Membuat cDNA

Dalam Central dogma dikatakan bahwa informasi biologi bermula dari DNA ke RNA kemudian ke protein (Gambar 1). Namun, ada juga informasi yang berasal dari RNA ke DNA seperti contohnya pada virus HIV yang hanya memiliki RNA genom yang harus dikonversi dulu menjadi DNA. Untuk mengkonversi RNA menjadi DNA, maka diperlukan enzim yang dikenal dengan reverse transkriptase yang diketahui juga di miliki oleh virus tersebut. Pakar biologi molekular juga berhasil memanfaatkan enzim tersebut, reverse transcriptase, untuk mengkonversi mRNA menjadicomplementary DNA (DNA komplementer) yang lebih dikenal dengancDNA.

Gambar 1.Central dogma: DNA menjadi RNA menjadi mRNA menjadi Protein.Menggunakan cDNA dalam beberapa kegiatan molekular cenderung lebih aman dibandingkan RNA (mRNA) secara langsung. Hal ini dikarena kestabilan dari RNA itu sendiri yang mudah sekali terdegradasi oleh RNase. Sehingga untuk berkerja dengan RNA secara langsung menjadi kurang efisien karena membutuhkan tingkat kehati-hatian yang cukup tinggi. Oleh karena itu, cara yang dianggap paling efektif dan efisien ketika ingin berkerja dengan RNA, yaitu dengan menggunakan sekuens komplemen dari mRNA tersebut yang selanjutnya dalam prosesnya menghasilkan cDNA. Begitupula, penyelidikan dengan DNA Microarray juga mengkonversi mRNA menjadi cDNA untuk memproduksi probesnya.Secara deskripsi, cDNA merupakan untai ganda DNA yang dibuat dari mRNA baik berasal dari prokariot maupun eukariot. Ketika mRNA berhasil diisolasi, maka diperlukan beberapa reagent yang sangat penting dalam proses konversi tersebut yaitu dNTPs (dGTP, dCTP, dATP and dTTP), primer, dan enzim reverse transcriptase. Selanjutnya yang harus dilakukan adalah mencampurkan mRNA dengan campuran reagen tersebut untuk membuat untai komplemen dari DNA (sintesis untai pertama). Proses ini memakan waktu 10-60 menit tergantung enzim reverse transkriptase yang digunakan. Kemudian mRNA harus dihilangkan dan untai kedua DNA dapat disentesis. Secara umum proses tersebut digambarkan sebagai berikut.

Figure 2.Empat jenis reagen Dasar yang diperlukan untu menghasilkan cDNA: mRNA sebagai cetakan, dNTP, enzim reverse transcriptase dan primer1. mRNAmRNA atau yang dikenal dengan messenger RNA merupakan untai tunggal yang membawa kode genetik yang siap untuk ditranslasikan di ribosom menjadi sebuah atau beberapa protein tertentu. Perlu diketahui bahwa tidak semua RNA bisa langsung digunakan sebagai template untuk dibuat sebagai cDNA kaitannya untuk mempelajari ekspresi suatu gen. Sebut saja RNA yang disandikan oleh kelompok eukariot dimana RNA tersebut masih mengandung sekuens asam nukleat yang tidak menyandikan protein tertentu atau yang dikenal dengan intron. Oleh sebab itu intron tersebut perlu dihilangkan sebelum digunakan sebagai templet untuk membuat cDNA. Sebaliknya sebagian besar RNA dari prokariot bisa langsung digunakan sebagai templet untuk membuat cDNA karena tidak memiliki intron.2. dNTPsdNTPs atau kependekan dari deoksi nucleotida triphosphate merupakan larutan yang mengandung monomer penyusun DNA (Guanin, Adenin, Sitosin dan Timin). Bahan ini sangat penting untuk kelanjutan sintesis cDNA dari mRNA. Tanpa adanya dNTPs maka proses penyusunan komplemen dari mRNA yang akan ditranskri balik dengan bantuan enzim reverse transkriptase tidak akan berjalan karena tidak ada monomer yang bisa dipolimerisasi menjadi untai cDNA.3. Enzim Reverse TranscriptaseEnzim reverse transkriptase merupakan enzim yang digunakan untuk mensintesis mRNA menjadi untai DNA. Di alam, banyak sekali jenis enzim ini yang secara umum dimiliki oleh virus-virus yang memiliki asam nukleat berupa RNA seperti HIV. Adapun enzim reverse transkriptase yang banyak digunakan untuk membuat cDNA di antaranya adalah M-MLV reverse transkriptase dari Moloney murine leukemia virus dan AMV reverse transkriptase dari avian myeloblastosis virus. Enzim ini akan bekerja dari ujung 3 ke ujung 5 dari mRNA.4. Primer.Terdapat tiga jenis primer yang dapat digunakan untuk mensintesis cDNA.a. Jika mRNA memiliki poly-A pada ujung 3, maka primer oligo-dT dapat digunakan sebagai primer untuk semua mRNA secara simultan. Umumnya primer jenis ini digunakan apabila mRNA yang digunakan berasal dari sel eukariot, sebab pada sel eukariot sel akan menambahkan poly-A (melakukan adenilasi) pada ujung 3 setelah proses splicing untuk menghilangkan intron.b. Jika cDNA yang akan dibuat berasal dari mRNA tertentu (mRNA target) maka penggunaan primer spesifik dapat dilakukan. Primer jenis umumnya digunakan pada mRNA dari sel prokariot karena mRNA dari sel prokariot tidak mengandung poly-A (sel tidak melakukan poly adenilasi.c. Jika cDNA yang akan dibuat berasal dari seluruh mRNA secara acak, maka random primer dapat digunakan. Namun, pemilihan primer secara umum adalah tergantung pada jenis kebutuhan dan target mRNA yang digunakan.

Dalam membuat cDNA (DNA komplemen) ada 2 step yang penting, yaitu membuat 1st strand cDNA dan 2nd strand cDNA.Pada waktu pembuatan 1st cDNA, RNA harus dalam keadaan lurus. Maka dari itu biasanya sebelum dibuat proses pembuatan cDNA sintesis, RNA terlebih dahulu dipanaskan pada suhu 65 derajat, 5 menit, kemudian masukkan dalam es. cDNA disintesis dari mRNA dengan reverse transcriptase dan menggunakan oligo dT sebagai primer (2 komponen ini sangat penting dalam pembuatan 1st strand cDNA). Yang lainnya adalah buffer-buffer, seperti 1st strand synthesis buffer Dalam hal ini konsep yang dipakai adalah proses transkripsi pada DNA. Biasanya kita juga menyebutnya proses ini adalah RT-PCR (Reverse Transcriptase-PCR). Di sini juga kita inkubasi pada suhu yang berbeda. Pada kit yang saya pakai, (1) suhu ruang pada 10 menit (preinkubasi) ; (2) 42 derajat pada 1 jam (proses pembuatan cDNA) ; (3) 80 derajat pada 5 menit (mematikan reverse transkriptase).Kemudian, proses selanjutnya adalah sintesis 2nd strand cDNA dari 1st cDNA yang telah terbentuk. Tapi sebelumnya ada proses penghancuran RNA (tapi RNA tidak hancur semua) dan meninggalkan potongan RNA kecil-kecil, oleh RNAse H. Potongan RNA kecil-kecil ini nantinya bisa dijadikan primer. Pada proses ini solution yang dibutuhkan adalah DNA polimerase untuk sintesis 2nd strand cDNA, RNA-se H (untuk memotong RNA), T4 DNA polimerase (untuk bluting / meratakan ujung DNA yang tidak rata. karena setelah dibentuk double-stranded DNA, kedua ujung cDNA tidak rata).Setelahnya, dilakukan purifikasi cDNA dan ligation of cassette adaptor (jadi cDNA-nya dipasang adaptor).

Perbedaan vektor kloning dan vektor ekspresi1. Vektor kloning adalah agen pembawa fragmen DNA masuk ke dalam sel makhluk hidup yang berfungsi untuk memperbanyak fragmen DNA. Beberapa vektor kloning yang umum digunakan adalah plasmid, vektor lamda, virus, kromosom bakteri buatan, kromosom khamir buatan, dan cosmid. Suatu vektor kloning harus dapat disambungkan atau menyatu dengan fragmen DNA yang ingin ditransfer kemudian dapat dimasukkan ke dalam sel. Di dalam sel tersebut, fragmen DNA akan diperbanyak jumlahnya. Untuk memilih vektor cloning yang cocok dalam penelitian,beberapa hal yangharus dipertimbangkan adalah ukuran fragmen DNA yang akan ditransfer, jumlah salinan, inkompatibilitas (ketidaksesuaian), marka pemilihan (selectable marker) untuk seleksi, situs kloning, dan fungsi khusus dari suatu vektor.2. Vektor ekspresi, adalah salah satu teknik yang digunakan untuk mempelajari fungsi protein. Pada teknik ini, potongan DNA penyandi protein yang diinginkan ditransplantasikan ke suatu plasmid (DNA sirkular yang biasanya ditemukan pada bakteri; dalam teknik ini, plasmid disebut sebagai vektor ekspresi). Plasmid yang telah mengandung potongan DNA yang diinginkan tersebut kemudian dapat disisipkan ke dalam sel bakteri atau sel hewan. Penyisipan DNA ke dalam sel bakteri disebut transformasi, dan dapat dilakukan dengan berbagai metode, termasuk elektroporasi, mikroinjeksi dan secara kimia. Penyisipan DNA ke dalam sel eukaryota, misalnya sel hewan, disebut sebagai transfeksi, dan teknik transfeksi yang dapat dilakukan termasuk transfeksi kalsium fosfat, transfeksi liposom, dan dengan reagen komersial. DNA dapat pula dimasukkan ke dalam sel dengan menggunakan virus (disebut transduksi viral). Setelah penyisipan ke dalam sel, protein yang disandi oleh potongan DNA tadi dapat diekspresikan oleh sel bersangkutan

Enzim retriksi sticky end dan blunt enda. Enzim retriksi sticky end adalah Enzim yang memotong pada kedua utas DNA tidak berhadapan langsung, tetapi selisih 2-4 basa menghasilkan potongan dengan ujung lengket (lancip.) Pemotongan DNA dengan tempat pemotongan semacam ini akan menghasilkan fragmen-fragmen dengan ujung 5 yang runcing karena masing-masing untai tunggalnya menjadi tidak sama panjang. Dua fragmen DNA dengan ujung yang runcing akan mudah disambungkan satu sama lain. Sedangkan enzim retriksi blunt end adalah enzim yang memotong DNA pada tempat yang berhadapan sehingga menghasilkan ujung, karena masing-masing untai tunggalnya sama panjangnya. Fragmen-fragmen DNA dengan ujung tumpul (blunt end) akan sulit untuk disambungkan. Biasanya diperlukan perlakuan tambahan untuk menyatukan dua fragmen DNA dengan ujung tumpul, misalnya pemberian molekul linker, molekul adaptor, atau penambahan enzim deoksinukleotidil transferase untuk menyintesis untai tunggal homopolimerik 3.b. Contoh enzim retriksi blunt end dan sticky end dan hasilnya Blunt end (Ujung Tumpul)

Sticky end (Ujung Lancip)

Metode transformasia. Heat shock adalah metode transformasi DNA ke dalam sel inang dengan metode kejut panas. Perlakuan ini dimaksudkan untuk membuka pori membran sel dan mengaktifkan protein Hsp (heat shock protein). Suhu yang digunakan untuk proses kejut panas adalah 420 C. Perlakuan heatshock tidak dilakukan terlalu lama yaitu maksimal 90 detik agar sel yang sudah terbuka tidak membuka terus sehingga sel tidak menjadi lisis. Sebelum diberi suhu 420 C sel tersebut diinkubasi dalam es selama 20 menit. Selanjutnya untuk mengetahui DNA insert yang digunakan telah masuk ke dalam sel, maka sel ditumbuhkan dalam media LB padat yang mengandung ampisilin, LA, xgaL, dan IPTG, selanjutnya diinkubasi pada suhu 370 C.b. ElektroforasiadalahtransformasiDNAkedalamselinangdenganmenggunakan arus listrik. Permeabilitas dinding sel bakteri dapat ditingkatkan dengan cara menempatkan sel bakteri kedalam medan listrik yang kuat. DNA dan sel bakteri dimasukkan bersama-sama dalam kuvet khusus yang kemudian ditempatkan dibawah medan listrik (1,8 kv), dalam waktu yang sangat singkat sekitar 4-5 detik. Dibawah medan listrik ini dinding sel bakteri dipaksa terbuka dengan sendirinya, sehingga DNA dapat masuk kedalam sel bakteri kedalam lubang yang terbentuk tersebut. Teknik ini dapat menyebabkan sebagian besar sel bakteri mati, namun sel yang bertahan hidup akan menerima DNA. Dewasa ini elektroporasi sering digunakan untuk transfer DNA karena prosesnya lebih cepat

Perbedaan E.coli dan A. Tumefaciens sebagai sel inanga. E. Coli sebagai sel inang Pemain utama dalam pengembangan teknik dan rekayasa genetika. Hampir seluruh rekayasa genetika dikembangkan melalui bantuan E. coli yang berperan sebagai inang plasmid/fage rekombinan. Hingga saat ini hampir seluruh tahapan kloning, karakterisasi dan modifikasi fragmen DNA spesifik dilakukan dengan menggunakan sistem E coli. Pengembangan vektor bolak balik (shuttel vektor) yang diaplikasikan untuk mikrorganisme lain dikerjakan dalam sistem E coli. E. coli masih berperan penting dalam industri bioteknologi untuk menghasilkan berbagai macam protein E. coli digunakan sebagai sel inang pada rekayasa genetika hewan.b. A. tumefaciens sebagai sel inang A. tumefaciens adalah bakteri patogen pada tanaman yang banyak digunakan untuk memasukkan gen asing ke dalam sel tanaman untuk menghasilkan suatu tanaman transgenik. Di era transformasi genetik sekarang ini, peran agrobacterium sangat besar dalam menghasilkan tanaman yang dimodifikasi untuk mendapatkan sifat yang diinginkan. A. tumafaciens digunakan sebagai sel inang pada sel tanaman

.