Mikrob Penghasil Nukleotida

Digunakan luas sbg Penyedap rasa

-purin ribonukleosida-5’-monofosfat:5’-GMP (as. Guanilat)5’-IMP (as. Inosinat)5’- XMP (as. Xanthilat)

-5’-AMP & isomer 2’ , 3’-5’-deaoksiribonukleitida-Nukleotida pirimidin

Tidak ada efek

Produksi 5’-IMP & 5’-GMP

-Enzimatik : hidrolisis RNA khamir

-dikembangkan di jepang th 1959- dikemersialisasi th 1961

Na2-IMPNa2-GMP

Digunakan sbg food additives

Kombinasi dg Na-glutamat

-Sup-Sauces Cukup 0.005- 0.01 %

-jumlah zat penyedap rasa yg dikonsumsi setiap makan;0.1 – 0.2 g terdiri dari:

- 5’- IMP = 8 – 12 %- 5’ – GMP = 1.5 – 2.0 %

Kombinasi dg glutamat

Produksi : - enzimatik hdrolisis- Fermentasi

Di Jepang : 3000 ton/tahun

Dipelajari untuk tujuan kemoterapi : antibiotik & sitostatikanalog purin : - 8-Azaguanin

- 6-Merkaptopurinβ-D-arabifuranosiladenin efektif utk Herpes

Terapi kanker

Struktur:

Biosintesis:-dimulai dr PRPP (dibentuk drribosa 5-fosfat & ATP)

-turunan purin komplit I:as. Inosinat (5’-IMP)

Prekusor5’-AMP, 5’-XMP, 5’-GMP

Regulasi:-overproduksi nukleotida purin dicegaholeh regulasi feedback.

produksi komersial, dieliminasi scr parsial

mutan auxotrofik or mutan resisten thd nalog purin

Metode Produksi:

1. Enzimatik or pemecahan scr Kimiawia. hidrolisis enzimatik dr RNA khamirb. pemecahan RNA dg enzim endogenous ekskresi c. hidrolisis kimiawi dr RNA khamir dg fosforilasi

2. Fermentasi: pakai mutan block biosintesis nukleotidatidak ada regulasi endproduct

a. Fermentasi & fosforilasi kimiawib. Konversi nukleosida jadi 5’-nukleotida

1a, 1c, 2a, 2b digunakan utk produksi 5’- IMP & 5’- GMP

*Produksi 5’-IMP & 5’-GMP dg Hidrolisis RNA scr Enzimatik

-metode I produksi nukleaotida scr komersial-50 % produk 5’-nukleotida di Jepang

Tahapan proses:1. Kultur sel khamir RNA tinggi2. Ekstraksi RNA3. Produksi enzim penghidrolisis4. Hidrolisis RNA5. Isolasi dan purifikasi 5’-IMP & 5’-GMP

RNA sel :- 5 % mRNA- 10 – 15 % tRNA- 75 – 80 % rRNA

- Khamir kandungan DNA rendah

Sumber RNA terbaik

Candida utilisSaccharomyces cerevisiae

-kandungan RNA tgt kondisi kultur:awal fase Log : RNA tinggiC/N ratio rendah : RNA tinggi+ ion Zn 0.25 ppm & 0.15 % fosfat (molase or glukosa)

Sel khamir dipisahkan & dikeringkanRNA diekstrasi dg larutan garam alkalin panas(8-20 % NaCl; 8 jam; 100oC)RNA diendapkan dg HCl or etanolDikeringkan ( kandungan RNA 70 – 90 %; BM:10000-150000)

Hidrolisis enzimatik

Sumber enzim : - Penicillium citrinum- Streptomyces aureus

*Produksi 5’-IMP & 5’-GMP dg Hidrolisis RNA scr kimiawi

-hidrolisis pd kondisi alkalin-Campuran 2’- & 3’- nukleotida bukan 5’-nukleotida-Pemanasan 130oC selama 3-4 jam dalam Ca(OH)2 prod nukleoside-Fosforilasi produksi 5’-IMP dan 5’- GMP

*Produksi 5’-IMP dg Fermentasi

Metode:1. Produksi inosin fosforilasi kimia 5’-IMP2. Fermentasi langsung jadi 5’-IMP3. Produksi adenosin or 5’-AMP konversi enzimatik 5’-IMP4. Konversi hipoxanthin (prod. Kimiawi) 5’-IMP

*Alasan ekonomis: no 1 & 2 digunakan scr komersil

Fermentasi produksi inosin:-sel tidak permeabel thd nukleotida-Permeabel thd nukleosida

5’-IMP (tidak dikeluarkan dr dalam sel)

Inosin (dikelurkan dr dalam sel)defosforilasi

-pertama ditemukan pd mutan auxotrof adenin (ade-)- Bacillus- Brevibacterium- Corinebacterium- Streptomyces- Saccharomyces

*fosforilasi scr kimia dg triakilfosfat dg PCl3

Fermentasi inosin Brevibacterium ammoniagenes KY 13761

Fermentasi langsung 5’-IMP:

Mutan harus:- tidak punya SAMP sintetase hilangkan regulasi AMP

pd level PRPP amidotransferase- aktivitas enzim pendegradasi 5’-IMP rendah- membran permeabel untuk ekskresi 5’-IMP

*Produksi 5’-GMP dg Fermentasi

Ekskresi 5’-GMP pada galur liar sangat jarangefek regulasi pd PRPP amidotransferase, IMP dehidrogenase,dan GMP sintetase

Metode:1. Fermentasi dr AICAR konversi kimiawi jadi 5’-GMP2. Produksi guanosin fosforilasi kimia 5’-GMP 3. Produksi xanthin or 5’-XMP konversi enzimatik 5’-GMP4. Fermentasi langsung jadi 5’-GMP

*no 1 & 2 digunakan scr komersil

Fermentasi dr AICAR:

Mikrob produksi AICAR (5-amino-4-imidazole karboksamida ribosida)

E. coliB. subtilisB. megateriumBrevibacterium flavum

Karakter:

-galur auxotrof purin block reaksi AICARPformiltransferase (AICARP FAICARP)

-tidak ada aktivitas enzim yg menghidrolisisAICA-ribosida

-enzim yg menkatalisis biosintesis AICARtidak sensitif thd regulasi nukleotida purin intraselular

-Produksi dipengaruhi sporulasi- sporulasi kurangi produksi AICAR

Ditekan : - inhibitor (as. Butirat)- kurangi supply O2

-AICARP yang terbentuk diekskresikan dalam bentuk terdefosforilasi (AICAR)

- AICAR konversi ke guanosin fosforilasi jadi 5’-GMP

Fermentasi Guanosin:-Galur yg ekskresi guanosin harus:

tidak ada SAMP sintetasetidak ada GMP reduktaseaktivitas nukleosidase tereduksienzim biosintesis GMP tidak teregulasi

-Bacillus subtilis-Bacillus pumilus-Bacillus licheniformis-Corynebacterium petrophilum-Corinebacterium guanofaciens-Streptomyces griseus