
69
Lampiran 9. Contoh cara menghitung persamaan desain faktorial
Faktor
Percobaan
Konsentrasi
cairan penyari
(X1)
Jumlah
sirkulasi
(X2)
AUC
Rata-rata
(Y)
00 4 1 12.044,87
10 50 1 20.298,80
20 100 1 22.731,33
01 4 3 18.660,30
11 50 3 23.417,47
21 100 3 33.932,87
02 4 5 3.489,80
12 50 5 13.722,60
22 100 5 17.593,77
Persamaan umum
Y = bo + b1X1 + b2X2 + b11X12 + b22X2
2 + b12X1X2
Percobaan 00
12044.87 = bo + b1(4) + b2(1)+ b11(16) + b22(1)
+ b12(4)
Percobaan 01
20298.8= bo + b1(4 )+ b2(3)+ b11(16) + b22(9)+ b12(12)
Percobaan 02
22731.33 = bo + b1(4) + b2(5)+ b11(16)+ b22(25) + b12(20)
Percobaan 10
18660.3 = bo + b1(50) + b2(1) + b11(2500) + b22(1)
+ b12(50)
Percobaan 11
23417.47 = bo + b1(50) + b2(3) + b11(2500) + b22(9)
+ b12(150)
Percobaan 12
33932.87 = bo + b1(50) + b2(5) + b11(2500) + b22(25)
+ b12(250)
70
Percobaan 20
3489.8 = bo + b1(100) + b2(1) + b11(10.000) + b22(1)
+ b12(100)
Percobaan 21
13722.6 = bo + b1(100) + b2(3) + b11(10.000) + b22(9)
+ b12(300)
Percobaan 22
17593.77 = bo + b1(100) + b2(5) + b11(10.000) + b22(25)
+ b12(500)
Melalui metode substitusi eliminasi didapat koefisien sebagai berikut :
bo : 6.489,71 b11 : – 4,442
b1 : 365,5 b22 : – 267,7
b2 : 4.498,873 b12 : 8,687
maka didapat persamaan sebagai berikut :
Y = 6.489,71 + 365,5 X1 + 4.498,873 X2 + 8,687 X1X2 – 4,442 X12 – 267,7 X2
2
71
Lampiran 10. Contoh cara menghitung nilai efek menggunakan yate’s
treatment
Percobaan R 1 R2 R3 Total
00 12090,6 12035,5 12008,5 36134,60
10 18664,6 185,5 18781,3 55980,90
20 3501,0 3474,7 3493,7 10469,40
01 20450,3 20260,6 20185,5 60896,40
11 23412,5 23431,8 23408,1 70252,40
21 13765,3 13701,6 13700,9 41167,80
02 22712,6 22729,1 22752,3 68194,00
12 33906,6 33916,2 33975,8 101798,60
22 17605,9 17585,2 17590,2 52781,30
Total
AUC kolom 1 kolom 2 efek
mean
divisor Square
00 36134,6 46604 167579,3 - - -
10 55980,9 102064,2 -41077,9 AL 18 93744103,8
20 10469,4 120975,3 -147980 AQ 54 405518363,2
01 60896,4 -25665,2 74371,3 BL 18 307282792,4
11 70252,4 -19728,6 10252,5 ALBL 12 8759479,7
21 41167,8 -15412,7 -17264,1 AQBL 36 8279143,0
02 68194 -65357,8 -36549,1 BQ 54 24737716,9
12 101798,6 -38440,6 -1620,7 ALBQ 36 72963,0
22 52781,3 -82621,9 -71098,5 AQBQ 108 46805525,0
Kolom 1 dihitung dengan cara sebagai berikut :
Baris 1 merupakan jumlah dari total AUC pada percobaan 00, 10, dan 20
Baris 2 merupakan jumlah dari total AUC pada percobaan 01, 11, dan 21
Baris 3 merupakan jumlah dari total AUC pada percobaan 02, 12, dan 22
Baris 4 merupakan selisih dari total AUC pada percobaan 20 dan 00
Baris 5 merupakan selisih dari total AUC pada percobaan 21 dan 01
Baris 6 merupakan selisih dari total AUC pada percobaan 22 dan 02
Baris 7 merupakan jumlah dari total AUC pada percobaan 20 dan 00 dikurangi
dua kali total AUC pada percobaan 10
Contohnya : 10469,4 + 36134,6 - (2 x 55980,9) = -65357,8
Baris 8 merupakan jumlah dari total AUC pada percobaan 21 dan 01 dikurangi
dua kali total AUC pada percobaan 11
72
Baris 9 merupakan jumlah dari total AUC pada percobaan 22 dan 02 dikurangi
dua kali total AUC pada percobaan 12
Kolom 2 diturunkan dari kolom 1 dengan cara yang sama
Mean divisor dihitung dengan rumus: 2r3tn
Dimana r adalah jumlah faktor dalam percobaan, t adalah jumlah faktor dalam
percobaan dikurangi jumlah sifat linear dalam percobaan, dan n adalah jumlah
replikasi
Contohnya :
AQBL
r = 2, t = 2-1 = 1, n = 3, maka
mean divisor = 2231.3 =36
Square dihitung dengan cara : nilai kolom 2 dikuadratkan kemudian dibagi mean
divisor
Contohnya :
AQBL
nilai kolom 2 = -17264,1, mean divisor = 2231.3 =36 maka
Square = (-17264,1)2 : 36 = 8279143
73
Lampiran 11. Contoh cara menghitung signifikansi dengan yate’s treatment
Sum of squares = square pada perhitungan nilai efek
Mean squares = Sum of squares dibagi df
F hitung = Mean squares dibagi experimental error mean square
experimental error mean square =
experimental error Sum of squares : df experimental error
df experimental error = total percobaan – 1 - 8 = 18
experimental error Sum of squares =
total sum of squares – replicate sum of square – treatment sum of square
Source
of
variation
Sum of squares
Degree
of
freedom
Mean square F hitung
A
AL 93744103,8 1 93744103,8 24951,47
AQ 405518363,2 1 405518363,2 107935,1
B
BL 307282792,4 1 307282792,4 81788,17
BQ 24737716,87 1 24737716,87 6584,334
AB
ALBL 8759479,688 1 8759479,688 2331,474
AQBL 8279143,022 1 8279143,022 2203,625
ALBQ 72963,01361 1 72963,01361 19,42026
AQBQ 46805525,02 1 46805525,02 12458,03
Error 67627,02444 18 3757,056914
Total 26
74
Percobaan Replikasi 1 Replikasi
2
Replikasi
3
00 12.090,6 12.035,5 12.008,5
01 20.450,3 20.260,6 20.185,5
02 22.712,6 22.729,1 22.752,3
10 18.664,6 18.535,0 18.781,3
11 23.412,5 23.431,8 23.408,1
12 33.906,6 33.916,2 33.975,8
20 3.501,0 3.474,7 3.493,7
21 13.765,3 13.701,6 13.700,9
22 17.605,9 17.585,2 17.590,2
total sum of squares
= (12.090,6)2 + (20.450,3)
2 +(22.712,6)
2 +(18.664,6)
2 +(23.412,5)
2 +(33.906,6)
2
+(3.501,0)2 +13.765,3 (17.605,9)
2 +(12.035,5)
2 +(20.260,6)
2 +(22.729,1)
2
+(18.535,0)2 +(23.431,8)
2 +(33.916,2)
2 +(3.474,7)
2 +(13.701,6)
2 +(17.585,2)
2
+(12.008,5)2 +(20.185,5)
2 +(22.752,3)
2 +(18.781,3)
2 +(23.408,1)
2 +(33.975,8)
2
+(3.493,7)2 +(13.700,9)
2 +(17.590,2)
2 - ( (497675,40)
2 : 27) )
= 1722375282,73
replicate sum of square
= ( ( (166109,40)2 + (165669,70)
2 +(165896,30)
2 ) : 9) - ( (497675,40)
2 : 27) )
= 10744, 27
treatment sum of square
= ( ( (36134,6)2 + (55980,90)
2 + (10469,40)
2 + (60896,40)
2 + (70252,40)
2 +
(41167,80)2 + (68194)
2 + (101798,60)
2 + (52781,30)
2 ): 3) –
( (497675,40)2 : 27) )
= 1722296911
experimental error sum of squares
=1722375282,73 - 10744, 27 – 1722296911
= 67627,02
experimental error mean square
= 67627,02 : 18 = 3757,06
Lampiran 12. Cara menghitung titik optimum
75
Titik optimum didapat dengan menggunakan rumus :
D = (d1 x d2 x d3 x...x dn)1/n
Keterangan :
D = Desirebility value titik optimum
d = Desirebility value tiap faktor
n = jumlah faktor
Titik optimum yang diinginkan :
Konsentrasi cairan penyari = maksimum
Jumlah sirkulasi = minimum
AUC komposit brazilin = maksimum
Desirebility value bernilai 0-1, semakin mendekati yang diinginkan maka nilai d
semakin mendekati 1, jadi :
Konsentrasi cairan penyari � d = 0 - 1
Range = 4 % - 100 %
Jumlah sirkulasi � d = 1-0
Range = 1-5
AUC komposit brazilin � d = 0 - 1
Range = 3.489,80 - 33.932,87
Kemudian dianalisis dengan software Design Expert 7.1.6 dan diperoleh
nilai D = 0,650 pada konsentrasi cairan penyari 68, 22 % dengan jumlah sirkulasi
1,57 kali yang menghasilkan AUC prediksi teoritis sebesar 16.835,62 sampai
19.311,48.
75
BIOGRAFI PENULIS
Nama : Dyah Shaula Yalapuspa
Tempat, tanggal lahir : Medan, 27 Februari 1989
Jenis Kelamin : Perempuan
Alamat : Perum Mojosari Indah H-6, Banguntapan,
Yogyakarta 55197
Telepon : 08562921812
Riwayat Pendidikan :
- TK : TK Pamardi Siwi, Yogyakarta tahun 1992
- SD : SD N Angkasa I, Yogyakarta tahun 1994-1995
SD Katolik Karya Budi, Banda Aceh tahun 1995-1998
SD N Angkasa I, Yogyakarta tahun 1998-2000
- SLTP : SLTP N 2, Dumai, Riau tahun 2000-2003
- SLTA : SMA Katolik Sang Timur, Yogyakarta tahun 2003-2006
-PT : Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta tahun 2006-2010
Riwayat Pekerjaan :
- Asisten Praktikum Botani Dasar tahun 2008
- Asisten Praktikum Kimia Dasar tahun 2008
- Asisten Praktikum Formulasi Teknologi Sediaan Solid tahun 2009
- Asisten Praktikum Analisis Makanan tahun 2009
Riwayat berorganisasi :
- Ketua Palang Merah Remaja tahun 2003-2006
- Anggota Herbal Garden Team tahun 2006
- Bendahara BEM Fakultas Farmasi tahun 2009-2010
Prestasi :
- Juara 2 lomba debat ilmiah se-Jateng tahun 2004
- Juara 1 lomba cerdas cermat alkitab tahun 2005
- Juara favorit kreasi pohon natal tahun 2005
- 10 terbaik lomba karya tulis rohani tahun 2005
- Program Kreatifitas Mahasiswa tahun 2009