OLEH : Adamilzary Fikry Abdulmannan 1112103000051 Program...
Transcript of OLEH : Adamilzary Fikry Abdulmannan 1112103000051 Program...
Skrining Gen TMPRSS6 pada SNP ss8296198 pada
Mahasiswa Program Studi Pendidikan Dokter Universitas
Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta Angkatan 2012 –
2014 Menggunakan Teknik High Resolution Melting
“Laporan Penelitian ini ditulis sebagai salah satu syarat untuk
Memperoleh gelar SARJANA KEDOKTERAN ”
OLEH :
Adamilzary Fikry Abdulmannan
1112103000051
Program Studi Pendidikan Dokter
Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
1436 H/ 2015 M
ii
LEMBAR PERNYATAAN KEASLIAN KARYA
Dengan ini saya menyatakan bahwa:
1. Laporan penelitian ini merupakan hasil karya asli saya yang diajukan untuk
memenuhi salah satu persyaratan memperoleh gelar strata 1 di UIN Syarif
Hidayatullah Jakarta
2. Semua sumber yang saya gunakan dalam penulisan ini telah saya cantumkan sesuai
dengan ketentuan yang berlaku di UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
3. Jika dikemudian hari terbukti bahwa karya ini bukan karya asli saya atau merupakan
hasil jiplakan dari karya orang lain, maka saya bersedia menerima sanksi yang
berlaku di UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Ciputat, 16 Oktober 2015
Adamilzary Fikry Abdulmannan
Materai
6000
v
KATA PENGANTAR
Assalamualaikum warahmatullahi wabarakatuh,
Alhamdulillah puji dan syukur kehadirat Allah SWT yang telah melimpahkan
rahmat dan ridho-Nya serta shalawat dan salam selalu tercurah kepada junjungan Nabi
Muhammad SAW karena dengan rahmat dan ridho-Nya penulis dapat menyelesaikan
penelitian dan laporan penelitian dengan judul “Skrining Gen TMPRSS6 pada SNP
ss8296198 pada Mahasiswa Program Studi Pendidikan Dokter Universitas Islam
Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta Angkatan 2012 – 2014 Menggunakan Teknik
High Resolution Melting.”
Penyusunan laporan penelitian ini dapat terselesaikan karena bantuan dari
berbagai pihak. Oleh karena itu, penulis ingin mengucapkan terimakasih kepada yang
terhormat:
1. Prof. Dr. H. Arif Sumantri, SKM, M.Kes. selaku Dekan Fakultas Kedokteran dan
Ilmu Keseharatan UIN Jakarta,
2. dr. Achmad Zaki,Sp.OT, M.Epid selaku Ketua Program Studi Pendidikan Dokter,
3. dr. Nouval Shahab, SpU, PhD, FICS, FACS selaku Penanggung Jawab Modul
Riset Program Studi Pendidikan Dokter 2012,
4. Chris Adhiyanto, S.Si, M.Biomed, PhD dan dr. Nouval Shahab, SpU, PhD, FICS,
FACS selaku pembimbing pertama dan kedua saya yang selalu membimbing,
mengajarkan, memfasilitasi, dan menyemangati.
5. dr.Mukhtar Ikhsan, Sp.P(K),MARS dan Nurlaely Mida R. S.Si, M.Biomed,DMS
selaku penguji pertama dan kedua.
6. Kedua orang tua saya, Dedi Abdulmannan dan Leni Nurleni yang selalu
memberikan kasih sayang, cinta, doa, dan semangat, sehingga memotivasi dan
menguatkan saya dalam melakukan penelitian ini.
7. Adik - adik saya tercinta, Adamilyara Aqil Abdulmannan dan Muhammad Fahmy
Abdulmannan yang telah memberikan semangat dalam menyelesaikan penelitian
ini.
vi
8. Laboran di laboratorium biokimia dan biologi yang telah membantu
berlangsungya penelitian ini.
9. Teman sekelompok dan seperjuangan penelitian, Hipni Solehudin, Amatillah
Raifah, Rizky Ananda Marpaung dan Nurul Hasanah yang telah menyemangati,
membantu, dan berjuang bersama di dalam penelitian ini.
10. Semua responden yang telah bersedia untuk menjalani penelitian ini.
11. Seluruh mahasiswa PSPD UIN Jakarta angkatan 2012.
12. Teman – teman Mercy yang selalu memberikan dukungan dan semangat.
Penulis menyadari dalam penyusunan laporan ini masih banyak terdapat kekurangan.
Kritik dan saran yang membangun dari semua pihak akan penulis terima demi laporan
penelitian yang lebih baik. Penulis berharap penelitian ini dapat bermanfaat bagi semua
pihak yang memerlukan. Akhir kata, semoga segala bantuan yang telah diberikan kepada
penulis akan mendapat balasam, rahmat, dan ridho dari Allah SWT, Amin.
Wassalamualaikum warahmatullahi wabarakatuh.
Jakarta, 16 Oktober 2015
Penulis
vii
ABSTRAK
Adamilzary Fikry Abdulmannan. Program Studi Pendidikan Dokter. Skrining Gen
TMPRSS6 pada SNP ss8296198 pada Mahasiswa Program Studi Pendidikan Dokter
Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta Angkatan 2012 – 2014
Menggunakan Teknik High Resolution Melting.
Anemia defisiensi besi merupakan anemia yang paling sering dijumpai terutama di negara
berkembang. Tujuan penelitian ini untuk melakukan skrining alel SS826198 serta
hubungannya dengan kadar hemoglobin dan mengetahui adanya faktor lain yang
menyebabkan anemia defisiensi besi yang disebabkan oleh mutasi gen pada mahasiswa
PSPD UIN Syarif Hidayatullah Jakarta angkatan 2012 – 2014 dengan menggunakan
teknik High Resolution Melting. Penelitian ini menggunakan metode experimental
dimana terpilih sebanyak 102 orang dari 3 kelas yang telah dipilih secara Simple Random
Sampling untuk diambil darahnya, berat badan, tinggi badan serta kadar hemoglobinnya.
Sebanyak 64 orang berjenis kelamin perempuan dan 38 orang laki – laki dengan rentang
usia dari 17 tahun hingga 23 tahun. Hasil penelitian didapatkan sebanyak 22 orang
memiliki alel Wildtype, 76 orang memiliki alel Heterozygote, 4 orang memiliki alel
Mutant. Berdasarkan analisis bivariat menggunakan uji chi square didapatkan hubungan
yang bermakna antara kadar hemoglobin dengan jenis kelamin sebesar p=0,001 dan
didapatkan nilai p=0,873 yang menunjukan tidak adanya hubungan antara genotip
ss8296198 dengan kadar hemoglobin sebesar 0,873.
Kata kunci: Anemia defisiensi besi, genotip ss8296198, High Resolution Melting.
ABSTRACT
Adamilzary Fikry Abdulmannan. Medical Education Study Program. Skrining Gen
TMPRSS6 pada SNP ss8296198 pada Mahasiswa Program Studi Pendidikan Dokter
Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta Angkatan 2012 – 2014
Menggunakan Teknik High Resolution Melting.
Iron deficiency anemia is the most common anemia, especially in developing countries.
The purpose of this study was to perform screening SS826198 allele and its relationship
with the levels of hemoglobin and aware of other factors that cause iron deficiency anemia
caused by mutations in a gene on medical student of UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
forces 2012-2014 using High Resolution Melting technique. This research used
experimental method which was chosen as many as 102 people from 3 classes that have
been selected by simple random sampling for blood drawn, weight, height and
hemoglobin levels. A total of 64 female and 38 male with an age range from 17 years to
23 years. The result showed as many as 22 people have wildtype allele, 76 people have
heterozygote alleles, 4 people have a mutant allele. Based on bivariate analysis using chi
square test found a significant association between hemoglobin levels by sex at p = 0.001
and p = 0.873 which showed no association between genotype ss8296198 with
hemoglobin levels.
Keywords: Iron deficiency anemia, genotyping ss8296198, High Resolution Melting
viii
DAFTAR ISI
LEMBAR JUDUL ................................................................................................ i
LEMBAR PERNYATAAN KEASLIAN KARYA ............................................ ii
LEMBAR PERSETUJUAN PEMBIMBING .................................................. iii
LEMBAR PENGESAHAN .................................................................................. iv
KATA PENGANTAR .......................................................................................... v
ABSTRAK ........................................................................................................... vii
DAFTAR ISI ..................................................................................................... viii
DAFTAR TABEL ................................................................................................. xi
DAFTAR GAMBAR .......................................................................................... xii
DAFTAR SINGKATAN ................................................................................... xiii
DAFTAR LAMPIRAN ..................................................................................... xiv
BAB I PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang ...................................................................................... 1
1.2 Rumusan Masalah ................................................................................ 2
1.3 Hipotesis ............................................................................................... 2
1.4 Tujuan Penelitian .................................................................................. 2
1.5 Manfaat Penelitian ................................................................................ 3
BAB II TINJAUAN PUSTAKA
2.1 Anemia ................................................................................................ 4
2.1.1 Epidemiologi ......................................................................... 4
2.1.2 Etiologi .................................................................................. 4
2.1.3 Patogenesis ............................................................................ 5
2.1.4 Manifestasi Klinis .................................................................. 5
2.1.5 Diagnosis ............................................................................... 5
2.1.6 Metabolisme Besi .................................................................. 6
2.1.7 Faktor yang Mempengaruhi Penyerapan Besi ....................... 7
2.1.7 Makanan – Makanan Sumber Zat Besi.................................. 9
2.2 Gen ...................................................................................................... 9
2.2.1 Replikasi DNA ...................................................................... 10
2.2.2 Sintesis DNA Baru .............................................................. 11
2.2.3 Pemanjangan Anti Paralel ................................................... 11
2.2.4 Perbaikan DNA ................................................................... 12
2.2.5 Cara Kerja PCR ................................................................... 13
2.3 Kerangka Teori.................................................................................. 14
2.4 Kerangka Konsep .............................................................................. 15
ix
2.5 Definisi Operasional……………………………………………..16
BAB III METODOLOGI PENELITIAN
3.1 Metode Penelitian ............................................................................... 17
3.2 Waktu dan Tempat Penelitian............................................................. 17
3.3 Populasi dan Sampel ........................................................................... 17
3.3.1 Populasi Target .................................................................... 17
3.3.2 Populasi Terjangkau ............................................................ 18
3.3.3 Perkiraan Besar Sampel ....................................................... 18
3.3.4 Kriteria Pemilihan Sampel .................................................. 19
3.3.5 Teknik Pengambilan Sampel ............................................... 19
3.4 Alat dan Bahan ................................................................................... 19
3.5 Cara Kerja Penelitian .......................................................................... 21
3.5.1 Desain Primer ss8296198 .................................................... 21
3.5.2 Desain High Resolution Melting ss8296198 ....................... 21
3.5.3 Isolasi DNA ......................................................................... 22
3.5.4 Tata Kerja PCR – HRM ...................................................... 24
3.5.5 Alur Kerja Penelitian ........................................................... 25
BAB IV HASIL PENELITIAN DAN PEMBAHASAN
4.1 Hasil .................................................................................................... 26
4.1.1 Data Karakteristik Responden .................................................... 26
4.1.1.1 Jenis Kelamin .................................................................. 26
4.1.1.2 Usia .................................................................................. 27
4.1.1.3 Hasil Pengukuran IMT .................................................... 28
4.1.1.4 Hasil Pengukuran Kadar Hemoglobin ............................. 28
4.1.1.5 Hasil Isolasi DNA Genom dari Whole Blood ................. 29
4.1.1.6 Hasil Analisis Kurva Genotip Wildtype, Heterozygote,
dan Mutant ....................................................................... 30
4.1.1.7 Hasil Gambaran Kurva HRM .............................................. 31
4.1.1.8 Hasil Hubungan Jenis Kelamin dengan Kadar
Hemoglobin ..................................................................... 33
4.1.1.9 Hasil Hubungan Jenis Kelamin dengan Genotip
ss8296198 ........................................................................ 34
4.1.1.10 Hasil Hubungan Genotip ss8296198 dengan
Kadar Hemoglobin (Anemia dan Normal) ...................... 35
4.2.Pembahasan ........................................................................................ 36
4.2.1 ss826198 ................................................................................... 36
4.2.2 Desain Primer ss826198 ........................................................... 37
4.2.3 Hasil Desain Primer .................................................................. 38
4.2.4 Hasil Kurva HRM ..................................................................... 41
4.2.3 Data Statistik ............................................................................. 43
4.3. Keterbatasan penelitian..................................................................... 43
x
BAB V SIMPULAN DAN SARAN
5.1 Simpulan ............................................................................................. 44
5.2 Saran ................................................................................................... 44
DAFTAR PUSTAKA ......................................................................................... 45
LAMPIRAN ........................................................................................................ 47
xi
DAFTAR TABEL
Tabel 3.1 Alat dan Bahan ..................................................................................... 19
Tabel 3.2 Isolasi DNA .......................................................................................... 22
Tabel 3.3 Prosedur HRM ...................................................................................... 24
Tabel 4.1 Karakteristik Jenis Kelamin Responden ............................................... 26
Tabel 4.2 Kemurnian dan Konsentrasi Hasil Isolasi Genom DNA Responden ... 30
Tabel 6.1 Hasil Pengukuran Kemurnian dan Konsentrasi DNA genom
Responden ............................................................................................ 52
xii
DAFTAR GAMBAR
Gambar 2.1 Patofisiologi Mutasi gen TMPRSS6 ss826198 menyebabkan
IRIDA ............................................................................................... 7
Gambar 2.2 Skema metabolisme zat besi didalam tubuh manusia....................... 9
Gambar 2.3 Bagan cara kerja PCR ....................................................................... 13
Gambar 2.4 Kerangka Teori ................................................................................. 14
Gambar 2.5 Kerangka Konsep.............................................................................. 15
Gambar 3,1 Alur Kerja Penelitian ........................................................................ 25
Gambar 4.1 Karakteristik Jenis Kelamin Responden ........................................... 26
Gambar 4.2 Karakteristik Usia Responden .......................................................... 27
Gambar 4.3 Karakteristik IMT responden ............................................................ 28
Gambar 4.4 Kadar Hemoglobin Responden ......................................................... 29
Gambar 4.5 Dokumentasi hasil elektroforesis agarose dari isolasi genom DNA
sampel ............................................................................................... 30
Gambar 4.6 Genotype SNP ss8296198 ................................................................ 31
Gambar 4.7 Kurva HRM ...................................................................................... 31
Gambar 4.8 Hasil sekuensing ss826198 Untuk wild type .................................... 32
Gambar 4.9 Hasil sekuensing ss826198 untuk heterozygote type no 70 ............. 32
Gambar 4.10 Hubungan Kadar Hemoglobin dengan Jenis Kelamin .................. 33
Gambar 4.11 Menunjukan hubungan jenis kelamin dengan genotip ss8296198 . 34
Gambar 4.12 Hubungan Genotip ss8296198 dengan Kadar Hemoglobin
(Anemia dan Normal) .................................................................... 35
Gambar 4.13 Letak lokasi mutasi gen ss8296198 ................................................ 36
Gambar 4.14 Lokasi Mutasi IRIDA ..................................................................... 37
Gambar 4.15 Area desain primer untuk ss8296198 ............................................. 40
Gambar 4.16 Optimasi PCR Fase Annealing ....................................................... 40
Gambar 4.17 Gel Documentation Elektroforesis Agarose dari Isolasi Genom
PCR-HRM ...................................................................................... 41
Gambar 4.18 Contoh Kurva HRM ....................................................................... 42
Gambar 7.3.1 Elektroforesis ................................................................................. 49
Gambar 7.3.2 Centrifuge Eppendorf .................................................................... 49
Gambar 7.3.3 Alat Inkubator ................................................................................ 49
Gambar 7.3.4 Micropipet & Tip ........................................................................... 49
Gambar 7.3.5 Cold Room dan Freezer ................................................................. 49
Gambar 7.3.6 vortex ............................................................................................. 49
Gambar 7.3.7 Instrument LightCycler® 480 II Roche ...................................... 49
Gambar 7.3.8 DNA sampel .................................................................................. 50
Gambar 7.3.9 Multiwall Plate Light Cycler® Roche ........................................... 50
Gambar 7.4 Bahan isolasi DNA Geneaid (Elution buffer, GB buffer, Wash
buffer, W1 buffer, RBC Lysis buffer dan Ethanol absolute 70%). 50
Gambar 7.4.1 Primer TMPRSS6 .......................................................................... 50
Gambar 7.4.2 gBlock TMPRSS6 ......................................................................... 50
Gambar 7.4.3 Mix HRM........................................................................................50
xiii
Gambar 7.4.4 Gel documentation hasil elektroforesis agarose dari isolasi genom
DNA sampel .................................................................................. 51
xiv
DAFTAR SINGKATAN
PCR Polimerase Chain Reactiom
HRM High Resolution Melting
DNA Deoxyribo Nucleic Acid
RNA Ribo Nucleic Acid
SNP Single Nucleotide Polymorphism
UIN Universitas Islam Negeri
WHO World Health Organization
RBC Red Blood Cell
PSPD Program Studi Pendidikan Dokter
HJV Hemojuvelin
BMP Bone Morphogenic Protein
IRIDA Iron Refractory Iron Deficiency Anemia
xv
LAMPIRAN
Lampiran 1 Lembar Permohonan Ethical Approval Penelitian............................ 47
Lampiran 2 Lembar Persetujuan Responden ........................................................ 48
Lampiran 3 Alat dan Bahan Penelitian ................................................................. 49
Lampiran 4 Gel documentation hasil elektroforesis agarose dari isolasi genom
DNA sampel ..................................................................................... 51
Lampiran 5 Hasil Kemurnian dan Konsentrasi DNA Sampel .............................. 52
Lampiran 6 Hasil Uji Statistik .............................................................................. 55
Lampiran 7 Curriculum Vitae Peneliti ................................................................. 59
1
BAB I
1.1.Latar Belakang
Semakin maju dan canggihnya perkembangan ilmu pengetahuan
menyebabkan semakin banyak ditemukannya berbagai macam penyakit yang
disebabkan oleh gangguan yang terjadi tidak hanya pada sel, tetapi sampai
genetika. Diantaranya adalah mulai ditemukannya bahwa mutasi gen dapat
memunculkan berbagai macam jenis penyakit dan sindrom, termasuk di dalamnya
adalah IRIDA (Iron Deficiency Iron Refractory Anemia) yang seringkali kita
memasukannya ke dalam anemia defisiensi besi.
Anemia defisiensi besi sendiri merupakan jenis anemia yang sering dijumpai,
terutama banyak ditemukan pada negara berkembang. Menurut Martoatmodjo et
al diperkirakan di Indonesia sekitar 16- 50 % laki – laki menderita penyakit
tersebut dan 25- 48 % pada perempuan tidak hamil. Di Bali, ditemukan angka
anemia pada pegawai pensiunan sebesar 36 – 61 %, sedangkan pada perempuan
hamil ditemukan sekitar 50 – 75 %.1
Menurut WHO, diketahui sekitar 2 juta orang mengalami anemia dan
diperkirakan lebih dari 30 % populasi dunia mengalami anemia. Kebanyakan
diakibat oleh asupan besi yang kurang, daerah dengan sosioekonomi rendah, dan
daerah yang memiliki tingkat prevalensi penyakit infeksi tinggi seperti penyakit
Malaria, HIV/AIDS, Cacing tambang, Schistosomiasis, dan penyakit lain seperti
Tuberkulosis.2
Menurut data riskesdas pada tahun 2013, jumlah penduduk dengan usia ≥ 1
tahun dengan keadaan anemia mencapai 21, 7 %, dimana persentase pada balita
sebesar 28,1 % diikuti pada anak sekolah, remaja sampai dewasa muda (34 tahun)
dan persentase kembali meningkat pada kelompok umur yang lebih tinggi.
Sedangkan berdasarkan jenis kelamin, pada perempuan lebih banyak mengalami
anemia dibandingkan laki – laki..3
2
Tingginya angka penderita penyakit anemia yang disebabkan oleh defisiensi
besi khususnya pada negara – negara berkembang seperti Indonesia, maka
diperlukannya suatu tindakan yang efektif, murah dan efisien serta tepat laksana
dalam penanggulangan masalah anemia defisiensi besi sehingga diharapkan
kedepannya minimal dapat mengurangi angka kejadian dari penyakit anemia
defisiensi besi.
Teknik PCR-HRM sendiri telah diketahui sebelumnya bahwa metode ini
dapat mendeteksi adanya mutasi hingga konsentrasi DNA mutan dalam campuran
DNA Wild type sebesar 12,5%. 4
1.2.Rumusan Masalah
- Apakah terdapat hubungan antara mutasi pada SS8296198 dengan angka
hemoglobin yang rendah pada pasien
- Berapakah frekuensi populasi mahasiswa PSPD UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
yang memiliki SNP genotype SS8296198
1.3.Hipotesis
Terdapat hubungan antara mutasi gen pada SNP SS826198 dengan rendahnya
kadar Hemoglobin pada darah.
1.4.Tujuan Penulisan
a. Tujuan Umum
Untuk melakukan skrining SNP SS8296198 menggunakan teknik HRM
pada mahasiswa PSPD UIN Syarif Hidayatullah Jakarta angkatan 2012 –
2014.
b. Tujuan Khusus
3
a. Mengetahui hubungan antara antara mutasi pada SS8296198 dengan
angka hemoglobin yang rendah pada mahasiswa PSPD UIN Syarif
Hidayatullah Jakarta angkatan 2012 – 2014.
b. Mengetahui terdapat atau tidaknya faktor lain yang menyebabkan
terjadinya mutasi pada SNP SS8296198.
1.5.Manfaat Penulisan
Hasil penelitian diharapkan memiliki manfaat untuk :
1.5.1. Bagi Peneliti
a. Memiliki Keterampilan dalam molekuler untuk mengetahui adanya
mutasi gen dengan teknik HRM.
b. Merupakan syarat kelulusan preklinik Program Studi Pendidikan Dokter
c. Menambah pengetahuan mengenai mutasi gen pada SS8296198.
d. Dapat memberikan edukasi tenaga kesehatan dalam menanggapi masalah
anemia yang disebabkan IRIDA.
1.5.2. Civitas Akademika
Sebagai sumber pengetahuan dan referensi bagi peneliti selanjutnya
yang akan melakukan penelitian yang berkaitan dengan penelitian ini.
4
BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
2.1 Anemia
2.1.1 Epidemiologi
Anemia defisisensi besi merupakan penyakit paling umum dan penyakit yang
berhubungan dengan nutrisi yang paling luas sebarannya di dunia. Dimana penyakit
ini menurut angka kejadiannya banyak dialami pada anak – anak dan perempuan
pada negara berkembang. Diketahui sekitar 2 juta orang mengalami anemia dan
diperkirakan lebih dari 30 % populasi dunia mengalami anemia, yang kebanyakan
diakibatkan dari asupan besi yang kurang, daerah miskin, dan daerah yang memiliki
tingkat prevalensi penyakit infeksi tinggi seperti penyakit Malaria, HIV/AIDS,
Cacing tambang, Schistosomiasis, dan penyakit lain seperti Tuberkulosis .2
Menurut studi literatur melaporkan anemia defisiensi besi telah terjadi pada 2
% laki – laki dewasa, 9-12 % perempuan berkulit putih, dan 20 % pada orang
berkulit hitam dan pada perempuan Mexico – Amerika. Selain itu ditemukan bahwa
9 % penderita anemia defisiensi besi dengan usia lebih dari 65 tahun diketahui
menderita kanker gastrointestinal. 1
2.1.2 Etiologi
Anemia defisiensi besi dapat disebabkan oleh beberapa hal, seperti : Peningkatan
penggunaan besi dan hematopoiesis akibat pertumbuhan yang terlampau cepat,
kehamilan, dan pengobatan eritropoietin. Selain itu dapat juga disebabkan oleh
meningkatnya tingkat kehilangan besi akibat dari perdarahan kronik, menstruasi,
kehilangan darah akut, donor darah, dan phlebotomi pada pengobatan polisitemia
vera. Dan dapat juga disebabkan oleh penurunan pemasukan dan absorpsi besi
akibat pemasukan konsumsi besi yang tidak adequat, terdapatnya kelainan
5
penyerapan seperti penyakit Sprue dan penyakit Crohn, dan juga akibat
pembedahan gastrektomi, dan inflamasi akut dan kronik.2
2.1.3 Patogenesis
Pada proses pematangan eritrosit akan melibatkan sintesis dari hemoglobin dan
pembentukan suatu badan kecil, berbentuk bikonkaf dan tanpa inti. Dalam proses
pematangannya, eritrosit dapat mengalami beberapa hal seperti pengurangan
volume dan inti sel, lalu anak inti akan mengecil dan menghilang. Selanjutnya
kromatin akan menjadi semakin padat sampai inti terlihat piknotik sampai akhirnya
didorong keluar sel. Lalu terjadi pengurangan jumlah dari poliribosom yang diikuti
dengan peningkatan jumlah hemoglobin di dalam sitoplasma. Organel lain dan
mitokondria pun berangsur – angsur akan menghilang.3
2.1.4 Manifestasi Klinis
Gejala umum anemia biasanya didapatkan apabila kadar anemia turun
dibawah 7-8 gr/dl dengan gejala berupa badan lemah, pucat, kelelahan, pusing,
Dyspneu d’effort, mata berkunang – kunang, telinga mendenging dan gejala umum
hipoksia lainnya. Pada gejala kronik dan respon kardiovaskular yang terjadi adalah
takikardi, peningkatan curah jantung, vasodilatasi. Sedangkan gejala khusunya
berupa Koilonychia (Kuku berbetuk seperti sendok), atrofi papil lidah, Stomatitis
Angularis, Disfagia, Atrofi mukosa gaster yang menyebabkan akhloridia, dan Pica
(keinginan memakan makanan yang tidak lazim).1,5
2.1.5 Diagnosis :
Seseorang dikatakan anemia apabila pada balita usia 12- 59 bulan kadar Hb
dibawah 11,0 gr/dL. Anak – anak sekolah usia 6 -12 tahun kadar Hb, 12,0 gr/dL.
Ibu hamil, 11,0 gr/dL. Laki – laki ≥ 15 tahun bila kadar Hb <13 gr/dL dan wanita
subur 15 – 49 tahun bila kadar Hb <12 gr/dL.3
6
2.1.6 Metabolisme Besi
Besi membentuk inti dari cincin besi – porfirin yang bersama globin berbentuk
hemoglobin. Pada keadaan anemia defisiensi besi, akan terbentuk eritrosit yang
berukuran kecil dan tidak cukup mengandung hemoglobin sehingga dapat
memberikan gambaran berupa anemia mikrositik hipokromik.4
Di alam, besi inorganik bebas bersifat toksik, namun besi juga merupakan zat
yang penting untuk tubuh. Agar dapat digunakan, besi harus melewati berbagai
macam proses terlebih dahulu seperti absorpsi, transpor, dan penyimpanan besi
hingga akhirnya dapat benar – benar digunakan oleh tubuh.8
Pada tubuh manusia, besi hanya dibutuhkan dalam jumlah yang sedikit, Hal
tersebut disebabkan hanya sedikit jumlah besi yang hilang dari tubuh setiap harinya.
Sehingga dengan asupan diet besi dalam jumlah kecil saja sudah cukup untuk
memenuhi kebutuhan besi harian setiap individu pada berbagai macam makanan.
Meskipun begitu, terdapat beberapa masyarakat khusus yang dalam kondisinya
membutuhkan asupan jumlah besi lebih tinggi dibandingkan masyarakat pada
umunya masyarakat tersebut seperti pada anak yang masih dalam masa
pertumbuhan, ibu hamil dan juga pada perempuan yang sedang menstruasi.8
Anemia defisiensi besi dapat terjadi tidak hanya disebabkan oleh gangguan
pada proses masuknya ataupun pengeluaran besi. Namun, terjadi karena adanya
mutasi gen TMPRSS6 sehingga mempengaruhi kerja enzim matriptase – 2 (MT2)
yang memiliki fungsi sebagai regulator negatif pada transkripsi dari hepsidin. Jika
terjadi peningkatan kadar hepsidin maka akan menghambat proses penyerapan
besi.5
Penyakit dengan gangguan mutasi pada TMPRSS6 disebut juga dengan Iron
Refractory iron deficiency anaemia (IRIDA). Dimana IRIDA sendiri merupakan
penyakit autosomal resesif yang tergolong anemia hipokrom mikrositik berat.
7
Dalam temuan laboratorium dapat ditemukan serum besi dan saturasi transferin
yang rendah, normal – tinggi ferritin dan tingginya hormon hepsidin. Menurut studi
pustaka, pasien yang mengalami penyakit ini akan tidak berespon terhadap
pengobatan besi secara oral dan keterlambatan respon pada asupan besi melalui
jalur intravena.
Gambar 2.1 Patofisiologi Mutasi gen TMPRSS6 SS826198 menyebabkan IRIDA5
(Sumber : Goncalves L, Nobre JG, Afonso C et al. The Role of TMPRSS6 gene variants in
different types of Iron Deficiency Anaemia from The Rare Severe Hereditary IRIDA to The
Common Mild Acquired IDA. 2014)
Mekanisme gambar 2.1 : A) Matripase – 2 mencegah ekspresi berlebih
hepsidin dengan mendegradasi Hemojuvelin (HJV). Hemojuvelin sendiri memiliki
fungsi sebagai Co-reseptor dari BMP (Bone Morphogenic Protein). Sedangkan
BMP berperan dalam pengekspresi gen HAMP. B) Apabila terjadi defisiensi dari
matriptase – 2 akan menyebabkan tingginya jumlah dari HJV yang dapat
meningkatkan jalur BMP, dengan begitu overekspresi hepsidin akan terjadi
sehingga menyebabkan penghambatan absorpsi, pengeluaran dan pembentukan
kembali dari besi penyebab IRIDA.9
2.1.7 Faktor – faktor yang mempengaruhi penyerapan zat besi
1. Tingginya kebutuhan tubuh akan zat besi. Pada kondisi seperti simpanan zat besi
yang berkurang akan merangsang respon tubuh berupa peningkatan penyerapan besi
8
2. Rendahnya HCl (Asam Klorida) pada lambung (Kondisi basa) akan menurunkan
penyerapan. Hal ini disebabkan fungsi HCl yang dapat merubah besi Fe 3+ menjadi
Fe2+ dimana Fe2+ lebih mudah diserap oleh mukosa usus.
3. Vitamin C gugus S1-I dan asam amino sulfur dapat meningkatkan absorpsi zat besi.
Karena sifat Vitamin C yang dapat dapat merubah besi Fe3+ menjadi Fe2+ dan juga
melalui pembentukan kompleks ferro askorbat yang dapat meningkatkan penyerapan
besi sebesar 25 – 50 %.
4. Protein hewani dapat meningkatkan penyerapan Fe.
5. Kelebihan besi fosfat menyebabkan besi tidak dapat diserap. Disebabkan karena besi
akan membentuk kompleks besi fosfat.
6. Terdapat Fitat menurunkan penyerapan Fe.
7. Penyakit yang menyebabkan gangguan pada usus dapat menurunkan penyerapan
pada usus seperti pada penyakit diare.
8. Penyakit infeksi menurunkan penyerapan Fe.6
9
Gambar 2.2 Skema metabolisme zat besi didalam tubuh manusia 5 7
2.1.8 Makanan – Makanan Sumber Zat Besi
Sereal (1-22 mg) Remis ( 23,7 mg), Nasi (9,73 mg), Kacang (8,2 mg), Kerang
(5,9 mg), Hati sapi (5,24 mg)8
2.2 Gen
DNA merupakan materi genetik berupa polimer dari nukleotida – nukleotida,
yang terdiri atas 3 komponen nukleotida : basa nitrogen, gula pentosa
(deoksiribosa), dan gugus fosfat. Dimana basa dapat berupa Adenin (A), Timin (T),
Guanin (G), Sitosin (C). Menurut penelitian dari Chargaff mengatakan bahwa
10
jumlah Adenin akan sama dengan jumlah Timin, sedangkan jumlah Guanin akan
sama dengan jumlah Sitosin.
2.2.1 Replikasi DNA
Replikasi dimulai dari suatu tempat khusus yaitu titik mula replikasi, bentangan
pendek DNA yang memiliki sekuens nukleotida spesifik. Protein – protein yang
menginisiasi replikasi DNA mengenali sekuens ini dan melekat ke DNA,
selanjutnya memisahkan kedua DNA dan membuka gelembung replikasi. Setelah
itu replikasi DNA berlanjut ke kedua arah sampai keseluruhan molekul tersalin.
Pada setiap ujung gelombang replikasi terdapat garpu replikasi, yaitu wilayah
berbentuk Y tempat untai induk sedang dibuka. Helikase adalah enzim – enzim
yang membuka uliran heliks ganda di garpu replikasi yang memisahkan dua untai
induk dan menjadikan keduanya tersedia sebagai untaian cetakan. Setelah
pemisahan untai induk, Single Strand Binding Protein berikatan dengan untai- untai
DNA tak berpasangan dan menstabilkan untai tersebut. Pembukaan uliran heliks
ganda menyebabkan uliran dan tegangan yang lebih ketat di depan garpu replikasi.
Topoisomerase membantu mengurangi tegangan ini dengan cara mematahkan,
memuntirkan dan menggabungkan kembali untai – untai DNA.
Bagian – bagian untai DNA induk yang terbuka kini tersedia sebagai cetakan
untuk sintesis untai – untai DNA komplementer baru. Akan tetapi, enzim – enzim
yang menyintesis DNA tidak dapat menginisiasi sintesis polinukleotida. Enzim
tersebut hanya dapat menambahkan nukleotida – nukleotida ke untai cetakan.
Rantai nukleotida yang dihasilkan pertama kali merupakan bentangan rantai pendek
RNA. Dimana rantai RNA disini disebut primer dan disintesis oleh enzim primase.
Primase mengawali rantai RNA dari satu nukleotida RNA tunggal, lalu
menambahkan nukleotida - nukleotida RNA satu persatu, menggunakan untai
DNA induk sebagai cetakan.
11
2.2.2 Sintesis DNA Baru
Enzim yang disebut DNA polimerase mengkatalisis sintesis DNA baru dengan
cara menambahkan nukleotida – nukleotida ke rantai DNA yang telah ada
sebelumnya. Dimana sebagian DNA polimerase membutuhkan primer dan untai
cetakan DNA selain jejeran nukleotida DNA komplementer.
Setiap nukleotida yang ditambahkan ke untai DNA berasal dari nukleosida
trifosfat, yang merupakan suatu nukleosida (gula dan basa) dengan tiga gugus
fosfat. Dimana gulanya sebagai nukleosida trifosfat yang memberikan nukleotida
adenin ke DNA. Gula tersebut berupa deoksiribosa, dimana nukleosida trifosfat
yang digunakan untuk sintesis DNA secara kimiawi bersifat reaktif, karena
sebagian ekor trifosfat memiliki gugus muatan negatif yang tidak stabil. Ketika
setiap monomer bergabung ke ujung untai DNA yang sedang tumbuh, dua gugus
fosfat hilang sebagai suatu molekul pirofosfat. Hidrolisis pirofosfat yang terjadi
setelahnya menjadi dua molekul fosfat anorganik adalah reaksi eksergonik
tergandengkan yang membantu menggerakan reaksi polimerisasi.
2.2.3 Pemanjangan Anti Paralel
Pada kedua ujung untai DNA berbeda satu sama lain sehingga setiap untai
memiliki keterarahan (direksionalitas). Selain itu, kedua untai DNA dalam suatu
heliks ganda bersifat anti paralel , yang berarti terorientasi ke arah yang berlawanan.
DNA polimerase hanya dapat menambahkan nukleotida – nukleotida hanya ke
ujung 3’ bebas dari suatu primer atau untai DNA yang sedang tumbuh, tidak pernah
ke ujung 5 ‘ sehingga dapat dikatakan bahwa untai DNA baru hanya dapat
memanjang dari 5’ 3’.
DNA polimerase III dapat menyintesis suatu untai komplemeter secara terus
menerus dengan memperpanjang daerah baru kearah 5‘3’. DNA pol III
menempel ke garpu replikasi di untai cetakan dan terus menerus menambahkan
nukleotida ke untai komplementer baru seiring majunya garpu replikasi. Dimana
hal tersebut merupakan untai DNA maju (Leading Strand).
12
Selain leading strand DNA, terdapat untai DNA lain yaitu untai lambat (
Lagging Strand ) dimana pada untai ini prosesnya disintesis secara tersendat –
sendat, sebagai rangkaian dari segmen – segmen . Segmen – segmen ini sering
disebut sebagai fragmen Okazaki.
Pada Fragmen Okazaki, setiap masing-masing segmen untai lambat
membutuhkan satu primer tersendiri tidak seperti pada untai maju yang hanya
membutuhkan satu buah primer saja. DNA Polimerase I pada untai lambat
berfungsi sebagai pengganti nukleotida RNA primer dengan nukleotida versi DNA.
Dimana yang bersangkutan menambahkan nukleotida satu demi satu sampai ke
ujung 3’ Fragmen Okazaki yang bersebelahan. Tetapi pada penggabungan
nukleotida terakhir dari segmen DNA ke nukleotida DNA Fragmen Okazaki akan
digantikan oleh DNA ligase sebagai penggabung gula fosfat dari fragmen Okazaki
menjadi untai DNA tidak terputus.
2.2.4 Perbaikan DNA
Seringkali DNA salah dalam berpasangan, oleh sebab itu terdapatlah
mekanisme pengecekan dan perbaikan DNA atau biasa disebut sebagai Mismatch
Repair. Disini, enzim – enzim berperan sebagai penyingkir serta pengganti
nukleotida yang salah berpasangan pada replikasi. Hal ini diduga terjadi akibat dari
penemuan yang mengatakan bahwa telah ditemukannya hubungan yang terjadi
antara cacat herediter pada suatu enzim dengan kejadian kanker usus besar.9
13
2.2.5 Cara kerja PCR
Gambar 2.3 Bagan cara kerja PCR
(Sumber : Campbell NA, Reece JB, Urry LA. Biologi. 8th ed Jilid 1. Jakarta : Erlangga. 2010)
14
2.4 Kerangka Teori
Gambar 2.5 Kerangka Teori 1,8,9
15
2.5 Kerangka Konsep
Gambar 2.5 Kerangka Konsep
16
2.6 Definisi Operasional
No Varabel Definisi Alat Ukur Skala Skor
1 SNP 826198
Variasi
Sekuensing
DNA pada gen
TMPRSS6
Light Cycler
480® Roche
04 909 631
001
Nominal
1. Wildtype
2.Mutant
3.Heterozygote
2 Kadar
Hemoglobin
Kadar
metaloprotein
dalam sel
darah merah
yang
berfungsi
sebagai
pengangkut
oksigen.
Dengan
satuan g/dL
Strip dan
alat cek
kadar Hb
Easy Touch®
GCHB meter
Ordinal
Laki - laki :
1. Anemia : < 13
2. Nonanemia :
>13,1
Perempuan :
1. Anemia : <12
2. Nonanemia :
>12,1
17
BAB III
METODE PENELITIAN
3.1 Metode Penelitian
Metode yang digunakan peneliti adalah metode experimental. Penelitian ini
dilakukan dengan merancang primer dan gBlock spesifik ss8296198. Rancangan
primer dan gBlock tersebut digunakan untuk mendeteksi dan melakukan skrining
ss8296198 dengan teknik High Resolution Melting pada mahasiswa jurusan PSPD
Universitas UIN Syarif Hidayatullah. Tahapannya berupa :
- Merancang primer dan gBlock yang spesifik untuk mendeteksi mutasi pada gen
TMPRSS6 SNP ss8296198.
- Mengaplikasikan metode High Resolution Melting untuk mendeteksi mendeteksi
mutasi pada gen TMPRSS6 SNP ss8296198.
- Melakukan skrining ss8296198 pada mahasiswa jurusan PSPD Universitas UIN
Syarif Hidayatullah Jakarta menggunakan metode High Resolution Melting untuk
mendeteksi mendeteksi mutasi pada gen TMPRSS6 SNP ss8296198.
3.2 Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan mulai bulan Mei 2015 sampai Agustus 2015. Penelitian
dilaksanakan di Laboratorium Riset, Biokimia, dan Biologi Fakultas Kedokteran dan
Ilmu Kesehatan, Universitas UIN Syarif Hidayatullah Jakarta.
3.3 Populasi dan Sampel
3.3.1 Populasi Target
Populasi target adalah responden laki – laki dan perempuan mahasiswa FKIK UIN
Syarif Hidayatullah Jakarta.
18
3.3.2 Populasi Terjangkau
Populasi terjangkau penelitian ini adalah responden laki – laki dan perempuan
mahasiswa Program Studi Pendidikan Dokter Angkatan 2012-2014 UIN Syarif
Hidayatullah Jakarta.
3.3.3 Perkiraan Besar Sampel
Sampel yang digunakan pada penelitian ini adalah sampel DNA yang diperoleh
dari 300 mahasiswa Jurusan PSPD UIN Syarif Hidayatullah Jakarta. Kontrol
digunakan dengan menggunakan sampel DNA SS8296198. Dalam penentuan jumlah
sampel, peneliti menggunakan perhitungan Slovin dengan alasan total jumlah
mahasiswa PSPD dari 2012-2014 kurang dari 500 orang. Rumus perhitungan yang
dipakai adalah:
Keterangan:
n = Besarnya sampel
N = Jumlah sampel
e = Batas toleransi kesalahan 10 % (0.1)
Maka ditemukan:
n = 300/(1+300x0.12)
= 75 Orang
19
3.3.4 Kriteria Pemilihan Sampel
Kriteria pemilihan dalam penelitian ini terdiri dari kriteria inklusi dan ekslusi.
Kriteria inklusi adalah mahasiswa aktif PSPD UIN Jakarta, laki - laki atau
perempuan. Untuk kriteria eksklusi tidak dibatasi karena peneliti ingin melihat hasil
skrining seluruh sampel dan melihat apakah terdapat gen abnormal atau tidak. Dan
mahasiswa yang menolak sebagai responden.
3.3.5 Teknik Pengambilan Sampel
Sampel yang diambil berdasarkan Simple Random Sampling dimana sampel
dipilih secara acak dari jumlah yang telah ditentukan. Subjek yang terlibat terlebih
dahulu menyatakan kesediaannya untuk menjadi subjek penelitian dengan
menandatangani lembar informed consent. Selanjutnya subjek yang bersedia mengisi
dan menandatangani informed consent secara sukarela memberikan 3-5 mL darahnya
untuk dilakukan pemeriksaan skrining genetik. Sampel darah dimasukan ke tabung
EDTA dan diberi nomor, selanjutnya disimpan dalam cold room untuk dilakukan
isolasi DNA, kemudian dilakukan PCR-High Resolution Melting. Pengambilan
sampel ini telah mendapat persetujuan etik dari Komisi Etik Penelitian Kesehatan,
Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
3.4 Alat dan Bahan
Alat dan bahan yang digunakan dalam penelitian ini terdapat dalam tabel dibawah
ini:
20
Tabel 3.1 Alat dan Bahan
Alat Bahan
Pengambilan sampel (darah)
Spuit 3 cc
Torniquet
Tabung berisi EDTA
Sarung Tangan
Kapas alkohol
EDTA dalam tabung
Isolasi Genom DNA dari darah
Tabung mikrosentrifugasi 1,5 ml steril,
Penangas air (Water bath) AS ONE TRW-
42TP 80 high temperature version,pipet
mikro BIOHIT berbagai ukuran,vortex
DADD,2 mL collection tube,Alat
sentrifugasi eppendorf ,mikrotip Biologix
ukuran 10µL, 200µL dan 1000µL,
incubator EYELA NDO-400,biomedical
freezer SANYO
RBC Lysis Buffer
GB Buffer
Elution Buffer
Ethanol Absolut
W1 Buffer
Wash Buffer
Pengukuran konsentrasi hasil isolasi DNA
Maestro Nano Drops
Elektroforesis genom DNA
Elektroforesis ATTO My Power II 300 AE-
8135,Timbangan analtik AdventureTM, gel
doc system, penggaris sumur,
Agarosa,ethidium
bromida,loading dye, plastic wrap
21
3.5 Cara Kerja Penelitian
3.5.1 Desain Primer ss8296198
Langkah kerja desain yang spesifik untuk primer ss826198 adalah sebagai berikut:
1. Penentuan area mutasi dilakukan dengan data yang diperoleh dari situs
Ensembl
2. Perancangan primer spesifik ss8296198 dilakukan sendiri secara manual
oleh peneliti
3. Perancangan primer yang spesifik untuk ss8296198 dilakukan sesuai
dengan syarat primer yang baik
4. Hasil rancangan primer selanjutnya dianalisis dengan menggunakan
program Primer Blast pada situs NCBI
5. Hasil rancangan primer dimasukan pada program Primer – Blast di situs
NCBI untuk membuktkan bahwa primer hasil rancangan merupakan primer
yang baik dan sekaligus untuk mengetahui Tm primer serta panjang produk
PCR atau area hasil pemotongan oleh primer tersebut
Langkah selanjutntya setelah mendapatkan rancangan primer yang dilakukan
adalah melakukan optimasi menggunakan PCR. Optimasi PCR sendiri disini
bertujuan untuk memperoleh reaksi, kondisi, dan hasil yang optimal dalam
melakukan proses PCR. Proses optimasi PCR dilakukan dengan cara
memvariasikan kondisi yang digunakan pada proses PCR meliputi suhu dan waktu
fase annealing serta jumlah dan konsentrasi bahan – bahan yang digunakan dalam
proses PCR.
3.5.2 Desain High Resolution Melting ss8296198
Langkah kerja desain High Resolution Melting untuk mendeteksi ss8296198
adalah sebagai berikut :
1. Penentuan area mutasi yang diperoleh dari situs Ensembl.
2. Perancangan spesifik SS8296198 dilakukan sendiri secara manual oleh
peneliti.
22
3. Hasil perancangan dianalisis dengan menggunakan program software
Roche HRM desain
4. Pada hasil desain diuji terhadap sampel DNA kontrol positif ss8296198
3.5.3 Isolasi DNA
Setelah sampel darah diambil, dilakukan isolasi DNA untuk mendapatkan genom
DNA dengan menggunakan Genomic DNA Mini Kit (Blood/Cultured Cell) Geneaid
dengan langkah kerja sebagai berikut.
Tabel 3.2 Isolasi DNA
Persiapan
Sampel Fresh Blood
1. Darah sebanyak 300 μL dimasukan kedalam 1,5 ml tabung
mikrosentrifugasi
2. Kemudian Tambahkan 900 μL RBC Lysis Buffer dan dikocok.
3. Tabung diinkubasi 10 menit dalam suhu ruangan
4. Tabung disentrifugasi selama 5 menit pada kecepatan 3000 rpm
selama 5 menit, supernatant dibuang.
5. Tambahkan 100 μL RBC Lysis Buffer untuk meresuspensi endapan
leukosit, kocok, kemudian diproses dengan cell lysis
Langkah
1
Cell
Lysis
6. Tambahkan 200 μL GB Buffer kedalam tabung tadi
7. Inkubasi tabung pada suhu 60o C selama 10 menit untuk
memastikan sampel terlisiskan.
8. Pada saat yang sama tabung lain berisi 50 μL Elution Buffer untuk
tiap satu sampel disiapkan, kemudian diinkubasi pada suhu 60o C.
9. Setelah sampel tabung diinkubasi, tabung didinginkan di suhu
ruangan.
Langkah
2
DNA
binding
10. Tambahkan 200 μL ethanol absolute ke dalam tabung, kemudian
secara cepat dikocok selama 10 detik.
11. Siapkan GD Column pada 2 mL Collection Tube.
12. Pindahkan campuran ethanol tadi kedalam GD Column
13. Sentrifugasi tabung pada 14.000 – 16.000 x g selama 5 menit
14. Buang cairan pada 2 ml Collection Tube
15. Tempatkan kembali GD Column pada 2 ml Collection Tube
23
Langkah
3
Wash
16. Tambahkan 400 μL W1 Buffer kedalam GD Column kemudian
disentrifugasi pada 14.000 – 16.000 x g selama 1 menit
17. Buang cairan pada 2 ml Collection Tube
18. GD Column ditempatkan kembali pada 2 ml Collection Tube
19. Tambahkan 600 μl Wash Buffer kedalam GD Column
20. Sentrifugasi tabung pada 14.000 – 16.000 x g selama 1 menit
21. Buang cairan pada 2 ml Collection Tube
22. Tempatkan kembali GD Column pada 2 ml Collection Tube
23. Sentrifugasi kembali tabung selama 1 menit untuk mengeringkan
matriks kolum
Langkah
4
DNA
Elution
Volume standar Elution Buffer untuk 1 sampel adalah 100 μl. Jika
sampel yang digunakan dalam volume sedikit, volume elusi sekitar
30 – 50 μl dapat meningkatkan konsentrasi DNA.
24. Pindahkan GD Column yang sudah kering ke dalam tabung
mikrosentrifugasi yang steril
25. Tambahkan 50 μl Elution Buffer yang sudah diinkubasi kedalam
matriks kolum, biarkan selama 3 menit
26. Sentrifugasi pada 14.000 – 16.000 x g selama 1 menit untuk
mendapatkan hasil
Genom DNA yang sudah diisolasi dilakukan pengecekan dengan cara
elektroforesis dan dibaca menggunakan alat Gel doc system.
Hasil isolasi DNA dinilai jumlah konsentrasi DNA nya dengan menggunakan
alat Maestro Nano Drops. Sampel diambil sebanyak 1 μL, kemudian diletakkan di
lensa nano, lalu tekan enter.
3.5.4 Tata Kerja PCR – HRM
Langkah memulai genotyping analisa:
1. Primer Mix
1. Buat pengenceran primerForward dan Reverse induk dengan konsentrasi
akhir 50 µM
2. Gabungkan primer induk yang telah diencerkan dengan menambahkan
dH20 hingga mencapai konsentrasi 5 µM (Primer Mix)
2. Template DNA
24
1. Ukur Konsentrasi DNA template
2. Lakukan 2x pengenceran DNA template
3. Lakukan Prosedur HRM
Tabel 3.3 Prosedur HRM
Bahan – bahan 25 µl rxn
HRM Kit 7,5 µl
MgCl2 1,2 µl
Primer (mix) 0,75 µl
dH2O 1,8 µl
Template DNA 3,75 µl
25
3.5.5 Alur Kerja Penelitian
Gambar 3,1 Alur Kerja Penelitian
Desain primer
Optimasi produk PCR
meliputi formulasi dan
program PCR
Uji coba deteksi gen
SS826198 sampel
kontrol positif
dengan teknik PCR-
HRM
Desain HRM
Sampel darah
Isolasi DNA
dengan metode
Geneaid
Analisis DNA
genom dengan
teknik elektroforesis
Pita DNA diamati
menggunakan alat
gel doc sistem
26
BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
2.1 Anemia
2.1.1 Epidemiologi
Anemia defisisensi besi merupakan penyakit paling umum dan penyakit yang
berhubungan dengan nutrisi yang paling luas sebarannya di dunia. Dimana penyakit
ini menurut angka kejadiannya banyak dialami pada anak – anak dan perempuan
pada negara berkembang. Diketahui sekitar 2 juta orang mengalami anemia dan
Gambar 4.1 Karakteristik Jenis Kelamin Responden
Tabel 4.1 Karakteristik Jenis Kelamin Responden
Frekuensi Persentase (%)
Jenis Kelamin Laki – laki 38 37,3
Perempuan 64 62,7
Total 102 100
37%
63%
Jenis Kelamin
Laki - laki Perempuan
27
Berdasarkan tabel 4.1 dari 102 sampel diketahui bahwa laki – laki berjumlah 38
orang dan perempuan berjumlah 64 orang dengan persentasi perempuan sebesar 63,75
% dan laki – laki sebesar 37,25 %.
4.1.1.2 Usia
Gambar 4.2 Karakteristik Usia Responden
Berdasarkan gambar 4.2 diketahui dari 102 sampel variasi usia responden dalam
penelitian terdiri dari usia 17 tahun sebanyak 2 orang, usia 18 tahun sebanyak 16 orang,
usia 19 tahun sebanyak 29, usia 20 tahun sebanyak 30 dengan persentase 29,4 % , usia 21
tahun sebanyak 22 orang, usia 23 tahun sebanyak 3 orang dengan persentase 2,9 %.
Melihat data tersebut dapat disimpulkan bahwa usia responden termuda pada penelitian
ini adalah 17 tahun dan usia tertua yang menjadi responden dalam penelitian ini adalah
23 tahun . Sedangkan jumlah terbanyak berada pada rentang usia 20 tahun.
Mean = 19,65
Std Deviasi = 1,208
N = 102
28
4.1.1.3 Hasil Pengukuran IMT
Berdasarkan gambar 4.3 diketahui bahwa sebaran sampel apabila dikelompokan
berdasarkan IMT menurut kriteria asia pasifik terbanyak berada pada berat badan normal
sebesar 62 orang dengan persentase 60,78 %. Sedangkan rerata IMT sebesar 2,24 ± 0,925
Gambar 4.3 Karakteristik IMT responden
4.1.1.4 Hasil pengukuran Kadar Hemoglobin
Berdasarkan hasil statistik deskriptif diketahui bahwa rentang kadar Hemoglobin
terendah pada responden didapatkan sebesar 8 sedangkan tertinggi didapatkan 18,5
Sedangkan rerata kadar Hemoglobin sebesar 11,526 dengan standar deviasi 2,022.
61%16%
9%
12%2%
Index Massa Tubuh
Normal Underweight Overweight Obese 1 Obese 2
29
Gambar 4.4. Kadar Hemoglobin Responden
Berdasarkan data diatas didapatkan bahwa persentase responden yang mengalami
anemia sebesar 72,5 %, sedangkan yang normal sebesar 27,5 % Hal ini merujuk kepada
standar yang diberikan oleh WHO yaitu pada laki – laki dikatakan anemia apabila kadar
Hemoglobin < 13 g/dL dan pada perempuan apabila kadar Hemoglobin <12 g/dL.
4.1.1.5 Hasil Isolasi DNA Genom dari Whole Blood
Penelitian ini menggunakan sampel berupa sampel DNA yang diperoleh dari
isolasi sel darah (Whole Blood). Sampel yag digunakan berjumlah 102 orang yang
seluruhnya merupakan mahasiswa PSPD UIN Syarif Hidayatullah Jakarta.
Isolasi dan purifikasi DNA dilakukan dari sampel darah (Whole Blood) dilakukan
berdasarkan protokol Geneaid. Selanjutnya untuk pengecekannya dilakukan dengan gel
elektroforesis dengan hasil sebagai berikut :
Anemia; 72,5
Normal; 27,5
KADAR HEMOGLOBIN RESPONDEN
30
Gambar 4.5. Dokumentasi hasil elektroforesis agarose dari isolasi genom DNA sampel
Dilanjutkan dengan pemeriksaan kemurnian dan konsentrasi dari 102 sampel DNA
genom yang dapat dilihat pada tabel berikut
Tabel 4.2. Kemurnian dan Konsentrasi Hasil Isolasi Genom DNA Responden
Kemurnian DNA Konsentrasi
Total 194,21 5530,23
Mean 1,8 50,7
4.1.1.6 Hasil Analisis Kurva Genotip Wildtype, Heterozygote, dan Mutant
Sampel yang telah dilakukan pemeriksaan mutasi gen dengan RT- PCR HRM akan
memberikan gambaran berupa hasil kurva yang berbeda berdasarkan temperatur lelehnya.
Hasil analisis kurva HRM dari genom DNA sampel didapatkan data genotyping sebagai
berikut :
Isolasi Genom yang baik Isolasi Genom yang tidak baik
31
Gambar 4.6 Genotype SNP ss8296198
Berdasarkan gambar 4.6 diketahui bahwa dari 102 sampel, didapatkan persentase alel
Wildtype sebesar 22 orang , Heterozygote sebesar 31 orang , Mutant sebesar 24 orang.
Prevalensi terbanyak pada Heterozygote.
4.1.1.7 Hasil Gambaran Kurva HRM
Gambar 4.7 kurva HRM
0
5
10
15
20
25
30
35
Wildtype Mutant Heterozygote
2224
31
Sebaran Alel
Heterozygote
Homozygote
32
Pada gambaran HRM tampak kurva yang paling kanan merupakan Wildtype , sedangkan
yang kedua merupakan Mutant, dan yang paling kiri adalah Heterozygote
Gambar 4,8 hasil sekuensing ss826198 Untuk wild type
Gambar 4.9 hasil sekuensing ss82916198 untuk heterozygote type no 70
Tanda panah di sekeunsing wildtype menunjukkan area yang berubah pada mutant type
ss8296198. Pada pola heterozygote type, kadang dijumpai ganda heterozygote. Adanya
ganda heterozygote ini, akan menyebabkan perubahan pola kurva HRM heterozygote
pada produk PCR untuk SS8296198.
33
4.1.1.8 Hasil Hubungan Jenis Kelamin dengan Kadar Hemoglobin
Gambar 4.10 Hubungan Kadar Hemoglobin dengan Jenis Kelamin
Berdasarkan data diatas didapatkan jumlah perempuan yang normal sebesar 10 orang dan
yang menderita anemia sebesar 54 orang .Pada laki – laki jumlah yang normal sebesar
18 orang dan menderita anemia sebesar 20 orang. Ini menunjukkan bahwa jumlah
perempuan yang mengalami anemia lebih tinggi dibandingkan laki – laki. Uji Chi-Square
didapatkan nilai Pearson Chi-Square sebesar 0,001 yang memiliki arti terdapat hubungan
yang signifikan antara jenis kelamin dan kadar hemoglobin.
0 10 20 30 40 50 60 70
Laki - laki
Perempuan
20
54
18
10
Hubungan Jenis Kelamin dengan Kategori Hemoglobin
Anemia Nonanemia
34
4.1.1.9 Hasil Hubungan Jenis Kelamin dengan Genotip SS8296198
Gambar 4.11 Menunjukkan Hubungan Jenis Kelamin dengan Genotip ss8296198.
Hasil dari uji Chi-Square didapatkan hasil perhitungan sebesar 0,248, dengan demikian
dapat disimpulkan tidak terdapat hubungan yang bermakna antara Jenis Kelamin dengan
Kategori Genotip ss8296198.
Wildtype
Mutant
Heterozygote
0
5
10
15
20
25
30
Laki - laki Perempuan
12 12
14
23
12
29
Hubungan Jenis Kelamin dengan Genotip
Wildtype Mutant Heterozygote
35
4.1.1.10 Hasil Hubungan Genotip ss8296198 dengan Kadar Hemoglobin (Anemia
dan Normal)
Gambar 4.12 Hubungan Genotip ss8296198 dengan Kadar Hemoglobin (Anemia dan
Normal)
Hasil data yang diperoleh kemudian dicari hubungan yang terjadi antara kategori genotip
(Wildtype, Heterozygote, Mutant) dengan Kadar Hemoglobin (Anemia dan Normal).
Kemudian dilakukan pengujian dengan uji Chi-Square sebesar 0,403, dengan begitu
dapat disimpulkan tidak terdapat hubungan yang bermakna antara genotip ss8296198
dengan kadar hemoglobin (Anemia dan Normal). Sedangkan menurut Gichiobi-wainaina
WN et al terdapat adanya hubungan antara ss8296198 terhadap rendahnya kadar
hemoglobin pada suatu populasi. Hal ini dapat terjadi disebabkan terdapat perbedaan
lokasi serta ras dari populasi yang diteliti. 22
0
5
10
15
20
25
30
35
Wildtype Heterozygote Mutant
19
31
24
5
10
13
Hubungan Genotip dengan Kadar Hemoglobin
Anemia Nonanemia
36
4.2 Pembahasan
4.2.1 ss8296198
1
Gambar 4.13 Letak lokasi mutasi gen ss8296198
ss8296198 merupakan SNP yang terletak pada kromosoom 22 pada daerah exon.
Exon sendiri adalah salah satu bagian dari DNA yang memiliki fungsi sebagai
pengkonversi menjadi mRNA yang matang. Prosesnya sendiri disebut sebagai transkripsi
dimana DNA digunakan sebagai template untuk membentuk mRNA. Selanjutnya mRNA
berperan dalam proses transalasi dalam proses sintesis protein lewat tRNA. Dapat diambil
kesimpulan bahwa exon secara tidak langsung berperan dalam sintesis protein sehingga
apabila terdapat gangguan berupa mutasi pada salah satu exon, maka akan terjadi
gangguan dalam proses sintesis protein pada DNA yang bersangkutan. 2,3
37
Gambar 4.14 Lokasi Mutasi IRIDA4 (Sumber : Benyamin B, Ferreira MA, Willemsen G et al. Common Variants in TMPRSS6 are Associated
with Iron Status and Erythrocyte Volume. Nature Genetics. November 2009)
4.2.2 Desain Primer ss8296198
Desain primer pada penelitian ini dilakukan dengan menggunakan primer – blast
pada situs NCBI. Sedangkan sequence serta urutan basa diperoleh dari Ensembl.
Sequence tersebut digunakan sebagai acuan dalam merancang primer untuk mendeteksi
ss8296198.
Pada penelitian ini, desain primer dilakukan secara manual oleh peneliti dengan
tujuan untuk merancang primer yang lebih spesifik untuk mendeteksi SNP ss826198
38
pada gen TMPRSS6. Primer yang dihasilkan, haruslah dapat menempel dan memotong
area target dan tidak menempel pada area lain
Panjang primer sendiri merupakan salah satu faktor yang berpengaruh dalam PCR
karena panjang primer dapat dapat menentukan suhu dan waktu fase annealing yang
optimal.5
4.2.3 Hasil desain Primer
1. gen TMPRSS6 ss8296198 A/G
Area yang berubah:
(https://www.lifetechnologies.com/order/genome-
database/browse/genotyping/keyword/rs855791?ICID=uc-snp-rs855791).
GCGTGGCGTCACCTGGTAGCGATAG[A/G]CCTCGCTGCACAGGTCCTG
TGGGAT
Area sekuensing untuk disain HRM-PCR ss8296198:
GGCAGCATCCTTTCTCCCTCCTCTCTCCCTCCCATGCCCGGGGGAC
TCACCTGACAGGCA TCCTTCTTGC CCTTGCGGTAGCCGGCACAC
AGCATGCGTG GCGTCACCTG GTAGCGATAG (G/A) CCTCGCTGCA
CAGGTCCTGT GGGATCAACT GCACATCCAC TTTCTGCAGA
GCGTTGCTGATGGGGCCTGT CCGTGGTCAA GGGCAGAAGTGAGA
TCTCAG GAGCCTGGAG CCCCTGTTCT
Panjang urutan basa nukleotida: 241 bp
gBlock Homozygote Wildtype sebagai kontrol
39
GGCAGCA TCC TTT CTC CCT CCT CTC T CCCTCCCATGCCCGGGG
GACTCACCTGACAGGCATCCTTCTTGCCCTTGCGGTAGCCGGCACAC
AGCATGCGTGGCGTCACCTGGTAGCGATAG
g
CCTCGCTGCACAGGTCCTGTGGGATCAACTGCACATCCACTTTCTGCA
GAGCGTTGCTGATGGGGCCTGTCCGTGGTCAAGGGCAGAAGTGAG
ATCTCAGGAGCCTGGAG CCCCTGTTCT
gBlock Homozygote Mutant sebagai kontrol
GGCAGCATCCTTTCTCCCTCCTCTCTCCCTCCCATGCCCGGGGGAC
TCACCTGACAGGCATCCTTCTTGCCCTTGCGGTAGCCGGCACACAGC
ATGCGTGGCGTCACCTGGTAGCGATAG
a
CCTCGCTGCACAGGTCCTGTGGGATCAACTGCACATCCACTTTCTGCA
GAGCGTTGCTGATGGGGCCTGTCCGTGGTCAAGGGCAGAAGTGAG
ATCTCAGGAGCCTGGAG CCCCTGTTCT
Urutan primer untuk ss8296198
Forward: TCC TTT CTC CCT CCT CTC T (G/C 0.53; TM 57)
Reverse: TCT CAC TTC TGC CCT TGA C (G/C 0.53; TM 57)
Hasil amplifikasi:
TCCTTTCTCCCTCCTCTCTCCCTCCCATGCCCGGGGGACTCACCTGA
CAGGCATCCTTCTTGCCCTTGCGGTAGCCGGCACACAGCATGCGTGG
CGTCACCTGGTAGCGATAGaCCTCGCTGCACAGGTCCTGTGGGATCA
ACTGCACATCCACTTTCTGCAGAGCGTTGCTGATGGGGCCTGTCCGT
GGTCAAGGGCAGAAGTGAGA
40
Gambar 4.15 Area desain primer untuk ss826198
Panjang produk PCR : 208 bp
Hasil produk PCR yang dihasilkan dari pemotongan primer forward dan primer
reverse adalah sepanjang 208 bp sehingga panjang dari hasil produk tersebut sudah
memenuhi persyaratan sebesar 300 – 2000 basa.6
Gambar 4.16 Optimasi PCR Fase Annealing21
Hasil optimasi PCR menunjukan bahwa suhu fase annealing yang optimal yaitu pada
suhu 62C. Pada suhu tersebut pita DNA produk PCR yang terbentuk hanya terdapat pada
area pemotongan primer yaitu pada 208 bp secara spesifik tanpa terbentuk pita DNA lain.
Hal tersebut membuktikan bahwa proses PCR telah terjadi secara optimal dimana semua
41
komponen bahan – bahan PCR telah bereaksi secara optimal tanpa menghasilkan bahan
sisa reaksi.
4.2.4 Hasil Kurva HRM
Gambar 4.17 Gel Documentation Elektroforesis Agarose dari Isolasi Genom PCR-HRM
Hasil kurva HRM – PCR dengan menggunakan software HRM-Roche menunjukkan
tiga pola grafik. Sesuai dengan nama metodanya, yaitu HRM yang berarti perubahan satu
basa akan menyebabkan perubahan temperatur leleh atau melt temperature setiap
fragmen produk PCR (amplicon). Dengan demikian, kita dapat mengamati pola wildtype,
heterozygote maupun mutant dari suatu produk PCR. Metoda ini sangat sensitif
dibandingkan metoda realtime PCR yang tidak menggunakan probe, karena pada metoda
ini digunakan suatu senyawa fluorescent dye konsentrasi tinggi yang akan berikatan
hanya pada DNA untai ganda. Ini berarti fluorescent dye hanya berikatan pada amplicon
tidak pada DNA untai tunggal. Saat DNA membentuk untai ganda dan dye berikatan pada
untai tersebut, maka akan dihasilkan sinyal fluorescence yang tinggi. Namun saat suhu
ditingkatkan secara perlahan, maka untai ganda tersebut secara perlahan akan terurai
membentuk untai tunggal, dan sinyal fluorescence turun. Dengan demikian, setiap
amplicon wildtype, heterozygote dan mutant akan dapat terbaca. Hal ini dapat dilihat pada
gambar 4.7 – 4.9, dimana perubahan basa nukelotida dalam satu amplikon DNA akan
mengubah pola grafik. Berdasarkan penelitian ini, menunjukkan bahwa HRM-PCR
memiliki sensitivitas yang baik namun tidak spesifik hanya pada satu area mutasi yang
Dimer 208 bp
M s1 s2 s3 s4 s5
M: DNA Ladder
S : Sampel
42
kita amati. Penggunaan metoda HRM-PCR sebaiknya diikuti dengan melakukan
sekuensing DNA7
Gambar 4.18 Contoh Kurva HRM
Pada gambar di atas memperlihatkan pada suhu kurang dari 770C, pancaran sinyal
fluoro sangat tinggi sedangkan pada suhu lebih dari 820C, pancaran melemah. Hal ini
diakibatkan, pada suhu 77C semua amplikon dalam bentuk untai ganda, dan perlahan
untai ganda terlepas dengan peningkatan suhu. Pancaran sinyal fluoro heterozygote GA
mulai melemah pada suhu sekitar 78C, sedangkan mutan AA pada suhu sekitar 78,5 dan
wildtype GG pada suhu 79C. Dengan demikian kita dapat membuat pengelompokan tipe
genotip masing-masing sampel. Walaupun teknik HRM-PCR dapat digunakan untuk
deteksi mutasi, polimorfisme dan epigenetik, namun jika ada mutasi lain atau mutasi yang
dituju bukan yang diinginkan dalam satu amplikon yang sama, maka pola grafik akan
berubah. Untuk itu diperlukan pemeriksaan lanjutan yaitu sekuensing DNA amplikon.
43
4.2.5 Data Statistik
Hasil uji bivariat antara jenis kelamin dengan kadar hemoglobin menggunakan uji Chi
Square, didapatkan nilai p-value 0,01 dengan standar nilai p-value ≤0,05 sehingga dapat
disimpulkan terdapat hubungan antara jenis kelamin dengan kadar hemoglobin.
Sedangkan hasil uji bivariat antara jenis kelamin dengan Genotip SS826198
menggunakan uji Chi Square, didapatkan nilai p-value sebesar 0,873 dengan begitu nilai
p-value ≥0,05 sehingga dapat disimpulkan tidak terdapat hubungan antara Jenis kelamin
dengan Genotip SS826198.
4.3 Keterbatasan Penelitian
1. Tidak mencari data mengenai status menstruasi responden
2. Tidak mencari data mengenai asupan zat besi responden
44
BAB V
Simpulan dan Saran
3.6 Simpulan
Berdasarkan penelitian yang sudah dilakukan menunjukan bahwa mutasi
gen pada Gen TMPRSS6 SNP ss826198 memiliki hubungan dengan jenis
kelamin hal ini dibuktikan dengan cenderung lebih banyaknya responden yang
perempuan yang mengalami mutasi pada Gen TMPRSS6 SNP ss826198 yang
diikuti dengan kadar hemoglobin yang rendah. Sedangkan hubungan antara
mutasi gen pada Gen TMPRSS6 SNP SS826198 tidak memiliki hubungan
dengan rendahnya kadar hemoglobin. Hal ini dibuktikan dengan hasil uji statistik
yang membuktikan bahwa tidak semua pasien yang mengalami mutasi pada Gen
TMPRSS6 SNP SS826198 memiliki kadar hemoglobin yang rendah, begitu pula
sebaliknya kadar hemoglobin yang rendah tidak selalu menunjukan mutasi pada
Gen TMPRSS6 SNP ss826198.
3.7 Saran
Pada penelitian selanjutnya perlu dilakukan pengujian kadar hemoglobin
yang lebih spesifik karena pada penelitian kali ini tidak menggunakan
pemeriksaan darah rutin lengkap seperti di laboratorium yang disebabkan oleh
keterbatasan biaya.
45
Daftar Pustaka
1. Sudoyo AW, Setiyohadi B, Alwi A et al. Buku Ajar Ilmu Penyakit Dalam 5 th ed.
Jilid II. Jakarta : Interna Publishing; 2009. p : 1130
2. World Health Organization [Internet]; 2015 [cited 2015 September 25]. Available
from: http://www.who.int/nutrition/topics/ida/en/
3. Riskesdas 2013. Badan Penelitian dan Pengembangan Kesehatan Kementerian
Kesehatan RI. 2013
4. Ridwanuloh AM. Analisis mutasi gen EGFR dan kras berbasis PCR-HRM (High
Resolution Melting) dan RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphisme)
terhadap cairan pleura pasien kanker paru yang disimpan pada kertas saring.
Bogor : Repository IPB; 2013
5. Prevalence Iron Deficiency [Internet]; 2015 [cited 2015 September 25].
http://www.aafp.org/afp/2007/0301/p671.html
6. Longo DL. Harrison’s Hematology and Oncology. New York : Mc Graw- Hill;
2010. p: 73
7. Mascher AL. Histologi Dasar Junqueira Teks dan Atlas 12th ed. Jakarta : EGC p:
213 - 215
8. Katzung BG. Farmakologi Dasar & Klinik Ed 10. Jakarta : EGC; 2007 p:539 -
541
9. Goncalves L, Nobre JG, Afonso C et al. The Role of TMPRSS6 gene variants in
different types of Iron Deficiency Anaemia from The Rare Severe Hereditary
IRIDA to The Common Mild Acquired IDA. 2014
10. Lubis H. Anemia Defisiensi Besi : Manifestasi dan Perawatannya. Usu
Repository. 2002
11. Wahyuni AS. Anemia Defisiensi Pada Balita. Repository Usu . 2004
12. Mahan LK, Stump SE. Krause’s Food & Nutrition 12th ed . 2008 . Hal 817
13. Campbell NA, Reece JB, Urry LA. Biologi. 8th ed Jilid 1. Jakarta : Erlangga.
2010
46
14. Exon Function [Internet]; 2015 [cited 2015 September 25].
www.dartmouth.edu/~cbbc/courses/bio4/bio4-lectures/EukGenes.html
15. Exon Function [Internet]; 2015 [cited 2015 September 25].
www.nature.com/.../translation-dna-to-mrna-to-protein-393
16. Benyamin B, Ferreira MA, Willemsen G et al. Common Variants in TMPRSS6
are Associated with Iron Status and Erythrocyte Volume. Nature Genetics.
November 2009.
17. Design Primer [Internet]; 2015 [cited 2015 September 25].
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/variation/view/?q=rs855791&filters=source:dbsnp
&assm=GCF_000001405.28
18. Kalender, Ruslan,David Lee, Alan H. Schulman. 2011. Java Web Tools for PCR
, in Silico PCR, and Oligonucleotide Assembly and Analysis. Genomics,98 : 137
– 144
19. Olsen, Jayme. 2008. Introduction to “primer Design” for PCR. Weinem : Wiley-
VCH Verlag GmbH & Co. KgaA
20. S Taylor et al. A Practical Guide To High Resolution Melt Analysis Genotyping.
BioRad Tech Note 6004. 2010
21. Tm Calculator [Internet]; 2015 [cited 2015 September 25].
http://tmcalculator.neb.com/#!/
22. Gichiobi-wainaina WN . Towers WG . Swinkels DW, et al . Inter-ethnic
differences in genetic variants within the transmembrane protease, serine 6
(TMPRSS6) gene associated with iron status indicators: a systematic review with
meta-analyses. Genes Nutr. November 2014
Lampiran 1. Lembar Permohonan Ethical Approval Penelitian
Permohonan Ethical Approval Penelitian
No. :
Hal : Permohonan Ethical Approval Penelitian
Kepada:
Yth. Ketua Komite Etik Penelitian
FKIK UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Di Ciputat
Dengan Hormat,
Bersama ini kami mohon bantuan kepada komite etik penelitian kedokteran FKIK UIN
Syarif Hidayatullah Jakarta dapat memberikan keterangan Lolos Kaji Etik (Ethical
Approval) untuk penelitian kami yang berjudul “Skrining Gen TMPRSS6 pada Alel
SS8296198 pada Mahasiswa PSPD UIN Syarif Hidayatullah Jakarta Angkatan 2012
– 2014 Menggunakan Teknik High Resolution Melting”.
Terlampir kami sampaikan (masing-masing 4 kopi),
1. Proposal Penelitian
2. Formulir informed consent
Dengan permohonan kami, atas bantuan dari Ibu/Bapak kami mengucapkan banyak
terimakasih.
Hormat saya,
Peneliti, Pembimbing,
Adamilzary Fikry Abdulmannan Chris Adhiyanto, S.Si, M.Biomed, PhD
NIM 1112103000001 NIP 19721103 200604 1 001
Mengetahui,
Ketua Program Studi Pendidikan Dokter
dr. Achmad Zaki,M.Epd,Sp.OT
NIP. 19780507 200501 1 005
Lampiran 2. Lembar Persetujuan Responden
SURAT PERSETUJUAN PENELITIAN
Saat ini saya Adamilzary Fikry Abdulmannan mahasiswa PSPD UIN Jakarta angkatan
2012 sedang melakukan penelitian dengan judul Skrining Gen TMPRSS6 pada Alel
SS8296198 pada Mahasiswa PSPD UIN Syarif Hidayatullah Jakarta Angkatan 2012
– 2014 Menggunakan Teknik High Resolution Melting. Pada penelitian ini saya akan
melakukan pemeriksaan dengan pengambilan darah partisipan sebanyak satu kali yaitu
3-5 cc. Darah tersebut akan dibawa ke laboratorium untuk dilakukan skrining.
Pengambilan darah dilakukan oleh analis yang sudah berpengalaman. Untuk itu, dengan
hormat saya memohon kesediaan Anda untuk ikut serta dalam penelitian ini.
Setelah membaca penjelasan diatas, bahwa yang bertanda tangan dibawah ini:
Nama:
Umur: tahun
Alamat:
Dengan sukarela diikutsertakan dalam penelitian ini. Segala hal yang menyangkut
kerahasiaan tentang partisipan akan terjaga dengan baik oleh peneliti.
Jakarta, Mei 2015
Mengetahui,
(________________) ( Adamilzary Fikry Abdulmannan )
Mahasiswa Peneliti
Lampiran 3. Alat dan Bahan Penelitian
Gambar 7.3.1. Elektroforesis Gambar 7.3.2. Centrifuge Eppendorf
Gambar 7.3.3. Alat Inkubator Gambar 7.3.4. Micropipet & Tip
Gambar 7.3.5. Cold Room dan Freezer
Gambar 7.3.6. vortex Gambar 7.3.7. Instrument LightCycler® 480 II
Roche
Gambar 7.3.8. DNA sampel Gambar 7.3.9. Multiwall Plate Light Cycler®
Roche
Gambar 7.4. bahan isolasi DNA Geneaid (Elution buffer, GB buffer, Wash buffer, W1
buffer, RBC Lysis buffer dan Ethanol absolute 70%).
Gambar 7.4.1. Primer TMPRSS6 Gambar 7.4.2. gBlock TMPRSS6
Gambar 7.4.3 Mix HRM
Lampiran 4. Gel documentation hasil elektroforesis agarose dari isolasi genom DNA
sampel
Gambar 7.4.3. Gel documentation hasil elektroforesis agarose dari isolasi genom DNA
sampel
Lampiran 5. Hasil Kemurnian dan Konsentrasi DNA Sampel
Tabel 6.1 Hasil Pengukuran Kemurnian dan Konsentrasi DNA genom Responden
No No sampel A260/A230 Kemurnian (A
260/A 280)
Konsentrasi
(ng/µl)
1 1 1.963 2.053 25.77
2 2 1.802 1.968 108.99
3 3 1.97 2.094 17.4
4 4 2.523 2.007 113.35
5 5 1.395 1.438 16.86
6 6 1.881 1.881 55.25
7 8 -9.226 1.858 28.51
8 9 -10.04 1.835 21.32
9 10 3.208 1.935 20.64
10 11 -1.66 1.986 6.27
11 12 -0.921 2.089 9.02
12 13 2.019 1.849 46.13
13 15 -16.772 1.775 5.37
14 16 -14.587 2.042 14.42
15 17 -1.423 1.72 15.32
16 18 -2.028 1.912 6.01
17 19 -0.4 1.409 24.79
18 20 9.182 1.973 11.75
19 21 -847.665 1.898 10
20 22 -71.179 1.845 36.13
21 23 4.325 1.964 41.38
22 24 4.438 1.887 47.55
23 25 -1.081 1.768 54.87
24 26 -2.704 1.684 11.87
25 27 -0.782 2.235 22.06
26 28 2.31 1.827 9.75
27 29 10.382 1.329 49.08
28 30 5.609 2.081 50.46
29 31 0.881 1.505 40.05
30 32 1.684 1.395 113.23
31 33 9.122 1.406 73.01
32 34 2.971 1.805 41.78
33 35 9.734 1.734 186.52
34 36 1.771 2.04 54.05
35 37 1.933 1.56 106.42
36 38 3.387 1.462 81.35
37 39 10.468 1.281 35.73
38 40 6.385 1.98 50.63
39 41 1.707 1.98 59.49
40 42 -2.042 1.403 74.07
41 43 7.681 1.78 17.36
42 44 2.129 2.022 55.04
43 45 -2.418 1.571 108.1
44 46 -3.51 1.679 17.81
45 47 -6.562 1.641 20.7
46 48 1.804 2.1 32.42
47 49 1.157 1.503 65.18
48 50 4.532 1.339 56.06
49 52 -2.105 1.934 62.66
50 53 3.131 1.972 15.1
51 58 3.554 1.815 72.22
52 59 2.019 1.725 48.24
53 60 3.371 1.464 64.24
54 61 -0.765 2.054 96.98
55 62 3.81 1.161 6.71
56 63 6.324 1.282 2.41
57 64 3.145 1.289 3.77
58 65 4.118 2.331 5.88
59 66 5.251 1.102 77.03
60 67 4.474 2.102 11
61 68 2.248 1.766 89.14
62 69 5.05 1.724 47.27
63 70 -3.076 1.642 50.4
64 71 10.417 1.838 63.03
65 72 -186.279 1.72 51.05
66 73 4.2 1.835 60.72
67 74 -33.861 1.439 67.78
68 75 -3.872 1.869 54.73
69 51 10.173 1.775 20.35
70 76 7.513 1.671 42.62
71 77 39.492 1.804 37.87
72 78 5.564 1.709 49.61
73 79 4.446 1.806 34.16
74 80 -0.765 1.92 23.64
75 81 2.899 1.676 40.8
76 82 3.448 1.571 43.01
77 83 1.96 1.459 34.27
78 84 1.446 1.382 49.4
79 85 1.892 1.732 46.86
80 86 23.765 1.733 60.37
81 114 12.113 2.108 101.16
82 115 3.557 1.73 262.43
83 116 1.591 1.808 82.2
84 117 1.613 1.44 59.1
85 118 5.783 2.136 45.56
86 119 2.078 2.092 43.72
87 120 2.177 1.958 49.6
88 121 1.313 1.265 190.37
89 122 4.829 1.428 80.95
90 123 3.02 1.891 57.47
91 124 3.885 1.652 69.51
92 125 1.681 1.901 59.5
93 126 2.296 1.778 98.96
94 127 37.568 2.055 47.14
95 128 2.899 2.077 115.31
96 129 2.186 2.152 84.84
97 130 4.521 1.622 42.08
98 131 -1.311 1.906 52.11
99 132 -4.868 2.038 35.36
100 133 -46.279 1.79 136.37
101 134 3.278 1.893 55.83
102 135 -0.267 1.944 12.53
Lampiran 6. Hasil Uji Statistik
Jenis Kelamin
Frequency Percent Valid Percent Cumulative
Percent
Valid
Laki - Laki 38 37,3 37,3 37,3
Perempuan 64 62,7 62,7 100,0
Total 102 100,0 100,0
Karakteristik Umur
N Minimum Maximum Mean Std. Deviation
Umur 102 17 23 19,65 1,208
Valid N
(listwise) 102
Rentang Umur
Frequency Percent Valid Percent Cumulative
Percent
Valid
17 2 2,0 2,0 2,0
18 16 15,7 15,7 17,6
19 29 28,4 28,4 46,1
20 30 29,4 29,4 75,5
21 22 21,6 21,6 97,1
23 3 2,9 2,9 100,0
Total 102 100,0 100,0
Statistics
IMT
N Valid 102
Missing 0
Mean 2,24
Std. Deviation ,925
Sebaran IMT
Frequency Percent Valid Percent Cumulative
Percent
Valid Underweight 16 15,7 15,7 15,7
Normal 62 60,8 60,8 76,5
Overweight 10 9,8 9,8 86,3
Obese I 12 11,8 11,8 98,0
Obese II 2 2,0 2,0 100,0
Total 102 100,0 100,0
Karakteristik Hb
N Minimum Maximum Mean Std. Deviation
Hb 102 8,0 18,5 11,526 2,0222
Valid N (listwise) 102
Kategori Hb
Frequency Percent Valid Percent Cumulative
Percent
Valid
Anemia 74 72,5 72,5 72,5
Nonanem
ia 28 27,5 27,5 100,0
Total 102 100,0 100,0
Hubungan Jenis Kelamin dengan Hemoglobin
Hemoglobin Total
Anemia Nonane
mia
Jenis Kelamin
Laki – Laki
Count 20 18 38
Expected
Count 27,6 10,4 38,0
Perempuan
Count 54 10 64
Expected
Count 46,4 17,6 64,0
Total Count 74 28 102
Expected
Count 74,0 28,0 102,0
Uji Chi Square
Value df Asymp. Sig.
(2-sided)
Exact Sig.
(2-sided)
Exact Sig.
(1-sided)
Pearson Chi-Square 12,064a 1 ,001
Continuity
Correctionb 10,522 1 ,001
Likelihood Ratio 11,840 1 ,001
Fisher's Exact Test ,001 ,001
Linear-by-Linear
Association 11,945 1 ,001
N of Valid Cases 102
a. 0 cells (0,0%) have expected count less than 5. The minimum expected count is
10,43.
b. Computed only for a 2x2 table
Hubungan Jenis Kelamin dengan Genotip ss 826198
gblockAG Total
Wildty
pe
Mutant Heteroz
ygote
Jenis Kelamin
Laki -
Laki
Count 9 2 27 38
Expected
Count 8,2 1,5 28,3 38,0
Perempua
n
Count 13 2 49 64
Expected
Count 13,8 2,5 47,7 64,0
Total
Count 22 4 76 102
Expected
Count 22,0 4,0 76,0 102,0
Chi-Square Tests
Value df Asymp. Sig. (2-
sided)
Pearson Chi-Square 2,792a 2 ,248
Likelihood Ratio 2,776 2 ,250
Linear-by-Linear Association ,577 1 ,447
N of Valid Cases 102
a. 0 cells (0,0%) have expected count less than 5. The minimum expected count
is 8,94.
Hubungan Hemoglobin dengan Genotip ss826198
gblockAG Total
WIldtype Mutant Heterozy
gote
Hb
Anemia
Count 15 3 56 74
Expected
Count 16,0 2,9 55,1 74,0
Nonane
mia
Count 7 1 20 28
Expected
Count 6,0 1,1 20,9 28,0
Total
Count 22 4 76 102
Expected
Count 22,0 4,0 76,0 102,0
Chi-Square Tests
Value df Asymp. Sig. (2-
sided)
Pearson Chi-Square 1,818a 2 ,403
Likelihood Ratio 1,799 2 ,407
Linear-by-Linear Association 1,645 1 ,200
N of Valid Cases 102
a. 0 cells (0,0%) have expected count less than 5. The minimum expected count
is 6,59.
Lampiran 7. Curriculum Vitae Peneliti
CURICULUM VITAE
Nama : Adamilzary Fikry Abdulmannan
Panggilan : Fikry
Jenis Kelamin : Laki-laki
Tempat, Tanggal Lahir : Bandung,11 Januari 1995
Usia : 20 Tahun
Golongan Darah : B
Mobile : 085813620311
Agama : Islam
E-mail : [email protected]
Alamat : Jln Tirta Nirwana Raya Cluster Tirta Nirwana No. 35
Bogor
Pendidikan
a. Elementary School : SDIT Ummul Quro Bogor
b. Yunior High School : SMPIT Insan Kamil Bogor
c. Senior High School : SMA Negeri 5 Bogor
d. University : UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Pengalaman Organisasi :
Anggota OSIS SMAN5 Bogor
Anggota Rohis Ithri SMAN5 Bogor
Ketua Organisasi MERCY (Medical Research Of Syahid)
Anggota Tim Medis USMR UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Anggota BEMPD UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Penghargaan :
Juara 1 Lomba Azan SDIT Ummul Quro
Juara 3 Lomba Nasyid se-jabobeka di SMAN 1 Bogor
Juara 1 lomba TBM FK se-Indonesia dalam lomba Meridian Cup
10 Finalis LKTI Muhammadiyah Jakarta Scientific Competition tingkat Nasional 2013
Delegasi PSPD UIN Jakarta dalam Olimpiade SPORA Cabang Jantung di FK UNSRI
Delegasi PSPD UIN Jakarta dalam Indonesian Medical Olympiad (IMO) Cabang
Cardiorespi di Padang 2014
Karya Tulis :
Potensi Z-din dalam Arachis Hipogaea L sebagai inhibitor Reseptor P2X7 untuk
alternatif Penetalaksanaan Hepatitis C
Carica Papaya Leaves, Psidium Guava Leaves Sebagai Terapi Tambahan dalam
Penanganan Penyakit Demam Berdarah Dengue