MAKALAH PRAKTIKUM KIMIA DAN BIOKIMIA

HASIL PERIKANAN

ACARA HISTAMIN

METODE PENGUJIAN HISTAMIN

OLEH

KHUSNUL ALFIONITA 12/331541/PN/12679

PINGKAN MAYESTIKA A 12/331550/PN/12684

RR. FIDYAH OKTA 12/331553/PN/12685

LUKMAN MUSTHAFA 12/335120/PN/13024

ASTERINA WULAN S. 12/335195/PN/13030

AHMAD NAWWAR S. 12/335241/PN/13032

LABORATORIUM TEKNOLOGI IKAN

JURUSAN PERIKANAN

UNIVERSITAS GADJAH MADA

YOGYAKARTA

2014

METODE PEGUJIAN HISTAMIN

A. TUJUAN

1. Mengetahui metode pengujian histamin

2. Mengetahui hal-hal penting yang berkaitan dengan pengujian histamine

B. ISI

Histamin merupakan senyawa amin yang dihasilkan dari proses dekarboksilasi

histidain bebas (-amina--inidosal propionate) (Lehane and Olley, 1999). Proses

pembentukan histamin pada ikan sangat dipengaruhi oleh aktivitas enzim L-Histidine

Decarboxylase (HDC) (Mangunwardoyo, dkk, 2007). Histamin adalah salah satu

komponen dari amina biogenic. Putresin, kadaverin, dan triptamin juga dikenal sebgai

amina biogenic. Amina biogenic adalah komponen biologis aktif yang dihasilkan oleh

proses dekarboksilasi asam amino bebas yang terdapat pada beberapa

Evaluasi sensorik umumnya digunakan untuk melihat indikator pembusukan

ikan yang berkembang saat ikan dibiarkan dalam beberapa waktu dan suhu tertentu.

Bau khususnya adalah cara yang efektif untuk mendeteksi ikan yang telah mengalami

berbagai kondisi secara kasar . Namun, dekomposisi tidak akan terjadi jika ikan

disimpan dalam suhu rendah, kecuali apabila ikan disimpan dalam suhu tinggi.

Kondisi ini membuat pemeriksaan sensorik saja tidak efektif untuk mencegah

terbentuknya scombrotoxin ( histamin ).

Pengujian kimia adalah cara yang efektif untuk mendeteksi adanya histamin

dalam daging ikan . Namun, variabilitas kadar histamin antara ikan dan dalam satu

individu ikan bisa besar , bahkan dalam ikan dari kapal yang dipanen bersamaan.

Untuk alasan ini , tingkat standar histamin telah ditetapkan sebesar 50 ppm pada

bagian ikan yang dapat dimakan . Jika 50 ppm ditemukan di salah satu bagian dari

ikan atau banyak , ada kemungkinan bahwa bagian lain mungkin melebihi 50 ppm .

Histamin diukur dengan metode fluorometri yang didasarkan kepada

pengukuran fluorosensi. Histamin diekstrak dari jaringan daging sampel dengan

menggunakan methanol dan sekaligus mengkonversi histamin ke dalam bentuk OH.

Zat-zat histamin selanjutnya dimurnikan melalui resin penukar ion dan diubah ke

bentuk derivatnya dengan senyawa OPA. Besarnya fluorosensi histamin diukur secara

fluorometri pada panjang gelombang Eksitasi 350 nm dan Emisi 444 nm (AOAC,

1995).

Prosedur analisis meliputi persiapan sampel dan standar, persiapan resin dan

kolom resin, pemuaian contoh, derivatisasi, pengukuran fluorosensi dengan

menggunakan spektrofluorometer dan perhitungan. Persiapan sampel dilakukan

dengan menghaluskan 10 gram sampel kemudian menambahkan 50 mL methanol,

dan dihomogenkan. Panaskan diatas waterbath selama 15 menit pada suhu 60OC

dalam kondisi tertutup. Dinginkan di suhu ruang. Tuang contih kedalam labu ukur

100 mL dan tambahkan methanol. Saring sampel dengan kertas saring. Larutan

standar histamin dibuat dengan konsentrasi 0.01 ppm, 0.02 ppm, 0.03 ppm, dan 0.1

ppm (AOAC, 1995).

Persiapan resin dilakukan dengan menimbang 3 gram resin Dowex 1 X8 50-

100 mesh tambahkan 15 mL NaOH 2N/gram resin, aduk dengan stirrer plate selama

30 mint. Tuang cairan bagian atas dan tambahkan kembali NaOH 2N dengan jumlah

yang sama. Kemudian bilas resin dengan aquades 3 kali, saring dengan kertas saring

dan simpan dalam aquades. Persiapan kolom resin dengan memasukkan gelaswool

kedalam kolom resin setinggi 1.5 cm, kemudian rensin dalam medium air

dimasukkan ke dalam kolom hingga setinggi 0.8 cm (AOAC, 1995).

Pemurnian contoh dilakukan dengan memipet filtrate contoh 1 mL

memasukkan ke dalam kolom resin yang telah disiapkan, menambahkan aquades

hingga diperoleh hasil elusi sebanyak 50 mL. derivatisasi dilakukan pada contoh

standar dan blanko. 5 mL contoh, standar, dan blanko ditambahkan 10 mL HCl 0.1 N,

kocok, tambahkan 3 mL NaOH 1N, kocok, dalam 5 menit ditambahkan 1 mL OPT

0,1% kocok, dalam 4 menit ditambahkan 3 mL H3PO4 3,57N, kocok. Larutan yang

dihasilkan diukur fluorosensinya sesegera mungkin dengan spektrofluorometer pada

panjang gelombang exitasi 350 nm dan emisi 444 nm (AOAC,1995).

Analisis kadar histamin sesuai dengan SNI 2354.10: 2009. Prosedur analisis

kadar histamin pada sampel ikan tongkol (Auxis thazard) asap dilakukan dengan

metode:

1. Ekstraksi sampel, pentolan pada plat silica gel, pencelupan pada bejana

kromatografi, pendeteksian dengan TLC scanner.

2. Perhitungan kadar histamin menggunakan metode standar internal

Histamin (ppm)=

Keterangan:

IU = Absorban sampel

A = Intersep

B = Slope

Fp = Faktor pengencer

Niven (1981) telah mengembangkan medium untuk pertumbuhan bakteri

penghasil histamine dalam bentuk agar cawan, yang disebut agar diferensial Niven.

Komposisi medium: 0.5% trypton, 0.5% yeast extract, 2.7% L-Histidin 2HCl, 0.5%

NaCl, 0.1% CaCO3, 0.2% agar, dan 0.006% bromoressol purple, dengan pH akhir 5.3

(Niven dkk, 1981). Bakteri pembentuk histamine akan membentuk koloni berwarna

ungu dengan latar belakang medium berwarna kuning. Histamin yang terbentuk

akan meningkatkan pH medium, sehingga terjadi perubahan warna kuning menjadi

ungu

Prinsip metode niven yaitu Enterobacteriaceae akan merubah histidin menjadi

histamine (melalui proses dekarboksilase), yang akan menyebabkan pH dan

perubahan warna pada medium.

Setelah pembuatan medium selesai, sampel sebanyak 25 gram dimasukkan

kedalam botol yang berisi 225 ml larutan Butterfields Phospate Buffered, kemudian

dilumatkan dengan blender hingga larutan homogen. Homogenat ini merupakan

larutan pengenceran 0,1. Dari campuran tersebut diambil 1 ml dan dimasukkan ke

dalam botol berisi 9 ml larutan Butterfields Phospate Buffered sehingga diperoleh

contoh dengan pengenceran 0,01 , kemudiandikocok sampai homogen. Pengenceran

dilakukan hingga 0,0001. Satu ml larutan sampel hasil setiap pengenceran

dimasukkan ke dalam cawan petri, lalu 12-15 ml media niven agar cair yang sudah

didinginkan hingga mencapai suhu 45 C dituangkan kedalam masing-masing cawan

yang sudah berisi sampel.

Setelah agar menjadi padat, cawan petri yang telah berisi agar dan larutan

sampel tersebut dimasukkan kedalam incubator dengan posisi terbalik selama 48 jam

pada suhu 35 C. Selanjutnya dilakukan penghitungan jumlah koloni berwarna ungu

pada latar belakang berwarna kuning atau orange. Koloni tersebut merupakan koloni

bakteri pembentuk histamin.Hasil penghitungan jumlah koloni bakteri pembentuk

histamine tersebutkemudian dibandingkan dengan nilai TPC sehingga diperoleh

persentase jumlah bakteri pembentuk histamine terhadap nilai TPC.

Kadar histamin dianalisis menggunakan modifikasi metode spektrofotometri

menurut Hardy & Smith, 1976. Pengukuran kadar histamin dilakukan dalam 2 tahap:

1. Tahap 1 (persiapan): sebanyak 5 ml hasil fermentasi ditambahkan 70 ml asam

trikloroasetat (TCA) 2,5 % lalu dinetralkan dengan larutan KOH 1 N.

2. Tahap ke-2: sebanyak 1 g amberlite resin di masukkan ke dalam kolom sepanjang

30 cm, kemudian dicuci dengan 150 ml larutan bufer asetat 0,2 N pH 4,6 dijaga

agar tidak kering. Setelah itu dimasukkan TCA yang sudah ditambah hasil

fermentasi seperti diuraikan pada tahap 1 (diatur jumlah tetesan 9 -10 tetes/menit).

Kemudian kolom dielusi dengan 25 ml HCl 0,2 N. Setelah itu 1 ml eluen

ditambah dengan 15 ml larutan Na2CO3 5% dan 2 ml larutan diazonium dan

didinginkan pada suhu 0oC selama 10 menit. Absorbansi diukur pada panjang

gelombang 495 nm dengan menggunakan spektrofotometri UV-VIS. Blanko

dibuat dengan prosedur yang sama menggunakan TCA 2,5% netral yang tidak

ditambah hasil fermentasi ( Hardy dkk, 1976)

Karena histamin umumnya tidak terdistribusi secara merata dalam tubuh ikan,

validitas pengujian histamin tergantung pada desain rencana sampling. Jumlah sampel

yang diperlukan untuk mengakomodasi variabilitas seperti distribusi tentu cukup

besar. Metode pengumpulan sampel ikan juga sangat penting. Dalam ikan besar

pembentukan scombrotoxin , semakin rendah , anterior ( depan ) bagian dari loin ikan

( bukan flap perut ) kemungkinan akan memberikan informasi terbaik tentang isi

histamin dari ikan. Dimana sampel yang gabungan untuk mengurangi jumlah analisis

diperlukan pada banyak, hal itu harus dilakukan dengan cara yang menjamin hasil

yang akurat . Tidak lebih dari tiga sampel harus digabung , untuk meminimalkan ikan

bermasalah. Selanjutnya, metode analisis dan instrumen yang digunakan harus

mampu andal mendeteksi histamin pada tingkat yang lebih rendah yang diperlukan

untuk sampel composited ( misalnya , 17 ppm histamin dalam tiga sampel komposit,

daripada 50 ppm dalam sampel tidak gabungan).

C. KESIMPULAN DAN SARAN

Kesimpulan

1. Metode pengujian histamin dapat dilakukan dengan metode fluorometri, Niven,

spektrofotometri dan mengikuti SNI 2354.10: 2009.

2. Histamin tidak terdistribusi merata dalam tubuh ikan sehingga dibutuhkan

pemilihan sampel yang baik. Tingkat standar histamin pada ikan adalah 50 ppm.

DAFTAR PUSTAKA

AOAC, 1995. Official Methods of Analysis of The Association of Analytical Chemists,

Washington D.C.

Bennour, A.E. Marrakchi, N. Bouchriti, A. Hamama, M.E. Ouadaa, 1991J. Food Prot. 54

789-792.

DotuLong, Verly. 2009. Studi kadar histamin ikan tongkol (Auxis thazard) asap yang diawet

dengan asam asetat. Warta WIPTEK. No 33 th 2009.

Hardy, R, J.G.M. Smith, J. 1976. Sci. Food. 27 .595 599.

Niven, C.F, Jeffery J.R, Corlett Jr DA. 1981. Differential planting medium for quantitive

detection of histamine-producing bacteria. App and environmental microbiology.

No 41. Hal 321-322.

L. Lehane, J. Olley. 1999. National Office of Animal and Plant Health, Canberra, 1999, p.80.

Mangunwardoyo, W, dkk. 2007. Seleksi dan Pengujian Aktivitas Enzim L-Histidine

Decarboxylase dari Bakteri Pembentuk Histamin.