8/17/2019 Majalah0910714054 1

1/12

PENGARUH PEMBERIAN EKSTRAK ETANOL BIJI KAKAO (Theobroma cacao L.)

TERHADAP JUMLAH SEL OSTEOKLAS TULANG TIBIA TIKUS PUTIH (Rattus

norvegicus) PASCA OVARIEKTOMI

Stefanus Gunawan

ABSTRAK

Osteoporosis adalah penyakit degenerasi tulang yang ditandai dari massa tulangyang kecil dan deteriorasi mikroarsitektural dari jaringan tulang. Osteoklas bertanggung jawab untuk pathogenesis penyakit tulang seperti osteoporosis, karena penyerapan tulangditingkatkan oleh aktifitas dan / atau perekrutan oleh osteoklas. Jumlah dan aktifitas dari selosteoklas meningkat akibat adanya proses inflamasi dan stres oksidatif. Biji kakao

mengandung antioksidan dan antiinflamasi yang dapat mencegah terjadinya osteoporosis.Tujuan dari penelitian ini adalah membuktikan bahwa potensi ekstrak etanol biji kakao(Theobroma cacao l.)  dapat menurunkan jumlah sel osteoklas. Penelitian ini merupakanpenelitian studi eksperimental in vivo pada hewan coba tikus wistar (Rattus norvegicus)dengan  post test  control group design dan menggunakan 5 kelompok tikus. Masing-masingkelompok terdiri dari 5 tikus. Selama 4 minggu tikus mengalami ovariektomi dan 4 minggukemudian diberi ekstrak etanol biji kakao. Analisis data dikerjakan dengan metode one way   Anova dilanjutkan Post Hoc Tukey, menunjukkan bahwa pemberian ekstrak etanol biji kakaomenurunkan jumlah osteoklas secara signifikan (p

8/17/2019 Majalah0910714054 1

2/12

PENDAHULUANOsteoporosis adalah penyakit

degenerasi tulang yang ditandai darimassa tulang yang kecil dan deteriorasimikroarsitektural dari jaringan tulang yangmenyebabkan kerapuhan dan kerentananterhadap fraktur, terutama pada tulangpinggul, tulang belakang, dan pergelangantangan (Shen et al , 2009).  Penelitiantentang osteoporosis juga menunjukkanpengaruh dari perbedaan gender. Wanitaempat kali lebih berisiko untuk terkenaosteoporosis dibandingkan dengan priakarena penurunan tingkat estrogenmereka setelah menopause dan jugakarena tulang yang secara umum lebih

ringan dan tipis. (Shen et al , 2009). Padausia mulai dari 40 tahun hingga pramenopause terdapat penurunan ukuranovarium secara lambat tetapi pasti yangdapat menimbulkan masalah kesehatan(Joelijanto, 2004).

Shen  et al   (2009) mengungkapkanbahwa sel osteoblas maupun osteoklasberperan dalam pengaturan metabolismetulang dan keduanya terlibat dalamperkembangan osteoporosis. Osteoklasadalah sel multinukleus yang berperan

dalam proses resorpsi tulang. Ketidak-seimbangan antara pembentukan tulangdan resorpsi tulang adalah kunci daripatofisiologi dari penyakit metabolicpenyakit tulang pada orang dewasatermasuk osteoporosis (Shen et al  2009).

Penelitian-penelitian yang mengarahkepada Kakao makin banyak dilakukansaat ini karena aktivitas antioksidan danantimikroba dari polifenol Kakao banyakmemberikan keuntungan bagi kesehatan(Osman H, 2004). Polifenol diketahui tidak

hanya berperan dalam pencegahanpenyakit jantung dan kanker, tetapi jugapencegahan osteoporosis karena potensikarakter antioksidannya. Selain ituflavanoid ( procyanidins) dalam Kakaodiketahui juga dapat mengatur keterlibatansitokin dalam respon inflamasi. Diketahuibahwa kadar polifenol pada  perserving  Kakao lebih banyak dibandingkan denganteh hijau, hal ini dikarenakan dalamkonsumsi di masyarakat, kakao memiliki jumlah  perserving   lebih banyak dibandingteh hijau (Subhasini et al , 2007).

Biji Kakao kaya akan komponensenyawa fenolik antara lain : katekin,

proantosianidin, asam fenolat, tanin, danflavanoid lainnya (Othman et al , 2007).Kakao kaya akan polifenol sehinggamenyebabkan rasa pahit. Polifenol dalambiji kakao disimpan dalam sel-sel pigmenkotiledon biji kakao.Tiga golonganpolifenol yang dapat ditemukan adalahcatechin atau flavan-3-ols, antosianin,proantosianin (Shen et al , 2009).

Tulang diresorpsi terutama oleh

osteoklas multinucleated . Hal Initerbentuk oleh fusi preosteoclasts, yangberasal dari sel stem hematopoietik akibatkeberadaan sitokin, seperti M-CSF danRANKL. Sitokin ini diekspresikan olehosteoblas / sel stroma dan memodulasi

fungsi dan kelangsungan hidup osteoklas.Sitokin dan sinyal dari integrin jugamenginduksi pembentukan struktur selterpolarisasi dalam osteoklas yangberpartisipasi dalam resorpsi tulang.Setelah masa resorpsi tulang, beberapaosteoklas mati oleh apoptosis. Dengandemikian, regulasi proses ini berpotensimenyebabkan kontrol resorpsi tulangnormal. Karena penyerapan tulangditingkatkan oleh aktifitas dan/atauperekrutan osteoklas yang bertanggung

 jawab untuk pathogenesis penyakit tulangseperti osteoporosis, maka agen yangmenghambat diferensiasi ataumenginduksi apoptosis pada sel-selosteoklas dapat digunakan sebagai agenprofilaksis atau terapi untuk pengobatanpenyakit yang berhubungan denganpeningkatan jumlah osteoklas yangberlebihan (shen et al , 2009).

Beranjak dari hal-hal diatas,diperlukan suatu penelitian mengenaihubungan antara pemberian ekstrak

etanol biji kakao terhadap jumlah selosteoklas tulang tibia tikus wistar paskamenopause. Dengan harapan dapatmemberikan pengetahuan mengenaikhasiat kandungan kakao kepadamasyarakat sehingga angka kejadian dariosteoporosis dapat dikurangi. Diharapkanpenelitian ini dapat membantu masyarakatuntuk meningkatkan kualitas hidup dalamaspek kesehatan dalam mencegahosteoporosis. 

METODE PENELITIANRancangan Penelitian. Penelitian inimenggunakan desain true experimental in

8/17/2019 Majalah0910714054 1

3/12

vivo  dengan metode Randomized Posttest Only Controlled Group Design  yaitumembandingkan hasil yang didapatsetelah perlakuan dengan menggunakankontrol positif dan negatif. Setiap hewancoba memiliki probabilitas yang samauntuk mendapatkan perlakuan, sehinggadapat menjaga validitas generalisasi kepopulasi.Estimasi Besar Sampel. Sampel yangakan digunakan dalam penelitian iniadalah sediaan tulang yang diambil daritikus. Penelitian ini menggunakan limakelompok perlakuan (p=5), Sehingga jumlah pengulangan (jumlah sampel) yangdibutuhkan adalah (Solimun, 2001):

p(n-1) ≥ 15  keterangan:pn – p ≥ 15  n=jumlah pengulangan 5n – 5 ≥ 15  p= jumlah perlakuan 5n ≥  20n ≥ 4 

Dari perhitungan didapatkan n ≥ 4, jadi dilakukan minimal empat kalipengulangan untuk masing-masingkelompok. Dalam penelitian ini digunakanlima ekor tikus untuk masing-masingkelompok sehingga besar sampel secarakeseluruhan adalah lima ekor tikus dikali 5

kelompok perlakuan, sehingga dibutuhkan25 ekor tikus.Pemilihan Hewan Coba. Hewan cobadalam penelitian ini adalah tikus jenisRattus norvegicus  strain wistar yang

diperoleh dari Laboratorium Penelitian danPengujian Terpadu Universitas GajahMada Yogyakarta.

Tikus galur Wistar dipilh sebagaisampel karena tikus merupakan hewancoba yang tergolong jinak, mudahperawatannya dan fungsi metabolismenyamirip dengan manusia. Lalu sampel dibagi kedalam lima kelompok denganteknik simple random sampling.

Teknik randomisasi untukpengelompokan perlakuan menggunakanmetode Rancangan Acak Lengkap (RAL)mengingat baik hewan coba, bahanpakan, dan bahan penelitian lainnyaadalah homogen. Pada rancangan ini

dimungkinkan setiap hewan cobaberpeluang sama untuk mendapatkesempatan sebagai sampel baik dalamkelompok perlakuan maupun dalamkelompok kontrol.Pemilihan Dosis. Terapi diberikan dalambentuk ekstrak etanol biji kakao karenadalam bentuk ekstrak kandungan polifenolakan terkonsentrasi serta agar dapatmengeliminasi kandungan lain yang tidakdiperlukan. Sehingga dari perhitungandidapatkan range  jumlah perserving

ekstrak etanol biji kakao yang diberikansecara per oral (p.o) dengan dosissebagai berikut: Dosis I (25 mg) : 125mg/kgBB; Dosis II (50 mg): 250 mg/kgBB;Dosis III (100mg) : 500mg/kgBB.

Gambar 4.1 Skema desain penelitian 

Hewan coba: 25 tikus utih Rattus norve icus ,

Randomisasi

K (-) 5 ekor

Tanpa

Perlakuan

(8 Minggu)

Perlakuan-1 5 ekor

Ovariektomi

(4 Minggu)

K (+) 5 ekor

Dengan

Ovariektomi

(8 Minggu)

Perlakuan-2 5 ekor

Ovariektomi

(4 Minggu)

Perlakuan -3 5 ekor

Ovariektomi

(4 Minggu)

Ektrak Etanol

Biji Kakao 125

mg/kgBB (4

Minggu)

Ektrak Etanol

Biji Kakao 250

mg/kgBB (4

Minggu)

Ektrak Etanol

Biji Kakao 500

mg/kgBB (4

Minggu)

Dekalsifikasi Tulang Tibia 

Histopatologi dengan Pewarnaan HE

8/17/2019 Majalah0910714054 1

4/12

Kelompok Perlakuan. Perlakuan  sampeldengan cara simple random sampling  yang membagi hewan coba menjadi limakelompok yaitu dua kelompok kontrol dantiga kelompok perlakuan yang masing-masing terdiri dari 5 ekor tikus, secaraskematis, desain penelitian tersebut dapatdigambarkan sebagai berikut:Keterangan :K (-) = kontrol negatif : tikus tanpa

perlakuan Ovariektomi dan tanpapemberian ekstrak, jumlahosteoklas diamati setelah 8minggu

K (+) = kontrol positif : tikus denganperlakuan Ovariektomi saja dan

tanpa pemberian ekstrak, jumlahosteoklas diamati setelah 8minggu

P1  = perlakuan 1 : tikus denganperlakuan Ovariektomi (dibiarkanselama 4 minggu) dan dilakukanpemberian ekstrak dengan dosis25 mg (125 mg/kgBB tikus)(selama 4 minggu), kemudian jumlah osteoklas diamati.

P2  = perlakuan 2 : tikus denganperlakuan Ovariektomi (dibiarkan

selama 4 minggu) dan dilakukanpemberian ekstrak dengan dosis50 mg (250 mg/kgBB tikus)(selama 4 minggu), kemudian jumlah osteoklas diamati.

P3  = perlakuan 3 : tikus denganperlakuan Ovariektomi (dibiarkanselama 4 minggu) dan dilakukanpemberian ekstrak dengan dosis100 mg (500 mg/kgBB tikus)(selama 4 minggu), kemudian jumlah osteoklas diamati. 

Variabel Bebas. Variabel bebas dalampenelitian ini adalah ekstrak kakao(Theobroma cacao L.) dengan berbagaidosis (P1  125 mg/kgBB, P2 250 mg/kgBBdan P3 500 mg/kgBB). Variabel Tergantung. Variabel

tergantung dalam penelitian ini adalah:Jumlah osteoklasDefinisi Operasional.1. Biji kakao yang digunakan adalah

buah kakao (Theobroma cacao L)dari tanaman kakao varietasmulia/edel. Ekstrak etanol biji kakaodidapatkan dari biji kakao kering yangdihaluskan, diambil dari Perkebunan

coklat kota Blitar, yang diekstraksidengan pelarut etanol 96% memakaimetode maserasi.

2. Hewan coba yang digunakan adalahtikus putih strain wistar (Rattusnorvegicus strain wistar) betinakarena diberi perlakuan ovariektomiuntuk mendapatkan keadaanmenopause. Tikus yang sudahdisiapkan dengan dibagi menjadi 5kelompok (n=5) yaitu 1 kelompokkontrol negatif, 1 kelompok kontrolpositif dan 3 kelompok perlakuan (P1,P2, P3). Kelompok kontrol positif dandiberi perlakuan ovariektomi sehinggaterjadi osteoporosis menopause akibat

defisiensi estrogen.3. Pemberian ekstrak dilakukan secaraper oral (p.o) selama 4 minggupada kelompok perlakuan (P1, P2,P3) masing-masing dengan dosisberbeda. Setelah adanya perlakuantikus akan eutanasia, kemudiandilakukan pengukuran parameter-parameter yang diperlukan.

4. sel osteoklas pada preparat histologitulang tibia dengan pewarnaanHematoksilin-Eosin dengan

pemeriksaan mikroskop berupa selraksasa dengan multinukleus yangberada pada sisi tulang yangmengalami resorbsi (lacuna howship),sitoplasma seperti busa, sedikitasidofilik. Penentuan rata-rata selosteoklas dilakuhkan secara manualdengan menghitung sel osteoklasmelalui preparat histologis dibawahpemeriksaan mikroskop denganpembesaran 400x dan dihitung perempat lapangan pandang.

Lokasi dan Waktu Penelitian. Lokasiyang digunakan untuk penelitian adalahlaboratorium Farmakologi dan Anatomi-Histologi Fakultas Kedokteran UniversitasBrawijaya, Malang. Waktu yang digunakanuntuk penelitian adalah bulan Februari2012 – Juli 2012.Bahan dan Alat untuk PemeliharaanTikus Putih. Bahan dan alat yangdiperlukan adalah kandang pemeliharaanhewan coba, tutup kandang dari anyamankawat, sekam, botol minum, alat semprot,tempat makan, dan pakan comfeed(makanan standar tikus)

8/17/2019 Majalah0910714054 1

5/12

Bahan dan Alat Pembuat makananHewan Coba. Pembuatan ransummakanan: Baskom plastik, timbangan,baskom, pengaduk, gelas ukur, dannampan, sedangkan bahannya adalahmakanan tikus dewasa yang terdiri dari:air,protein kasar, serat kasar, lemak kasar,abu, kalsium, fosfor, tepung terigu, airaquades steril.Bahan dan Alat untuk PembuatanEkstraksi Kakao. Bahan untuk ekstraksiadalah aquades, etanol 95%, kakaovarietas mulia/edel (usia 4-5 tahun)sebanyak 31 gram. Alat untuk ekstraksiadalah pisau, blender, tabungErlenmeyer, Waterbath, neraca analitik

untuk menimbang simplisia, kertas saring,beaker glass 500 mL dan satu set alatrotary evaporator vacuum  untukmenghilangkan pelarut ekstrak.Alat untuk Pemberian Ekstrak Kakao. Alat yang dipakai adalah spuit yangujungnya dipasang sonde yang dapatmasuk dari mulut sampai ke lambung tikusdan kain untuk memegang tikus.Bahan dan Alat yang dibutuhkan untukOvariektomi pada Tikus Putih. Bahanuntuk ovariektomi adalah alkohol 70% dan

larutan betadine, serta alat yangdiperlukan adalah scalpel One med 1 ml,dan tempat untuk tikus.Alat untuk Pembedahan Tikus.  Alatuntuk pembedahan tikus adalah papanbedah, pisau bedah, dan pinset.Bahan dan Alat untuk Embedding danPembuatan Preparat Jaringan  Tulang.Bahan yang dibutuhkan adalah larutanfiksatif, xilol, etanol, parafin blok, air, airhangat 38-40°C, dan aquades. Alat yangdigunakan adalah mikrotom, beaker

glass 250 mL, kuas, objek glass,inkubator, hot plate 38-40°C, dan wadah.Bahan Dan Alat Dekalsifikasi. Larutanyang digunakan adalah larutan ONCALK dengan kandungan larutan HCL(Hydrogen chloride).Bahan dan Alat untuk PewarnaanHematoxylen Eosin. Bahan yangdigunakan adalah preparat jaringanperiartikular, alkohol, xilol, air, aquades,larutan Harris Hematoksilin dan larutanEosin. Alat yang digunakan rak untukpewarnaan, pipet, cover glass, entellan,mikroskop cahaya Olympus CX31 dankamera digital Nikon Coolpix 9090.

Alat untuk Pemeriksaan HistologiOsteoklas.  Alat yang digunakan untukmelihat sel osteoklas pada pengamatanhistologi adalah Mikroskop Olympus PhotoSlide BX51 denagn kamera DP71 12Megapixel.Osteoporosis dengan PerlakuanOvariektomi pada Tikus Putih1. Osteoporosis dilakukan dengan

perlakuan ovariektomi padakelompok tikus (b), (c), (d) dan (e). 

2. Kelompok tersebut dibiarkan selama 4minggu paska ovariektomi, sebelumdiberikan perlakuan. 

Pembuatan Ekstrak Kakao1. Biji kakao ditumbuk dengan mortar dan

dihaluskan dengan grinder2. Bongkahan yang telah halus kemudiandikeringkan dalam oven pada suhu1050 Celcius selama 3 jam

3. Sebanyak 50 miligram contoh yangtelah dikeringkan ditempatkan dalamlabu takar volume 50 ml kemudiandilarutkan dengan etil asetat sampaitanda garis.

4. Di atas hot plate diletakkan gelas pialayang berisi air hingga suhu mencapai520- 750 C (sampai berasap).

5. Contoh dalam labu takar dipanaskanselam 15 menit kemudian didinginkan.

6. 2 ml Larutan contoh dimasukkan keerlenmeyer tutup asah berukuran100ml dan ditambahkan larutan etilasetat 50 ml kemudian dipansakandiatas hotplate seperti di atas selama 5menit dan didinginkan.

7. Absorbansi larutan diukur denganspektrofotometer pada panjanggelombang 279 dan 300 nm

Pemberian Ekstrak Kakao. Pemberian

ekstrak kakao diberikan setiap sore hari(15.00) pada kelompok perlakuan I (100mg/kgBB tikus), II (250 mg/kgBB tikes)dan III (500 mg/kgBB tikus) secara peroral (p.o) selama 4 minggu denganmenggunakan spuit yang ujungnyadipasang sonde sehingga dapatlangsung masuk dari mulut hingga kelambung tikus.Pemrosesan Jaringan dan TulangDekalsifikasi. Lakukan proses fiksasi,dehidrasi, clearing dan impregnasi dengancara mencelupkan jaringan ke dalamlarutan sesuai dengan waktu yang telahditentukan. Lakukan embedding dan

8/17/2019 Majalah0910714054 1

6/12

penyayatan jaringan dengan mikrotomdengan tata urutan sebagai berikut :1. Alat cetak yang berbentuk logam

berbentuk siku-siku disusun di ataspermukaan kaca yang telah diolesigliserin. Penggunaan gliserin ini untukmempermudah pemisahan alat cetakdari blok parafin yang sudah beku.Dua tempat parafin cair, yaitu parafinsebagai bahan embedding dan parafinsebagai media penyesuaiantemperatur jaringan yang akanditanam, dipersiapkan dengantemperatur optimum tetapi tidakmengembangkan alat cetak blok.

2. Parafin cair pada tempat pertama

dituangkan ke dalam alat cetak hinggapenuh pada perlnukaannya, lalu jaringan ditanam pada posisi yangsesuai dengan bagian permukaan jaringan yang menempel pada kacadiusahakan rata.

3. Alat cetak dilepas bila parafin sudahcukup keras, lalu blok jaringan diberilabel dan siap disayat. Blok parafin tadiditempelkan pada alat pemegangnyayang berupa lempengan logam yangsudah dipanasi. Perhatikan sisi blok

mana yang akan dipotong, kemudiandidinginkan pada suhu kamar agarmelekat erat. Pisau mikrotom dipasangpada pegangan mikrotom membentuksudut 5-10°. Pisau harus selalu tajamdan permukaannya rata benar.

4. Water   bath  dipersiapkan denganmengatur suhu air di bawah titik lelehparafin (±48°C). Blok yang sudahmenempel pada pemegangnyadipasang pada mikrotom dan siapdilakukan pernotongan tipis dengan

ketebalan yang dikehendaki, umumnva4-8 mikron. Hasil pemotongan berupapita tipis dengan hati-hati dipindahkanke dalam water bath agar sayatan jaringan mengembang dengan balk. 

5. Sayatan diseleksi dan dipindahkan keatas kaca obyek dengan telah diolesidengan mayer albumin (putih telur)atau polisin sebagai bahan perekatnyadan sudah diberi label pada blok.Sediaan dibiarkan kering dandimasukkan ke dalam oven dengansuhu optimum (58-60°C) selama 30menit, dan sediaan siap dicat. 

Pengumpulan Data. Data dalampenelitian ini dikumpulkan dari hasilevaluasi pada kelompok tikus kontrolnegatif, positif, perlakuan I, II dan III.Kemudian dilakukan evaluasi hasil daripengukuran jumlah osteoklas.secarahistopatologi kemudian mencatat hasil darievaluasi yang telah dilakukan.Analisis Data.  Analisa data statistikmenggunakan SPSS Ver 20.0 untukWindows 7 dengan taraf kepercayaan95% (α= 0,05). Dilakukan uji normalitasdata untuk menginterpretasikan apakahsuatu data memiliki sebaran normal atautidak. Uji homogenity of varience untukmenguji berlaku atau tidaknya asumsi

 ANOVA, yaitu data yang diperoleh darisetiap perlakuan memiliki varian yanghomogen. Jika didapatkan varian yanghomogen, maka analisa dapat dilanjutkandengan uji  ANOVA. One way ANOVA digunakan untuk mengetahui apakah adaefek bermakna dari treatment yangdilakukan pada rata-rata dua atau lebihkelompok. Regresi korelasi pearsondigunakan untuk mengatahui dose effectrelationship.

HASIL PENELITIAN.Hasil. Pada penelitian eksperimental inihewan coba dibagi menjadi 5 kelompokyang diberikan perlakuan berupaovariektomi, kecuali pada kelompokpertama yang merupakan kontrol negatif.Tiga kelompok terakhir dilakukanpemberian ekstrak etanol biji Kakaodengan dosis berbeda, yaitu 125, 250 dan500 mg/kgbb, masing-masing dosisdiberikan sebanyak 2 cc per tikus. Setelah8 minggu dilakukan pengambilan data

dengan mengambil preparat tulang tibiatikus wistar yang merupakan hewan coba,lalu dibuat menjadi preparat histologisdengan pemotongan bidang tranversal.Penentuan rata-rata sel osteoklasdilakukan secara manual denganmenghitung sel osteoklas melalui 4lapangan pandang preparat histologisdibawah pemeriksaan mikroskop denganpembesaran 400x, kemudian hasilnyadirata-rata. Hasil pengukuran danpengamatan jumlah sel osteoklas tikus(Rattus norvegicus) kontrol (-), kontrol (+)dan perlakuan adalah sebagai berikut:

8/17/2019 Majalah0910714054 1

7/12

Tabel 5.1 Hasil Pengukuran Jumlah sel osteoklas

KelompokTikus

Rerata

StandarDeviasi

1 2 3 4 5 (SD)

K(-) 1.25 1 1 0.75 0.5 0.9 0.25495K(+) 2.75 2.75 3.75 5.25 3.25 3.55 0.92736

P 1 1.25 1.5 1.75 1.5 1.25 1.45 0.18708

P 2 0.75 1.25 1 1.25 1.5 1.15 0.25495

P 3 0.25 0.5 0.25 0.75 1.25 0.6 0.37417

Gambar 5.1 Potongan tranversal tulang tibia tikus dengan pengecatan HE dan pembesaran400x dengan mikroskop olympus photo slide BX51 dengan kamera DP71 12 megapixel.

Keterangan kelompok :K (-) = Kontrol Negatif (Normal)K (+)= Keadaan ovariektomi 8 mingguP1 = Keadaan ovariektomi 4 minggu +

Ekstrak etanol biji Kakao 125mg/kgBB 4 minggu

P2 = Keadaan ovariektomi 4 minggu +Ekstrak etanol biji Kakao 250mg/kgBB 4 minggu

P3 = Keadaan ovariektomi 4 minggu +Ekstrak etanol biji Kakao 500mg/kgBB 4 mingguSetelah dilakukan pengamatan

dan perhitungan jumlah osteoklas darisemua kelompok perlakuan padabeberapa lapangan pandang, maka hasilperhitungan osteoklas yang dibuat padatabel 5.1

Dari gambar mikroskopis dandiagram batang dapat dilihat bahwa padakelompok tikus tanpa ovariektomi dan

tanpa pemberian ekstrak etanol biji kakao(K (-) = (0,90), Osteoklas tampak dalam jumlah yang normal. Pada kelompok tikus8 minggu pasca ovariektomi dan tanpapemberian ekstrak etanol biji kakao (K (+)= 3,55) jumlah sel osteoklas terlihat lebih

banyak. Pada kelompok tikus 4 minggupasca ovariektomi kemudian 4 minggupemberian ekstrak etanol biji Kakao dosis125mg/kgBB (P1 = 1,45) jumlah selosteoklas terlihat lebih tinggi darikelompok kontrol negatif namun lebihrendah dari kelompok kontrol positif. Padakelompok tikus 4 minggu pascaovariektomi kemudian 4 minggupemberian ekstrak etanol biji Kakao dosis250mg/kgBB (P2 = 1,15) jumlah selosteoklas masih terlihat lebih tinggi darikelompok kontrol negatif namun lebihrendah dari kelompok kontrol positif danlebih rendah dari perlakuan dosis 125

8/17/2019 Majalah0910714054 1

8/12

mg/kgBB. Pada kelompok tikus 4 minggupasca ovariektomi kemudian 4 minggupemberian ekstrak etanol biji Kakao dosis500mg/kgBB (P3 = 0,60) jumlah selosteoklas terlihat lebih sedikit darikelompok kontrol negatif dan jauh lebihrendah dari kelompok kontrol positif danlebih rendah lagi dari perlakuan dosis 250mg/kgBB.

Pemberian ekstrak etanol bijikakao nampaknya mempengaruhi jumlahsel osteoklas tulang tibia tikus jikadibandingkan dengan kelompok tikus 8minggu pasca ovariektomi, yaitu denganbertambahnya dosis pemberian ekstraketanol biji kakao menunjukkan semakin

menurunnya jumlah sel osteoklasmendekati jumlah sel osteoklas padakelompok normal.Uji Normalitas Data. Uji statistik untukmenentukan normalitas data denganmenggunakan uji Kolmogorov-smirnov  dan Shapiro-Wilk , dimana suatu datadikatakan memiliki sebaran yang normal jika p > 0,05 (Dahlan, 2004). Berdasarkanpengujian normalitas data denganmenggunakan uji Kolmogorov-smirnovdidapatkan bahwa data untuk semua

kelompok memiliki sebaran normaldengan nilai p > 0,05, begitu juga denganmenggunakan uji Shapiro-Wilk   didapatkanbahwa data untuk semua kelompokmemiliki sebaran normal dengan nilai p >0,05, sehingga p diterima dan dapatdisimpulkan bahwa data variabel tersebutmenyebar mengikuti sebaran normal.Dengan demikian dapat dilakukanpengujian dengan Anova karena syaratkenormalan data telah terpenuhi.Uji Homogenitas Varian. Untuk

menentukan apakah data jumlah selosteoklas memiliki varian yang berbedaatau tidak dengan menggunakan ujihomogenitas Levene test . Pada ujihomogenitas Levene suatu data dikatakanmemiliki varian yang normal bila nilaisignifikansi p > 0,05 (Dahlan, 2004). Padatabel uji homogenitas didapatkan bahwadata memiliki varian yang sama (p > 0,05)dengan nilai p = 0,341 Dengan demikianmaka analisa data dapat dilakukandengan menggunakan uji One-way Anova.Uji Oneway ANOVA.  Analisis denganmenggunakan uji Oneway ANOVAbertujuan untuk mengevaluasi perbedaan

nilai jumlah osteoklas antar kelompok.Perbedaan rata  –  rata sel osteoklasdianggap bermakna jika nilai p

8/17/2019 Majalah0910714054 1

9/12

2. Pada kelompok dengan pemberianekstrak etanol biji kakao dosis125mg/kgBB (P1), 250mg/kgBB (P2),dan 500mg/kgBB (P3) pada tikus,menunjukkan jumlah sel osteoklastidak berbeda bermakna dibandingkandengan kelompok tikus kontrol normalyang tidak diberi perlakuan apa-apa(K-),

3. Pada kelompok dengan pemberianekstrak etanol biji kakao dosis 125mg/kgBB, 250mg/kgBB (P2), dan500mg/kgBB (P3) menunjukkan jumlah sel osteoklas berbedabermakna bila dibandingkan dengankelompok tikus 8 minggu pasca

ovariektomi (K+).4. Pada kelompok dengan pemberianekstrak etanol biji kakao 125mg/kgBB(P1), 250mg/kgBB (P2), dan500mg/kgBB (P3) menunjukkanbahwa jumlah sel osteoklas tidakberbeda bermakna antar kelompok.Namun terdapat perbedaan bermaknaantara 125mg/kgBB (P1) dan500mg/kgBB (P3).

Sehingga dapat disimpulkanbahwa terdapat perbedaan yang

bermakna antara kelompok satu dengankelompok yang lainnya dan ada juga yangtidak.Homogeneous Subsets. Untukmelengkapi hasil dari uji Tukey  digunakanHomogeneous Subsets. Pada analisis ini

didapatkan ada beberapa kelompok yangberbeda secara signifikan dan didapatkanada tiga subset yang berbeda secarasignifikan.

Dapat dilihat bahwa adanyaperbedaan yang signifikan antara 5

kelompok. Kelompok kontrol negatifdengan kontrol positif menunjukkanperbedaan yang nyata. Kelompok kontrolpositif dengan dosis 1 (dosis 125mg/kgBB), dosis 2 (dosis 250 mg/kgBB)dan dengan dosis 3 (dosis 500 mg/kgBB)masing-masing menunjukkan adanyapenurunan osteoklas yang signifikan.Sedangkan kelompok dosis 2 dankelompok dosis 3 menunjukkanpenurunan osteoklas yang tidak terlalubanyak, hal ini kemungkinan disebabkankarena dosis biji srikaya sudah maksimalpada dosis 2 (1mg/grBB) sehingga jikadiberikan dosis yang lebih besar dari 250

mg/kgBB maka tidak menunjukkan adanyapenurunan osteoklas yang tidak terlalusignifikan. Uji Korelasi-Regresi. Untuk mengetahuihubungan antara perlakuan (pemberianekstrak etanol biji kakao) denganpenurunan jumlah sel osteoklas digunakanuji korelasi-regresi (lihat lampiran...), untukuji korelasi regresi didahului dengan hasiluji korelasi pearson dikarenakan Analisiskorelasi pearson digunakan untukmengukur kekuatan korelasi antaraekstrak etanol biji kakao denganosteoklas, dan untuk menentukan arahkorelasi, yaitu positif atau negatif.Sedangkan analisis Regresi yang dalam

penelitian ini digunakan uji regresi linieruntuk mengetahui sejauh mana hubunganantara peningkatan dosis ekstrak etanolbiji kakao dengan penurunan jumlahosteoklas.

Korelasi dapat positif dan negatif.Korelasi positif menunjukkan arah yangsama hubungan anatar variabel, artinya jika variabel 1 besar maka variabel 2semakin besar pula. Sebaliknya korelasinegatif menunjukkan arah yangberlawanan, artinya jika variabel 1 besar,

maka variabel 2 menjadi kecil. Signifikansihubungan dua variabel dapat dianalisisdengan ketentuan, jika probabilitas atausignifikansi < 0,05, hubungan keduavariabel signifikan. Jika probabilitas atausignifikansi > 0,05 hubungan keduavariabel tidak signifikan.Interpretasi perhitungan statistik(lampiran...) korelasi pearson adalahsebagai berikut:

1. Kekuatan korelasi (r)= -.871dengandemikian terdapat korelasi yang

kuat antara dosis ekstrak etanol bijikakao terhadap jumlah selosteoklas tikus Wistar.

2. Arah korelasi adalah negatif,sehingga semakin besar dosisekstrak etanol biji kakao, makasemakin kecil pula jumlah selosteoklas tikus Wistar

3. Nilai p= 0, 000, dengan demikianterdapat korelasi yang signifikanantara dosis ekstrak etanol bijikakao terhadap jumlah osteoklastikus Wistar

8/17/2019 Majalah0910714054 1

10/12

PEMBAHASANPenelitian ini dilaksanakan dengan

tujuan untuk mengetahui pengaruh ekstraketanol biji kakao terhadap jumlahosteoklas tulang tibia tikus Rattusnorvegicus pasca ovariektomi untukmemperlambat progresi osteoporosis.

Berdasarkan penelitian Tanaka etal  (2003) hilangnya hormon steroid setelahovariektomi menyebabkan tingginyaresorbsi tulang dibanding tulang yangterbentuk karena hilangnya esterogenakan menginduksi osteoclastogenesis.Dengan menurunnya estrogen, stressoksidatif juga akan meningkat sehingga jumlah sel osteoblas akan menurun,

kemudian mempercepat kerusakan tulang(Almeida, 2009). Wanita yang telahmengalami menopause juga menunjukkanpeningkatan konsentrasi IL-1 sampai IL-6(Sudoyo, 2007). Hasil penelitian untukkelompok tikus 8 minggu pascaovariektomi didapatkan jumlah selosteoklas meningkat secara signifikan jikadibandingkan dengan kelompok tanpaovariektomi (kelompok kontrol negatif).

Estrogen berperan menurunkanproduksi berbagai sitokin oleh bone

marrow stromal cell dan sel-selmononuklear, seperti IL-1, IL-6, dan TNF-αyang berperan meningkatkan kerjaosteoklas.  Estradiol (salah satu jenisesterogen) dapat menghambat pelepasanTNF-α oleh monosit (Sudoyo, 2007).Estrogen juga mengurangi stress oksidatifsehingga osteoblas dapat berdeferensiasidan mencegah apoptosis dari osteoblas.Stress oksidatif adalah faktor patogenikyang penting pada osteoporosis, karenamemicu meningkatnya apoptosis dari

osteosit dan osteoblas, sehinggamenurunkan jumlah dari osteoblas danpembentukan tulang melalui Wnt/β-cateninsignalling  (Shin, 2007). Esterogen mampumempengaruhi gen-gen yang ada padaosteoklas dan jalur lain diluar osteoklasdalam hal meregulasi proses formasi,proliferasi, apoptosis, dan kapasitasiosteoklas untuk meresorbsi tulang yangberguna untuk menjaga keutuhan strukturdan fungsi dari tulang (Srivastava,2000).Pada tikus kelompok normal yang tidakdiberi perlakuan ovariektomi sepertikelompok lainnya, terdapat kadar

esterogen yang cukup untuk mengaturaktivitas osteoklas.

Hasil penelitian terhadap kelompokperlakuan menunjukkan terjadinyapenurunan jumlah sel osteoklas secarasignifikan pada tikus yang diovariektomi 8minggu dengan ekstrak etanol biji kakaodosis 125mg/kgBB, 250mg/kgBB, dan500mg/kgBB bila dibandingkan dengankelompok yang diovariektomi 8 minggudan tidak diberikan terapi apapun. Hasilpenelitian menunjukkan tidak ada bedasignifikan antara kelompok normal yangtidak diberikan terapi apapun dengansemua kelompok tikus 8 minggu pascaovariektomi dengan terapi ekstrak etanol

biji kakao yang ditunjukkan oleh diagrambatang (tabel 5.2), yang menunjukkanbahwa penurunan osteoklas padakelompok tikus 8 minggu pascaovariektomi dengan terapi ekstrak etanolbiji kakao mendekati arah normal. Antarakelompok perlakuan yang diovariektomi 8minggu dengan terapi ekstrak etanol bijikakao dosis 125 mg/kgBB, 250 mg/kgBBdan 500mg/kgBB tidak menunjukkanperbedaan yang signifikan dalammenurunkan jumlah osteoklas.

Esterogen memegang perananpenting dalam mencegah ataumeringankan osteoporosis dengan caramenurunkan aktivtas osteoklas, sehinggaterjadi kesimbangan antara prosespembentukan dan penghancuran tulang(remodeling). Polifenol diketahui tidakhanya berperan dalam pencegahanpenyakit jantung dan kanker, tetapi jugapencegahan osteoporosis karena potensikarakter antioksidan dan antiinflamasi.Flavanoid ( procyanidins) dalam kakao

 juga diketahui dapat mengatur keterlibatansitokin dalam respon inflamasi(Subhashini, 2010). Selain itu Polifenolgolongan Katekin juga menghambatproduksi dari TNF-α, IL-6 dan IL-8 (sitokinpro-inflamasi) melalui prosespenghambatan intraseluler dari levelCA(2+), ERK1/2 dan aktivasi NF-κB. sertamengurangi stress oksidatif denganmenghambat aktivasi Nuclear Faktor-κB(NF-κB), sebuah faktor transkripsi yangdiperlukan untuk menginduksi iNOS(inducible Nitric Oxide synthase) (Shin,2007).

8/17/2019 Majalah0910714054 1

11/12

 Ada perbedaan yang signifikanantara dosis 125mg/kgBB, dan500mg/kgBB dapat disebabkankemungkinan dosis yang diberikan beradadalam rentang jangkauan yang panjang,sehingga penurunan jumlah sel osteoklasantara dosis I dan III terlihat signifikansecara statistik. Hal ini disebabkan belumadanya penelitian tentang rentang dosispolifenol yang dapat mempengaruhi jumlah sel osteoklas sebelumnya. Namunmelalui penghitungan jumlah sel osteoklassecara manual antara dosis I, II, dan III jumlah osteoklas masih tetap mengalamipenurunan seiring bertambahnya dosisekstrak etanol biji kakao.

Pada hasil analisa statistikdidapatkan korelasi yang kuat (r= - 0,871)dan signifikan(p= 0,000) mengenaihubungan antara peningkatan dosisekstrak etanol biji kakao dengan jumlahsel osteoklas tikus wistar. Arah korelasiadalah negatif, yang berati semakin besardosis ekstrak etanol biji kakao, makasemakin kecil jumlah sel osteoklas tikuswistar. Hasil penelitian ini semakinmenguatkan hipotesa penelitian bahwapemberian ekstrak etanol biji kakao dapat

menurunkan jumlah sel osteoklas tikuswistar. Pada pemberian ekstrak etanol bijikakao 250mg/kgBB didapatkan bahwaekstrak etanol biji kakao sudahmemberikan dampak dalam menurunkan jumlah osteoklas dan sudah mendekati jumlah osteoklas tikus kelompok normal,namun pada pemberian ekstrak etanol bijikakao 500mg/kgBB didapatkan bahwaekstrak etanol biji kakao mampumenurunkan jumlah osteoklas melebihi jumlah osteoklas tikus kelompok normal.

Beberapa faktor lain yang perludiperhatikan dalam penelitian ini adalahhasil preparat yang kurang memuaskanakibat metode dekalsifikasi menggunakanON CALK yang bersifat dekalsifikasiagresif, serta metode pengolahan kakaoyang dapat digunakan dalam diet manusiayang dapat diteliti lebih lanjut untukmengeliminasi kandungan lain yang tidakdiperlukan atau yang mempengaruhi efekterapi Kakao.

Hal ini membuktikan hipotesabahwa pemberian ekstrak etanol biji kakaodapat menurunkan jumlah osteoklastulang tibia pada tikus Wistar pasca

ovariektomi, yang ditandai denganmenurunnya jumlah sel osteoklas padakelompok tikus pasca ovariektomisehingga dapat memperlambat progresiosteoporosis.

Dari mekanisme kerja polifenolsebagai antiinflamasi dan mengurangistress oksidatif yang dapat menghambatkenaikan jumlah osteoklas pada reaksidestruksi tulang tibia maka dapatdikatakan bahwa polifenol kakao dapatberpengaruh pada penurunan jumlahosteoklas, sehingga ekstrak etanol bijiKakao dapat membuat tulang tibia tetappadat dan berfungsi optimal dalammenyangga tubuh.

Kesimpulan. Berdasarkan hasil penelitiandan pembahasan, maka dapatdisimpulkan bahwa ekstrak etanol bijikakao (Theobromin cocoa L.) dapatmengurangi jumlah sel osteoklas tulangtibia tikus putih (Rattus norvegicus) paskaovariektomi dengan rincian sebagaiberikut:1. Terdapat peningkatan jumlah sel

osteoklas tulang tibia pada tikus wistar(Rattus norvegicus) pasca ovariektomi.

2. Terdapat penurunan jumlah selosteoklas tulang tibia pada tikus wistar(Rattus norvegicus) pasca ovariektomisetelah pemberian ekstrak etanol bijikakao (Theobroma cacao L).

3. Arah korelasi negative (Kekuatankorelasi (r)= -0.871) antara dosisekstrak etanol biji kakao (Theobromacacao L) dengan jumlah sel osteoklastulang tibia tikus wistar (Rattusnovergicus), yang berarti semakinbesar dosis ekstrak etanol biji kakao

(Theobroma cacao L) yang diberikan,maka semakin kecil jumlah selosteoklas tulang tibia yang ditemukan.

4. Dosis ekstrak etanol biji kakao(Theobroma cacao L) optimum yangdapat menurunkan jumlah selosteoklas tulang tibia tikus wistar(Rattus norvegicus) pasca ovariektomiadalah dosis 250mg/kgBB.

DAFTAR PUSTAKA

 Almeida, M. 2009. Estrogens AttenuateOxidative Stress and theDifferentiation and Apoptosis of

8/17/2019 Majalah0910714054 1

12/12

Osteoblasts by DNA-Binding-Independent Actions of the ERα. JBone Miner Res, 25(4): 769 –781.

Joelijanto, R. 2004. Pengaruh OvariektomiTerhadap Jaringan PeriodontalPada Tikus Wistar. TesisKekhususan Biologi KedokteranProgram Studi Ilmu Biomedik.Program Pascasarjana. FakultasKedokteran Universitas Indonesia.

Osman H, Nasarudin R, Lee S.L. Extractsof cocoa (Theobroma cacao L.)leaves and their antioxidationpotential. Food Chemisty , 2004; 86

41 –46.Othman A., Ismail A., Ghani N.A., Adenan,

I., Antioxidant Capacity andPhenolic Content of Cocoa Bean.Food  Chemistry 2007;1523-1530.

Shen, C.-L., Yeh, J. K., Cao, J., & Wang,J.-S. 2009. Green Tea and BoneMetabolism. Nutr Res , 437-456.

Shin, H., Kim, S., & Jeong, H. 2007.Epigallocatechin-3-gallate inhibitssecretion of TNF-alpha, IL-6 andIL-8 through the attenuation ofERK and NF-kappaB in HMC-1cells. Int Arch Allergy Immunol   ,

142  (4), 335-44.Solimun. 2001. Diklat metodologi

penelitian LKIP dan PKM.Kelompok Agrokomples.Universitas Brawijaya. Malang. Hal13

Srivastava. 2000. Esterogen decreaseOsteoclast Formation by DownRegulating Receptor Activator ofNF-Kb Ligand (RANKL)-inducedJNK Activation.(http://www.jbc.org/conte

nt/276/12/8836.full) Subhashini, R., Mahadeva Rao, U.,

Sumathi, P., & Gunalan, G. 2010. A Comparative Phytochemical Analysis of Cocoa and Green Tea.Indian Journal of Science andTechnology  , 3 (2), 188-192.

Sudoyo, A. W., setiyohadi, B., Alwi, I.,Simadibrata K, M., & Setiati, S.2007. Buku Ajar Ilmu PenyakitDalam. Jakarta: Interna Publishing.

http://www.jbc.org/content/276/12/8836.fullhttp://www.jbc.org/content/276/12/8836.fullhttp://www.jbc.org/content/276/12/8836.fullhttp://www.jbc.org/content/276/12/8836.full