Mekanisme Molekular yang mengatur tingkat ikatan Sel DC-T

Klass P.J.M van Gisbergen, Lutz C. Paessens, Teunis B.H. Geijtenbeek, Y vette van Kooyk

Abstrak

Kapasitas yang tidak dapat dibandingkan antara sel dendritik (DC) dan Sel T naif primer

diperkirakan tergantung pada pembentukan sebuah synaps imunologis, DC-SIGN, sebuah

lektin C-type yang secara khusus diekspresikan pada permukaan DC, dan berfungsi sebagai

sebuah reseptor adhesi yang memfasilitasi perikatan Sel T yang didasari melaui pengenalan

ICAM-3 glycosilat pada sel T naif. Saat ini, DC-SIGN diketahui juga memediasi pengikatan

patogen-patogen seperti HIV melalui pengenalan gp120 glikosilat.

Cakupan penelitian ini adalah untuk menginvestigasi apakah DC-SIGN yang dikenali dari

ligand selularnya dan ligand patogenik, dapat mempengaruhi pembentukan synaps DC dan

aktivasi/mobilisasi dari reseptor adhesi lainnya seperti LFA-1 menuju area kontak sel.

Menggunakan sebuah DC-SIGN deletion mutant, kami menemukan bahwa DC-SIGN

merupakan sebuah reseptor aktif secara konstitutif yang memediasi ikatan ligand independen

pada signaling melalui domain sitoplasmik. Secara mengejutkan, initial binding dari gp120

dengan DC-SIGN tidak terjadi dalam peningkatan level adhesi dari LFA-1 dan lingand-nya

ICAM-1 baik dalam DC immature dan sel Raji-DC-SIGN imatur. Walau bagaimanapun, ligand

binding menuju DC-SIGN diinduksi dengan adanya LFA-1 pada area adhesi. Terlebih lagi, kami

dapat mendemostrasikan bahwa aktivasi dari LFA-1 terjadi dalam DC-SIGN-LFA-1 Ko-Kluster

pada membrane sel. Hal ini mencetuskan ikatan dari ligand menuju LFA-1 yang bersama

dengan DC-SIGN, seperti ICAM-3, tetapi tidak dari ligand yang tidak bersama DC-SIGN, seperti

ICAM-1.

Jadi, kami mengusulkan bahwa pada ikatan ligand DC-SIGN dibutuhkan LFA-1 pada area

kontak, menghasilkan pembentukan DC-SIGN-LFA-1 ko-kluster, serta interaksi-interaksi intial

yang dimediasi oleh DC-SIGN dengan ligand bersifat sementara dan akhirnya bergeser

menuju interaksi LFA-1-dependent yang lebih stabil.

1

1. Introduksi

Dendritik cells (DC) merupakan penjaga dari system immune. Terletak dibawah

epithelium dan mukosa, DC imatur merupakan sel imun pertama yang menghadapi

pathogen yang masuk, yang kemudian ditangkap dan diproses untuk dipresentasikan

menuju sel T limfosit. Dalam menangkap antigen, DC menjadi matang dan beredar

menuju lymfe nodus, dimana mereka menginstruksikan sel T patogen-spesifik untuk

berproliferasi dan mengeliminasi pathogen. Aktivasi Sel T membutuhkan kontak yang

berkelanjutan antara DC dan Sel T, hal ini penting dalam pembentukan immunological

synaps. Synaps yang matang terdiri atas cluster sentral dari kompleks TCR-MHC (c-

smac), dikelilingi oleh cincing terluar dari molekul LFA-1-ICAM-1 (p-smac) yang

menyediakan adhesi yang kuat antara DC dan Sel T.

LFA-1 merupakan reseptor transmembran heterodimer yang tersusun dari

hubungan rantai α dan β secara non-kovalen yang merupakan golongan integrin

reseptor. Penyusun dari FLA-1 termasuk ICAM-1, ICAM-2, dan ICAM-3. Pengertian

terbaru mengenai peran utama dari reseptor LFA-1 didapat dari study T limfosit,

dimana LFA-1 disimpan pada status inaktif di dalam sel T. Pada kontak dengan ikatan

DC dari kompleks TCR yang menginisiasi sinyal inside-out, dan mencetuskan LFA-1 ke

status aktif, memungkinkan integrin untuk mengikat struktur pasangannya. Perubahan

dalam aviditas yang terjadi mengatur transisi LFA-1 dari status inaktif menjadi status

aktif. Signal inside-out diperkirakan berperan mengatur ulang LFA-1 menjadi cluster

melalui pelepasan integrin dari ikatan sitoskeletonnya. Hal ini meningkatkan aviditas

LFA-1 dan memungkinkan adhesi dari LFA-1 dan ICAM-1.

Penelitian pada pembentukan synapse antara DC dan sel T belum menyertakan

analisa mengenai sifat dari DC-SIGN, sebuah C-type lectin yang secara spesifik

diekspresikan pada DC. DC-SIGN merupakan reseptor pathogen yang mengikat dan

menginternalisasi HIV-1, HCV, Mycobacterium tuberculosis dan pathogen-patogen

lainnya. DC-SIGN juga berperan penting pada clustering DC-T cell melalui adhesi ICAM-

3 pada sel T. DC-Sign berfungsi pada tingkat awal pembentukan synapse. Dalam hal ini,

DC-SIGN berbeda dari adhesi molekul FLA-1, yang terlibat pada fase lanjutan dari

proses ini. Karena FLA-1 tidak hanya diekspresikan pada sel T, tetapi juga pada DC, baik

sel T- dan DC-expressed LFA-1, memiliki kontribusi dalam pembentukan synaps antara

DC dan Sel T. Sama denga FLA-1 pada sel T, LFA-1 pada DC imatur monocyte-derived

2

juga dalam fase inaktif. Pada Signaling sel T melalui TCR akan mencetuskan aktifasi

LFA-1, baru sedikit hal yang diketahui mengenai signal yang mencetuskan aktifasi LFA-

1 pada DC. Disini, kami telah menguji apakah DC-SIGN terlibat dalam pengerahan dan

Aktifasi LFA-1 pada DC. Kami telah menemukan bahwa ikatan ligand dan DC-SIGN

menginduksi akumulasi LFA-1 pada area adhesi, tetapi tidak mencetuskan ikatan

ICAM-1 dan LFA-1. Bagaimanapun, hasil kami ini mengindikasikan bahwa DC-SIGN

dapat mengerahkan LFA-1 untuk menstabilkan interaksi dengan ICAM-3 pada sel T dan

bahwa interaksi inisial sementara yang dimediasi DC-SIGN-ICAM-3 dapat bergeser

menjadi interaksi yang dimediasi LFA-1-ICAM-3 yang lebih stabil.

2. Material dan Metode

2.1. Antibodi dan reagen

Antibodi dari protein-protein dibawah ini digunakan: DC-SIGN, (AZN-DI dan AZN-

D2), LFA-1α-chain, (TS2/4), SPV-L7 dan NKI-L15, LFA-1 β-cahin (KIM185), LFA-3 (TS2/9),

CD14 (immunotech, fullertone,CA), CD80 (becon and Dickinson &co., Oxnard, CA),

CD83 (immunotech) dan CD86 (pharmingen, san Diego, CA). Recombinant ICAm-1Fc

dan ICAM-3-Fc DNA construct disediakan oleh Dr. D. Simmons. Peleburan protein

diproduksi sebagaimana digambarkan sebelumnya.

2.2. Sel

Transfectan K562 stabil diregenerasikan dengan electroporation dengan 5 x 106

sel dalam 800 µl RPMI 1640 (Gibco, lifetechnologies Ltd., Gaithersburg, MD) pada

0.40kV dan 960µF. Untuk menciptakan K562-DC-SIGN, 10 µg dari DC-SIGN dalam

vector pRc/CMV di transfeksikan kedalam sel k562. Untuk menciptakan K562-DC-SIGN-

GFP dan K652-DC-SIGN(ΔCYT)-GFP, 10 µg dari vector pMX yang sesuai di co-

transfeksikan dengan 2 µg vector pGk-hygkedalam sel K562. Karena LFA-1 tersusun

atas dua rantai co-transfection dari α-chain didalam pCDM8 dan β-chain di dalam

pRc/CMV dibutuhkan untuk membuat K562-LFA-1. Sama halnya, K562-LFA-1 (L732R) di

buat dan menuju wild-type αL-chain yang mengandung β2-chain dengan mutasi pada

L732R. Secara subsekuen, 10 µg DC-SIGN-GFP di dalam vector pMX dan 10 µg DC-

SIGN(ΔCYT)-GFP di dalam vector pMX di co-transferasikan dengan 2 µg pGK-hyg

3

kedalam K562-LFA-1 dan K562-DC-SIGN/LFA-1 (L732R), K562-DC-SIGN/LFA-1 dan K562-

DC-SIGN/LFA-1 (L732R). Raji transfectant stabil mengexpressikan DC-SIGN (Raji-DC-

SIGN) dibuat dengan electroporation dari pRc/CMV-DC-SIGN.

DC imatur merupakan kultur dari monocyt dalam keberadaan Il-4 dan GM-CSF

(500 dan 800 U/ml). dalam percobaan, 5-8 hari DC imatur digunakan.

2.3. Analisa Imunofluorosensi

Ekspresi dari molekul permukaan sel ditentukan dengan immunofluorosence. Sel

di inkubasi dengan antibody yang sesuai (5 µg/L) dalam phosphat buffer saline (PBS)

yang disuplementasikan dengan 0.5% bovine serum albumin (BSA) dan 0.01% sodium

azide selama 30 menit pada suhu 4o C, diikuti dengan inkubasi dengan FITC-labelled

(Zymod) atau antibody sekunder PE-conjugated goat antimouse selama 30 menit pada

4o C. intensitas fluorosence dinilai dengan FACScan analysis.

2.4. Fluorescent bead adhesion assay

Adhesi dari ligand-coated beads dan sel dilaksanakan sebagaimana dijelaskan

sebelumnya. Singkatnya, strepvidin di gabungkan secara kovalen dengan carboxylated-

modified TransFuloSpheres. Streptavidin-coated beads diinkubasi dengan fragmen

biotinylated goat anti-human anti-Fc-FAb2. Gp120-coated beads dibuat sebagaimana

dipaparkan sebelumnya. Singkatnya, streptavidin-coated beads diinkubasi selama 4

jam dengan fragment biotynilated rabbit anti-sheep anti-Fc-Fab2 pada suhu 4o C.

Penilaian Adhesi Fluorosence bead dilakukan sebagaimana dijelaskan.

Singkatnya, sel di pre-inkubasi dengan blocking atau antibody inaktivasi (20 – 10

µg/ml) selama 10 menit dalam TSM (20mM Tris-HCl pH 8.0, 150 mM NaCl, 1 mM

CaCl2, 1 mM MgCl2) 0.5% BSA pada suhu ruangan. Dan secara subsekuen, sel di

inkubasi dengan ligand-coated beads selama 45 menit pada 37o C dalam TSM 0.5%.

Adhesi dari bead tersebut dinilai dengan FACScan analysis. Untuk Memisahkan antara

ikatan ICAM-1-Fc dan gp120 coated beads digunakan TransFluoroSpheres dengan

perbedaan fluorosence (488 dan 465 nm).

4

2.5. Confocal microscopy

Distribusi dari sel-sel LFA-1 atau mutant LFA-1 (L732R) dan DC-SIGN-GFP co-

transfected menjadi K562 ditentukan dengan confocal laser-scanning microscopy

(CLSM). Untuk pelabelan, sel-sel tersebut difiksasi dengan 1% paraformaldehyde

buffered (PFA) selama 15 menit pada suhu ruangan, dicuci dan di inkubasi dengan

antibody primer yang sesuai (10 µ g/ml) dalam PBS yang mengandung 0.55 BSA selama

30 menit pada suhu ruangan. Setelah pencucian, sel-sel tersebut di inkubasi dengan

goat anti-mouse secondary antibodies 9Fluorosence-conjugated, Zymed Laboratories,

Inc., San Fransisco, CA; texas red-conjugated; Jackson immunoResearch Laboratories

Inc., West Grove) selama 30 menit pada suhu ruangan. Dan secara subsekuen di

lekatkan dengan ply-L-lysine-coated glass slide dan dianalisa degan CLSM.

Redistribusi dari molekul permukaan sel dpada Raji-Dc-SIGN dan Imatur DC pada

ikatan gp120-coated beads dinilai dengan CLSM. Non-fluorosent beads di lapisi dengan

fp120 dan dibiarkan melekat pada sel selama 45 menit masa inkubasi pada suhu 37o C.

Sel kemudian dilabel dengan antibody primer yang sesuai dan dideteksi dengan FITC-

conjugated goat anti-mouse secondary antibody (Zymed). CSLM dilakukan pada 488

(FITC dan GFP) atau 568 nm (Texas Red) dengan Krypton/argon laser (Bio-Rad.

Hercules, CA). Untuk melokalisasi beads pada permukaan sel, gambaran transmisi

deambil dengan menggunakan microskop phase-contract.

3. Hasil

3.1. Ikatan ligand dan distribusi dari DC-SIGN bersifat independen dari domain

sitoplasmik

Kami membuat sebuah transfectant dalam sel k562 yang mengekspresikan wild-

type DC-SIGN berpasangan dengan GFP pada ekor sitoplasmik. Ekspresi dari GFP dan

DC-SIGN dengan pewarnaan anti-DN-SIGN antibody dikonfirmasikan pada transfectant

K562-DC-SIGN-GFP (Fig. 1A). Untuk menegaskan bahwa GFp-tag tidak mengganggu

adhesi DC-SIGN, sel K562 yang mengekspresikan wild-type DC-SIGN dibandingkan

dengan transfectant K562-DC-SIGN-GFP dalam fluorosence bead adhesion assay,

dengan menilai ikatan antara gp120 coated bead dengan trasfectant (fig. 1B). Sama

5

dengan K562-DC-SIGN, sel K562 yang mengekspresikan DC-SIGN-GFP yang berikatan

kuat dengan gp120 beads dan adhesi dihambat dengan menggunakan DC-SIGN

antibody dan Ca2+ chelator EGTA (Fig. 1B). kami melakukan titrasi Ca2+ untuk menilai

lebih lanjut ketergantungan dengan adhesi antara wild-type DC-SIGN dan DC-SIGN-GFP

(Fig 1C). Ikatan ICAM-3 dan gp120 dengan K562-DC-SIGN dan K562-DC-SIGN-GFP

menunujukan gambaran ketergantungn atas Ca2+, kami menyimpulkan bahwa GFP-tag

yang melekat pada ekor sitoplasmic dari DC-SIGN tidak mengobstruksi aktivitas

adhesive dari DC-SIGB.

Tidak adanya campur tangan fungsional memvalidasi penggunaan DC-SIGN-GFP

sebagai sebuah alat untuk meneliti molekul ini. DC-SIGN-GFP digunakan untuk menilai

peran domain intraselular dalam ikatan ligand. Sampai saat ini, 36 asam amino

pertama dari coding sequence dari DC-SIGN yang menyusun domain intraseluler utuh

dihilangkan dan sisanya dilebur dengan GFP pada N-terminus. Transfection dari hasil

bentukan DC-SIGN(ΔCYT)-GFP kedalam sel K562 terjadi dalam ekspresi GFP dan

Ekspresi permukaan dari DC-SIGN (Fig. 1A). Perbandingan dari K562- DC-SIGN(ΔCYT)-

GFP dengan K562-DC-SIGN-GFP dalam fluorocent bead adhesion assay menunjukan

ikatan yang sama antara ICAM-3 dan gp120 dengan transfectant dan ketergantungan

Ca2+ dari ikatan ligand dapat dibandingkan. Jadi, adhesi dari ICAM-3 dan gp120 dengan

DC-SIGN tidak dipengaruhi oleh penghilangan sitoplasmik, mendemonstrasikan bahwa

signaling konstitutif melalui ekor sitoplasmik tidak dibutuhkan untuk ikatan ligand

dengan DC-SIGN.

3.2. Ikatan ligand dan DC-SIGN meredistribusi LFA-1

Kami menilai adakah ada ikatan ligand dengan DC-SIGN menghasilkan signals

inside-out yang mencetuskanLFA-1 menjadi bentuk adhesif, untuk menginvestigasi hal

ini, kami menggunakan LFA-1 ekspresi Sel Riji yang ditransfeksikan dengan DC-SIGN

sebagai sistem model. Raji adalah sebuah sel dari jalur sel B, yang mengekspresikan

LFA-1 endogen pada level rendah (Fig. 2A). LFA-1 pada sel Raji tidak dapat berikatan

dengan ICAM-1 atau ICAM-3 bila berada pada status inaktifnya (data tidak tersedia).

Transfeksi stabil dari DC-SIGN dan sel Raji tidak mengalterasi tingkat ekspresi dari LFA-

1 yang tersisa dalam jumlah rendah, dan tidak juga menstimulasi ikatan ligand dengan

6

LFA-1 (data tidak tersedia). Walaupun raji-DC-SIGN dapat berikatan dengan ligand LFA-

1 ICAM-2 dan ICAM-3, adhesi yang terjadi sepenuhnya dimediasi oleh DC-SIGN (data

tidak tersedia). Jadi, untuk mempelajari signaling dari DC-SIGN dan LFA-1, Raji-DC-SIGN

merupakan sebuah sistem model yang baik dalam mengekspresikan DC-SIGN aktif dan

LFA-1 inaktif.

Untuk menilai interplay antara DC-SIGN dan LFA-1, maka ICAM-1 dan gp120

coated beads dipresentasikan secara stimultan menuju Raji-DC-SIGN dalam sebuah

fluoroscent baed adhesion assay. Kami memilih ICAM-1 dan gp120, karena ICAM-1

merupakan ligand primer dari LFA-1 dan tidak mengikat DC-SIGN. Perbandingannya,

gp-120 berikatan kuat dengan DC-SIGN, tetapi tidak dengan LFA-1. Hal ini

memudahkan kami untuk menilai apakah ikatan gp120 dengan DC-SIGN terdapat

sebuah aktifasi signal ke LFA-1 dan ICAM-1. Untuk membedakan antara ikatan

simultan dari ICAM-1 dan LFA-1 serta gp120 dan DC-SIGN, ligand-ligand tersebut

dilapisi dengan beads dengan fluoroscent berbeda (488 nm untuk ICAM-1 coated

beads dan 645 nm untuk gp120 coated beads). Adhesi dari gp120 dan DC-SIGN tidak

berubah dengan adanya ICAM-1 (Fig. 2B panel bawah). Hasil mengejutkan dari

penelitian ini, ikatan ICAM-1 tidak mengalami peningkatan dengan adanya gp120 (Fig.

2B, panel atas). Untuk menginvestigasi signaling DC-SIGN menjadi LFA-1 pada DC

imatur moncyte-derived, percobaan sejenis dilakukan dengan sel-sel ini. DC imatur

mengekspresikan level tinggi dari DC-SIGN dan level rendah sampai sedang dari LFA-1

(Fig. 2A). Ikatan DC-SIGN spesifik dari gp120 coated beads tidak mengalami perubahan

dengan adanya ICAM-1 coated beads. Adhesi dari ICAM-1 coated beads menunjukan

sebuah penurunan minor bukannya sebuah peningkatan, ketika terdapat gp120 beads

coated (Fig. 2C, panel atas). Hal ini mendemonstrasikan bahwa DC-SIGN tidak dapat

menimbulkan signal inside-out yang menginduksi ICAM-1 dengan LFA-1 pada DC

imatur.

Kami berikutnya menanyakan apakah interaksi DC-SIGN-ligand mempengaruhi

distribusi LFA-1 dan aviditas LFA-1. Microskopi confocal digunakan untuk mempelajari

distribusi dari LFA-1 pada permukaan sel dari transfectant Raji-DC-SIGN setelah

crosslinking dengan DC-SIGN. Kami menginkubasi sel Raji-DC-SIGN dengan gp120-

coated non-fluoroscent beads dan ini dihasilkan dalam akumulasi dari DC-SIGN pada

tempat dimana gp120-coared beads diikat (data tidak tersedia). Secara mengejutkan,

7

LFA-1 juga diakumulasi pada area kontak dari Raji-DC-SIGN dan gp120-coated beads

(Fig. 3A). Efek yang terjadi bersifat spesifik untuk LFA-1, dimana LFA-3 tidak ter ko-

lokalisasi dengan beads (Fig. 3B). Jadi signal dari DC-SIGN berinteraksi dengan gp120

menyusun redistribusi dari LFA-1 menuju area kontak pada DC-SIGN-transfected raji

cells. Sama halnya, crosslink dari DC-SIGN dengan gp120-coated beads pada DC imatur

dihasilkan dalam akumulasi LFA-1 pada area kontak dari DC imatur. Redistribusi dari

LFA-1 menuju gp120-coated beads bersifat spesifik karena CD14 tidak ber-ko-lokalikasi

dengan beads tersebut (Fig. 3D). Jadi gp120 dan DC-SIGN menginduksi pengerahan

LFA-1 pada Raji-DC-SIGN dan DC imatur, tetapi tidak mencetuskan ikatan ICM-1 dan

LFA-1.

3.3. Transmisi dari shared ligands antara DC-SIGN dan LFA-1 bergantung pada status

aktivasi LFA-1

Reseptor DC-SIGN dan LFA-1, diekspresikan pada permukaan DC, memiliki sifat

adhesi yang overlapping, dan keduanya dapat mengikat ICAM-3. Untuk mempelajari

apakah keberadaan baik DC-SIGN maupun LFA-1 pada sel yang sama dapat

mempengaruhi interaksinya dengan ICAM-3, maka dibuatlah transfactant single dan

double k562 yang mengekspresikan DC-SIGN, LFA-1, ataupun keduanya. Level ekspresi

permukaan dari DC-SIGN dan LFA-1 tidak ditemukan untuk membedakan antara single

dan double transfactant secara substansial (Fig. 4A). Seperti yang diharapkan, K562-

DC-SIGN berinteraksi dengan ICAM-3, tetapi tidak dengan ICAM-1, dimana K562-LFA-1

berikatan dengan dengan ICAm-1 tapi lebih berikatan kuat dengan ICAM-3 (Fig. 4B dan

C). Adhesi ini bersifat spesifik karena blocking anti DC-SIGN antibody menginhibisi

ikatan ICAM-3 dengan K562-LFA-1 (Fig. 4B dan C). Lebih lanjut, stimulasi antibody

melawan LFA-1 menjadi adhesi up-regulasi yang kuat antara ICAM-1 dan ICAM-3

dengan K562-LFA-1 tetapi tidak pada K562-DC-SIGN (Fig. 4B dan C). Transfactant

double co-expressing DC-SIGN dan LFA-1, K562-DC-SIGN/LFA-1 bersifat penggabungan

atau campuran K562-DC-SIGN/LFA-1 yang berada dalam Single transfactant yang

mengekspresikan LFA-1 dimana ikatan dari ICAM-3 berada dalam single trasnfactant

yang mengekspresikan DC-SIGN. Jadi, ketika LFA-1 distimulasi, maka ikatan ICAM-1

8

meningkat, pada saat ikatan dari ICAM-3 secara komplit dimediasi oleh DC-SIGN dan

maksimal pada kondisi standar (Fig. 4D).

Wildtype LFA-1 pada transfactant K562 didistribusikan merata pada seluruh

membrane. Sebuah mutasi tunggal pada posisi 732 rantai-β dari LFA-1 (L732R) telah

dilaporkan untuk menyebabkan reseptor dalam distribusi cluster, meningkatkan

aviditasnya, yang tergambar dengan peningkatan aktivitas ikatan spontan dari LFA-1

untuk ICM-1 (Fig. 4E). DC-SIGN-GFP di ko-transfeksikan dengan wild-type LFA-1 dan

LFA-1 aktif (L732R) pada sel K562 untuk menganalisa distribusi dari DC-SIGN pada dua

tingkat status aviditas LFA-1 yang berbeda. Level ekspresi rata-rata dari DC-SIGN-GFP

dan LFA-1 dapat dibandingkan antar transfectant (Fig. 4E). Pola ekspresi dari DC-SIGN

adalah homogeny pada K562-DC-SIGN-GFP/LFA-1 yang juga memiliki ekspresi

homogeny untuk wildtype LFA-1, dimana DC-SIGN dikelompokan ……………………………..

…………………………………………..[data tidak terbaca]…………………………………………………………

……………………………………………………………………………………………………………………………………..

LFA-1 active mengandung mutasi L732R (Fig.3E).

Kami mempertanyakan apakah keberadaan erat DC-SIGN dan LFA-1 didalam

cluster akan mempengaruhi ikatan ligand terhadap reseptor-reseptor ini. Kemudian,

K562 double transfactant yang mengekspresikan wildtype DC-SIGn dan LFA-1 aktif

(L732R) di analisa secara fungsional (Fig. 4 F). Adhesi dari double transfactant dengan

ICAM-1 bersifat sama dengan single transfactant yang mengekspresikan LFA-1 (L732R),

bagaimanapun, adhesi ICAm-3 tidak hanya dimediasi oleh DC-SIGN seperti K562-DC-

SIGN (Fig. 4B, E dan F). Ikatan ICAM-3 dihambat oleh antibody DC-SIGN, bekerja secara

independent, juga dihambat oleh antibody anti-LFA-1 pada double transfactant (Fig.

4F). Karena hanya single transfactant yang mengekspresikan DC-SIGN yang

menunjukan adhesi dengan dengan ICAM-3 dibawah kondisi standar (Fig. 4B dan E).

hal ini dapat mengindikasikan adhesi sekuensial daril ICAM-3 dengan DC-SIGN pertama

dan kemudian dengan LFA-1 untuk memungkinkan terjadinya transmisi in-cis ICAM-3

dari DC-SIGN dengan LFA-1 dan interaksi kuat LFA-1-ICAM-3.

9

4. Diskusi

Dalam laporan ini, kami memperluas pengetahuan mengenai karakteristik adhesi

dari DC-SIGN. Pertama, kami menemukan bahwa signaling melaui ekor sitoplasmik dari

DC-SIGN tidaklah dibutuhkan untuk terjadinya adhesi. Kedua, dalam ikatan ligand

ligand kami menemukan DC-SIGN membutuhkan LFA-1, tetapi tidak ditemukan pada

aktivasi LFA-1. Ketiga, kami mendemonstrasikan bahwa DC-SIGN dapat memfasilitasi

adhesi dari ICAM-3 untuk menjadi aktif tetapi tidak menginaktifasi LFA-1.

4.1. Peran domain sitoplasmik dari DC-SIGN dalam proses adhesi

DC-SIGN merupakan sebuah reseptor aktif secara konstitutif yang mengikat

ligand seluler ICAM-3 sebagaimana ligand patogenik gp120. Delesi dari ekor

sitoplasmik DC-SIGN menunjukan ikatan ligand untuk terjadi secara independen dari

domain intraseluler. Transfectants K562 mengekspresikan DC-SIGN-GFP, dimana GFP-

tag tidak mempengaruhi ikatan ligand, dan dapat dibandingkan dengan ekspresi dari

DC-SIGN(ΔCYT)-GFP dengan melihat level maksimal dan ketergantungan Ca2+ dari

ikatan ke ICAM-3 dan gp120. Hal ini menunjukan bahwa adhesi dari ligand dan DC-

SIGN tidak membutuhkan signaling konstitutif, perlekatan pada sitoskeleton atau

protein aksesorsi, dimana ekor sitoplasma sangat diperlukan. Juga, distribusi dari DC-

SIGN di dalam membrane sel tidak tergantung pada sitoskeleton, seperti cytoplasmic

deletion mutant yang menunjukan gambaran distribusi homogenus, mirip seperti wild-

type dari DC-SIGN (data tidak diperlihatkan). Hal ini kontras dengan LFA-1 yang

membutuhkan interaksi dengan sitiskeleton, untuk menjaga distribusi

homogenousdan yang membenrtuk cluster pada …………………………………………………

…………………………….

……………………………………………………………………………………………………………….

……………………………………[tulisan tidak terbaca]……….….…………….…………..……………

………………………………………………………………………………………………………………………………………

DC-SIGN tidak mengalami pengekangan dari sitoskeleton, yang membuat reseptor ini

sangat cocok untuk memediasi interaksi dengan ICAM-2 pada endothelium dan

dengan ICAM-3 pada T lymphosit muda tanpa aktifasi sebelumnya.

10

4.2. Pengerahan LFA-1 melalui ligasi dari DC-SIGN

Walaupun ekor sitoplasmik dari DC-SIGN tidak mentransduksi sinyal dalam ke

luar untuk memungkinkan ikatan ke ligand, hal ini dapat memediasi signaling dari arah

berlawanan, yang kemudian disebut outside-in signaling dalam proses perikatan

ligand. Tentu saja, dalam ikatan DC-SIGN-transfected Raji cells dari DC-SIGN dengan

gp120 menggerakkan LFA-1 menuju tempat ikatan ligand. Pengerahan LFA-1 yang

sama diobservasi pada DC imatur ketika DC-SIGN diikat oleh gp120. Jadi, gp120

berikatan dengan DC-SIGN menibulkan outside-in signal yang dihasilkan dalam

redistribusi dari LFA-1 menuju adhesion site (Fig. 5).

Sama seperti LFA-1 pada Sel T, LFA-1 pada DC Imatur dan juga pada Raji-DC-

SIGN, menunjukan gambaran distribusi homogenus dan tidak mengikat ligand. Dalam

pengkelompokan sel T dari LFA-1 menyebabkan terjadinya adhesi molekul dan ICAM-

1. Bagaimanapun, pada DC imatur dan Transfectan Raji, DC-SIGN yang dicetuskan dari

akumulasi LFA-1 tidak terjadi dalam peningkatan adhesi ICAM-1. Mungkin, kelompok

yang terinduksi daro LFA-1 tidak cukup kuat untuk mendukung adhesi ICAM-1. Secara

alternative, signal-signal tambahan, yang mempengaruhi status afinitas LFA-1, dapat

saja dibutuhkan untuk bekerja secara sinergistikal dengan sinyal daro DC-SIGN,

mempengaruhi status aviditas, untuk secara penuh mengaktifakan LFA-1 pada DC.

LFA-1 yang terakumulasi dapat bekerjasama dengan DC-Sign untuk memfasilitasi

infeksi HIV-1 pada sel limfosit T CD4+. Transmisi dari HIV-1 dari DC ke sel limfosit T

CD4+ tergantung dari pembentukan infectious synapse, tempat dimana kontak yang

dalam antara DC dan Sel T. Hal ini telah didemonstrasikan bahwa DC-SIGN terlibat

dalam pembentukan infectious synapse. Dalam ikatan HIV-1 gp120 DC-SIGN dapat

memediasi redistribusi dari LFA-1 terhadap partikel HIV-1 dalam DC. Hubungan LFA-1

dengan ICAM-1 pada sel T yang berlawanan dapat menyediakan interaksi yang kuat

yang dibutuhkan untuk pembentukan kontak yang dalam antara DC dan Sel T. tentu

saja, keberadaan LFa-1 didalam infectious synapse telah didemonstrasikan untuk

meningkatkan infektifitas viral. Terlebih lagi, di dalam sebuah interaksi DC-T cell co-

culture blocking dan LFA-1–ICAM-1 secara substasial mengurangi produksi HIV-1.

11

4.3. DC-Sign versus LFA-1 : sebuah peperangan untuk ligand

Dalam perbandinagn antara double transfectant co-expressing wild-type LFA-1

dan DC-SIGN-GFP, yang ditunjukan dengan distribusi molekul adhesi yang tersebar dan

non-matching, transfectant co-expressing dan mutant LFA-1 dengan point mutasi pada

posisi 732 dari rantai-β (L732R) terbentuk kelompok, dimana molekel adhesi

membentuk co-assemble. Alsan untuk co-assembly dari transfectant co-expressing dan

mutant LFA-1 dalam cluster tersebut belum jelas. Mungkin, DC-SIGN melokalisasi lipid

raft, yang diperkirakan mengandung LFA-1. Co-cluster dari mutant LFA-1, tetapi bukan

dari wild-type FLA-1, dengan DC-SIGN-GFP memiliki kemungkinan untuk dipelajari

mengenai ikatan ligand dalam situasi yang dapat dibandingakan antara pre dan post

dari cross-linking dari DC-SIGN baik Raji transfectant maupun imatur DC.

Co-expression dari wild-type LFA-1 dengan DC-SIGN tidak menginduksi aktivasi

dari LFA-1, karena adhesi untuk ligand LFA-1 ICAM-1 tidak meningkat dan ikatan ICAM-

13 tidak dimediasi oleh LFA-1, tetapi oleh DC-SIGN. Juga co-expression dari LFA-1 aktif

(L732R) dengan DC-SIGN tidak menstimulasi lebih lanjut adhesi LFA-1 dengan ICAM-1.

Bagaimanapun, adhesi dari LFA-1 aktif (L732R) dengan ICAM-3 diinduksi oleh co-

expression dari DC-SIGN. Hal ini dapat menggambarkan transmisi dari ligand antara

DC-SIGN dan LFA-1 daripada aktivasi LFA-1 pada iklatan ICAM-3 dengan DC-SIGn,

karena sama dengan Raji-DC-SIGN dan Imatur DC, adhesi darei ICAm-1 dengan K562-

DC-SIGN/LFA-1 (L732R) tidak ditingkatkan dengan ikatkan dari DC-SIGN dengan ligand

(data tidak tersedia). Lebih jauh, baik antibody anti-LFA-1 dan anti-DC-SIGN

menghambat ikatan dengan ICAM-3 secara independen, mengindikasikan ikatan yang

berurutan antara ICAM-3 dan DC-SIGN dan LFA-1. Hal ini mengingatkan pada fungsi

dari DC-SIGN sebagai reseptor intrans-acting pada transmisi HIV-1 antara DC dan Sel T

Limfpsit CD4+. Disini, DC-SIGN berikatan dengan HIV-1 melalui gp120 tetapi tidak

mengizinkan dari DC, terlebih DC-SIGN memfasilitasi transmisi dari virus yang

tertangkap pada CD4 dan reseptor chemokine pada sel T yang mati akibat infeksi HIV-

1. Jadi, transmisi dari ligand DC-SIGN dari DC-SIGN menuju reseptor lainnya dengan

afinitas untuk ligand yang sama dapat pula terjadi dalam proses adhesi selama

homeostasis. Interaksi inisial DC-SIGN-ICAM-2-dependent yang memediasi perputaran

12

DC pada endothelium dapat mendahului interaksi kuat LFA-1-ICAM-2-dependent yang

memediasi penangkapan. Demikian pula, interaksi stabil LFA-1-ICAM-3 dapat diikuti

interaksi transient DC-SIGN-ICAM-3 dalam pembentukan infectious synapse antara DC

dan Sel T untuk memastikan aktivasi sel.

5. Kesimpulan

Karakteristik fungsional dari DC-SIGN mengindikasikan sebuah peran sebagai

molekul adhesi momen pertama dalam ekstravasasi. Aktivasi sel T dan infeksi HIV-1.

Dengan menggunakan cytoplasmic deletion mutant dari DC-SIGN kami memaparkan

reseptor tersebut untuk bekerja sebagimana mestinya, ikatan ligand ICAM-3 dan

gp120 pada struktur yang berlawanan tidak membutuhkan signaling melalui ekor

sitoplasmik. DC-SIGN juga memediasi signal outside-in yang dibutuhkan tetapi tidak

mengaktivasi LFA-1 dalam transfektan Raji-DC-SIGN dan DC imatur. Dengan

menggunakan K562 double transfectan co-expressing DC-SIGN dan LF-1 kami

memaparkan DC-Sign untuk memfasilitasi ikatan ICAM-3 tetapi tidak untuk ICAM-1

kepada LFA-1 ketika molekul-molekul mengalami ko-lokalisasi didalam cluster.

Sehingga, DC-SIGN diperkirakan untuk memediasi adhesi initial dan untuk menarik

molekul adhesi lainnya seperti LFA-1 yang mengambil alih ikatan menuju ligand DC-

SIGN untuk membentuk adhesi yang lebih stabil.

13