I. PENDAHULUAN

A. Latar BelakangSelama mempelajari mikroba, kita tahu satu hal bahwaukuran mikroorganismeatau mikrobasangatkecil, oleh karena itu informasi yang dapat diperoleh tentang sifat-sifatnya dari pemeriksaan terhadapindividuitu terbatas. Pengamatan sifat-sifat seperti bentuk, susunan, permukaan, pengkilatan dan sebagainya dapat dilakukan dengan pandangan biasa tanpa menggunakkan mikroskop, pengamatan ini disebut pengamatanmakroskopi.Supaya sifat-sifat tersebut tampak jelas, bakteri perlu dibiakkan pada medium padat yaitu dengan cara isolasi bakteri.Isolasi adalah mengambil mikroorganisme yang terdapat di alam danmenumbuhkannya dalam suatu medium buatan.Populasi mikroba di alam sekitar kita sangat besar dan sangat komplek. Beratus-beratus spesies berbagai mikroba biasanya menghuni bermacam-macam bagian tubuh kita, termasuk mulut, saluran pencernaan dan kulit. Sebagai contoh, sekali bersin dapat menyebarkan beribu-ribu mikroorganisme (Pelczar, 1986). Bakteri tersebar sangat luas baik ditanah, air dan udara, bila hendak mengisolasi bakteri dari tanah/ benda padat yang mudah tersuspensi atau terlarut, atau zat cair lain maka dilakukan serangkaian pengenceran (dilution series) terhadap zat tersebut. Sumber isolat dari bakteri benda yang liat atau padat, misatnya daging maka zat tersebut dihancurkan terlebih dahulu. Tehadap bakteri yang hanya terdapat dipermukaan maka pengenceran dilakukan terhadap air tempat zat tersebut dicelupkan/ direndam.Dan jika bakteri hendak diisolasi dari udara, cukup dengan membuka cawan petri yang berisi media agar steril beberapa saat. Di dalam laboratorium mikrobiologi, populasi bakteri ini dapat diisolasi menjadi kultur murni yang terdiri dari satu jenis yang dapat dipelajari morfologi, sifatdan kemampuan biokimiawinya (sutedjo, 1996).Isolasi merupakan cara untuk memisahkan atau memindahkan mikroba tertentu dari lingkungan, sehingga diperoleh kultur murni atau biakkan murni. Kultur murni ialah kultur yang sel-sel mikrobanya berasal dari pembelahan dari satu sel tunggal.Prinsip dari isolasi mikroba adalahmemisahkan satu jenis mikroba dengan mikroba lainnya yang berasal dari campuranbermacam-macam mikroba.Cara isolasi bakteri dilakukan dengan metode tuang (pour plate), metode goresan (streak plate), metode miring (slant culture), dan metode tegak (stab culture).Praktikum kali ini kami semua menggunakan medium NA (Nutrien Agar). Dimana medium ini berfungsi sebagai tempat mikroba itu tumbuh.Mikroorganismeyangdibiakkan di laboratorium pada medium yang terdiri dari bahan nutrient. Biasanya pemilihan medium yang dipakai bergantung kepada banyak faktor seperti seperti apa jenis mikroorganisme yang akan ditumbuhkan. Perbenihan untuk pertumbuhan bakteri agar dapat tetap dipertahankan harus mengandung semua zat makanan yang diperlukan oleh organisme tersebut. Faktor lain seperti PH, suhu, dan pendinginan harus dikendalikan dengan baik.

B. TujuanMempelajari dan mempraktekan beberapa tahapan dalam isolasi mikroba.

II. TINJAUAN PUSTAKAIsolasi adalah mengambil mikroorganisme yang terdapat di alam dan menumbuhkannya dalam suatu medium buatan. Prinsip dari isolasi mikroba adalahmemisahkan satu jenis mikroba dengan mikroba lainnya yang berasal dari campuran bermacam-macam mikroba. Hal ini dapat dilakukan dengan menumbuhkannya dalam mediapadat sel-sel mikroba akan membentuk suatu koloni sel yang tetap pada tempatnya.Isolasi bakteri atau biakan yang terdiri dari satu jenis mikroorganisme (bakteri) dikenal sebagaibiakan murniataubiakan aksenik.Biakan yang berisi lebih dari satu macam mikroorganisme (bakteri) dikenal sebagaibiakan campuran, jika hanya terdiri dari dua jenis mikroorganisme, yang dengan sengaja dipelihara satu sama lain dalam asosiasi, dikenal sebagaibiakan dua-jenis.Persyaratan utama bagi isolasi dan kultivasi fage adalah harus adanya kondisioptimumuntuk pertumbuhan organisme inangnya. Sumber bakteriofage yang paling baik dan paling utama adalah habitat inang. Sebagai contoh fage koli yang di jumpai di dalam pencernaan dapat diisolasi dari limbah atau pupuk kandang. Hal ini dilakukan dengan sentifugasi atau filtrasi bahan sumbrnya dan penambahan kloroform untuk membunuh sel-sel bakterinya (Adams, 2000).Prinsip dari isolasi mikroba adalah memisahkan satu jenis mikroba dengan mikroba lainyang berasal dari campuran bermacam-macam mikroba. Hal ini dapat dilakukan dengan menumbuhkannya dalam media padat, sel-sel mikroba akan membentuk koloni sel yang tetap pada tempatnya (Nur, I. dan Asnani, 2007).Dikenal beberapa cara atau metode untuk memperoleh biakan murni dari suatubiakan campuran. Dua diantaranya yang paling sering digunakan adalah metode cawan gores dan metode cawan tuang. Yang didasarkan pada prinsip pengenceran dengan maksud untuk memperoleh spesies individu. Dengan anggapan bahwa setiap koloni dapat terpisah dari satu jenis sel yang dapat diamati (Afrianto, 2004). Biakan murni diperlukan dalam berbagai metode mikrobiologis, antara lain digunakan dalam mengidentifikasi mikroba. Untuk mengamati ciri-ciri kultural morfologi, fisiologi dan serologi dibutuhkan mikroba yang berasal dari satu spesies(Dwidjoseputro, 2005).Ada berbagai cara untuk mengisolasi bakteri dalam biakan murni yaitu, cara pengenceran, cara penuanagan, cara penggesekan, atau penggoresan, cara penyebaran, cara pengucilan 1 sel, dan cara inokulasi pada hewan. Masing-masing mempunyai kelebihan dan kekurangan. (Waluyi, 2007).Untuk metode streak plate misalnya, mikroba diletakan didalam pada ujung palte mengguanakan ose, lalu digoreskan pada permukaan medium agar tersebut dengan pola tertentu yang khas. Ada pula metode Pour Plate atau penuanga. Metode ini dapat digunakan untuk penghitungan bakteri secara langsung. Karena sebelum dituang bakteri tersebut diencerkan terlebih dahulu. Sehingga syarat penghitungan langsung yaitu dalam 1 media terdapat 30-300 koloni dapat terpenuhi (Prescott et.al.2008).Dalam keadaan sebenarnya (di alam bebas) tidak ada bakteri yang hidup tersendiri terlepas dari spesies lainnya. Kerapkali bakteri patogen kedapatan bersama-sama bakteri saproba. Yang terakhir ini boleh disebut penyerbu yang membonceng (secondary invaders). Mungkin juga bakteri patogen yang membonceng. Untuk menentukan siapa pembonceng dan siapa yang diboncengi diberikan pedoman siapa yang kedapatan di situ lebih dulu, dan siapa yang datang terkemudian.Mikroorganisme dibiakkan di laboratorium pada medium yang terdiri dari bahan nutrient. Biasanya pemilihan medium yang dipakai bergantung kepada banyak faktor seperti seperti apa jenis mikroorganisme yang akan ditumbuhkan.Perbenihan untuk pertumbuhan bakteri agar dapat tetap dipertahankan harus mengandung semua zat makanan yang diperlukan oleh organisme tersebut. Faktor lain seperti PH, suhu, dan pendinginan harus dikendalikan dengan baik (Buckle, 2007).Selain untuk tujuan diatas medium juga memiliki fungsi lain seperti tempat untuk mengisolasi, seleksi, evaluasi dan diferensiasi biakan yang didapatkan. Agar tiap-tiap medium memilki karakteristik yang sesuai dengan tujuan sehingga seringkali digunakan beberapa jenis zat tertentu yang mempunyai pengaruh terhadap pertumbuhan dan perkembangbiakan mikroba (Suriawiria, 2005). Beberapa indikasi pembiakan pada laboratorium mikrobiologi meliputi:1.Pengasingan (isolasi) mikroba pada biakan bakteri2.Menunjukan sifat khas mikroba.3.Untuk menentukan jenis mikroba yang diisolasi dengan cara-cara tertentu.4.Untuk mendapatkan bahan biakan yang cukup untuk membuatantigendan percobaan serologi lainnya.5.Menentukan kepekaan kuman terhadap antibiotik.6.Menghitung jumlah kuman7.Mempertahankan biakan mikroba.Mikroorganisme tidak memerlukan banyak ruangan untuk perkembangannya, sebab itu media buatan(agar) dapat dimasukkan ke dalam sebuah tabung percobaan labu atau cawan Petri. Pada permulaannya tabung atau cawan Petri harus dalam keadaan steril (bebas dari setiap mikroorganisme hidup) lalu setelah itu dimasukkan mikrobia yang diinginkan, tabung atau cawan harus dilindungi terhadap kontaminasi dari luar.Sumber utama pencemaran dari luar adalah udara, yang banyak mengandung mikroorganisme yang berterbangan. Bentuk cawan petri, dengan tutup yang saling menyelubungi, dirancang untuk mencegah pencemaran udara. Pencemaran tabung atau labu dihindari dengan cara menyumbat mulutnya dengan penutup yang cocok, biasanya dengan kapas. Permukaan luar cawan biakan yang menjadi sasaran pencemaran, dan bagian dalam labu atau tabung akan tercemar bila dibuka untuk memasukkan atau mengeluarkan bahan. Bahaya ini dapat dihindari dengan cara membakar bibir atau pinggiran cawan, tabung atau labu dalam api, segera setelah penutup dibuka dan dibakar sekali lagi pada waktu akan ditutup.Ada empat cara isolasi bakteri yaitu : Metode tuang atau pour plateBeberapa ml suspensi bakteri dicampur dengan medium yang masih cair (belum membeku) dengan demikian akan diperolehpiaraan adukan.Digunakan untuk mengencerkan atau mengisolasi yang terdapat pada contoh. Setelah inkubasi pada suhu dan waktu tertentu, koloni akan tumbuh pada permukaan dan bagian bawah agar. Metode goresan atau streak plateUjung kawat imokulasi yang membawa bakteri digesekkan atau digoreskan dengan bentuk zig-zag pada permukaan agar-agar dalam cawan Petri sampai meliputi seluruh permukaan. Untuk memperoleh hasil yang baik diperlukan keterampilan, yang biasanya diperoleh dari pengalaman. Metode cawan gores yang dilakukan dengan baik kebanyakan akan menyebabkan terisolasinya mikroorganisme yang diinginkan. Dua macam kesalahan yang umum sekali dilakukan adalah tidak memanfaatkan permukaan medium dengan sebaik- baiknya untuk digores sehingga pengenceran mikroorganisme menjadi kurang lanjut dan cenderung untuk menggunakan inokulum terlalu banyak sehingga menyulitkan pemisahan sel-sel yang digores. Agar miring atau slant cultureUjung kawat yang membawakan bakteri digesekkan pada permukaan agar-agar miring dalam tabung reaksi.Dapat dilakukan dengan cara menggoreskan secaa zig-zag pada permukaan agar miring menggunakan jarumoseyang bagian atasnya dilengkungkan. Caraini juga dilakukan pada agar tegak untuk meminimalisir pertumbuhan mikroba dalam keadaan kekurangan oksigen (Rusdimin, 2003). Agar tegak atau stab cultureUjung kawat yang membawakan bakteri ditusukkan pada media padat (agar-agar) dalam tabung reaksi, berbeda dengan slant culture permukaan agar-agar ini tidak miring. Media agar setengah padat dalam tabung reaksi, digunakan untuk menguji gerak bakteri secara makroskopisKarakteristik koloni bakteri hasil inokulasi merupakan salah satu bagian dalam identifikasi bakteri. Beberapa bentuk koloni spesifik koloni bakteri pada media agar datar yaitu (SutedjodalamSari, 2009):1.UkuranTitikKecilSedang Besar2.Warna koloniBakteri yang hidup hampir tidak berwarna dan tidak kontras dengan air, di mana sel-sel bakteri tersebut disuspensikan. Oleh karena itu pengamatan tanpa pewarnaan menjadi lebih sukar dan tidak dapat digunakan untuk melihat bagian-bagian sel dengan teliti.3.Bentuk koloniBundarTidak beraturanRhizoid (tersebar seperti akar)

4.Bentuk bagian tepi koloni (margin)Rata (entire)Tidak rata, bergelombang secara beraturan (lobate)Bergelombang (undulate)Bergerigi(serrate)Seperti filamen (filamentous)

III. METODE

A. Alat dan Bahan1. AlatAlat-alat yang digunakan pada praktikum kali ini adalah cawan petri steril, tabung reaksi, jarum ose, dan lampu spirtus.2. BahanBahan-bahan yang digunakan pada praktikum kali ini adalah medium NA dan sampel sebagai sumber mikroba meliputi air kran, tanah, mendoan, dan es teh.

B. Prosedur Kerja1. Metode goresan (streak plate)Medium NA steril disiapkan dengan suhu sekitar 45 o C - 50 o C

Salah satu cara goresan mikroba pada agar cawan adalah goresan kuadran1 ose bakteri (dari acara 1 dalam medium NA) digoreskan pada permukaan agar dalam cawan petri,selama digoreskan tutup cawan dibuka secukupnyaMedium dituangkan dalam cawan petri steril, diratakan dan dibiarkan dingin memadat

Cawan dibagi 4 bagian, bagian pertama digores sebanyak 3 baris

Goresan berikutnya pada bagian kedua sebanyak 3 baris disambungkan dengan goresan pertama

Kemudian cawan petri dibungkus dan di inkubasi selama 2 hariSetiap akan digunakan jarum ose disemprot alkohol dan dipijarkan kemudian di dinginkan dengan cara ditempelkan pada bagian pinggir agar dalam cawanAkhir goresan pertama digunakan sebagai awal goresan kedua, demikian seterusnya

2. Agar miring (slant culture)Medium agar miring steril disiapkan dalam tabung reaksi

1 ose bakteri yang telah murni (ambil koloni yang terpisah dari lainnya) diambil dan digoreskan secara zig zag pada permukaan agar

Di inkubasi selama 2 hariGoresan dimulai dari ujung tabung (bagian bawah) sampai akhir medium (bagian atas), tabung reaksi ditutup kembali dengan kapas dan plastik

3. Agar tegak (stab culture)Medium agar tegak steril disiapkan dalam tabung reaksi

Di inkubasi selama 2 hari1 ose bakteri diambil dan ditusukkan kedalam agar kira0kira bagian. Jarum ose yang digunakan yang ujungnya runcing. Tabung reaksi ditutp dengan kapas dan plastik

IV. HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Hasil

B. PembahasanDalam praktikum isolasi bakteri, memerlukan lingkungan dan medium yang berisi zat hara untuk pertumbuhan sel, sintesis sel, keperluan energi dalam metabolisme, dan pergerakanyang sesuai dengan mikroorganisme. Medium biakan yang digunakan untuk menumbuhkan mikrobia dalam bentuk padat, semi padat, dan cair. Yang digunakan dalam praktikum adalah medium padat yaitu agar. Agar digunakan sebagai media karena tidak dapat diuraikan oleh mikroba. Media yang digunakan dalam praktikum adalah NA karena yang akan dibiakan adalah bakteri.1. Metode goresanMetode goresan terdiri dari penginokulasian biakan murni dalam hal ini digunakan sampelbakteri dari acara I dengan medium NAdalam cawan petri. Mula-mula medium NA dengan suhu 45-5000C dituangkan pada cawa petri steril, diratakan dengan cara memutar-mutarkan cawan setelah itu biarkan hingga dingin dan memadat. Setelah medium NA padat, ambil 1 ose bakteri dari biakan murni pada acara 1 kemudian goreskan pada permukaan agar selama menggores tutup cawan dibuka secukupnya. Cara menggoreskannya yaitu awalnya cawan dibagi menjadi 4 bagian kemudian goreskan bakteri pada permukaan agar dengan dibuat zigzag menyambung dari cawan bagian ke-1 sampai ke cawan bagian ke-4 tidak terputus. Pada bagian cawan ke-4 goresan tidak boleh mengenai bagian yang pertama. Setelah diinkubasi selama 2 hari akan terlihat koloni bakteri berkumpul pada goresan-goresan tersebut. Karena pada saat penggoresan yang kurang baik, akhirnya bakteri menyebar ke semua bagian cawan.Teknik ini lebih menguntungkan jika ditinjau dari sudut ekonomi dan waktu, tetapi memerlukan ketrampilan-ketrampilan yang diperoleh dengan latihan. Penggoresan yang sempurna akan menghasilkan koloni yang terpisah. Inokulum digoreskan di permukaan media agar nutrien dalam cawaan petri dengan jarum pindah (lup inokulasi). Di antara garis-garis goresan akan terdapat sel-sel yang cukup terpisah sehingga dapat tumbuh menjadi koloni. Cara penggarisan dilakukan pada medium pembiakan padat bentuk lempeng. Bila dilakukan dengan baik teknik inilah yang paling praktis. Dalam pengerjaannya terkadang berbeda pada masing-masing laboratorium tapi tujuannya sama yaitu untuk membuat goresan sebanyak mungkin pada lempeng medium pembiakan (Kusirianto, 2006).Pada praktikum isolasi bakteri dengan teknik metode gores atau streak plate,kita dapat lebih jelas untuk melihat struktur atau bentuk bakteri dari masing-masing sampel. Pada kuadran 1 mungkin belum terlalu terlihat jelas bentuk bakterinya karena antar jarak koloni masih sangatlah dekat.Tetapi pada kuadran 4 karena jarak antar koloninya sudah agak jauh,sehingga kita dapat melihat dengan jelas struktur bakterinya. Dengan kita melihat hasil isolasi bakteri dengan teknik streak plate tersebut, baik pada sampel air sumur,air sungai,tanah,udara dan makanan,semuanya mengandung bakteri dengan jenis dan sturktur yang berbeda-beda. Dapat disimpulkan bahwa bakteri hidup dimana saja dan jenis serta strukturnya bermacam-macam tergantung dari dimana dia hidup.Bakteri yang dihasilkan ada bermacam-macam ukuran ada yang large dan small, dengan bentuk irregular, elevasi flat, dan margins lobate.2. Agar miring (slant culture)Metode ini hampir sama dengan streak plate, hanya saja pada metode slant culture ini (agar miring) media NA disiapkan dalam tabung reaksi dengan keadaan miring. Satu koloni bakteri diambil dari acara I dengan menggunakan jarum ose (ujungnya berbentuk bulat) dan digoreskan dengan arah zig-zag dimulai dari bawah tabung. Setelah itu diinkubasi selama 2 X 24 jam untuk melihat pertumbuhan bakteri. Dalam percobaan yang dilakukan ada pertumbuhan bakteri yang terlihatdipermukaan agar.Dimana data yang kami dapat berdasarkan bentuknya adalah spreading. Dan kebutuhan oksigen affuse.Keuntungan media agar miring ini adalah luas permukaan yang kecil sehingga peluang kontaminasi rendah dan dapat memperluas bidang untuk digunakan strain murni (indukan murni). Sedangkan kerugiannya hanya memuat sedikit mikroorganisme. Media agar untuk bakteri digunakan media NA (Nutrien agar) karena yang komposisinya ekstrak daging sapi didalamnya mengandung protein, karbohidrat, vitamin dan sedikit lemak juga terdapat adanya beberapa factor pertumbuhan yang tidak mampu mensintesis mikroorganisme (Waluyo, 2005).Dari hasil praktikum isolasi bakteri dengan metode agar miring atau slant culture.Warna bakteri yang didapat dari masing-masing sampel bakteri dar acara I adalah sama. Pada bagian ujung atas bakteri warnanya adalah kehitaman. Pada bagian tengah bakteri berwarna hijau kehitaman. Sedangkan pada ujung bawah tabung reaksi,tepatnya warna pada ujung bawah medium NA menjadi berwana kuning. Dan pada teknik agar miring, kita juga dapat melihat antara bakteri aerob dan anaerob,cukup hanya dengan dilihat dimana letak posisi bakteri itu.3. Agar tegak (stab culture)Medium yang dibuat pada metode ini tidak memakai cawan petri steril akan tetapi menggunakan tabung reaksi. Medium NA disiapkan dalam tabung reaksi, kemudian 1 ose koloni bakteri diambil dari acara Idan ditusukkan dengan menggunakan jarum ose yang ujungnya runcing. Setelah itu tabung ditutup menggunakan kapas dan plastik dan diinkubasi selama 2 hari. Setelah 2 hari inkubasi terdapat pertumbuhan mikroba pada agar ditusukkan sebelumnya. Bakteri yang tumbuh memiliki bentuk echinulate dan berdasarkan kebutuhan oksigennya yaitu affuse.Metode tusuk yaitu dengan dengan cara meneteskan atau menusukan ujung jarum ose yang didalamnya terdapat inokolum, kemudian dimasukkan ke dalam media (Winarni, 1997). Pada metode agar tegak hanya mikroba anaeroblah yang dapat hidup, karena pada agar tegak, teknik yang digunakan adalah dengan menusukan jarum ose yang didalmnya sudah terdapat bakteri kedalam agar. Dan pada bagian dalam agar yang ditusukan jarum ose tersebut tidak tersedia oksigen untuk bakteri aerob, jadi hanya bakteri anaeroblah yang dapat bertahan.

V. PENUTUP

A. KesimpulanPemilihan metode yang akan digunakan dalam mengisolasi suatu bakteri didasarkan pada tujuan percobaan/penelitian. Ketepatan penggunaan metode dengan tujuan percobaan/penelitian akan menunjang keberhasilan percobaan/penelitian. Metode-metodeyang digunakan dalam mengisolasi bakteri adalah streak plate, pour plate, slant culture dan stab culture yang masing-masing memiliki karakteristik tersendiri. Cara isolasi bakteri yang dilakukan pada praktikum ini dengan metode tuang (pour plate), metode goresan (streak plate), metode miring (slant culture), dan metode tegak (stab culture) yang semuanya menggunakan medium NA dari acara 1. Pengertian dari Isolasi adalah mengambil mikroorganisme yang terdapat di alam dan menumbuhkannya dalam suatu medium buatan. Prinsip dari isolasi mikroba adalah memisahkan satu jenis mikroba dengan mikroba lainnya yang berasal dari campuran bermacam-macam mikroba. Hal ini dapat dilakukan dengan menumbuhkannya dalam media padat sel-sel mikroba akan membentuk suatu koloni sel yang tetap pada tempatnya.B. SaranDalam percobaan kali ini praktikan sangat mengharapkan petunjuk dari para asisten, agar dapat berhati hati dalam melakukan praktikum mengingat bahan percobaan yang mengandung mikroba yang bisa saja mengkontaminasi praktikan.Dan dalam pelaksanaan praktikum, sebaiknya lebih memperhatikan dan lebih teliti lagi dalam setiap metode yang dilakukan, supaya hasilnya bisa sesuai dengan yang diharapkan. Kondisi akseptis juga harus diperhatikan, baik dari praktikan maupun alat-alat yang akan digunakan, untuk mengurangi adanya kontaminasi dari luar (udara).

DAFTAR PUSTAKAAdams, M.R. 2000. Food Microbiology. University of Surrey. Guildford. New YorkBuckle. 2007. Mikrobiologi Terapan. Yogyakarta: Universitas Gajah Mada.Http: // Nurhidayat.lecture.ub.ac.id/2011/09/metode-lectur-murni/ diakses pada tanggal 3 Juni 2016.Pelczar, M. 1986. Dasar-Dasar Mikrobiologi I. Jakarta: Erlangga.Rusdimin.2003. Mikrobiologi Dasar Dalam Praktek. Jakarta: Pt Gramedia.Sari, N. 2009. Teknik Isolasi Mikroorganisme. https://www.scribd.com/doc/24589708/Teknik-Isolasi-M-O. diakses pada 3 Juni 2016.Suriawiria, U. 2005. Mikrobiologi Dasar. Jakarta: Papas Sinar Sinanti.Sutedjo, M. 1996. Mikrobiologi Tanah. Jakarta: Rineka Cipta.Winarni, D. 1997. Diktat Teknik Fermentasi. Surabaya: Program Studi D3 Teknik Kimia FTI- ITS.Waluyo, L. 2005. Mikrobiologi Umum. Malang: MM Press.