TUGAS TERSTRUKTURBIOKIMIA PEMISAHAN PROTEIN

Disusun Oleh:AMALIA NUR KHASANAHG1F013056

KEMENTERIAN PENDIDIKAN DAN KEBUDAYAANUNIVERSITAS JENDERAL SOEDIRMANFAKULTTAS KEDOKTERAN DAN ILMU-ILMU KESEHATANJURUSAN FARMASIPURWOKERTO2014

KATA PENGANTAR

Puji syukur saya haturkan kepada Allah SWT, karena atas ridho-Nya lah makalah biokimia ini dapat terselesaikan. Shalawat dan salam semoga tetap tercurahkan kepada Rasulullah Muhammad SAW. Serta para pihak yang telah membantu penyusunan makalah ini. Adapun tujuan dalam penyusunan makalah ini agar dapat menjadi rujukan untuk mempelajari tentang Pemisahan Senyawa Protein. Dalam penulisan makalah ini penulis mencoba semaksimal mungkin dalam penyusunannya. Namun tidak ada gading yang tak retak, begitupun dengan makalah ini, oleh sebab itu penulis sangat mengharapkan kritik dan saran dari pembaca guna memperbaiki makalah sederhana ini. Semoga makalah ini dapat menambah ilmu pengetahuan,wawasan mengenai materi biokimia.

Purwokerto, 24 Oktober 2014Penyusun,

Amalia Nur KhasanahG1F013056

BAB IPENDAHULUANA. LATAR BELAKANGProtein (asal kata protos dari bahasa Yunani yang berarti "yang paling utama") adalah senyawa organik kompleks berbobot molekul tinggi yang merupakanpolimer dari monomer-monomer asam amino yang dihubungkan satu sama lain dengan ikatan peptida. Molekul protein mengandung karbon, hidrogen, oksigen,nitrogen dan kadang kala sulfur serta fosfor. Protein berperan penting dalam struktur dan fungsi semua sel makhluk hidup dan virus.Kebanyakan protein merupakan enzim atau subunit enzim. Jenis protein lain berperan dalam fungsi struktural atau mekanis, seperti misalnya protein yang membentuk batang dan sendi sitoskeleton. Protein terlibat dalam sistem kekebalan (imun) sebagai antibodi, sistem kendali dalam bentuk hormon, sebagai komponen penyimpanan (dalam biji) dan juga dalam transportasi hara. Sebagai salah satu sumber gizi, protein berperan sebagai sumber asam amino bagiorganisme yang tidak mampu membentuk asam amino tersebut (heterotrof).Protein merupakan salah satu dari biomolekul raksasa, selain polisakarida, lipid, dan polinukleotida, yang merupakan penyusun utama makhluk hidup. Selain itu, protein merupakan salah satu molekul yang paling banyak diteliti dalam biokimia. Protein ditemukan oleh Jns Jakob Berzelius pada tahun 1838.B. RUMUSAN MASALAHAdapun rumusan masalah dalam makalah ini adalah apa saja cara/teknik yang dapat digunakan untuk memisahkan protein.

C. TUJUANAdapun tujuan pembuatan makalah ini adalah untuk mengetahui cara/teknik pemisahan protein yang baik dan benar.

BAB IIISI

A. CARA/TEKNIK PEMISAHAN PROTEINBerikut ini adalah beberapa cara yang biasa dgunakan untuk melakukan pemisahan terhadap senyawa protein.

1. DialisisDialisisadalah proses perpindahanmolekulterlarut dari suatu campuran larutan yang terjadi akibatdifusipadamembransemi-permeabel. Molekul terlarut yang berukuran lebih kecil dari pori-pori membran tersebut dapat keluar, sedangkan molekul lainnya yang lebih besar akan tertahan di dalam kantung membran. Selulosaadalah salah satu jenis materi penyusun membran dialisis yang cukup umum dipakai karena bersifat inert untuk berbagai jenis senyawa ataumolekulyang akan dipisahkan. Laju difusi ditentukan oleh beberapa kondisi(Whang, 1990): Konsentrasi molekul pelarut yang akan keluar dari kantung dialisis. Jika konsentrasi molekul terlarut di lingkungan lebih kecil dibandingkan dengan yang ada di dalam kantung dialisis maka laju difusi akan semakin cepat. Luas permukaan kantung dialisis. Semakin luas permukaan membran yang digunakan maka laju difusi akan semakin cepat. Volume pelarut. Jika rasio luas permukaan membran dengan volume pelarut besar maka laju difusi akan berlangsung dengan cepat karena molekul terlarut dapat berdifusi dalam jarak yang dekat.

Metode dialisis banyak digunakan dalam pemurnianprotein(terutamaenzim).Dalam proses ini, dialisis digunakan untuk menghilangkan molekulgaram, sepertiamonium sulfat, sebelum dilanjutkan dalam proses pemurnian berikutnya ataupun pada tahap akhir pemurnian. Dialisis juga banyak digunakan dalam proses pencuciandarahpada pasien penderita gagalginjal. Untuk kasus ini, peranan ginjal untuk menghilangkan senyawa beracun, garam danairberlebih digantikan dengan sistem buatan. Hemodialisisadalah metode pencucian darah dengan menggunakan mesin, sedangkan dialisis peritoneal menggunakan membran peritoneal yang berlokasi di daerahperutuntuk menggantikan peranan ginjal (Clive, 2002)

2. ElektroforesisElektroforesis Protein adalah teknik pemisahan protein berdasarkan ukurannya dan memperlihatkan hasilnya. Akan tetapi protein jauh lebih beragam dalam ukuran dan strukturnya, karena itu tekniknya jauh lebih rumit.

Pada dasarnya alat elektroforesis terdiri atas 2 bagian utama yaitu bagian electric transformer yang mengubah arus AC ke DC dan bagian tanki elektroforesis yang berisi flat bed, slab, column, dan selang.

Beberapa faktor yang mempengaruhi pemisahan komponen pada elektroforesis protein :1.Densitas muatan molekul - berbeda diantara pH media dan pl molekul.2. Pengaruh buffer3. Bentuk dan ukuran molekul.4. Media pendukung Metode Yang Digunakan:Polyacrilamide Gel Elektroforesis (PAGE)Sistem yang digunakan dalam PAGE- Flat Bed- Rod atau Column- Vertical Slab- Capillary Faktor yang mempengaruhi resolusiBerikut adalah factor-faktor yang mempengaruhi resolusi (Khopkar,1990):1. Konsentrasi Gel Poliakrilamid- Konsentrasi monomer - proporsional terhadap porositas gel akhir- Persentase Cross-linker pada Monomer - mempunyai pengaruh pada porositas gel akhir- kimia alam untuk Cross-linker - dapat mempengaruhi porositas dan penangan selanjutnya pada gel akhir- Kemurnian monomer - sering terkontaminasi dengan asam akrilat yang menyebakan efek elektroendosmosis pada gel final.

2. Buffer- pH- Penggunaan sistem buffer kontnyu atau diskontinyu- Komposisi buffer- Inklusi agen disosiasi : Urea, detergen non ionic, Sodium Dodecyl Sulphate (SDS).

Untuk mempelajari protein, kita perlu mengurutkan dan memvisualisasikannya. Salah satu cara paling umum untuk melakukannya dikenal dengan SDS-PAGE (sodium dodecylsulfate polyacrylamide gel electrophoresis).Tidak seperti DNA, protein yang diisolasi ini tidak akan memiliki muatan negatif yang sama. Karena itu perlu untuk melindungi semua protein dengan sesuatu untuk memberikan muatan negatif, yang memungkinkan mereka bergerak menuju ujung positif arus listrik.Untuk memisahkan protein secara akurat berdasarkan ukurannya, akan sangat penting jika kita mendenaturasi protein sebelum mengisikannya dalam gel. Untuk melakukan hal ini, kita akan menggunakan loading buffer dengan 2 bahan penting, SDS dan DTT (ditiotreitol). DTT adalah agen pereduksi yang kuat yang memutus ikatan disulfida. Selain itu untuk mempergunakan 2 agen kimia untuk mendenaturasi protein, kita juga harus memanaskan beberapa sampel hingga 95oC untuk membantu mendenaturasi protein secara sempurna, menghasilkan molekul linier yang akan bermigrasi berdasarkan bobot molekulnya.

Struktur Protein

Di dalam sel, protein berada dalam bentuk 3 dimensional. Struktur primer protein merupakan sekuen sederhana dari asam amino. Asam amino ini dapat membentuk struktur umum seperti alpha heliks, akibat ikatan hidrogen. Struktur protein juga dapat lebih lanjut terpengaruhi oleh interaksi elektrostatik dan hidrofobik, sekaligus juga gaya yang lebih kuat seperti ikatan kovalen disulfide, ini dikenal dengan sebutan struktur tersier protein (Soebagio, 2004).

3. Kromatografi Penukar Ion

Kromatografi pertukaran ion adalah salah satu teknik pemurnian senyawa spesifik di dalam larutan campuran. Prinsip utama dalam metode ini didasarkan pada interaksi muatan positif dan negatif antara molekul spesifik dengan matriks yang barada di dalam kolomkromatografi. Metode ini pertama kali dikembangkan oleh seorang ilmuwan bernama Thompson pada tahun1850. Secara umum, teradapat dua jenis kromatografi pertukaran ion, yaitu (Syehla, 1985): Kromatografi pertukaran kation, bila molekul spesifik yang diinginkan bermuatan positif dan kolom kromatografi yang digunakan bermuatan negatif. Kolom yang digunakan biasanya berupa matriksdekstranyang mengandung guguskarboksil(-CH2-CH2-CH2SO3- dan -O-CH2COO-).Larutan penyangga(buffer) yang digunakan dalam sistem ini adalahasam sitrat,asam laktat,asam asetat,asam malonat, buffer MES dan fosfat.kromatografi pertukaran anion, bila molekul spesifik yang diinginkan bermuatan negatif dan kolom kromatografi yang digunakan bermuatan positif. Kolom yang digunakan biasanya berupa matriks dekstran yang mengandung gugus -N+(CH3)3, -N+(C2H5)2H, dan N+(CH3)3. Larutan penyangga (buffer) yang digunakan dalam sistem ini adalah N-metil piperazin, bis-Tris, Tris, dan etanolamin (Syehla, 1985).

Metode ini banyak digunakan dalam memisahkan molekulprotein(terutamaenzim). Molekul lain yang umumnya dapat dimurnikan dengan menggunakan kromatografi pertukaran ion ini antara lain senyawaalkohol,alkaloid,asam amino, dannikotin.

Suatu resin penukar ion yang ingin direaksikan dalam suatu sistem dapat dilakukan dengan memasukkan gugus-gugus dari suatu resin yang terionkan kedalam suatu matriks polimer organik, yang paling lazim diantaranya ialah polisterina hubungan silang yang diatas diperikan sebagai absorben. Produk tersedia dengan berbagai derajat hubungan silang. Suatu resin umum yang lazim ialah resin 8% terhubung silang yang berarti kandungan divenilbenzenanya 8 %. Resin-resin itu dihasilkan dalam bentuk manik-manik bulat, biasanya dengan 0,1-0,5 mm, meskipun ukuranukuran lain juga tersedia (Svehla, 1985).

Resin pertukaran ion merupakan bahan sintetik yang berasal dari aneka ragam bahan, alamiah maupun sintetik, organik maupun anorganik, memperagakan perilaku pertukaran ion dalam analisis laboratorium dimana keseragaman dipentingkan dengan jalan penukaran dari suatu ion. Pertukaran ion bersifat stokiometri, yakni satu H+diganti oleh suatu Na+. Pertukaran ion adalah suatu proses kesetimbangan dan jarang berlangsung lengkap, namun tak peduli sejauh mana proses itu terjadi, stokiometrinya bersifat eksak dalam arti satu muatan positif meninggalkan resin untuk tiap satu muatan yang masuk. Ion dapat ditukar yakni ion yang tidak terikat pada matriks polimer disebut ion lawan (Counterion) (Underwood, 2001).

Resin dapat digunakan dalam suatu analisis jika resin itu harus cukup terangkai silang, sehingga keterlarutan yang dapat diabaikan, resin itu cukup hidrofilik untuk memungkinkan difusi ion-ion melalui strukturnya dengan laju yang terukur dan berguna. Selain itu, resin juga harus menggunakan cukup banyak gugus penukar ion yang dapat dicapai dan harus stabil kimiawi dan resin yang sedang mengembang, harus lebih besar rapatannya daripada air (Harjadi, 1993).

Dalam suatu proses subtituen polar dapat memberikan afinitas yang tinggi bagi air. Apabila disuspensikan dalam air partikel resin itu akan membengkak karena menyerap air, yang derajat pembengkakannya dibatasi olah jauhnya hubungan silang. Sekitar satu gugus asam sulfonat percincin aromatik kebanyakan dalam posisi para sulfonasi secara dramatis mengubah karakter polimer itu. Asam-asam arisulfonat adalah asam kuat. Jadi gugus-gugus ini akan terikat bila air menembusi manik resin itu.R SO3H R- SO3-H+

Namun berlawanan dengan elektrolit basa, anion itu melekat secara permanen pada matriks polimernya. Anion itu tak dapat berimigrasi kedalam fase air didalam pori resin itu, juga tak dapat lolos kelarutan luar. Pengikatan ion ini selanjutnya membatasi mobilitas kationnya, H+. Kenetralan listrik dipertahankan didalam resin dan H+tidak akan meninggalkan fase resin kecuali bila digantikan oleh suatu kation lain. Pergantian inilah yang disebut proses pertukaran ion (Underwood, 2001).Prinsip-prinsip dasar dari pertukaran ion telah banyak menetapkan penelitian-penelitian dalam sistem air, serta menghasilkan penetapan-penetapan yang berguna. Namun lingkup dari pertukaran ion telah diperluas selama sekitar dekade terakhir ini, dengan menggunakan baik sistem pelarut organik, maupun sistem pelarut campuran air-organik. Pelarut-pelarut organik yang umum digunakan adalah senyawaan-senyawaan akso dari tipe alkohol, keton dan karboksilat yang umumnya mempunyai tetapan dielektrik dibawah 40 (Svehla, 1985).

Di tahun 1935, Adam dan Holmes membuat resin sintesin pertama dengan hasil kondensasi asam sulfonat fenol dengan formaldehid. Semua resin-resin ini memiliki gugusan reaktif -OH, -COOH, -HSO3, sebagai pusat-pusat pertukaran. Gugusan fungsional asam (atau basa) suatu resin penukar ditempati oleh ion-ion dengan muatan berlawanan. Ion yang labil adalah H+pada penukar kation. Resin dengan gugusan sulfonat atau amina kuartener adalah terionisasi kuat, tidak larut dan sangat reaktif. Resin-resin demikian disebut resin penukar kuat, sedangkan gugusan ion yang terionisasi secara parsial seperti > COOH, -OH, dan NH2dikenal sebagai resin penukar yang lemah (Khopkar, 1990).

Semua penukar ion yang bernilai dalam analisis, memilih beberapa kesamaan sifat: mereka hampir-hampir tak dapat larut dalam air dan pelarut organik, dan mengandung ionion katif dan ion-ion lawan yang akan bertukar secara reversibel dengan ion-ion lain dalam larutan yang mengelilinginya tanpa terjadi perubahan-perubahan fisika yang berarti dalam bahan tersebut.penukaran ion bersifat kompleks dan sesungguhnya adalah polimerik. Polimer ini membawa suatu muatan listrik yang tepat dinetralkan oleh muatan-muatan pada ion-ion lawannya (ion aktif). Ion-ion aktif ini beruapa kation-kation dalam penukar kation, dan berupa anion-anion dalam penukar anion (Bassett, 1994).

Larutan yang melalui kolom disebutinfluent, sedangkan larutan yang keluar kolom disebuteffluent. Proses pertukarannya adalah serapan dan proses pengeluaran ion adalah desorpsi atau elusi. Mengembalikan resin yang sudah terpakai kebentuk semula disebut regenerasi sedangkan proses pengeluaran ion dari kolom dengan reagent yang sesuai disebut elusi dan pereaksinya disebuteluent. Yang disebut dengan kapasitas pertukaran total adalah jumlah gugusan-gugusan yang dapat dipertukarkan di dalam kolom, dinyatakan dalam miliekivalen. Kapasitas penerobosan (break through capacity) didefinisikan sebagai banyaknya ion yang dapat diambil oleh kolom pada kondisi pemisahan; dapat juga dikatakan sebagai banyaknya miliekivalen ion yang dapat ditahan dalam kolom tanpa ada kebocoran yang dapat teramati. Kapasitan penerobosan lebih kecil dari kapasitas total pertukaran kolom dan tidak tergantung terhadap sejumlah variabel, seperti tipe resin, afinitas penukaran ion, komposisi larutan, ukuran partikel, dan laju aliran (Khopkar, 1990).

4. Filtrasi GelKromatografi eksklusi gel merupakanjenis kromatografi eksklusi dimana fasediamnya yang berperan sebagaipenyaring molekul terbuat dari gelpolimer yang berikatan silang danberpori heterogen.Kromatografi eksklusi gel dibagi menjadi dua yaitu kromatografi filtrasi gel dankromatografi permeasi gel (Khopkar,1990).Macam-macam gel (Khopkar,1990):SephadexDigunakan untuk pemisahan proteinTerbuat dari polisakarida yangmengandung gugus hidroksil sehingga gelbersifat polar.BiogelTerdiri dari poliakril amidaTidak larut dalam air dan pelarut organikumumnyaStiragelUntuk memisahkan larutan tak berairTidak dapat digunakan dengan air, asetonatau kloroform.

Mekanisme Pemisahan (Khopkar,1990):

Suatu kolom yang telah diisi dengan gel yang beperan sebagai fase diam, dialirifase gerak yang membawa molekul-molekul yang akan dipisahkan. Molekul- molekul yang berukuran lebih besar dari pori- pori terbesar gel akan keluar kolom dengan mudah melalui celah- celah diantara partikel individual gel.Molekul- molekul yang berukuran sama atau lebih kecil daripada pori- pori terbesar gel akan masuk ke dalam jaringan yang terbuka di dalamgel.Molekul- molekul tersebut akan tertahan padaberbagai tingkatan dan akan terelusi menurut penurunan berat molekulnya.Molekul- molekul yang berukuran besar umumnya juga memiliki berat molekul yang besar dan molekul- molekul yang berukuran kecil umumnya juga memiliki berat molekul yang kecil.Penggunaan KEGAnalisis campuran molekul dengan beratmolekul yang berbeda seperti pemisahanrafinosa, maltosa dan glukosa.Pengeluaran garam (desalting).Pemisahan asam- asam nukleat darinukleotida.Pemisahan polisakarida gula dan protein darisenyawa- senyawa berbobot molekul rendah.

Kekurangan dan Kelebihan KEG (Hendyana, 2006) :Kromatografi eksklusi gel memiliki beberapa keuntungan dalam penggunaannya:1. pita-pita sempit.2.waktu pemisahan pendek.3.waktu pemisahan mudah diramalkan.4.Harga Tr sesuai dengan ukuran cuplikan.5.tidak terjadi kehilangan cuplikan atau reaksiselama pemisahan.6.hanya terjadi sedikit masalah dalam deaktivasikolom.

Kromatografi ekslusi gel juga memiliki kelemahan:1. kapasitas terbatas2.tidak dapat digunakan untuk cuplikanyang mempunyai ukuran hampirsama.3.prinsip pemisahan tidak sepertikromatografi lain.

BAB IIIPENUTUP

A. KESIMPULANPemisahan senyawa protein dapat dilakukan dengan beberapa cara, yaitu: Dialisis (proses perpindahanmolekulterlarut dari suatu campuran larutan yang terjadi akibatdifusipadamembransemi-permeabel. ). Elektroforesis (teknik pemisahan protein berdasarkan ukurannya.). Kromatografi Penukar Ion (teknik pemurnian senyawa spesifik di dalam larutan campuran.). Filtrasi Gel (jenis kromatografi eksklusi dimana fase diamnya yang berperan sebagai penyaring molekul terbuat dari gel polimer yang berikatan silang dan berpori heterogen.).

B. DAFTAR PUSTAKA

Basset, J. 1994.Buku Ajar Vogel : Kimia Analisis Kuantitatif Anorganik.Jakarta: EGC Buku KedokteranClive Dennison (2002).A Guide to Protein Isolation.ISBN0-792-35751-5.Harjadi, W. 1993. Ilmu Kimia Analitik Dasar.Jakarta: ErlanggaHendayana, Sumar. 2006. Kimia Pemisahan: PTRemaja Rosdakarya Offset.Khopkar, S.M. 2008.Konsep Dasar KimiaAnalitik. Jakarta: UI-Press.Soebagio,dkk. 2004.Kimia Analitik II. Malang:UNM.Syehla. G.1985. Bukuteks analisis anorganik kualitatig makkro dan semi mikro,diterjemahkan oleh Dr.A hadjanan pudjaatmana, edisi ke ima jilid dua.Jakarta: PTkalian media pustaka.Underwood, A.L. 1988.Analisa Kimia Kuantitatif Edisi Ke Empat.Jakarta:ErlanggaWhang JE, Kim YM. 1990. Purification and characterization of methanol dehydrogenase fromMethylobacterimsp. strain SY1.Korean Biochem J23(2):190-197.