Metodos de Siembra Para Transporte y to De

8/8/2019 Metodos de Siembra Para Transporte y to De

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TCNICA DE AISLAMIENTO

Las tcnicas de aislamiento, permiten la

obtencin de microorganismos a partir de

muestras complejas (suelo, agua, humanas,etc.) en las que hay una gran diversidad de

microbiana, as como para comprobar la

pureza de los cultivos obtenidos, los cuales

son indispensables para conocer bioqumica,patogenicidad, sensibilidad a antibiticos e

identificacin de especie microbianas


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MEDIOS DE CULTIVO

Las bacterias deben ser cultivadas en mediosde cultivo de laboratorio para caracterizar sucrecimiento, hacer su identificacin ydeterminar sus actividades metablicas.

Entonces, podemos decir que un medio decultivo es una solucin acuosa de diferentes

compuestos y en diferentes estados quecontiene todos los elementos indispensablesque requieren los microorganismos paracrecer.


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MEDIDAS DE BIOSEGURIDAD En Microbiologa, todas las manipulaciones deben ser llevadas

a cabo de modo que se impida cualquier tipo decontaminacin en el rea de trabajo.

Se aconseja que la siembra de todas las muestras a los medios

de cultivos se realice bajo la luz de un mechero, una cabina deflujo de aire laminar , en un gabinete de seguridad.

Las muestras procesadas se las debe considerar comopotencialmente infecciosas y manipularlos adecuadamente.

Tambin se deben utilizar guantes de goma o latex biolgicos La mesa de trabajo debe estar equipada con todos los

materiales necesarios para efectuar las siembras, tambin sedebe contar con todos los medios de cultivos necesarios pararealizar las siembras.


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Personal de Laboratorio de Microbiologa

Cabina de Flujo laminar


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MEDIDAS DE BIOSEGURIDAD

Las asas deben esterilizarse antes y despus de utilizarlas,deben enfriarse sobre el agar o el material de vidrio (enzonas estriles) antes de tomar la muestra de

microorganismos, con objeto de no destruirlos por calor.

Las bocas de los tubos y matraces de vidrio se flameanligeramente una vez destapadas, antes y despus de la

inoculacin.

Durante la inoculacin, los tapones se mantienen en la mano

sujetndolos por la parte que no entra en contacto con tubosy matraces.

Los tubos abiertos deben mantenerse en posicin inclinadahacia el frente para que el riesgo de contaminacin sea

mnimo.


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Siembra de microorganismos


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DIRECTIVAS PARA TRANSPORTE YALMACENAMIENTO DE CULTIVOS1. Para que las bacterias crezcan adecuadamente en un medio

de cultivo artificial debe reunir una serie de condicionescomo son: temperatura, grado de humedad y presin de

oxgeno adecuado, as como un grado correcto de acidez o

alcalinidad entre otras medidas.


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3. Seleccione el tipo anatmico correcto donde se obtendr elespcimen, y utilice la tcnica apropiada y los instrumentoso elementos adecuados para su obtencin.

Toma de muestra, adecuada


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4. Adjunte en el formulario cualquiera informacin de inters,tales como si el paciente es inmunosuprimido o si

recibe drogas inmunosupresoras, si recibe antibiticos,diagnstico presuntivo, inters en algn germen, etc.

Ejemplo de formulario


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5. Cuando se va a proceder a tomar un espcimen clnico, esimportante evitar la contaminacin con microorganismos

saprfitos del rea. Esta flora normal puede interferir conla interpretacin del cultivo y enmascarar la presencia delverdadero agente etiolgico de la enfermedad.

Transporte de Helicobacter Pylori


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6. En el transporte y almacenamiento de bacterias que ejerzan

una fuerte descomposicin de la materia orgnica, la fase decrecimiento exponencial ser la de inters, ya que en estafase es en la que se produce la mayor tasa dedescomposicin y por tanto un aumento en el ndice dedisminucin de nutrientes. Para mantener el cultivo en esta

fase se tendr que vigilar los parmetros ms importantes

que influyen a las bacterias: pH, temperatura, disponibilidadde nutrientes, presencia o ausencia de oxgeno

El grfico siguiente representa la variacin de labiomasa (o nmero de clulas, etc.) de un cultivoa lo largo del tiempo. En este cultivo, se vaconsumiendo un substrato cuya concentracindecrece de forma proporcional al crecimiento de

la biomasa.


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7. El desarrollo de la biomasa est estrechamente ligado alintervalo de temperaturas para el que un organismo

desarrolle sus funciones metablicas. Dentro de esteintervalo existe una temperatura ptima a la que la actividadmetablica, y por tanto, el consumo de sustrato y el

desarrollo de biomasa ser mximo. Si se considera queestamos por debajo de la temperatura ptima (a la

temperatura de referencia u operacin), el aumento detemperatura provocar un aumento en la velocidad decrecimiento bacteriano definido por la ecuacin


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Bacterias mnima ptima mxima

Listeria monocytogenes 1 30-37 45

Pseudomonas maltophila 4 35 41

Escherichia coli 10 37 45

Clostridium kluyveri 19 35 37

Bacillus flavothermus 30 60 72

Thermus a uaticus 40 70-72 79

Sulfolobus acidocaldarius 70 75-85 90

Pyrobacterium brockii 80 102-105 115

Temperaturas optimas para el desarrollo de determinadas bacterias


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8. La presencia de oxigeno ser determinante para

lograr un crecimiento de una colonia bacteriana,la cual esta en funcin al tipo de metabolismoque realice dicha bacteria y podemos distinguir 3

tipos: anaerobia, aerobia, microaerfilas.

Micobacterium tuberculosis Clostridium perfringens


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MTODOS DE SIEMBRA

Son una forma de aislar poblaciones

microbianas, pueden realizarse por mtodos dedilucin, en medios slidos por estra y

dispersin (cesped) en placa o en medios

lquidos.


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Recordar:

Antes de sembrar en un medio, debemos

asegurarnos que la superficie permanezca seca,lo cual se logra con un reposo de por lo menos 2

horas o colocndolo con la tapa entre abierta enla estufa por 15 min a 35C.


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METODO DE PLACA INVERTIDA

(DILUSIN)

Objetivo: Este mtodo se emplea para aislar

poblaciones bacterianas lo cual dar origen auna colonia caracterstica visible a simple vista,

se realiza a partir muestras puras y permiten

obtener datos cualitativos y cuantitativos.


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Procedimiento:

Se siembran 1ml de dilucin en placas petri conunos 20ml de agar nutritivo como medio de

cultivo, como a continuacin se indica:

1- Aadir a cada placa petri 1ml de la dilucincorrespondiente.

2- Aadir despus unos 20ml de agar nutritivo.

3- Agitar suavemente la placa para repartir ladilucin y dejar reposar para que el agar

nutritivo solidifique.

4- Invertir la placa y llevar a incubacin.


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MTODO DE ESTRIADO

Objetivo: El objetivo de este tipo de siembra

es aislar colonias de bacterias y observar

caracteristicas externas (color, forma,apariencia, etc) de las colonias bacterianas.

Consiste en diseminar la muestra en forma de

zig-zag sobre la superficie del agar, es un

mtodo comn y se puede realizar endistintas formas.


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Procedimiento:

1. Preparar los medios de cultivos solidos en placaso tubos y dejarlos enfriar.

2. Esterilizar el asa de siembra y tomar una

pequea muestra e inocularla en la superficie

del medio de cultivo

3. Realizar un movimiento horizontal de un lado a

otro en zig-zag cuidando de no tocar las orillas.

4. Se puede realizar de distintas formas y en lasproporciones deseadas.


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MTODO TIPO CESPED

Objetivos:

Determinar la sensibilidad a diversos antibiticos

de un determinado microorganismo Comprender el concepto de antibitico y su

especificidad de accin sobre determinadasbacterias.

Conocer el concepto de cepa sensible yresistente.

Entender el concepto de halo de inhibicin


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Procedimiento:1. Tomamos con una jeringa una pequea cantidad de suero fisiolgico

estril (2-5 ml) y lo vertemos en un tubo de ensayo.

2. A partir de la placa problema, que contiene colonias delmicroorganismo cuya sensibilidad a los antibiticos queremosdeterminar, tomamos una muestra SUPERFICIAL de UNA SOLACOLONIA con un asa de siembra.

3. Introducimos el asa de siembra con la muestra en el tubo y agitamosel asa para realizar una suspensin de las bacterias en el suerofisiolgico. Al acabar echamos al contenedor de residuos el asa desiembra.

4. Introducimos una torunda estril en el tubo y se pasa muy

suavemente por la superficie de una placa agar-sangre nueva. Enesta ocasin realizaremos una siembra en csped, es decir, por toda lasuperficie de la placa, para conseguir que crezca bacterias de modomasivo (no interesa aislar bacterias). Es importante que la siembra seaSUPERFICIAL, sin profundizar en el medio de cultivo.

5. Se tapa la placa y se rotula indicando en el nombre, grupo y fecha ymarcando con una A la ta a (antibio rama)


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Colocacin de los discos de antibitico

1. Tomamos ahora con las pinzas NUNCA CON LAS MANOS-

un disco de cada uno de los antibiticos que se facilitan (cadadisco es un papel de filtro que contiene una suspensin de unoo varios antibiticos a la concentracin teraputica).

2. Se deposita el disco suavemente sobre la placa, sin tocar conla superficie con las pinzas. Es muy importante que el discocontacte con el medio de cultivo en un nico sitio.

3. Realizamos la misma operacin con los otros cincoantibiticos, colocando los nuevos discos separados de losanteriores, formando un hexgono.


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Incubacin y observacinSe llevan las placas a incubar a 37C (temperaturacorporal), durante 24 horas. Tras este perodo serecogen las placas y SIN ABRIR se observa el

crecimiento bacteriano. Medicin del halo de inhibicin

Por la parte trasera de la placa incubada mediremosel dimetro de los halos de inhibicin que se han

formado alrededor de los discos de antibitico a losque la bacteria problema es sensible.


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Qu son los halos de inhibicin?

Alrededor de cada disco de antibitico, las bacterias sensibles aese antibitico no habrn podido reproducirse y, por lo tanto,no forman colonias, dejando un hueco alrededor del disco.

Por qu se miden los halos?

No basta con ver si las bacterias han crecido o no alrededor delantibitico para saber si son o no sensibles. Hay que sabercunto no han crecido. Solo si el halo de inhibicin essuficientemente grande, usando el antibitico a laconcentracin teraputica la que el antibitico puede alcanzaren el lugar de la infeccin sin que se produzcan efectos txicoso secundarios- se dice que la bacteria es sensible al antibitico.Por eso se mide el efecto y se consultan las tablas.


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Patrones estndar del halo de inhibicin para Pseudomonas aeruginosa y Acinetobacter spp.a ,puntos de corte equivalentes a la CMI y dimetro del halo de inhibicin para la cepa Pseudomonas

aeruginosa ATCC 27853 empleada como control de calidad

GRUPO AntimicrobianoCarga

deldisco(g)

Dimetro del halo deinhibicin (mm)

Punto de corte

Equivalente a laCMI(g/ml)

Resistente

Intermedia

Sensible Resistente Sensible

A Mezlocilina b Pseusomonasspp

75 21 >128 128 128 128 128 8 32/16 128/2


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BACTERIAS AEROBIASSe denominan bacterias aerobios o aerbicos a los organismos quenecesitan del oxgeno diatmico para vivir o poder desarrollarse. El adjetivo"aerobio" se aplica no slo a organismos sino tambin a los procesosimplicados ("metabolismo aerobio") y a los ambientes donde se realizan. Un"ambiente aerobio" es aquel rico en oxgeno, a diferencia de uno anaerobio,donde el oxgeno est ausente, o uno microaeroflico, donde el oxgeno seencuentra a muy baja concentracin.

El metabolismo aerobio (respiracin) surgi en la evolucin despus de quela fotosntesis oxignica, la forma ms comn de fotosntesis, liber ala atmsfera oxgeno, el cual haba sido muy escaso hasta entonces.Inicialmente represent una forma de contrarrestar la toxicidad del oxgeno,ms que una manera de aprovecharlo. Como la oxidacin de la glucosa yotras sustancias libera mucha ms energa que su utilizacin anaerobia porejemplo, la fermentacin, los seres aerobios pronto se convirtieron en losorganismos dominantes en laTierra.

Un buen ejemplo podra ser la oxidacin de la glucosa (un monosacridos) enla respiracin aerbica

C6H12O6 + 6 O2 -> 6 CO2 + 6 H2O + 38 ATP


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Bacterias

GENEROS GRUPOSMEDIOS DE

CULTIVODESCRIPCION ENFERMEDAD

A

NAE

R

O

B

IA

CLOSTRIDIUM C. BOTULINUM

caldo peptona-

levaduraagar yema de

huev35oCdurante 48

horas

G (+), familia Bacillaceae,

esporulados, anaerobiosbotulismo

Calymmatobacte

riumC. granulomatis Bacilos cortos, pleomrficos

produce

donovanosis ogranuloma

inguinal venreo.

Salmonella S. typhyAgarDesoxicolato

yCitrato

Patgenos del hombre y

animalesfiebre tifoidea

AE

R

O

B

I

A

Brucella B. abortus

Agar sangre

Agar triptosa

suero

cocobacilos, Gram negativos,

aerobios

Brucelosis

infeccin

placentaria y

abortos

Neisseriaceae N. meningitidis Agar sangreCocos individuales o en

pares, aerobiosmeningitis

PSEUDOMONA Ps. aeruginosaagar eosina-azul

de metileno (EMB)

Mviles por uno o varios

flagelos polares, aerobios

puede ocasionar

infecciones

urinarias, otitis,

septicemia.


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