LAPORAN TETAP PRAKTIKUM BIOKIMIA

Kromatografi Lapis Tipis (KLT)

Muhammad Merlis06101010017

Fakultas Keguruan dan Ilmu PendidikanProgram Studi Pendidikan Kimia

Universitas Sriwijaya2013

I. NOMOR PRAKTIKUM : VIII (Delapan)

II. NAMA PRAKTIKUM : Kromatografi Lapis Tipis (KLT)

III. TUJUAN PERCOBAAN : Untuk mengetahui cara pemisahan asam amino dengan cara

kromatografi lapis tipis dan menghitung harga Rf asam

amino.

IV. LANDASAN TEORI

Kromatogarafi merupakan bagian penting dalam analisa senyawa kimia, kromatografi

merupakan salah satu teknik yang digunakan untuk memisahkan zat-zat yang saling

bercampur. Begitupula dalam menganalisa asam-asam amino yang terkandung dalam suatu

protein. Beberapa tahun belakangan ini, jenis alat kromatografi terus berkembang seiring

berkembangnya ilmu pengetahuan, salah satu jenis kromatografi adalah kromatografi lapis

tipis. Kromatografi jenis ini memiliki fase diam (adsorban) berupa silika jel, alumina, atau

serbuk selulosa yang dilekatkan diatas lempeng kaca dengan ketebalan adsorban sekitar 0,1-

0,3 mm dan fase bergerak (eluen) berupa cairan. Menurut Soebagio (dalam Anonim, 2010),

Bahan adsorben sebagai fasa diam digunakan silica gel, alumina, dan serbuk selulosa. Partikel

silica gel mengandung gugus hidroksil di permukaannya yang akan membentuk ikatan

hidrogen dengan molekul-molekul polar. Alumina lebih disukai untuk memisahkan senyawa-

senyawa polar lemah, sedangkan silica gel lebih disukai untuk memisahkan molekul-molekul

seperti asam-asam amino dan gula. Magnesium silikat, kalsium silikat, dan arang aktif

mungkin juga dapat digunakan sebagai adsorben. Prinsip kerja Kromatografi ini secara umum

sama dengan kromatografi kertas, yaitu sampel dipisahkan dengan cara diteteskan pada

adsobran kemudian eluen dibiarkan meresap sambil membawa komponen-komponen yang

terdapat dalam sampel sesuai dengan sifat masing-masing zat. Langkah terakhir adalah

dengan melihat jarak perpindahan tiap zat dengan cara deteksi noda, beberapa cara yang dapat

dilakukan adalah dengan disinari sinar ultra violet atau dengan cara direaksikan dengan zat

kimia lain yang dapat menghasilkan warna.

Asam amino merupakan bagian penyusun suatu protein, asam amino dapat

diidentifikasi dengan cara pemisahan dari campuran menggunakan kromatografi lapis tipis.

Setiap asam amino memiliki ciri-ciri khusus baik dari jarak tempuh perpindahan noda atau

warna yang dihasilkan dari reaksi terhadap suatu zat kimia. Identifikasi menggunakan

kromatografi lapis tipis didasarkan pada jarak tempuh suatu asam amino yang dibawa oleh

eluen pada fasa diam. Jauh dekatnya jarak tempuh yang dihasilkan tergantung pada jenis dan

kepolaran eluen yang digunakan. Jarak tempuh ini kemudian dilambangkan dengan Rf. Misal

hasil pemisahan dengan kromatografi lapis tipis didapat seperti gambar berikut ini :

Maka untuk mencari nilai Rf untuk setiap warna dihitung dengan rumus sebagai berikut:

Rf = jarak yangditempuh olehkomponenjarak yang ditempuholeh pelarut

*(Sumber : Khopkar :1999)

Hasil yang diperoleh ini kemudian dibandingkan dengan nilai Rf standar asam amino

yang telah diteliti sebelumnya. Adapun nilai Rf standar suatu asam amino adalah

sebagai berikut :

*(sumber : handout Thin Chrom, Sherma Fried)

V. ALAT DAN BAHAN

1. alat :

a. Pelat kromatografi

b. Selembar kaca

c. Penggiling

d. Beker gelas

e. Pengaduk magnetik

f. Gelas ukur

g. Pipet tetes

h. Penyemprot

i. Penggaris

j. Pensil

2. Bahan

a. Silika gel

b. Pelarut etanol

c. Larutan ninhidrin

d. Larutan kuprinitrat

e. Larutan asam amino (tirosin, fenilalanin, glisin)

f. Aquades

VI. PROSEDUR PERCOBAAN

Pembuatan lapis tipis. Plat gelas yang dipakai harus bersih, terutama bebas dari lemak.

Timbag 25 gram Silica gel G dan aduk ini dengan 50 ml air dengan pengaduk magnetik

sampai homogen. Suspensi ini dimasukkan ke alat pembuatan lapis tipis (alat Stahl atau alat

buatan dalam negeri). Tebal lapis tipis adalah sekitar 250 mu. Biarkan lapis tipis ini

ditempatnya kira-kira 10 menit. Sesudah ini boleh dipindah tempatnya dan dibiarkan kering

diudara selama semalam.

Meneteskan larutan zat yang akan diperiksa. Zat asam amino yang diperiksa, paling

banyak 0,5 – 2,0 ug dalam 0,5 ul, diteteskan pada plat silica gel kira-kira 1 cm dari tepi

bawah. Jika banyak macam zat yang akan diselidiki maka ini dapat diteteskan sejajar dengan

jarak kira-kira 1 cm antara dua zat dan kira-kira 1,5 cm dari tepi sisi. Penetesan harus

dilakukan dengan hati-hati seklai supaya permukaan lapis tidak rusak. Tempat-tempat pada

plat yang akan ditaruh (ditetesi) dengan alrutan-larutan zat tersebut, sebelum diberi titik

dengan ujung pensil yang runcing, guna mengetahui kelak titik-titik permulaan. Lubang-

lubang yang kecil ini tidak akan banyak mempengaruhi bentuk noda.

Sebelum eluaen dijalankan maka tetesan-tetesan tersebut harus dibiarkan dulu sampai

kering.

Ruang Kromatografi. Ruang kromatografi harus dapat ditutup dengan rapat. Ruang ini

diisi dengan eluaen sedemikian sehingga apabila plat dimasukkan bagian bawahnya terendam

sampai bawah tempat tetesan zat-zat yang diselidiki. Dinding ruang harus dilapisi dengan

kertas saring yang dibasahi dengan eluen. Ini supaya ruang kromatografi mudah dan cepat

dijenuhi dengan uap eluen.

Cara melakukan elusi. Plat-plat yang telah ditetesi asam amino dan yang telah kering,

dimasukkan ke dalam ruang kromatografi. Disini yang dipakai adalah kromatografi mendaki.

Hendaknya suhu dibuat tetap. Kromatografi diberhentikan setelah berjalan sekitar 10 cm.

Pada batas ini semulad diberi tanda garis dengan ujung pensil yag runcing. Plat diambil dan

dikeringkan pada suhu kamar.

Cara perwarnaan.

(a) dengan hati-hati disemprot dengan larutan ninhidrin. Asam asetat yang ditambahkan

dimasukkan untuk menjaga pH sekitar 5, juga apababila fase gerakj yang dipakai bersifat

alkali. Kemudian plat dikeringkan pada 60oC selama 30 menit atau 110oC selama 1`0 menit.

Kalau dipanasi lebih lama, maka nantinya plat akan berwarna sedikit rose.

(b) untuk menstabilkan noda-noda setelah diwarnakan dengan ninhidrin, maka plat kemudian

disemprotkan dengan larutan penyemprot kuprinitrat (lihat bab metrial). Maka akan terjadi

ikatan komplek Cu-ninhidrin yang berwarna. Warna ini hanya stabil apabila tidak ada asam

bebas. Maka sesudah disemprot, plat harus dikenakan uap amonia. Juga plat tidak boleh

terdisoasiasi dalam suasana basa antara pH 7-9. walau disosiasi ini reversibel. Di atas pH 9

disosiasi tersebut bersifta irreversibel.

VII. HASIL PENGAMATAN

Asam amino Panjang (cm) Warna

Alanin

Arginin

Asparagin

0,22

0,26

0,24

Merah

Ungu

Orange

VIII. REAKSI KIMIA

IX. ANALISA DATA

Menghitung harga Rf, yaitu perbandingan antara jarak yang ditempuh asam amino

dengan jarak yang ditempauh pelarut dari awal hingga garis akhir.

Asam amino Panjang (cm) Warna

Alanin

Arginin

Asparagin

0,22

0,26

0,24

Merah

Ungu

Orange

Rf = jarak yang ditempuh oleh komponen jarak yang ditempuh oleh pelarut

1. Pada Alanin,

Rf = jarak yang ditempuh oleh komponen jarak yang ditempuh oleh pelarut

Rf =

0 ,22 cm10 cm

=0 , 022

2. Pada Arginin

Rf = jarak yang ditempuh oleh komponen jarak yang ditempuh oleh pelarut

Rf =

0 ,26 cm10 cm

=0 ,026

3. Pada Aparagin

Rf = jarak yang ditempuh oleh komponen jarak yang ditempuh oleh pelarut

Rf =

0 ,24 cm10 cm

=0 , 024

VIII. PEMBAHASAN

Praktikum ke-8 mengenai identifikasi asam amino menggunakan kromatografi lapis

tipis praktikan menggunakan beberapa jenis asam amino standar yaitu Alanin (Ala), Arginin

(Arg), dan Aspargin (Asp).

Sesuai dengan prosedur percobaan tahap pertama yang dilakukan adalah membuat

fasa diam kromatografi lapis tipis menggunakan lempeng kaca. Pada percobaan kali ini yang

berperan sebagai fasa diam adalah silica gel. Sedangkan untuk eluen yang digunakan adalah

campuran asam asetat, butanol, dan air dengan perbandingan 1 : 2 : 2. Campuran kemudian

dipisahkan dengan corong pemisah dan larutan yang berada dilapisan atas yang digunakan

sebagai eluen. Campuran ini digunakan sebagai eluen dengan alasan agar masing-masing

asam amino dapat dibawa oleh eluen. Hal ini dikarenakan ketiga asam amino diatas memiliki

kepolaran yang berbeda-beda. Alanin termasuk kedalam asam amino non polar, Asparagin

termasuk kelompok asam amino Polar, sedangkan Arginin termasuk kelompok asam amino

yang bermuatan positif.

Setelah dilakukan langkah kerja pada tahap kedua yaitu identifikasi asam amino pada fase

diam, didapatlah hasil seperti yang tertera pada data hasil pengamatan. Pada percobaan kali

ini untuk melihat bercak noda yang dihasilkan praktikan menggunakan larutan ninhidrin yang

disemprotkan pada lempeng fase diam sehingga menghasilkan warna yang berbeda-beda

pada tiap-tiap asam amino. Alanin berwarna merah, asparagin berwana ungu, sedangkan

arginin berwarna orange.

Berdasarkan data hasil pengamatan lalu dilakukan analisa data, diperoleh nilai Rf

untuk masing-masing asam amino. Untuk alanin didapat nilai 0,22 (seharusnya pada eluen

yang sama nilai Rf standar adalah 0,41 (data A pada tabel di dasar teori)), Asparagin 0,26

(seharusnya pada eluen yang sama nilai Rf standar adalah 0,26 (data A pada tabel di dasar

teori)), dan Arginin 0,24 (seharusnya pada eluen yang sama nilai Rf standar adalah 0,25 (data

A pada tabel di dasar teori)). Jika dilihat dari data yang didapat untuk data alanin terjadi

kesalahan yang cukup besar. Faktor yang menyebabkannya adalah dilapangan jauh jarak

tempuh eluen pada fase diam hanya 2,6 cm, sedangkan pada tabel di dasar teori panjang jarak

tempuh eluen adalah 17 cm.

Namun secara umum, berdasarkan hasil yang diperoleh praktikum kali ini dapat dikatakan

berhasil.

IX. KESIMPULAN

1. Ketika direaksikan dengan larutan Ninhidrin alanin memberikan warna merah,

asparagin warna ungu, sedangkan arginin berwarna orange.

2. Nilai Rf yang diperoleh untuk masing-masing asam amino adalah :

a. Alanin : 0,22

b. Asparagin : 0,26

c. Arginin : 0,24

3. Penggunaan campuran butanol, asam asetat, dan air sebagai eluen didasarkan pada

jenis asam amino yang akan diidentifikasi.

XI. DAFTAR PUSTAKA

Khopkar. 1990. Konsep Dasar Kimia Analitik. Jakarta : UI-Press.

Lehninger. 1995. Dasar-dasar Biokimia, Jilid I. Jakarta : Erlangga.

Zweg G & Sherma J. Handbook of Chromatography, Volume 1. Florida : CRC Press.

Anonim. (2010, April 12). Blogspot.co.id. Dipetik Mei 12, 2013, dari Blogspot.co.id: http//blogspot/kromatografi-lapis-tipis.htm