Manual Praktikum MK Teknik Analisis Laboratorium (Bagian ... · (anion), dalam hal tersebut ......

of 52

Manual Praktikum

MK Teknik Analisis Laboratorium (Bagian Produksi Ternak)

Semester Genap 2018/2019

Oleh :

Laboratorium Epidemiologi

LABORATORIUM EPIDEMIOLOGI

FAKULTAS PETERNAKAN

UNIVERSITAS BRAWIJAYA

MALANG

2018

of 52

Manual Praktikum

MK Teknik Analisis Laboratorium (Bagian Produksi Ternak)


Materi I

ELEKTROFORESIS

Dasar Teori

Elektroforesis berasal dari bahasa Yunani yang mempunyai arti transport atau perpindahan

protein melalui perbedaan potesial partikel-partikel listrik. Elektroforesis adalah suatu cara analisis

kimiawi yang didasarkan pada pergerakan molekul-molekul protein bermuatan di dalam medan

listrik (titik isoelektrik). Pergerakan molekul dalam medan listrik dipengaruhi oleh bentuk, ukuran,

besar muatan dan sifat kimia dari molekul (Titrawani, 1996). Molekul terlarut dalam medan listrik

bergerak atau migrasi dengan kecepatan yang ditentukan oleh rasio muatan dan massa. Sebagai

contoh jika dua molekul mempunyai massa dan bentuk yang sama, molekul dengan muatan lebih

besar akan bergerak lebih cepat ke elektrode (David G. Watson, 2007). Bila arus listrik dialirkan

pada suatu medium penyangga yang telah berisi protein plasma maka komponen-komponen protein

tersebut akan mulai bermigrasi secara berangsur-angsur (Ricardson dkk. 1986) sesuai dengan

porusitas gel.

Kecepatan molekul yang bergerak pada medan listrik tergantung pada muatan, bentuk dan

ukuran. Dengan demikian elektroforesis dapat digunakan untuk separasi makromolekul (seperti

protein dan asam nukleat). Posisi molekul yang terseparasi pada gel dapat dideteksi dengan

pewarnaan (mis: Commasie Blue) atau autoradiografi, ataupun dilakukan kuantifikasi dengan

densitometer. Elektroforesis untuk makromolekul memerlukan matriks penyangga untuk mencegah

terjadinya difusi karena timbulnya panas dari arus listrik yang digunakan.

Dasar elektroforesis adalah pembentukan suatu ketidakhomogenan atau gradasi konsentrasi

sepanjang sistem. Koloid, protein enzim menunjukkan mobilitas elektroforesis spesifik dan titik

isoelektrik yang dapat digunakan untuk identifikasi zat-zat spesifik. Pemisahan dapat dilakukan bila

senyawa-senyawa yang telah terpisah tidak secara spontan bercampur kembali akibat sirkulasi

konvektif. Pada elektroforesis, medan listrik dialirkan pada suatu medium yang mengandung

sampel yang akan dipisahkan. Sebagai akibatya adalah terbentuk pita (band) yang dapat diwarnai

agar mudah dilakukan identifikasi.

Prinsip kerja dari elektroforesis berdasarkan pergerakan partikel-partikel bermuatan negatif

(anion), dalam hal tersebut DNA, yang bergerak menuju kutub positif (anode), sedangkan partikel-

partikel bermuatan positif (kation) akan bergerak menuju kutub negatif (anode) (Klug &

Cummings, 1994: A 6). Prinsip inilah yang dipakai dalam elektroforesis untuk memisahkan

molekul-molekul berdasarkan muatannya sehingga pergerakan molekul-molekul tersebut pada suatu

fase diam (stationary phase) dalam sebuah medan listrik akan berbeda-beda. Oleh karena partikel

sol bermuatan listrik, maka partikel ini akan bergerak dalam medan listrik. Kemampuan

perpindahan pergerakan muatan molekul tersebut menuju ke arah kutub yang berlawanan

merupakan suatu parameter kecepatan dalam proses elektroforesis yang dinyatakan sebagai

mobilitas elektroforetik. Mobilitas elektroforetik merupakan laju perpindahan partikel bermuatan

dalam cm per detik yang disebabkan karena pengaruh medan listrik 1 V per cm, dinyatakan dalam

cm2V

-1s

-1. Mobilitas elektroforetik dapat ditetapkan hanya untuk elektrolit tertentu pada kondisi

pengujian yang tepat.

of 52

Menurut Stenesh dalam Titrawani (1996) teknik elektroforesis dapat dibedakan menjadi dua

cara, yaitu : elektroforesis larutan (moving boundary electrophoresis) dan elektroforesis daerah

(zone electrophoresis). Pada teknik elektroforesis larutan, larutan penyangga yang mengandung

makro-molekul ditempatkan dalam suatu kamar tertutup dan dialiri arus listrik. Kecepatan migrasi

dari makro-molekul diukur dengan jalan melihat terjadinya pemisahan dari molekul (terlihat seperti

pita) di dalam pelarut. Sedangkan teknik elektroforesis daerah adalah menggunakan suatu bahan

padat yang berfungsi sebagai media penunjang yang berisi (diberi) larutan penyangga. Media

penunjang yang biasa dipakai adalah gel agarose, gel pati, gel poliakrilamida dan kertas sellulose

poliasetat. Adapun menurut Sargent & George (1975) elektroforesis daerah disebut sebagai

elektroforesis gel dengan dua buah model yaitu horizontal dan vertikal. Metode yang biasa

digunakan adalah model horizontal, karena mempunyai beberapa keuntungan yaitu peralatan yang

digunakan sangat sederhana, relatif murah dan pemisahan untuk enzim tertentu dapat menghasilkan

pemisahan yang lebih baik.

Elektroforesis biasanya memerlukan media penyangga sebagai tempat bemigrasinya

molekul-mulekul biologi. Media penyangganya bermacam-macam tergantung pada tujuan dan

bahan yang akan dianalisa. Media penyangga yang sering dipakai dalam elektroforesis antara lain

yaitu kertas, selulose, asetat dan gel. Gel poliakrilamid dan agarosa merupakan matriks penyangga

yang banyak dipakai untuk separasi protein dan asam nukleat.

Beberapa faktor mempengaruhi kecepatan migrasi dari molekul protein yakni:

(Soedarmadji, 1996)

1. Ukuran molekul protein

Migrasi molekul protein berukuran besar lebih lambat daripada migrasi molekul berukuran kecil.

2. Konsentrasi gel

Migrasi molekul protein pada gel berkosentrasi rendah lebih cepat daripada migrasi molekul

protein yang sama pada gel berkosentrasi tinggi.

3. Buffer (penyangga) dapat berperan sebagai penstabil medium pendukung dan dapat

mempengaruhi kecepatan gerak senyawa karena ion sebagai pembawa protein yang bermuatan.

Kekuatan ion yang tinggi dalam buffer akan meningkatkan panas sehingga aliran listrik menjadi

maksimal. Hal ini dapat mempercepat gerakan molekul protein. Kekuatan ion rendah dalam

buffer akan menurunkan panas sehingga aliran listrik akan sangat minimal dan migrasi molekul

protein sangat lambat.

4. Medium penyangga

Medium pendukung ideal untuk elektroforesis adalah bahan kimia inert yang bersifat relatif

stabil, mudah ditangani dan mempunyai daya serap yang baik, sebagai migrasi elektron atau

penyaringan berdasarkan ukuran molekul seperti gel poliakrilamid (Sudarmadji, 1996).

Jika ukuran pori dari medium kira-kira sama dengan molekul, maka molekul yang lebih kecil

akan berpindah lebih bebas di dalam medan listrik, sedangkan molekul yang lebih besar akan

dibatasi dalam migrasinya. Besarnya pori-pori dapat diatur dengan mengubah konsentrasi

penyusun gel poliakrilamidnya yaitu akrilamid dan bisakrilamid.

5. Kekuatan voltase

Voltase yang dipakai rendah (100-500) V, kecepatan migrasi molekul sebanding dengan

tingginya voltase yang digunakan.

Voltase yang dipakai tinggi (500-10000) V, mobolitas molekul meningkat secara lebih tajam

dan digunakan untuk memisahkan senyawa dengan BM rendah serta jenis arus yang dipakai

selalu harus searah (bukan bolak balik).

of 52

6. Temperatur medium disaat proses elektroforesis berlangsung. Jika temperatur tinggi akan

mempercepat proses bermigrasinya protein dan sebaliknya jika temperatur rendah akan

mengurangi kekuatan bermigrasinya protein.

Elektroforesis gel

Elektroforesis gel digunakan untuk memisahkan atau melihat kemurnian DNA atau protein

yang tidak bisa diperoleh dengan metode lain seperti gradient sentrifugasi. Media yang banyak

dipakai dalam proses pemisahan ini adalah agarose atau akrilamid. Agarose digunakan untuk

memisahkan molekul-molekul yang lebih besar karena memiliki ukuran partikel yang lebih besar.

Sehingga daya pisah dari agarose (resolusi) lebih kasar (lebih lemah) dibandingkan akrilamid.

Akrilamid memiliki ukuran partikel yang lebih halus sehingga daya pemisahannya lebih baik.

Elektroforesis melalui gel agarosa atau poliakrilamid merupakan Teknik ini merupakan

teknik yang sederhana, cepat, dan dapat memisahkan molekul yang diinginkan dari matriksnya yang

tidak dapat dilakukan oleh prosedur lainnya, seperti sentrifugasi gradient. (David G. Watson, 2007).

Jenis-jenis Elektroforesis Gel

a. Elektroforesis gel agarosa

Metode standar yang digunakan untuk memisahkan, mengidentifikasi dan memurnikan

fragmen DNA adalah elektroforesis gel agorose. Teknik ini sederhana, cepat terbentuk, dan mampu

memisahkan campuran potongan DNA sesuai dengan ukurannya secara akurat, dibanding dengan

densitas gradient sentrifugasi. (Maniatis T. et al, 1982)

Agarosa yang disari dari ganggang laut merupakan polimer dengan dasar struktur D-

alaktosa dan 3,6 –anhidro L-galaktosa. DNA dari 200 basa sampai 50 kilo basa dapat dipisahkan

dengan gel agarosa dengan berbagai konsentrasi agarosa. Gel agarosa biasanya dilakukan dalam

konfigurasi horizontal dalam kekuatan medan listrik dan arah tetap. (David G. Watson, 2007)

Gel agarosa dibuat dengan melelehkan agarosa dengan buffer dan kemudian dituangkan

pada cetakan dan diamkan sampai dingin. Setelah mengeras, agarosa membentuk matriks dengan

kerapatan yang ditentukan oleh konsentrasi agarosa. Jika medan magnet diberikan antara kedua

ujung gel, DNA yang bermuatan negatif pada pH netral, bergerak ke anoda. Kecepatan migrasi ini

ditentukan oleh ukuran (panjang) DNA, konformasi DNA, konsentrasi agarosa dan besaran

tegangan yang digunakan. (David G. Watson, 2007)

Molekul DNA untai ganda linear, yanag diletakkan pada salah satu ujung gel, bergerak

melalui matriks gel pada kecepatan yang berbanding terbalik terhadap log jumlah asam basa.

Molekul yang lebih besar bergerak lebih lama karena terjadi gesekan lebih besar. (David G.

Watson, 2007)

Hal ini disebabkan DNA harus melewati pori-pori gel sehingga kurang efisien lajunya

daripada molekul yang lebih kecil.Fragmen DNA linear dengan panjang tertentu bermigrasi dengan

kecepatan yang berbeda pada gel yang mengandung konsentrasi agarosa berbeda.

Cara yang paling mudah untuk mendeteksi adanya DNA dengan menggunakan etidium

bromide, suatu senyawa berfluoresensi yang biasanya digunakan untuk mendeteksi DNA pada gel

agarosa atau poliakrilamid. (David G. Watson, 2007)

b. Elektroforesis Gel Poliakrilamid

Akrilamid merupakan suatu monomer, yang jika ada radikal bebas, biasanya diberikan oleh

ammonium persulfat dan distabilkan oleh TEMED, terjadi reaksi berantai sehingga monomer

terpolimerisasi menjadi rantai panjang.

of 52

Gel poliakrilamid dibuat dengan cara menuangkan antar dua lempeng kaca yang dipisahkan

dengan pembatas dengan ketebalan tertentu. Gel poliakrilamid berukuran dari 5 cm sampai 50 cm

panjangnya tergantung pada keperluannya dan dilakukan elektroforesis dengan cara vertikal. (David

G. Watson, 2007)

c. Elektroforesis Gel Poliakrilamid-SDS ( SDS-PAGE)

Protein dapat dipisahkan berdasarkan ukuran massanya dengan elektroforesis gel

poliakrilamid dengan system gerak. Sebelumnya, campuran protein dipanasi dengan natrium

dedosil suldat (SDS), suatu detergen anionik utnuk menyelubungi molekul protein. Penyelubungan

ini menyebabkan interaksi nonkovalen terganggu sehingga molekul protein dalam struktur primer.

Anion SDS berikatan dengan rantai utama dengan rasio satu molekul SDS untuk dua residu asam

amino. . (David G. Watson, 2007)

Merkaptoetanol atau ditiotreitol juga ditambahkan untuk mereduksi ikatan disulfida.

Kompleks SDS dengan protein terdenaturasi mempunyai jumlah muatan negatif yang sebanding

dengan ukuran protein. Muatan negatif yuang terdapat pada ikatan SDS ini jauh lebih besar

daripada muatan pada protein asli. Kompleks protein SDS kemudian dielektroforesis, sehingga

semua molekul protein bergerak menuju kutub positif. Ketika elektroforesis selesai, protein dalam

gel dapat ditampakkan oleh pewarnaan dengan perak atau zat warna seperti Coonassie biru, yang

akan menampakkan beberapa pita. (David G. Watson, 2007).

Analisis Protein

Protein

Protein berasal dari bahasa Yunani proteios yang berarti pertama atau utama. Protein

merupakan makromolekul yang menyusun lebih dari separuh bagian dari sel. Protein menentukan

ukuran dan struktur sel, komponen utama dari sistem komunikasi antar sel serta sebagai katalis

berbagai reaksi biokimia di dalam sel. Karena itulah sebagian besar aktivitas penelitian biokimia

tertuju pada protein khususnya hormon, antibodi dan enzim.

Semua jenis protein terdiri dari rangkaian dan kombinasi dari 20 asam amino. Setiap jenis

protein mempunyai jumlah dan urutan asam amino yang khas. Di dalam sel, protein terdapat baik

pada membran plasma maupun membran internal yang menyusun organel sel seperti mitokondria,

retikulum endoplasma, nukleus dan badan golgi dengan fungsi yang berbeda-beda tergantung pada

tempatnya. Protein-protein yang terlibat dalam reaksi biokimiawi sebagian besar berupa enzim

banyak terdapat di dalam sitoplasma dan sebagian terdapat pada kompartemen dari organel sel.

Protein merupakan kelompok biomakromolekul yang sangat heterogen. Ketika berada di

luar makhluk hidup atau sel, protein sangat tidak stabil. Untuk mempertahankan fungsi dan nya,

setiap jenis protein membutuhkan kondisi tertentu ketika diekstraksi dari normal biological milieu.

Protein yang diekstraksi hendaknya dihindarkan dari proteolisis atau dipertahankan aktivitas

enzimatiknya.

Untuk menganalisa protein yang ada di dalam sel tersebut, diperlukan prosedur fraksinasi

sel yaitu (1) memisahkan sel dari jaringannya, (2) menghancurkan membran sel untuk mengambil

kandungan sitoplasma dan organelnya serta (3) memisahkan organel-organel dan molekul

penyusunnya. Prosedur (1) dan (2) dinamakan homogenasi dapat dilakukan dengan menggunakan

alat yang paling sederhana seperti homogeniser atau mortal sampai alat yang paling mutakhir

seperti pemakaian vibrasi dan sonikasi tergantung pada bahan yang akan dihomogenasi. Prosedur

(3) dilakukan dengan menggunakan sentrifus dengan kecepatan dan lama sentrifugasi tertentu.

of 52

Sebagian besar protein merupakan molekul yang mudah rusak bila tidak berada pada kondisi

fisiologisnya. Karena itu, untuk mempertahankan struktur dan fungsi protein, fraksinasi dilakukan

pada suhu rendah (0-40C) dalam buffer dan pH tertentu (tergantung dari jenis protein yang akan

dianalisa).

Hasil homogenasi yang dinamakan homogenat biasanya masih berupa larutan keruh yang

terdiri dari debris sel (bagian sel yang tidak hancur), organel-organel sel dan makromolekul

penyusun sel diantaranya yaitu protein. Dengan sentrifugasi, debris dan organel sel akan

mengendap di dasar tabung sentrifus (dinamakan pellet), sedangkan makromolekul (termasuk di

dalamnya protein) yang ukurannya jauh lebih kecil daripada debris dan organel sel tidak akan

mengendap tetapi terlarut dalam buffer (dinamakan supernatan yang bening). Supernatan inilah

yang dipakai sebagai sampel untuk analisa protein dalam jaringan.

Untuk analisa protein yang di dalam plasma atau serum darah, prosedur fraksionasi (1) dan

(2) tidak diperlukan karena protein sudah terlarut dalam plasma darah, sedangkan sentrifugasi tetap

diperlukan untuk mengen-dapkan sel-sel darah sehingga protein yang terlarut dalam plasma atau

serum terdapat sebagai supernatan.

Beberapa teknik analisa protein membutuhkan prosedur isolasi yaitu memisahkan protein dari

makromolekul yang lain atau memisahkan protein dengan sifat tertentu dari protein lain yang tidak

diinginkan dalam analisa. Suatu teknik isolasi dan identifikasi protein harus mempertimbangkan

sifat-sifat fisik, kimiawi dan kelistrikan suatu protein sedemikian rupa sehingga konformasi dan

aktifitasnya tidak berubah. Pada tahap awal isolasi, biasanya digunakan metode yang memiliki daya

pemisah terendah seperti pengendapan dengan amonium sulfat. Pengendapan ini dipengaruhi oleh

berbagai faktor antara lain jumlah dan posisi gugus polar, berat molekul, pH dan temperatur larutan.

Protein hasil sentrifugasi homogenat masih terdiri dari berbagai jenis protein (atau

dinamakan crude protein) ataupun protein hasil pengendapan amonium sulfat (jenis protein lebih

spesifik) selanjutnya dapat dianalisa secara kuantitatif maupun kualitatif. Analisa kuantitatif protein

biasanya menggunakan spektrofotometer dengan panjang gelombang tertentu tergantung pada jenis

protein dan pereaksi yang dipakai. Dengan spektrofotometer dapat diketahui banyaknya atau jumlah

protein dalam suatu sampel (biasanya dinyatakan dalam mg prot

sampel atau dalam satuan ppm tergantung dari satuan yang dipakai pada saat membuat kurva

standar). Analisa kualitatif protein dapat menggunakan kromatografi ataupun elektroforesis

tergantung pada tujuan analisa. Dalam prakteknya, baik analisa kualitatif maupun kuantitatif dapat

dipakai secara terpisah ataupun dipakai secara bersamaan dalam suatu rangkaian analisa.

Presipitasi Protein Menggunakan Amonium Sulfat

Metode ini dapat dipakai untuk memisahkan protein albumin dari protein globulin dalam

plasma darah. Kelarutan protein dalam garam amonium sulfat sangat bervariasi tergantung pada

kekuatan ioniknya dan konsentrasi amonium yang ditambahkan. Proses ini dapat dikelompokkan ke

dalam dua bagian yaitu salting in dan salting out. Pada salting in, garam yang ditambahkan tidak

jenuh atau pada konsentrasi rendah sehingga protein menjadi bermuatan dan menjadi larut dalam

larutan garam. Kelarutan protein akan terus meningkat sejalan dengan peningkatan kon-sentrasi

garam. Bila konsentrasi garam diting-katkan terus, maka justru kelarutan protein menjadi turun.

Bahkan pada konsentrasi garam yang lebih tinggi lagi atau jenuh, protein akan mengendap. Proses

penambahan garam amo-nium sulfat jenuh pada isolasi protein ini dinamakan salting out.

Mekanisme dasar salting out sangat kompleks tetapi dapat diperkirakan bahwa pengendapan

terjadi karena persaingan antara garam dan protein untuk mengikat air. Pada konsentrasi tinggi,

of 52

kekuatan ionik garam semakin kuat sehingga garam lebih dapat mengikat molekul air. Dengan

demikian, tidak cukup banyak air yang terikat pada protein sehingga gaya tarik menarik antar

molekul protein lebih menonjol dibandingkan dengan tarik menarik antara air dan protein. Dalam

kondisi seperti itu protein akan mengendap.

Setiap jenis protein mempunyai ke-larutan yang berbeda pada amonium sulfat jenuh. Karena

itu, salting out biasa dipakai untuk mengisolasi protein tertentu. Dengan metode salting out protein

globulin akan mengendap sebagai pelet, sedangkan protein albumin terlarut dalam garam amonium

sulfat sebagai supernatan. Hal ini disebabkan karena perbedaan kelarutan albumin dan globulin

dalam garam amonium sulfat.

Garam amonium sulfat juga diper-gunakan dalam pemurnian enzim. Garam ini sangat larut dalam

air, relatif murah dan dapat diperoleh dengan tingkat kemurnian tinggi serta tidak menurunkan

aktifitas molekul yang dianalisa.

Selama proses salting out berjalan, sangat penting untuk menjaga konsentrasi garam agar tidak

menurun dalam larutan sehingga tidak terjadi pengendapan yang bersamaan antara protein yang

ingin dimurnikan dengan protein yang tidak diinginkan (protein pencemar). Dengan demikian selalu

dilakukan pengadukan selama penambahan garam dalam prosedur salting out.

Untuk mendapatkan hasil pengendapan yang sempurna dan maksimal, penambahan

amonium sulfat ke dalam larutan protein dilakukan secara bertahap. Pada setiap tahap penambahan

garam, endapan protein selalu dipisahkan dengan sentrifugasi. Endapan yang diperoleh

disuspensikan dengan larutan bufer fosfat pH 8,2.

Dalam keseluruhan proses pemurnian protein, salting out tidak hanya dilakukan sebagai tahap awal

melainkan sering juga dilakukan sebagai tahap akhir. Penambahan garam pada proses akhir

pemurnian bertujuan untuk memperoleh protein yang lebih pekat. Karena itu cara yang terakhir ini

tidak ditujukan untuk memurnikan dan mengidentifikasi protein melainkan ditujukan untuk

memekatkan protein hasil.

METODE KERJA

Bahan : Aquadest

Tris base

Glisin

SDS

Bis-akrilamid

Akrilamid

Gliserol

Alat : Elektroforesis

Mikropipet

Cara Kerja : A. Menyiapkan sampel

1. Sampel protein ditambah dengan Reducing Sample Buffer (RSB) 1:1

dalam tabung Eppendorf.

2. Kemudian sampel dipanaskan pada 100oC selama 5 menit

3. Setelah dingin, bila sampel tidak langsung digunakan, sampel bisa simpan

pada -20oC

B. Menyiapkan separating dan stacking gel

1. Plate pembentuk gel disusun seperti petunjuk.

2. Separating gel 12,5 % dibuat dengan cara :

of 52

Siapkan tabung polipropilen 50 ml

Masukkan 3,125 ml stock acrilamid dalam tabung polipropilen

Masukkan 2,75 ml 1 M Tris pH 8.8, tabung ditutup lalu tabung

digoyang secara perlahan

Masukkan aquabidest 1,505 ml, tabung ditutup lalu tabung digoyang

secara perlahan

Masukkan 75µl SDS 10%, tabung ditutup lalu tabung digoyang secara

perlahan

Masukkan 75 µl APS 10 %, tabung ditutup lalu tabung digoyang secara

perlahan

Masukkan 6,25 µl TEMED, tabung ditutup lalu tabung digoyang secara

perlahan

Segera tuang larutan ke dalam plate pembentuk gel menggunakan

mikropippet 1 ml (dijaga jangan sampai terbentuk gelembung udara)

sampai batas yang terdapat pada plate

Perlahan tambahkan aquadest diatas larutan diatas larutan gel dalam

plate agar permukaan gel tidak bergelombang

3. Biarkan gel memadat selama kurang lebih 30 menit (ditandai dengan

terbentuknya garis transparan diantara batas air dan gel yang terbentuk ).

Setelah itu,air yang menutup separating gel dibuang.

4. Sesudah separating gel memadat, stacking gel 3% disiapkan dengan cara

yang sama yang sama dengan point B.2 diatas, dengan volume larutan

sebagai berikut:

Aquabidest 2,11 ml

30% acrylamide – bis 0,45 ml

1 M Tris pH 6.8 0,38 ml

10% SDS 30 µl

10% APS 30 µl

TEMED 5 µl

C. Memasukkan sampel pada sumur gel

1. Plate yang sudah berisi gel dimasukkan dalam chamber elektroforesis

2. Running buffer dituang sampai bagian atas dan bawah gel terendam

3. Bila terbentuk gelembung udara pada dasar gel atau diantara sumur sampel

harus dihilangkan

4. Marker standar sebanyak 3-5 µl dimasukkan pada salah satu sumur (bisa

disumur yang paling tepi atau pada sumur yang tengah)

5. Sampel sebanyak 10-20 µl (yang kandungan proteinnya minimal 0,1 µg

dan maksimal 20-40 µg) dimasukkan hati-hati ke dalam dasar sumur gel,

menggunakan Hamilton syringe

6. Syringe dibilas sampai 3x dengan menggunakan air atau dengan running

buffer sebelum dipakai untuk memasukkan sampel yang berbeda pada

sumur gel berikutnya

D. Running sampel

1. Untuk memulai running perangkat elektroforesis dihubungkan dengan

of 52

power supply

2. Running dilakuakn pada constant current 20 mA selama kurang lebih 40-

50 menit atau sampai tracking dye mencapai jarak 0,5 cm dari dasar gel

3. Setelah selesai, running buffer dituang dan gel diambil dari plate

E. Pewarnaan Gel

1. Untuk tahap ini diperlukan larutan staining untuk mewarnai protein gel,

pewarnaan yang dipakai adalah Comasie Brilliant Blue atau Silver Stain

tergantung kegunaan. Staining dilakukan selama 30 menit

2. Larutan destaining untuk menghilangkan warna pada gel dan memperjelas

band protein yang terbentuk.

KENDALA PADA ELEKTROPHORESIS

Gel mengeras memerlukan waktu lama

Terlalu sedikit APS atau TEMED. Naikkan komposisi sekitar 50%

Suhu terlalu rendah. Pembuatan gel sebaiknya dilakukan di suhu ruang

APS dan TEMED sudah terlalu lama. Gunakan yang baru

Kulaitas akrilamida yang buruk. Gunakan akrilamida electrophoresis-grade

Ada bahan yang tidak dimasukkan. Pastikan bahan untuk pembuatan gel terdaftar dalam list

sehingga mudah dipantau

Konsentrasi bahan yang tidak sesuai. Periksa konsentrasi supaya sesuai dengan protokol

Gel terlalu lunak

Kualitas akrilamida yang buruk

Pembentukan ikatan silang yang terlalu sedikit. Perhatikan konsentrasi bahan-bahan

penyusun

Tidak terjadi polimerisasi

Suhu terlalu rendah

APS dan TEMED yang terlalu sedikit atau sudah lama

Kualitas akrilamida yang buruk

Ada lekukan di permukaan gel

Katalis yang berlebihan sehingga gel membeku terlalu cepat. Turunkan konsentrasi APS dan

TEMED masing-masing sekitar 25%

Inhibisi gel karena polimerisasi memerlukan waktu lebih dari 1 jam. Naikkan APS dan

TEMED sekitar 50%

Gel mudah patah

Terlalu banyak ikatan silang. Periksa konsentrasi gel

Gel berwarna putih

Terlalu banyak bis-akrilamida. Periksa konsentrasi bis

Kebocoran gel saat pembuatan

Terdapat keretakan atau patahan kecil pada kaca plate. Periksa kaca plate dan apabila

keretakan tidak terlalu parah maka bisa ditambal menggunakan parafilm

Pemasangan kaca plate yang tidak sesuai. Pastika bagian bawah telah sejajar dan rata

sehingga tidak ada larutan yang bisa keluar

Gel retak saat polimerisasi

Suhu yang terlalu tinggi. Pastikan reagen tidak terlalu panas

Sampel tidak jatuh sampai dasar sumur

of 52

Konsentrasi gliserol yang kurang pada buffer sampel

Sisir yang dilepas terlalu cepat saat gel dalam proses polimerisasi sehingga terjadi webbing

pada sumur. Pastikan gel terpolimerisasi sempurna sekitar 30 menit sebelum digunakan

Larutan sampel berwarna kuning

Larutan terlalu asam. Tambahkan sedikit NaOH supaya larutan berwarna biru

Bromofenol biru yang terlalu sedikit pada buffer sampel

Gel lepas dari kaca selama elektroforesis

Kaca yang kurang bersih. Setelah dibersihkan dengan akuades, pastikan tidak ada sisa-sia

tetesan air di dalam cetakan

Dasar sumur tampak melengkung ke bawah saat elektroforesis

Umum terjadi apabila tedapat molekul dengan massa molekul besar dan bermuatan terjebak

di sumur. Biasanya ditemukan pada sampel yang mengandung asam nukleat dengan jumlah

banyak. Periksa kandungan asam nukleat pada sampel dan bersihkan sampai ke jumlah yang

sewajarnya

Sumur yang buruk

Sumur dapat rusak atau terdistorsi apabila sisir tidak dilepas dengan hati-hati. Lepaskan sisir

dengan gerakan vertikal

Apabila sisir sulit dilepaskan dari gel penahan, turunkan konsentrasi gel penahan

Webbing di sumur dapat disebabkan sisir yang terlalu longgar atau gel mengeras terlalu

cepat. Pastikan sisir sesuai dengan cetakan kaca yang tersedia dan periksa konsentrasi APS

dan TEMED

Gel retak saat elektroforesis

Kondisi elektroforesis yang terlalu hangat. Hal ini umum terjadi pada gel dengan

konsentrasi tinggi

Beberapa pita tidak bergerak turun

Hal ini dapat disebabkan oleh keberadaan gelembung udara pada jalur pergerakan pita.

Pastikan tidak ada gelembung saat menuang gel

Bagian atas gel yang terlalu lengket

Terjadi penetrasi etanol yang digunakan untuk meratakan gel pemisah ke dalam gel. Pada

saat meratakan gel, jangan sampai etanol ikut tercampur. Jangan membiarkan etanol

tertinggal terlalu lama pada gel yang terlah terpolimerisasi atau bisa etanol bisa digantikan

dengan air

Resolusi pita protein yang tidak sempurna

Waktu elektroforesis yang tidak cukup. Tambahkan waktu running

Ukuran pori-pori gel pemisah tidak sesuai dengan ukuran protein yang akan dianalisa. Atur

konsentrasi gel pemisah

Pita protein memiliki ketebalan yang tidak seragam

Sampel dimuat dengan tidak seragam. Pastikan dasar sumur lurus semua dan horizontal

of 52

Gambar Elektroforesis Mini-Protean 3

of 52

Proses Pembuatan Gel

Proses Memasukkan Sampel

of 52

Proses Running

of 52

Tanda Tangan Dosen/Asisten :

…………………………………………………

………………………………….

Laporan Sementara :

of 52

Materi II

Haemacytometer

Dasar Teori

Haemocytometer adalah alat awalnya dirancang untuk penghitungan sel darah . Sekarang

juga digunakan untuk menghitung jenis sel serta partikel mikroskopis lainnya. Hemositometer ini

ditemukan oleh Louis-Charles Malassez dan terdiri dari tebal kaca slide mikroskop dengan lekukan

persegi panjang yang menciptakan sebuah kamar. ruang ini diukir dengan laser-terukir grid garis

tegak lurus. Perangkat ini dibuat dengan hati-hati sehingga daerah yang dibatasi oleh garis

diketahui, dan kedalaman ruang ini juga diketahui. Oleh karena itu mungkin untuk menghitung

jumlah sel atau partikel dalam volume tertentu cairan, dan dengan demikian menghitung

konsentrasi sel dalam cairan secara keseluruhan.(Wiki, 2011).

PEMERIKSAAN HITUNG JUMLAH LEUKOSIT / ERITROSIT

Menghitung jumlah sel-sel leukosit perliter darah (System International Units = SI unit) atau per

satu mmk darah. Nilai normalnya 4000 - 11000 / mmk.Untuk penerapan hitung leukosit ada dua

metode, manual dan elektronik. Pada umumnya metode elektronik belum digunakan secara umum.

Peralatan dan Bahan :

1. Haemocytometer

bilik hitung

pipet leukosit

pipet eritrosit (untuk menghitung eritrosit)

Neubauer Improve : luas seluruh bilik 3 x 3 mm2. tinggi/dalam 0,1 mm. di dalam bilik terdapat :

kotak besar : 1 x 1 mm2

kotak sedang ada 2 macam :

di tengah : 1/5 x 1/5 mm2

di empat sudut : 1/4 x 1/4 mm2

kotak kecil : 1/20 x 1/20 mm2

2. Kaca penutup

3. Mikroskop

Bahan :

1. Spesimen

Darah vena atau darah kapiler

Cara Kerja

Mengisi pipet Leukosit

Isaplah darah kapiler (kapiler, EDTA, atau oxalat) sampai pada garis tanda “0,5″ tepat.

Hapus kelebihan darah yang melekat pada ujung pipet

Masukkan ujung pipet kedalam larutan TURK sambil mempertahankan darah tetap pada garis

tanda.

Pipet dipegang dengan sudut 45 derajat dan larutan TURK dihisap perlahan-lahan sampai

garis tanda “11″ tepat. Hati-hati jangan sampai terjadi gelembung udara.

Angkatlah pipet dari cairan; tutup ujung pipet dengan ujung jari kemudian lepaskan karet

penghisap.

http://translate.googleusercontent.com/translate_c?hl=id&sl=en&u=http://en.wikipedia.org/wiki/Microscope_slide&prev=/search%3Fq%3Dhaemocytometer%26hl%3Did%26biw%3D1366%26bih%3D559%26prmd%3Divnsb&rurl=translate.google.co.id&usg=ALkJrhhHKRfvhb3KTVJqSuZ6dabVMTucSw

of 52

Kocoklah pipet tadi selama 15-30 detik. jika tidak segera akan dihitung letakkan pipet dalam

posisi horizontal.

Mengisi kamar hitung

Letakkan kamar hitung yang telah benar-benar bersih dengan kaca penutup yang terpasang

mendatar di atas meja.

Kocoklah pipet yang berisi tadi selama 3 menit terus menerus (jangan samapai ada cairan

yang terbuang dari pipet saat mengocok)

Buang semua cairan yang ada pada batang kapiler pipet (3 – 4 tetes) dan kemudian sentuhkan

ujung pipet (sudut 30 derajat) dengan menyinggung pinggir kaca penutup pada kamar hitung.

Biarkan kamar hitung tersebut terisi cairan perlahan-lahan dengan gaya kapilaritasnya sendiri.

Biarkan kamar hitung yang sudah terisi tersebut selama 2-3 menit agar leukkosit-leukosit

mengendap. jika tidak akan dihitung segera, simpan kamar hitung tersebut dalam cawan peti

tertutup yang berisi kapas basah.

Cara menghitung sel

Pakailah lensa objektif kecil (pembesaran 10x). turunkan lensa kondensor atau kecilkan

diafragma mikroskop meja mikroskop harus datar.

Kamar hitung dengan bidang bergaris diletakkan di bawah objektif dan fokus mikroskop

diarahkan pada garis-garis bagi tersebut. Dengan sendirinya leukosit-leukosit akan jelas

terlihat.

Hitunglah semua leukosit yang terdapat dalam keempat “bidang besar” pada sudut-sudut

“seluruh permukaan yang dibagi”.

Mulailah menghitung dari sudut kiri atas, terus ke kanan, kemudian turun ke bawah dan dari

kanan ke kiri dan seterusnya.

Kadang ada sel yang menyinggung garis suatu bidang, sel-sel yang menyinggung garis batas

sebelah kiri atau garis atas haruslah di hitung.

Sebaliknya sel-sel yang menyinggung garis sebelah kanan dan bawah tidak boleh dihitung.

Perhitungan

Pengenceran yang dilakukan pada pipet adalah 20 kali.

Jumlah semua sel yang dihitung dalam keempat bidang itu dibagi 4 menunjukkan jumlah

leukosit dalam 0,1 µl. Kalikan angka tersebut dengan 10 (untuk tinggi) dan 20 (untuk

pengenceran) untuk mendapatkan jumlah leukosit dalam 1 ul darah. Singkatnya : Jumlah sel

yang terhitung dikali 50 = jumlah leukosit per µl darah.

Catatan :

Pengenceran yang lazim digunakan untuk menghitung leukosit adalah 20 kali, tetapi menurut

keadaan (leukositosis tinggi atau leukopenia) pengenceran dapat diubah sesuai keadaan tersebut,

lebih tinggi pada leukositosis dan lebih rendah pada leukopenia. Sedian darah dengan oxalat

yang tidak segera dipakai ada kemungkinan terjadi penggumpalan leukosit. Jika darah tepi

banyak mengandung sel darah merah berinti maka sel tersebut akan diperhitungkan seperti

leukosit, untuk koreksi dapat dilakukan pemeriksaan sedian hapus yang dipakai untuk hitung

jenis leukosit, persentase sel darah merah berinti di catat. misalnya ; didapatkan 10.000 leukosit

per ul darah dan dari hitung jenis didapatkan tiap 100 leukosit ada 25 sel darah merah berinti,

maka jumlah leukosit yang sebenarnya adalah :

of 52

Gambar kamar hitung Luasan untuk menghitung

jumlah sel Leukosit

Ukuran kamar hitung

http://3.bp.blogspot.com/__iY2vaygxLo/TFtGW5hyi_I/AAAAAAAABGg/J6wBUzfIe50/s1600/bilik+hitung.jpg

of 52


…………………………………………………

………………………………….

Laporan Sementara :

of 52

Materi 3

Keselamatan Kerja di Laboratorium

Upaya Pencegahan dan Tindakan Terhadap Kecelakaan

1. Kebakaran

Bahan kimia atau reagensia yang mudah terbakar antara lain: benzena, alkohol, eter, aseton.

Tindakan pencegahan agar tidak terjadi kebakaran:

Tempat penyimpanan bahan kimia terpisah dari laboratorium

Ruangan dirancang agar ventilasi baik, bebas dari sumber percikan listrik, asap rokok,

bersuhu dingin dan kering (tidak lembab)

Perlu diperhatikan bahwa bahan-bahan ini dapat berinteraksi dan bereaksi sehingga

mampu menimbulkan ledakan atau kebakaran, sehingga bahan-bahan ini harus isimpan

dengan urutan yang terpisah. Misalnya: asam sulfat dengan klorat, perklorat,

permanganat, air, asam asetat dengan asam kromat, asam nitrat, perklorat, peroksida,

Na-nitrat dengan amonium nitrat, kalium permanganat dengan etilen, asam sulfat,

gliserin.

Tindakan yang dilakukan apabila terjadi kebakaran:

Segera memindahkan bahan kimia yang menyebabkan kebakaran dan menjauhkkan

bahan kimia lain yang mudah terbakar

Untuk memadamkan api digunakan alat pemadam kebakaran atau pasir. Penyebab

kebakaran dari bahan kimia CCl4 dan NaHCO3 dapat dipadamkan dengan alat pemadam

kebakaran. Jika memungkinkan tidak menggunakan air sebagai alat pemadam, kecuali

bila kobaran api sudah meluas.

Korban kebakaran harus segera diselamatkan melalui pertolongan darurat.

Jika seseorang pekerja laboratorium terbakar, pakaian segera di lepas, penderita

dilarang berlari karena mengundang angin yang kan memperbesar nyala api. Luka bakar

diambil tindakan pertama dengan mendinginkan dengan air dingin, kebersihan luka

dijaga, dan menutup dengan kain bersih. Bila kuka bakar melepuh jangan dgaruk dan

segera dibawa ke rumah sakit.

Jika api telah padam, pintu, jendela dibuka untuk sirkulasi udara.

Bahan-bahan yang rusak dibersihkan dan dilakukan observasi terhadap bagian-bagian

yang rusak.

Dalam keadaan luka bakar ringan, daerah luka sebaiknya didinginkan dengan air dingin,

jaga kebersihan dan luka korban ditutup dengan kain yang bersih. Bila luka bakar berat,

penderita sebaiknya berbaring dan ditenangkan. Setelah baju diambil dengan gunting,

tindakan darurat selanjutnya adalah menghubungi dokter atau membawa ke rumah

sakit.

2. Kaca Pecah

Tindakan yang harus dilakukan apabila terkena kaca:

Pecahan kaca di dalam luka harus diambil

Setelah itu luka diberi desinfektan, agen penekan dan hemostatis serta diberi obat yang

dapat menghentikan hemorhagi.

Luka yang besar dan diikuti dengan pendarahan harus di bawh pengobatan dokter.

Jika serpihan kaca masuk ke dalam mata, jangan diusap tetapi dicuci dengan air. Dan

jika diperlukan perlu ke dokter atau rumah sakit.

of 52

3. Bahan Kimia Tumpah Pada Kulit

Bahan kimia yang dapat merusak kulit adalah asam dan basa keras. Dalam melaksanakan

tugas di laboratorium disarankan, sebagai berikut:

Pada saat menuang bahan kimia dari botol harus hati-hati jangan sampai menetes ke

meja dan tertinggal di meja.

Pada saat menggunakan bahan kima, jangan meletakkan bahan kima tersebut dekat

dengan mata, dan jangan mengocok karena dapat tumpah

Melarutkan asam sulfat dengan air harus sedikit dmei sedikit agar gelas tidak pecah.

Pipet atau buret harus digunakan untuk pengambilan asam atau basa yang pekat.

Tindakan terhadap bhan kimia yang mengenai bagian kulit dapat dicuci dengan air

yang cukup. Demikian juga bila terpercik dengan bahn kimia, tidak boleh

menggosok (mengucek), tetapi harus dicuci dengan air yang mengalir. Selanjutnya

dibasahi dengan larutan penetral berupa asam atau basa yang lemah.

Apabila bahan kimia mengenai mata, maka dicuci dengan air secukupnya, tanpa

diberikan penetral.bila rasa sakit yang berlanjut maka diperlukan pertolongan

dokter. Khusus gas amonia perlu perhatian serius karena dapat menyebabkan

kebutaan.

4. Menghirup Gas Berbahaya

Pada saat melaksnakan pencampuran bahan-bahan kimia berikut ini akan

menimbulkan gas beracun. Karena itu dikerjakan dengan hati-hati. Misalnya: senyawa nitrat

dengan asam sulfat menimbulkan gas nitrogen oksida, senyawa sulfida dengan asam

menimbulkan gas asam sianida. Gas beracun yang berasal dari bahan kimia masuk melalui

pernapasan, korban merasa tercekiki, karena menyumbat saluran pernapasan. Upaya

pencegahan dan pertolongan pertama yang dapat diberikan:

Jangan sekali-kali menghirup gas beracun

Melengkapi laboratorium dengan lemari asam (fume hood), pintu jendela yang dapt

dirancang denganventilasi yang baik sehingga membatasi pemaparan gas beracun.

Upaya penyelamatan, korban harus segera dipindahkan ke tempat yang berudara

terbua dan segar serta dijauhkan dari bau gas beracun. Ditidurkan telentang dan

diberi selimut.

5. Menelan Bahan Kimia yang Beracun

Upaya pencegahan dan pertolongan pertama yang dilakukan:

Pada saat memipet bahan kimia harus dilakukan dengan hati-hati.

Bila terlanjur masuk ke dalam mulut, harus segera diludahkan.

Bila sudah tertelan maka harus diupayakan agar korban muntah sehingga bahan

kimia beracun keluar dari muut dengan menggunakan obat muntah (emetics),

misalnya larutan garam 20%

Bila berhasil (sembuh), perawatan lebih lanjut diberikan obat penawar racun

(antidotes) seperti: air susu.

6. Tersengat Aliran Listrik

Kejadian tersengat listrik dapat dicegah dengan cara:

Menggunakan sepatu sebagai alas kaki

Jangan menyentuh sumber listrik dalam keadaan tangan basah ata pada saat yang

bersamaan memegang keran air distilasi karena dapat menimbulkan shock listrik

yang berujung pada kematian.

of 52

Korban yang tersengat listrik sampai (shock) atau pingsan, sumber listrik harus dicabut

terlebih dahulu dan baru penderita ditenangkan. Apabila sampai menderita luka bakar,

perlu diberikan tindakan darurat dan kmudian dibawa ke dokter atau rumah sakit.

7. Ledakan

Upaya menurunkan bahaya ledakan pada pekerja laboratorium dengan membuat dinding

besi, beton atau kaca. Sumber ledakan biasanya berasal dari:

Pemanasan bahan kimia yang mudah terbakar

Proses destilasi bahan kimia

Senyawa keras (caustics), seperti: metal Na, KclO,H2O2, yang dicampur dengan

pelarut yang mudah menguap seperti: eter, gas metana, asetilin.

Bahan kimia yang inkompatibel disimpan berdekatan.

Jika ledakan luka robek dan terbakar sebaiknya diberikan tindakan darurat dan korban

sebaiknya dibawa ke dokter atau ke rumah sakit setelah distabilkan.

Saran Dalam Penggunaan Alat Agar Aman:

Dalam penggunaan alat disarankan untuk melaksanakan hal-hal berikut

Tangan harus dicucui bersih dan dijaga kering.

Jangan mengambil cawan untuk ditimbang dengan menggunakan tangan, namun harus

dengan forceps.

Sering terjadi tutup desikator lepas saat diangkat, oleh karena itu memegang desikator

harus penuh hati-hati. Tutup desikator tidak boleh diletakkan terbuka di atas meja.

Plate (bagian bibir desikator) harus bersih dan terbebas dari bahan sampel yang

dikeringkan. Sampel yang dikeringkan dalam desikator jangan terlalu penuh.

Timbangan analitis harus dalam keadaan kering dan pintu tertutup. Dihindari bahan

yang lembab, kotor dan berlemak disekitar tempat menimbang (balance pan). Jangan

memegang batu timbangan dan sampel yang ditimbang dengan tangan.

Penggunaan oven harus sesuai instruktur kerja atau yang telah didemonstrasikan oleh

teknisi atau instruktur.

Saran Sebelum Melaksanakan Analisis

Sebelum melaksanakan analisi disarankan, sebagai berikut:

Belajar dari teknisi atau instruktur tentang prosedur analisis yang dilaksanakan.

Dilarang memulai analisi sebelum mengerti prosedur analisi, setelah mengerti baru

menyiapkan bahan dan alat yang diperlukan.

Peraturan penggunaan laboratorium harus memakai sepatu tertutup dan jas laboratorium.

Setelah selesai menimbang, alat harus dibersihkan.

Hati-hati dlaam menuang bahan kimia dari botol. Jangan meninggalkan tetesan di luar botol

dan mengenai label.

Perhatikan apakah pipet yang digunakan itu loop pipet (pipet yang harus di tiup)

Bila memanaskan atau memasak bahan dalam laeutan harus dimulai dengan api yang kecil

terlebih dahulu.

Jangan melaksanakaan pencampuran asam pekat dengan basa pekat.

Bila melarutkan asam atau basa pekat dengan air, maka asam atau basa pakai itu dituangkan

ke dalam air, jangan sebaliknya (Berbahaya!)

Jangan melarutkan KOH dan NaOH ke dalam air panas

Semua bahan kimia yang mempunyai titer tertentuharus distandarisasi terlebih dahulu

sebelum digunakan.

of 52

Perlu diperhatikan dalam pelaksanaan analisis, ada istilah:

1. Air: adalah aquadestilata, kecuali secara spesifik disebut air kran

2. Alkohol: adalah etil alkohol 95%. Bila ingin membuat alkohol yang lebih encer,

misalnya a% dapat dibuat dengan mengencerkan a ml alkohol 95% tersebut dengan air

sehingga menjadi 95ml

3. Etil eter: etil eter yang bebas peroksida

4. Tanda (1+1), (1+2) dan seterusnya: angka pertama adalah volume kimia yang digunakan

dan angka kedua adalah volume air.

Bila menggunakan tanur untuk pengabuan sampel harus dimulai dari suhu rendah secara

bertahap naik ke suhu tinggi yang diinginkan.

Gelas piala, cawan dan alat dari gelas yang masih panas jangan dimasukkan langsung ke

dalam air tetapidiletakkan di atas kayu yang disediakan. Jangan diletakkan dia atas meja

yang diat atau di atas segel porselin.

Alat-alat yang dipecahkan harus segera diganti, bila praktikan yang melakukan maka harus

segera mengganti

Setelah selesai analisi, alat yang digunakan dicuci sampai bersihdan bila perlu beberapa alat

dikeringkan, kemudian disimpan pada tempat yang disediakan

Sebelum meninggalkan laboratorium agar diperiksa sekali lagi listrik, air, gas dan botol

bahan kimia sehingga terjaga kondisi laboratorium yang aman.

of 52


…………………………………………………

………………………………….

Laporan Sementara :

of 52

Manual Praktikum

MK Teknik Analisis Laboratorium (Nutrisi dan Makanan Ternak)


Oleh :

Laboratorium Nutrisi dan Makanan Ternak

LABORATORIUM NUTRISI DAN MAKANAN TERNAK

FAKULTAS PETERNAKAN

UNIVERSITAS BRAWIJAYA

MALANG

2018

Manual Praktikum

of 52

MK Teknik Analisis Laboratorium (Nutrisi dan Makanan Ternak)


A. Materi Laboratorium

Materi I

Analisis Van Soest

Dasar Teori

Sistem analisa Van Soest menggolongkan zat pakan menjadi isi sel (cell content) dan

dinding sel (cell wall). NDF mewakili kandungan dinding sel yang terdiri dari lignin, selulosa,

hemiselulosa, dan protein yang berikatan dengan dinding sel. Bagian yang tidak terdapat sebagai

residu dikenal sebagai Detergent Soluble (NDS) yang mewakili isi sel dan mengandung lipid, gula,

asam organik, non protein nitrogen, peptin, protein terlarut dan bahan terlarut dalam air. Serat kasar

terutama mengandung selulosa dan hanya sebagian lignin, sehingga nilai ADF lebih kurang 30

persen lebih tinggi dari serat kasar pada bahan yang sama.

Prosedur kerja analisis kadar ADF, NDF, selulosa, hemiselulosa dan lignin menurut Van

Soest, (1976) :

Penentuan Kadar Acid Detergent Fiber (ADF)

1. Timbang sampel 0,3 gram (a gram) kemudian masukkan kedalam tabung reaksi 50 ml

2. Tambahkan 40 ml laritan ADF kemudian tutup rapat tabung reaksi tersebut

3. Refluks dalam air mendidih selama 1 jam

4. Saring dengan sintered glass yang telah diketahui beratnya (b gram) sambil diisap dengan

pompa vacum

5. Cuci dengan lebih kurang 100 ml air mendidih sampai busa hilang dan 50 ml alkohol

6. Ovenkan pada suhu 100oC selama 8 jam atau dibiarkan bermalam

7. Dinginkan dalam eksikator lebih kurang ½ jam kemudian timbang (c gram) Perhitungan:

Penentuan Neutral Detergen Fiber (NDF)

1. Timbang sampel 0,2 gram (a gram)

2. Masukkan kedalam tabung reaksi 50 ml

3. Tambahkan 25 ml larutan NDS, kemudian tutup rapat tabung reaksi tersebut

4. Refluks dalam air mendidih selama 1 jam

5. Saring dengan sintered glass yang telah diketahui beratnya (b gram) sambil diisap dengan

pompa vacum

6. Cuci dengan lebih kurang 100 ml air mendidih hingga busa hilang

7. Cuci dengan lebih kurang 50 ml alkohol

8. Ovenkan pada suhu 100oC selama 8 jam atau dibiarkan bermalam

9. Dinginkan dalam eksikator lebih kurang ½ jam kemudian timbang (c gram) Perhitungan:

Penentuan Selulosa dan Lignin

of 52

1. Sintered glass yang berisi ADF diletakkan diatas petridisk

2. Tambah 20 ml H2SO4 72%

3. Sekali-kali diaduk untuk memastikan bahwa serat terbasahi dengan H2SO4 72% tersebut

4. Biarkan selama 3 jam

5. Hisap dengan pompa vacum sambil dibilas dengan air panas secukupnya

6. Ovenkan selama 8 jam pada suhu100oC atau dibiarkan bermalam

7. Masukkan ke dalam deksikator kemudian timbang (d gram)

8. Masukkan kedalam tanur listrik atau panaskan hingga 500oC selama 2 jam, biarkan agak

dingin kemudian masukkan kedalam deksikator selama ½jam

9. Timbang (e gram) Perhitungan:

of 52


…………………………………………………

………………………………….

Laporan Sementara :

of 52

Materi II

Pengukuran Kecernaan In vitro (Tilley dan Terry, 1963)

Dasar Teori

Alat :

- Labu ukur 3500 ml

- Penangas yang dilengkapi dengan stirer

- Inkubator

- Karet penutup

- Rak

- Centrifuge 2500 rpm

- Kertas saring

- Oven 105 0C

- Eksikator

- Tanur

Bahan kimia :

MgCl2, CaCl2, aquades, cairan rumen, larutan buffer, gas CO2, air es, larutan HCL, pepsin.

Kecernaan secara in vtro dengan menggunakan cairan rumen sapi sebagai media percobaan untuk

mengukur kecernaan BK dan BO (Tilley dan Terry, 1963), yang dimodifikasi oleh Van der Meer

(1980).

Cara Kerja :

1. Kedalam Labu ukur 3500 ml dimasukan :

- 520 ml larutan a

- 5,2 g MgCl2 (larutan b)

- 5,2 g CaCl2 (larutan c)

Kemudian ditambahkan aquades sampai tepat 2069,6 ml, ambil dikocok. Diukur pH nya (Ph

= 6,9) pada temperatur 38-39 0C.

2. Mengambil cairan rumen yang telah disaring kemudian dimasukkan ke dalam larutan buffer

dengan perbandingan cairan rumen : larutan buffer 1 : 4. Selanjutnya dialiri gas CO2 dan

dipanaskan di atas penangas yang dilengkapi dengan stirer pada suhu 39 0C

selama 20

menit.

3. Menimbang 0,5 gram sampel (BK 88-92 %), lalu dimasukkan ke dalam tabung fermentor

yang diberi nomor (untuk setiap sampel dilakukan 2 kali ulangan), dan dimasukkan ke

dalam inkubator pada suhu 39 0C

(sekitar 1 hari sebelum pelaksanaan). Ukuran sampel 0,5

– 1,0 mm.

4. Kedalam tabung fermentor yang telah ditambahkan sampel 0,5 gram ditambahkan 50 ml

campuran larutan buffer dan cairan rumen dengan perbandingan 4 : 1. Sebelum tabung

ditutup dengan karet, dialiri lebih dahulu dengan CO2 selama kurang lebih 15 detik agar

kondisi an-aerob. Tabung-tabung tersebut dimasukkan rak dan dimasukkan ke dalam

inkubator dengan suhu 39 0C.

5. Setelah 1 jam inkubasi, kocok pelan-pelan setiap tabung dengan tangan agar seluruh

partikel sampel menjadi basah. Pengocokkan selanjutnya dilakukan setiap 8 jam.

of 52

6. Dibuat 4 tabung yang terdiri dari 2 tabung untuk balnko dan 2 tabung untuk standar berupa

rumput gajah yang telah diketahui kecernaan secara in vivo.

7. Setelah inkubasi berlangsung selama 48 jam tabung-tabung diambil dari inkubator dan

aktifitas mikroba dihentikan dengan cara direndam dalam air es.

8. Dilakukan centrifuge pada 2500 rpm selama 15 menit.

9. Residu sampel yang hasil centrifuge pada 2500 rpm selama 15 menit akan ditambah dengan

50 ml larutan HCL – Pepsin, dimasukkan kembali ke dalam inkubator pada suhu 39 0C,

selanjutnya diinkubasikan selama 48 jam, tanpa penutup bunsen valve dan dikocok 2 kali

sehari.

10. Kemudian didigeti selama 48 jam, tabung diambil dan dipindahkan isi tabung fermentor ke

dalam kertas saring yang telah ditimbang.

11. Kertas saring dan residu dikeringkan dalam oven 105 0C satu malam, kemudian didinginkan

dalam eksikator dan ditimbang untuk mengetahui kehilangan bahan kering.

12. Bahan organik diperoleh dengan mengabukan kertas saring dan residu dalam tanur pada

suhu 550 0C selama 4 jam atau sampai sampel berwarna putih, didinginkan di dalam

eksikator dan ditimbang.

Dihitung presentase KcBK dan KcBO dikalikan kecernaan sampel standar sebagai faktor

korelasi. Berikut rumus kecernaan bahan kering (KcBK) dan kecernaan bahan organik (KcBO)

yaitu :

1. Kecernaan Bahan Kering (KcBK) (%)

=BK sampel − (BK residu − BK blangko)

BK sampelx 100 % x

KcBK standar in − vivo

KcBK standar in − vitro

2. Kecernaan Bahan Organik (KcBO) (%)

=BO sampel − (BO residu − BO blangko)

BO sampelx 100 % x

KcBO standar in − vivo

KcBO standar in − vitro

of 52


…………………………………………………

………………………………….

Laporan Sementara :

of 52

Materi III

Pengukuran produksi gas (Makkar et al. 1995)

Dasar Teori

Alat-alat :

1. Syringe (diameter 32 mm, panjang 200 mm, volume 100 ml)

2. Waterbath

3. Termometer

4. Erlenmayer 2000 ml

5. Pipet piston

6. Timbangan analitik

7. Beaker glass

Bahan kimia :

1. NaHCO3

2. NH4HCO3

3. Na2HPO4

4. KH2HPO4

5. MgSO4 7H2O

6. NaCL

7. CaCL2 2 H2O

8. MNCL2 4 H2O

9. CoCl2 6 H2O

10. FeCL3 6 H2O

11. Resazurin

12. Na2S 9H2O

13. NaOH 1 M

Prosedur :

Sampel digiling dengan ukuran 1 mm dan ditimbang sebnayak 0.5 gram BK dimasukkan

dalam dasar syiringe (dengan ukuran diameter 32 mm, panjang 200 mm, volume 100 ml).

Selanjutnya sebelum piston dimasukka ke dalam syiringe, terlebih dahulu diolesi dengan dengan

vaselin. Ujung dari syringe dihubungkan dengan selang karet silicon panjangnnya sekitar 5 cm dan

dapat ditutup dengan klep plastik. Cairan rumen yang digunakan dalam pengukuran gas tersebut

berasal dari 1 ekor sapi PFH jantan yang berfistula, yang telah disaring terlabuh dahulu. Cairan

rumen sebelum dimasukkan dalam sringe dicampur terlebih dahulu dengan larutan buffer dangan

perbandingan 1:3.41 (v/v).

Larutan buffer (tipa 1 liter) terdiri dari : NaHCO3 35 gram + NH4HCO3 4 gram, dilarutkan

dalam 1 liter aquadest. Larutan makro mineral (tiap 1 liter) terdiri dari : Na2HPO4 5,7 gram +

KH2HPO4 6,2 gram + MgSO4 7 H2O 0,6 gram + NaCL 2,22 gram dilarutkan dalam 1 liter aquadest.

Larutan mikro mineral (tiap 100 ml) terdiri dari CaCL2 2 H2O 13,2 gram+MNCL2 4 H2O 10

gram+CoCl2 6 H2O +FeCL3 6 H2O 0,8 gram, dilarutkan dalam aquadest sampai volumenya 100 ml.

Larutan resazurin : 0,1 gram resazurin dilarutkan dengan aqudest sampai volumenya 100 ml.

Redukter solvent (dibuat sesaat sebelum mengambil cairan rumen) terdiri dari Na2S 9H2O 0,58

gram + NaOH 1 M 3,7 ml.

Larutan buffer campuran terdiri dari :

of 52


…………………………………………………

………………………………….

- Aquadest : 1095 ml

- Buffer : 730 ml

- Makro mineral : 365 ml

- Mikro mineral : 0,23 ml

- Resazurin : 1 ml

- Reduktor : 60 ml

Larutan buffer campuran ini dimasukkan dalam labu, dicampur dan dipanas-kan pada suhu

390C dalam waterbath. Gas CO2 dialirkan, sementara itu reduktor ditambahkan. Larutan yang

berwarna kebiru-biruan akan berubah menjadi agak merah kemudian menjadi tidak berwarna.

Cairan rumen dari cairan feses sebanyak 660 ml masing-masing dimasukkan kedalam labu, dan

CO2 tetap dialirkan dalam labu. Larutan buffer campuran dengan cairan rumen tersebut dimasukkan

dalam syringe dengan menggunakan pipet otomatis sebanyak 50 ml. Gelembung-gelembung udara

yang ada dalam syringe dikeluarkan secara perlahan melalui selang silikon selanjutnya klip plastik

pada selang silikon ditutup dan dibaca volumenya (V0), kemudian syringe ditempatkan dalam

waterbath pada suhu 390 C. Blanko dibuat dengan cara seperti diatas hanya tanpa penambahan

sampel. Pada pengukuran volume produksi gas dicatat setelah inkubasi 2, 4, 8, 12, 24, dan 48 jam.

Produksi gas dihitung dengan menggunakan rumus sebagai berikut :

Vblanko = Vblanko t – VO

Produksi gas = (V1-V0-Vblanko)

of 52


…………………………………………………

………………………………….

Laporan Sementara :

of 52

Laporan Sementara :

Materi IV

of 52


…………………………………………………

………………………………….

Pengukuran NH3

Dasar Teori

Prinsip:

Amonia (NH3) akan menguap apabila bereaksi dengan Natrium Karbonat (NaCO3),

kemudian ditangkap oleh asam borat (H3BO4) berindikator Metil Merah dan Brom Kresol,

kemudian dilakukan titrasi dengan H2SO4 0,005 N sampai warna semula, banyaknya H2SO4 untuk

merubah warna merupakan indikasi banyaknya kandungan NH3.

Alat-alat:

Petridish volume Conway, pipet ukur, beaker glass, buret dan PH meter.

Bahan:

Sampel cairan rumen, vaselin, H2SO4 pekat, larutan H3BO3 4% berindikator metal merah

dan brom kresol hijau, Na2CO3 jenuh dan H2SO4 0,005 N.

Prosedur Kerja:

1. 5 ml cairan rumen dari syringe setelah pembacaan produksi gas pada inkubasi jam 24 jam ke

botol yang telah diisi 5 tetes H2SO4 pekat guna menghenti kan proses fermentasi mikroba

serta mengikat N agar tidak menguap.

2. Sebelumnya cawan Conway dan tutupnya telah diolesi vaselin

3. kemudian sebanyak 1 ml cairan supernatan dimasukkan kedalam salah satu ujung alur

cawan, sedangkan pada ujung yang lain dimasukkan 1 ml NaCO3 jenuh.

4. Pada bagian tengah cawan dimasukkan 1 ml larutan H3BO3 berindikator metil merah dan

Brom Kresol hijau ber PH 5,2.

5. Cawan conway ditutup dengan cepat dan rapat lalu cawan dimiringkan dengan harapan

larutan Na2CO3 jenuh dapat bercampur dengan supernatan.

6. Setelah disimpan selama 24 jam dalam suhu kamar, dilakukan titrasi pada larutan H3BO3

dengan menggunakan larutan H2SO4 0,005 N hingga warna berubah dari biru menjadi

merah jingga (seperti warna semula).

Kadar NH3 mg/100 ml cairan rumen dihitung dengan rumus:

Konsentrasi NH3 = ml titrasi H2SO4 x n H2SO4 x BM NH3

(mg/ml cairan rumen) ml sampel

ml H2SO4 = Titrasi H2SO4

n H2SO4 = Normalitas H2SO4 (0,005 N)

BM NH3 = berat molekul NH3 (17)

of 52


…………………………………………………

………………………………….

Laporan Sementara :

of 52

Laporan Sementara :

B.Materi Lapang

of 52


…………………………………………………

………………………………….

Materi I

Pengambilan Sampel Pakan, Feses dan Urin

Dasar Teori

Pada periode pengumpulan data, pakan yang diberikan pada tiap ekor ternak dan yang

tersisa, urine dan juga feses yang dikeluarkannya ditimbang setiap hari dan sampel masing-masing

diambil. Kemudian sampel yang terkumpul dianalisa kandungan zat makanannya di laboratorium.

Alat yang digunakan :

1. Timbangan analitik

2. Kantong plastik

3. Label

4. Alat semprot

5. Penyaring

6. Gelas ukur

Prosedur Pengambilan Sampel :

1. Pengambilan sampel bahan pakan :

Sampel hijauan 200 g, diambil setiap kali pemberian pakan dimasukkan dalam kantong

plastik dan diberi label

Sampel konsentrat 50 g, diambil satu kali karena kandungan nutrisinya konstan, masukkan

dalam kantong plastik dan diberi label

2. Pengambilan sampel sisa pakan

Diambil pada pagi hari

Ditimbang seluruh sisa pakan dan diambil sampel sisa pakan sebanyak 10 % dari bobot

sisa pakan, dimasukkan dalam kantong plastik dan diberi label

3. Pengambilan sampel urine

Diambil pagi hari seluruh urine

Disaring urine dan dimasukkan dalam gelas ukur (ukur volume)

Diambil sampel sebanyak 10 %

Dimasukkan botol, ditetesi dengan H2SO4 dan diberi label

4. Pengambilan sampel feses

Diambil feses pada pagi hari dan ditimbang

Diambil sampel sebanyak 10 % dari bobot feses

Dimasukkan dalam kantong plastik, semprot formalin dan diberi label

of 52


…………………………………………………

………………………………….

Laporan Sementara :

of 52

Laporan Sementara :

Materi II

of 52

Kecernaan In Vivo

Dasar Teori

Pengukuran daya cerna secara in vivo merupakan cara pengukuran daya cerna suatu pakan

dengan menggunakan hewan percobaan. Pakan yang diuji diberikan secara langsung pada hewan

percobaan, kemudian diukur berapa jumlah yang dikonsumsi dan yang dikeluarkan lewat feses.

Pakan yang dikonsumsi merupakan selisih antara jumlah pakan yang diberikan dan jumlah pakan

yang tersisa. Pengukuran ini menggunakan kandang khusus yang disebut kandang metabolis, yaitu

kandang yang dilengkapi dengan tempat pakan, tempat minum dan tempat koleksi feses serta urine.

Dalam pelaksanaannya, pengukuran daya cerna dengan cara ini dilakukan paling sedikit

selama 14 hari yang dibagi menjadi dua periode yaitu periode pendahuluan (preliminary period)

dan periode pengumpulan data (collecting period). Periode pendahuluan dilakukan sedikitnya

selama 7 hari atau sampai hewan percobaan terbiasa dengan pakan yang sedang diuji. Hal ini

ditandai dengan konsumsi pakan yang relatif konstan setiap hari. Tujuan periode ini adalah agar

terjadi penyesuaian hewan percobaan terhadap pakan yang sedang diuji dan untuk meniadakan

pengaruh pakan yang dikonsumsi oleh ternak pada beberapa waktu sebelumnya. Setelah periode

pendahuluan dilaksanakan maka diikuti dengan periode pengumpulan data yang dilakukan selama

7-14 hari. Pada periode ini, pakan yang diberikan pada tiap ekor ternak dan yang tersisa dan juga

feses yang dikeluarkannya ditimbang setiap hari dan sampel masing-masing diambil sebanyak

kurang lebih 10 %. Kemudian sampel yang terkumpul dianalisa kandungan zat makanannya di

laboratorium.

Alat dan Bahan

Alat yang digunakan dalam praktikum ini adalah :

- Timbangan

- Kandang metabolis sebanyak ternak yang digunakan

- Ember penampung/pengumpul feses masing-masing kandang 1 buah

- Ember pengumpul urine masing-masing kandang 1 buah

- Kantong plastik tempat sampel urine, feses, pakan hijauan dan konsentrat

- Sebuah freezer atau kulkas

- Spidol permanen untuk memberi tanda

- Gelas ukur 10 ml

- Chopper untuk hijauan

Bahan yang digunakan dalam praktikum ini adalah :

- Kambing

- Pakan ternak kambing (hijauan dan konsentrat)

- Air minum

- Larutan H2SO4 10%

- Formalin

of 52


…………………………………………………

………………………………….

Laporan Sementara :

of 52

Materi III

Kecernaan In Sacco

Dasar Teori

Untuk mengetahui nilai manfaat suatu pakan perlu dilakukan percobaan kecernaan pakan pada

ternak, karena dari hasil analisis kimia terhadap suatu pakan hanya menggambarkan nilai zat-zat

makanannya tanpa nilai manfaatnya. Kecernaan in sacco merupakan pengukuran kecernaan pakan dengan

memasukkan bahan pakan dalam kantong nilon ke dalam alat pencernaan ruminansia. Kecemaan secara in

sacco dengan menggunakan metode kantong nilon adalah suatu metode yang sederhana untuk mendapatkan

informasi dasar tentang nilai nutrisi pakan (kecernaan), dengan cara menempatkan kantong nilon berisi

sampel pakan di dalam rumen selama waktu tertentu. Pori-pori kantong nilon berkisar antara 20- 50m yang

ditempatkan dalam rumen temak ruminansia meialui canula, berat sampel yang di masukkan kedalam

kantong nilon berkisar 2,5-5 gram bahan kering. Faktor yang mempengaruhi kecemaan in sacco antara lain :

lama inkubasi, ukuran sampel dan saat pencucian. Masa inkubasi pakan di dalam rumen meialui percobaan

kecemaan in sacco adalah 12-36 jam untuk konsentrat, 24-60 jam untuk hijauan bemilai nutrisi baik dan 48-

72 jam untuk hijauan berserat kasar tinggi, sehingga dengan mengetahui jumlah pakan yang hilang dari

kantong nilon, maka dapat diketahui koefesien kecemaan dan laju degradasi.

Penentuan degradasi bahan pakan di dalam rumen pada berbagai masa inkubasi telah

dijelaskan oleh Ørskov et al. (1980).

Penyiapan sampel

Materi yang digunakan adalah satu ekor sapi berfistula rumen dengan diameter bagian

dalam 1 cm. Selama percobaan, sapi diberi makanan basal yang mengandung bahan pakan sesuai

perlakuan secara ad libitum. Kantung yang digunakan dalam percobaan berbahan polyester dengan

ukuran 6 cm x 12 cm dengan lubang pori-pori lebih kurang 60 mikron. Berat kantung nilon kering

sekitar 0,5 g-1,0 g. Setiap kantung diberi nomor sebagai tanda perlakuan, dan setiap bahan pakan

membutuhkan dua kantung untuk pengamatan secara duplo. Sampel yang digunakan adalah bahan

pakan kering udara (as fed basis) dan telah dihaluskan dengan hammer mill sampai berukuran 1

mm.

Prosedur Teknik Kantung Nilon

Teknik kantung nilon ini dapat digunakan untuk menyaring pakan pada tingkat taksiran awal

nilai gizinya. Prosedur teknik kantung nilon adalah sebagai berikut:

1. Timbang kantung nilon kering, kemudian catat bobot kantung (a gram).

2. Timbang 3 gram untuk bahan pakan hijauan atau 5 gram untuk bahan pakan sumber

protein (biji-bijian), kemudian catat bobot bahan (b gram).

3. Ikat kantung nilon pada tali plastik yang telah diberi pemberat. ƒ

4. Masukkan ke dalam rumen untuk inkubasi pada waktu yang berbeda-beda.

Masa inkubasi

Sampel dimasukkan kedalam rumen untuk inkubasi selama 3 jam, 6 jam, 12 jam, 24 jam,

48 jam, dan 72 jam. Masa inkubasi 0 jam berarti sampel tidak dimasukkan ke dalam

rumen, tetapi cukup dicuci dengan air mengalir selama lima menit untuk menghilangkan

partikel-partikel terlarut, kemudian dikeringkan pada 60ºC selama 18–24 jam.

Mengambil kantung dari rumen, pencucian, dan pengeringan:

of 52

1. Keluarkan kantung nilon beserta tali dari dalam rumen dan masukkan ke dalam timba

yang berisi air hangat untuk menjaga fermentasi dan mencuci partikel-partikel pakan

keluar dari kantung.

2. Lepas kantung nilon dari tali pengikat dengan menggunakan gunting.

3.Cuci kantung nilon dengan air mengalir sampai air berwarna jernih.

4. Keringkan kantung nilon pada 60ºC selama 18-24 jam atau sampai beratnya tidak

berubah.

5. Timbang kantung nilon beserta bahan pakan, catat bobot sampel (c gram).

6. Persentase residu sampel dapat dihitung menggunakan rumus:

Laju degradasi BK dapat dihitung menggunakan persamaan Ørskov dan McDonald

(1979):

p = a + b (1- e -ct), di mana:

p = degradabilitas pada waktu t.

a = bagian yang dapat larut dalam air (%, waktu 0 jam)

b = bagian yang potensial dapat didegradasi (%)

c = laju degradasi dari b (%/jam)

e = konstanta eksponensial

t = waktu inkubasi (jam)

Nilai parameter degradasi a, b, dan c dihitung dengan menggunakan paket program

Neway Excel.

of 52


…………………………………………………

………………………………….

Laporan Sementara :

Manual Praktikum MK Teknik Analisis Laboratorium (Bagian ... · (anion), dalam hal tersebut ......

Documents

Transcript of Manual Praktikum MK Teknik Analisis Laboratorium (Bagian ... · (anion), dalam hal tersebut ......