Material dan Metode

Bakteri strain dan kondisi pertumbuhan

S.Pneumoni 5%CO2 on tryptic soy agar plate (TSA) pada 37⁰C + 10mg/l colistine+ 5mg/l oxolid acid + 5% defibrinated sheep blood (semalem)

Liquid culture didiamkan dan dilembabkan suhu atmosfer sampai A600 = 0,25 pada todd Hewitt Broth + THYE (yeast ekstrack )

Untuk evaluasi ekspresi pilus yang berbeda pada kondisi media yg berbeda yaitu pada rich media

(THYE,TSA,Brain Hearth Infusion broth)+MnSO4 (1 mM)+ FeCl3 ($ 50 mM) atau Fetal Bovine Serum (20%), sampai fase pertumbuhan yang berbeda (A600 berkisar antara 0,01 sampai 1.2), pada berbagainilai pH (5,5, 6,4, 8,4) atau dengan adanya konsentrasi o2 yang berbeda

• Koleksi strain S.pneumonia dari berbagai tempat untuk mengkarakterisasi serotipe dan deteksi adanya PI-1 dan PI-1 clade dengan pemilihan secara random hasilnya PI-1 (+)

• Ekstraksi genom DNA wizard denomic DNA purification kit dengan bahan bakteri dari kultur cair .

• mendapatkan P-1 sequencing ABI 3730xl DNA Analyzer dan dirakit dengan Vector NTI 10

Immunisasi hewan

• sera spesifik protein protein recommbinan yang sudah dimurnikan suntik tikus 3 dosis terpisah dengan jarak 2 minggu intra peritoneal2 minggu setelah penyuntikan ke 3 perdarahan pada tikus itu.

Flow Cytometry

• Bakteri dari kultur liquid + antisera tikus (anti Rrgb)

• bakteri terfixasi dengan 2% formaldehide dianalisis FACS-Calibur cytometer

• Bakteri tetap tumbuh di media THYE

• bakteri yang diinkubasi + antibodi anti-RrgB kelinci (1:400 dilusi)

+ antirabbit IgG biotin terkonjugasi (Abcam, 1:1000 dilusi) antibodi pada kambing diinkubasi+ Sepharose magnetikmanik dilapisi dengan streptavidin (Invitrogen) selama 1 jam pada 4uC = TIGR4 pilus rendahdi ekspresikan

SDS-PAGE dan analisis Western Blot

• Analisis SDS-PAGE lysates bakteri Nu-PAGETM 4-12 Bis-Tris atau 3-8% gradien Tris-asetat gel (Invitrogen )

• analisis Western Blot Hi-MarkTM pra-pewarnaan HMW protein standar (Invitrogen) + Antibodi tikus dan kelinci pengenceran 1:3000 dan 1:5000 (western blue stabilizer Substrat untuk Alkaline Phosphatase)

Colony immuno-blot

• Bacteria sonification with SONICS vibra-cell sonicator (ensure that the colonies were

derived from single bakteria)

checked microscope diluted on blood-agar plates

nitrocellulose membrane discs(Millipore) removed after 5 min,

heat-treated with microwave irradiation (300

W for 2 min)

Western Blot analysis

ekstraksi RNA

• Reagen bakteri RNA protect (Qiagen) + 2 ml kultur bakteri cair (2:1) divortex beberapa detik sentrifugasi (5000 g, 10 menit), resuspensi dalam 1 ml prewarmed (100uC) SDS solusi (SDS 2%, 16 mM EDTA pH 8,00) diinkubasi pada 100uC selama 2 mnt (kocokan yang kuat) Prewarmed (65uC) asam fenol (1 ml) + diinkubasi selama 5 menit pada 65uC (dikocok/digetarkan) diekstraksi dua kali dengan 1 ml Fenol / Kloroform / Isoamyl alkohol (25:24:1) dan sekali dengan 1 ml kloroform / Isoamyl alkohol (24:1) Fase liquid + 2,5 volume etanol dan 1/10 vol Na Asetat 3 M (pH 4,5) Setelah 2 jam inkubasi pada 220uC dan sentrifugasi (16000 g, 20 menit), pelet RNA didapatkan dan dimurnikan oleh menggunakan RNeasy Mini Kit (Qiagen) Sebelum elusi akhir, semua sampel RNA dua kali ke perlakuan DNase I (Qiagen). Cek Integritas RNA total pada gel agarosa.

Desain Microarray• Custom microarray berdasarkan fragmen dsDNA (200-500 bp),

PCRamplified pada TIGR4 DNA genom• Gen dianggap non-spesifik jika mereka memiliki Gen sesuai

homolog pada TIGR4 dengan identitas lebih besar dari 80% atau sekurang kurannya 80% dari panjang gen

• PCR amplifikasi dilakukan pada DNA genomik dimurnikan menggunakan QIAquick-96 PCR piring pemurnian (Qiagen) dielusi di ddH2O sebelum diperiksa oleh gel elektroforesis pada format 96 dan akhirnya diencerkan dengan DMSO (dimetil sulfoksida) 50% (vol / vol) ). Semua PCR-diperkuat fragmen yang terlihat dalam rangkap empat dengan menggunakan Microgrid II spotter (Arrayit Corporation) pada Jenis-VII * berlapis aluminium cermin slide (ArrayJet)

Probe labeling and microarray hybridization

• RNA labeling 1 mg total RNA-> reverse transcribed for two hours at 42uC using Super Script II Reverse Trascriptase (Invitrogen), oligonucleotides (GE Healthcare) and the fluorochromes Cyanine3-dCTP or Cyanine5-dCTP (GE Healthcare)

• labeled cDNA RNAse (RNAse One,Promega and RNAse H, Invitrogen) at 37uC for 30 min

purified by using the Qiaquick PCR purification kit (Qiagen)• Hybridize microarray slides heat denaturation (2 min at 95uC)-> over

night incubation at 42uC) in microarray hybridization buffer (GE Healthcare) and 50% formamide washed once for 5 min in SSC solution (150 mM NaCl and 15 mM Sodium Citrate) 0.2% SDS, and twice for 10 min in 0.1x SSC 0.2% SDS dipped 5 times in 0.1X

SSC, 2 times in water and then dried with nitrogen

Microarray data analysis• application BASE2• Genes having a t-test pvalue <0.05 were usually accepted as differentially

expressed• genes with a log2 ratio .1 or ,21 were accepted and classified as being

significantly changed• Gene expression changes were validated by quantitative realtime PCR

(qRT_PCR) analysis• gene, duplicate reactions Analyses with Light CyclerH 480 SW 1.5(Roche)• evaluate the quantitative variation in gene expression

between the high and low pilus expressing subpopulations for the 5different strains tested, (threshold cycle DDCT)

• GAPDH (glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase) ampliconswere used as the endogenous control for the normalization ofthe data.

Expression of RrgB or RlrA in TIGR4 low pilus expressing

bacteria• chromosom DNA TIGR4 strain (tdk pnya pili)

diambil dengan PCR lalu di kloning pada plasmid pMU1328 diantara BamHI and SalI restriction sites

• Mengekspresikan RlrA, RrgB and SrtC-2 berubah menjadi TIGR4 yang mengeskpresikan pilus yang pendek

• Expression of pili on the bacterial surface was detected by Western blot, FACS and immune-fluorescence analysis.

Supporting Information

• Pilus expression ratio is constant at different growth phases

• Microarray expression profile analysis of thehigh versus the low pilus expressing sub-populations

• SrtC-2 is expressed and functional in bacteriatransformed with pMU1328-Pc-srtC-2.

TERIMA KASIH