Laporan Resmi p1 Biosel
-
Upload
deddy-deddy -
Category
Documents
-
view
178 -
download
18
description
Transcript of Laporan Resmi p1 Biosel
LAPORAN RESMI
PRAKTIKUM BIOLOGI SEL MOLEKULER
P-1 MERANCANG PROBE
Dosen Pengampu : Drs. H. Ibrahim Arifin, M.Sc., Apt.
DISUSUN OLEH :
DEDDY SETYAWAN (145010163)
GOL. IV
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS WAHID HASYIM
SEMARANG
2016
LAPORAN RESMI
PRAKTIKUM BIOLOGI SEL MOLEKULER
P-1 MERANCANG PROBE
I. TUJUAN1. Merancang dan menganalisis probe yangakan digunakan dalam Southern Blot dengan
menggunakan Bioinformatics data base (NCBI).2. Mengetahui dan memahami cara mendeteksi terjadinya ekspresi gen dengan teknik
hibridisasi metode Southern Blot.
II. DASAR TEORICara untuk menyelidiki informasi yang terkandung dalam DNA sebelumnya adalah
melalui genetika , yang memungkinkan deduksi fungsi-fungsi gen dari fenotip-fenotip
organisme mutan serta keturunannya. Sekarang telah disempurnakan dengan
seperangkat teknik yang umum dikenal sebagai teknologi DNA rekombinan.
DNA merupakan polinukleotida yang terdapat dalam inti sel yang secara kimiawi
berupa asam nukleat yang tersusun secara kompak yang diikat oleh protein-protein.
Bagian dari kromosom adalah gen. Gen adalah suatu unit DNA yang diturunkan. Setiap
gen terdiri dari suatu rangkaian DNA yang membawa informasi dari suatu protein.
Studi mengenai eksistensi asam nukleat pertama kali dilakukan oleh Friwdrich
Miescher dari jerman yang megisolasi inti dari sel darah putih pada tahun 1869. Dia
menemukan bahwa di adalam inti sel tersebut terdapat senyawa yang mengandung
fosfat yang kemudian dinamakan nuklein. Selanjutnya pada akhir abad ke-19 telah
berhasil dilakukan pemisahan antara DNA (Deoxyribonucleicacid) dan RNA
(ribonucleic acid) dari proten-protein yang melekatkan molekul asam nukleat tersebut
sel. Pada awal tahun 1930-an, P. Levene, W. Jacobs, dan kawan-kawan menunjukkan
bahwa RNA tersusun atas satu gugus gula yang berbeda yaitu deoksiribosa.
Tiap organisme memiliki gen yang merupakan sekuen DNA yang menyandi kode
genetik yang dapa diekspresikan menjadi protein. Gen tidak selalu diekspresikan
tergantung pada pengaturan nomeostatis yang terjadi pada tiap organisme. Dalam
beberapa kasus, seperti deteksi penyakit, pelacakana terjadinya ekspreksi gen menjadi
sangat penting. Leh karena itu dikembangkan teknik hibridasi yang merupakan salah
satu cara pengidentifikasian dengan menguakan probe.
Di alam ada 20 macam asam amino yang umum yang terdapat dalam struktur
polipeptida jasad hidup. Masing-masing asam amino mempunyai kodon yang spesifik
sedangkan nukleotida ada 4 macam yaitu A,U,G,C. Oleh karena ada beberapa kodon
yang berbeda umtuk satu asam amino yang sama, maka dikenal ada 64 macam kodon,
tiga diantaranya yaitu TAA(UAA pada mRNA), TAG (UAG pada RNA) dan TGA
(UGA pada RNA) tidak mengkode asam amino apapun karena ketiga kodon ini
merupakan kodon untuk mengakhiri (terminasi) proses translasi. Ada beberapa aspek
yang perlu diketahui mengenai kode genetik, yaitu :
1. Kode genetik bersifat idak saling tupang tindih (non overlapping), kecuali
pada kasus tertentu, misalnya pada bakteriofag OX174 yang mempunyai
kodon tumpang tindih
2. Tidak ada sela (gap) antara kodon satu dengan kodon lain.
3. Tidak ada koma diantara kodon.
4. Kodon bersifar degenerate, artinya ada beberapa asam amino yang
mempunyai lebih dari satu kodon.
5. Secara umum kodon bersifat hampir universal karena pada beberapa
organel jasad tinggi ada beberapa kodon yang berbeda dengan kodon yang
digunakan disitoplasma.
Reaksi hibridisasi adalah proses dimana single strand asam nukleat yang
komplementer dapat denganmudah membentuk double strand kembali. Pada reaksi
hibridisasi rangkaian asam nukleat yang komplementer dengan konsentrasi rendah tetap
dapat terdeteksi asalkan digunakan DNA probe sebagai indikatornya. Teknik hibridisasi
ini juga dapat digunakan untuk mencari gen yang tidak identik namun mempunyai
suatu hubungan. Selain itu, DNA probe dapat digunakan untuk menyelidiki ekspresi
gen (dalam reaksi hibridisasi dengan RNA). Hibridisasi DNA probe dengan RNA sel
memungkinkan aktif tidaknya suatu gen. Selain itu dapat menentukan terjadinya
perubahan akibat mekanisme kendali yang bekerja terhadap transkripsi DNA, splising
RNA atau translasi molekul-molekul mRNA-nya yang sudah matang kedalam protein
jika ekspresi sebuah gen berubah.
Terjadinya ekspresi gen dapat diketahui dengan melacak keberadaan mRNA atau
protein dari gen tersebut. Hibridisasi bisa terjadi antara :
1. DNA target dengan pelacak cDNA/Mrna (disebut Southern Blot Technique)
2. RNA target dengan pelacak RNA /DNA (disebut Northern Blot Technique)
3. Protein target dengan pelacak antibodi (disebut Westhern Blot Technique)
Probe adalah sekuens nukleotida single strand pendek (kira-kira 15-32bp) yang
komplemen dengan DNA target yang biasa digunakan untuk mendeteksi dan
menganalisa keberadaan penyakit yang menginfeksi tubuh kita. Probe adalah agen yang
dimasukkan kedalam sebuah medium untuk mendapatkan informasi tentang struktur
maupun substansi tertentu. Probe dilabel baik dengan radioaktif maupun dengan
molekul tertentu yang dapat dideteksi seperti biotin atau fluoresin. Untai DNA atau
RNA dapat berhibridisasi dengan sekuens yang berkomplemen atau besesuaian
dengannya. Oleh karena itu, probe dapat melabel plaques virus, koloni bakteri maupun
pita pada gel yang mengandung gen yng menjadi minat dalam pelacaka atau deteksi.
Prosedur ini dinamakan DNA hibridisasi dan bergantung pada pembentukan pasangan
basa yang stabil antara probe dengan sekuens target.
Probe yang spesifik akan melacak sekuens basa yang spesifik. Probe dengan
spesifikasi tinggi ini diperlukan agar tidak terjadi kesalahan dalam pendeteksian, karena
dalam prakteknya isolasi DNA/RNA yang dilakukan akan mengisolasi semua
DNA/RNA. Probe yang tidak spsifik juga dapat berkomplemen dngan DNA/RNA lain
yang tidak menjadi target pelacakan (competitor). Salah satu yang mempengaruhi
kespesifikan suatu probe adalah panjang probe. Pada umumnya panjang probe adalah
100-1000 bp (base pire). Dengan adanya bioinformatics database dapat dilakukan
perancangan probe yang spesifik.
Molekul-molekul RNA yang telah membentuk hybrid dengan DNA probe yang
radioaktif (karena memiliki sebagian dari rangkaian gen yang normal) kemudian
ditentukan lokasinya dengan menginkubasi kertas tersebut dengan larutan yang
mengandung probe dan probe telah membentuk hybrida dideteksi dengan otoradiografi.
Secara in vitro, DNA Single Strand (SS) dapat dikembaikan menjadi Double Strand
(DS) dengan kondisi tertentu seperti penurunan susu secara perlahan-lahan setelah
pemanasan (jika penurunan suhu dilakukan dengan cepat maka rantai DNA akan tetap
menjadi SS). Proses pemanasan dilanjutkan dengan pendinginan secara perlahan-lahan
disebut Annealing.
III. ALAT DAN BAHANA. ALAT
Laptop
Cargher
Stop Kontak
Modem/Wifi
B. BAHAN
Situs NCBI : http:// www.ncbi.nlm.nih.gov/
Kode Genetik:
Latihan : NM_000125.3
Tugas : NM_001759.3
IV. CARA KERJA1. Merancang Probe
Membuka situs NCBI : http:// www.ncbi.nlm.nih.gov/
Mengganti pilihan “All Databases” dengan “Nucleotide”
Memasukan kode gen latihan NM_000125.3 pada kotak “Search Nucleotide
Kemudian muncul data kode gen dan mencari tulisan CDS (Coding Sequens)
Membuat probe dengan mem-block sekuen pada data ORiGIN yang masuk
dalam region CDS (Probe Pendek : 200 bp,Probe Sedang : 500 bp,Probe Panjang:
1000 bp) dengan mouse sepanjang yang diinginkan. Copy
Keluar dari halaman tersebut, buka kembali situs yang sama, Klik menu BLAST
Selanjutnya pilih NUKLEOTIDE BLAST
Masukan rancangan Probe pada kotak QUERY lalu di paste untuk mencari komplemennya,tuliskan nama Praktikan di JOB TITLE dan pilih HUMAN
GENOMIC + TRANSCRIPT pada DATABASE
Tekan BLAST, Maka akan muncul halaman baru
Melakukan analisis lebih lanjut apakah probe tersebut spesifikai atau tidak dengan memperhatikan banyaknya kompetitor dan presentase
komplemennyadibandingkan dengan gen target
Rancangan probe dibuat sebanyak tiga jenis dengan probe pendek (query length 200bp), sedang (query length 400bp) dan panjang (query length
800bp) dengan cara yang sama.
V. HASIL PENGAMATANA. LATIHAN
Probe Pendek (200 bp)
Kode Gen : NM_000125.3Nama Gen : Homo Sapiens Estrogen Receptor 1 (ESR1), Transcript
Variant 1 mRNACDS : 235...2022Query length : 241...440 (200 bp)
NO DESCRIPTION MAX SCORE
% QUERY IDENT
1 Homo Sapiens Estrogen Receptor 1 (ESR1), transcript variant X1, Mrna 370 100% 100%
2 Homo Sapiens Estrogen Receptor 1 (ESR1), transcript variant X2, mRNA 370 100% 100%
3 Homo Sapiens Estrogen Receptor 1 (ESR1), transcript variant X3, mRNA 370 100% 100%
4 Homo Sapiens Estrogen Receptor 1 (ESR1), transcript variant X4, mRNA 370 100% 100%
5 Homo Sapiens Estrogen Receptor 1 (ESR1), transcript variant X5, mRNA 370 100% 100%
6 Homo Sapiens Estrogen Receptor 1 (ESR1), transcript variant X6, mRNA 370 100% 100%
GENNOMIC SEQUENCE (COMPETITOR)
7 Homo Sapiens Chromosome 6, GRCh38.p2 Primary Assembly 370 100% 100%8 Homo Sapiens Chromosome 6, Alternate Assembly CHM1 1.1 364 100% 99%
Probe Sedang (500 bp)
Kode Gen : NM_000125.3Nama Gen : Homo Sapiens Estrogen Receptor 1 (ESR1), Transcript
Variant 1 mRNACDS : 235...2022Query length : 241...961 (760 bp)
NO DESCRIPTION MAX SCORE
% QUERY IDENT
1 Homo Sapiens Estrogen Receptor 1 (ESR1), transcript variant X1, Mrna 1404 100% 100%
2 Homo Sapiens Estrogen Receptor 1 (ESR1), transcript variant X2, mRNA 1404 100% 100%
3 Homo Sapiens Estrogen Receptor 1 (ESR1), transcript variant X3, mRNA 1404 100% 100%
4 Homo Sapiens Estrogen Receptor 1 (ESR1), transcript variant X4, mRNA 1404 100% 100%
5 Homo Sapiens Estrogen Receptor 1 (ESR1), transcript variant X5, mRNA 1376 100% 99%
6 Homo Sapiens Estrogen Receptor 1 (ESR1), transcript variant X6, mRNA 1389 98% 100%
GENNOMIC SEQUENCE (COMPETITOR)
7 Homo Sapiens Chromosome 6, GRCh38.p2 Primary Assembly 826 99% 100%8 Homo Sapiens Chromosome 6, Alternate Assembly CHM1 1.1 815 99% 99%
Probe Panjang (1000 bp)
Kode Gen : NM_000125.3Nama Gen : Homo Sapiens Estrogen Receptor 1 (ESR1), Transcript
Variant 1 mRNACDS : 235...2022Query length : 241...1441 (1200 bp)
NO DESCRIPTION MAX SCORE
% QUERY IDENT
1 Homo Sapiens Estrogen Receptor 1 (ESR1), transcript variant X1, Mrna 2327 100% 100%
2 Homo Sapiens Estrogen Receptor 1 (ESR1), transcript variant X2, mRNA 2327 100% 100%
3 Homo Sapiens Estrogen Receptor 1 (ESR1), transcript variant X3, mRNA 2327 100% 100%
4 Homo Sapiens Estrogen Receptor 1 (ESR1), transcript variant X4, mRNA 2327 100% 100%
5 Homo Sapiens Estrogen Receptor 1 (ESR1), transcript variant X5, mRNA 2300 100% 99%
6 Homo Sapiens Estrogen Receptor 1 (ESR1), transcript variant X6, mRNA 2307 100% 99%
GENNOMIC SEQUENCE (COMPETITOR)
7 Homo Sapiens Chromosome 6, GRCh38.p2 Primary Assembly 826 100% 100%8 Homo Sapiens Chromosome 6, Alternate Assembly CHM1 1.1 815 100% 99%
B. TERJEMAH SUMMARY LATIHAN
Kode Gen : NM_000125.3Nama Gen : Homo Sapiens Estrogen Receptor 1 (ESR1), Transcript
Variant 1 mRNACDS : 235...2022
Summary: This gene encodes an estrogen receptor, a ligand-activated transcription
factor composed of several domains important for hormone binding, DNA binding, and
activation of transcription. The protein localizes to the nucleus where it may form a
homodimer or a heterodimer with estrogen receptor 2. Estrogen and its receptors are
essential for sexual development and reproductive function, but also play a role in other
tissues such as bone. Estrogen receptors are also involved in pathological processes
including breast cancer, endometrial cancer, and osteoporosis. Alternative promoter
usage and alternative splicing result in dozens of transcript variants, but the full-length
nature of many of these variants has not been determined. [provided by RefSeq, Mar
2014].
Ringkasan: Gen ini mengkode reseptor estrogen, ligan-diaktifkan faktor transkripsi
terdiri dari beberapa domain penting untuk hormon mengikat, DNA mengikat, dan
aktivasi transkripsi. Itu protein melokalisasi ke nukleus di mana ia dapat membentuk
homodimer atau heterodimer dengan reseptor estrogen 2. Estrogen dan reseptor penting
untuk perkembangan seksual dan fungsi reproduksi, tetapi juga berperan dalam jaringan
lain seperti tulang. reseptor estrogen juga terlibat dalam proses patologis termasuk
payudara kanker, kanker endometrium, dan osteoporosis. promotor alternatif
penggunaan dan splicing alternatif hasil dalam puluhan transkrip varian, tetapi sifat
full-length dari banyak varian ini memiliki belum ditentukan. [Disediakan oleh RefSeq
Mar 2014].
C. TUGAS
Probe Pendek (200 bp)
Kode Gen : NM_001759.3Nama Gen : Homo Sapiens Cyclin D2 (CCND2), mRNACDS : 306...1175Query length : 311...610 (300 bp)
NO DESCRIPTION MAX SCORE
% QUERY IDENT
1 Homo Sapiens Cycln D2 (CCND2), mRNA 555 100% 100%
2 Homo Sapiens CCND2 Antisense RNA 1 (ccnd2-AS1) Long Non-Coding RNA 104 18% 100%
GENNOMIC SEQUENCE (COMPETITOR)
3 Homo Sapiens Chromosome 12, Alternate Assembly CHM1 1.1 355 100% 100%
4 Homo Sapiens Chromosome 12, GRCH38.P2 Primary Assembly 355 100% 100%
5 Homo Sapiens Chromosome 11, Alternate Assembly CHM1 1.1 148 39% 89%
6 Homo Sapiens Chromosome 11, GRCH38.P2 Primary Assembly 148 39% 89%
Probe Sedang (400 bp)
Kode Gen : NM_001759.3Nama Gen : Homo Sapiens Cyclin D2 (CCND2), mRNACDS : 306...1175Query length : 311...760 (450 bp)
NO DESCRIPTION MAX SCORE
% QUERY IDENT
1 Homo Sapiens Cycln D2 (CCND2), mRNA 832 100% 100%
2 Homo Sapiens CCND2 Antisense RNA 1 (ccnd2-AS1) Long Non-Coding RNA 233 28% 100%
GENNOMIC SEQUENCE (COMPETITOR)
3 Homo Sapiens Chromosome 12, Alternate Assembly CHM1 1.1 405 100% 100%
4 Homo Sapiens Chromosome 12, GRCH38.P2 Primary Assembly 405 100% 100%
5 Homo Sapiens Chromosome 11, Alternate Assembly CHM1 1.1 364 59% 91%
6 Homo Sapiens Chromosome 11, GRCH38.P2 Primary Assembly 364 59% 91%
Probe Panjang (800 bp)
Kode Gen : NM_001759.3Nama Gen : Homo Sapiens Cyclin D2 (CCND2), mRNACDS : 306...1175Query length : 311...1010 (700 bp)
NO DESCRIPTION MAX SCORE
% QUERY IDENT
1 Homo Sapiens Cycln D2 (CCND2), mRNA 1293 100% 100%
2 Homo Sapiens CCND2 Antisense RNA 1 (ccnd2-AS1) Long Non-Coding RNA 233 18% 100%
GENNOMIC SEQUENCE (COMPETITOR)
3 Homo Sapiens Chromosome 11, Alternate Assembly CHM1 1.1 549 74% 86%
4 Homo Sapiens Chromosome 11, GRCH38.P2 Primary Assembly 549 74% 86%
5 Homo Sapiens Chromosome 12, Alternate Assembly CHM1 1.1 405 99% 100%
6 Homo Sapiens Chromosome 12, GRCH38.P2 Primary Assembly 405 100% 100%
D. TERJEMAH SUMMARY TUGAS
Kode Gen : NM_001759.3Nama Gen : Homo Sapiens Cyclin D2 (CCND2), mRNACDS : 306...1175
Summary: The protein encoded by this gene belongs to the highly conserved cyclin
family, whose members are characterized by a dramatic periodicity in protein
abundance through the cell cycle.Cyclins function as regulators of CDK kinases.
Different cyclins exhibit distinct expression and degradation patterns which contribute
to the temporal coordination of each mitotic event. This cyclin forms a complex with
CDK4 or CDK6 and functions as a regulatory subunit of the complex, whose activity is
required for cell cycle G1/S transition. This protein has been shown to interact with and
be involved in the phosphorylation of tumor suppressor protein Rb. Knockout studies of
the homologous gene in mouse suggest the essential roles of this gene in ovarian
granulosa and germ cell proliferation. High level expression of this gene was observed
in ovarian and testicular tumors. Mutations in this gene are associated with
megalencephaly-polymicrogyria-polydactyly-hydrocephalus syndrome 3 (MPPH3).
[provided by RefSeq, Sep 2014].
Ringkasan: Protein yang dikode oleh gen ini milik keluarga cyclin sangat kekal, yang
anggotanya ditandai dengan periodisitas dramatis dalam kelimpahan protein melalui
siklus sel. Siklin berfungsi sebagai regulator dari CDK kinase. siklin yang berbeda
menunjukkan berbeda ekspresi dan degradasi pola yang berkontribusi terhadap
koordinasi temporal setiap peristiwa mitosis. cyclin ini membentuk kompleks dengan
Cdk4 dan CDK6 dan fungsi sebagai subunit peraturan kompleks, yang aktivitasnya
diperlukan untuk siklus sel G1/S transisi. Protein ini telah ditunjukkan untuk
berinteraksi dengan dan terlibat dalam fosforilasi protein penekan tumor Rb. Studi KO
gen homolog pada tikus menunjukkan peran penting dari gen ini dalam granulosa
ovarium dan proliferasi sel germinal. ekspresi tingkat tinggi gen ini diamati pada tumor
ovarium dan testis. Mutasi pada gen ini terkait dengan sindrom megalencephaly-
polymicrogyria-polydactyly-hidrosefalus 3(MP3). [Disediakan oleh RefSeq, Sep 2014].
VI. PEMBAHASAN
Tiap organisme memiliki gen yang merupakan sekuen DNA yang menyandi : kode
genetik yang dapat di ekspresikan menjadi protein. Gen tidak selalu diekspresikan
tergantung pada pengaturan nomeostatis yang terjadi pada tiap organanisme. Probe
merupakan suatu indikator untuk mendeteksi ekspresi dari suatu gen pada reseptor yang
dilakukan secara komputerisasi. DNA probe adalah suatu fragmen DNA atau RNA atau
protein pelacak target. DNA probe yang telah dilabel akan akan berkomplementasi
dengan target melalui hibridisasi sehingga dapat mendeteksi keberadaan gen yang
dilacak sehingga ikatan komplemen probe dengan DNA target cenderung lebih kuat
dan presisi. perancangan probe sangat bermanfaat untuk mengetahui desain probe
sebelum mensintesisnya. Desain probe yang ideal di antaranya dapat membedakan
dengan baik antara target yang diinginkan dan non target, selain itu juga dapat
mendeteksi perbedaan konsentrasi gen di bawah kondisi hibridisasi. Penerapan DNA
Probe itu sendiri meliputi pemilihan rekombinan cDNA tentang kloning.
Teknik hibridisasi adalah proses pembentukan double strand DNA baik secara
lengkap maupun sebagian oleh penggabungan single strand DNA (RNA). Pada
praktikum merancang dan menganalisis probe yang akan digunakan dalam Southern
Blod dengan menggunakan Bioinformatics data base (NCBI) serta untuk mengetahui
dan memahami cara mendeteksi terjadinya ekspresi gen dengan teknik Hibridisasi
metode Southem Blod . Southern Blot merupakan salah satu metode hibridisasi dengan
proses perpindahan fragmen DNA yang terpisah secara eleklroforensis dari gel ke
membran atau DNA target dengan pelacak cDNA atau mRNA.
Dalam praktikum ini dilakukan pengidentifikasian terhadap perancangan probe
dengan menggunakan situs yang menyediakan gen bank database yang diperlukan
untuk merancang suatu probe yaitu http:// www.ncbi.nlm.nih.gov/ . Percobaan yang
dilakukan dengan menggunakan 2 sampel kode gen. Kode gen pertama NM_000125.3
(Homo Sapiens Estrogen Receptor 1 (ESR1), Transcript Variant 1 mRNA ), Gen ini
mengkode reseptor estrogen, ligan-diaktifkan faktor transkripsi terdiri dari beberapa
domain penting untuk hormon mengikat, DNA mengikat, dan aktivasi transkripsi. Itu
protein melokalisasi ke nukleus di mana ia dapat membentuk homodimer atau
heterodimer dengan reseptor estrogen 2. Estrogen dan reseptor penting untuk
perkembangan seksual dan fungsi reproduksi, tetapi juga berperan dalam jaringan lain
seperti tulang. reseptor estrogen juga terlibat dalam proses patologis termasuk payudara
kanker, kanker endometrium, dan osteoporosis. promotor alternatif penggunaan dan
splicing alternatif hasil dalam puluhan transkrip varian, tetapi sifat full-length dari
banyak varian ini memiliki belum ditentukan.
Pada kode gen latihan dengan panjang CDS 235...2022 yang mana CDS yang
dirancang pada probe nantinya tidak boleh dari batas ketentuan region tersebut. Pada
kode gen pertama ini diracang 3 probe yaitu probe panjang (200 bp), probe sedang (760
bp) dan probe panjang (1200 bp). Hasil yang didapat dari perancangan probe ini
sebagai berikut:
Probe pendek region CDS 241...440 (200 bp) menghasilkan 2 kompetitor
dan 6 gen yang kemungkinan sama bermagna. Max Score gen didapat 370
dan kompetitor 370 dan 364. % QUERY didapatkan kesamaan antara gen
dan kompetitor yaitu 100%. Probe ini dikatakan tidak spesifik karna
perbedaan Max score gen dan competitor tidak berbeda bermakna, dan %
QUERY gen dan competitor sama yaitu 100%.
Probe sedang region CDS 241...961 (760 bp) menghasilkan 2 kompetitor
dan 6 gen yang kemungkinan sama bermagna. Max Score gen didapat 1404
dan kompetitor 826 dan 815. % QUERY gen didapat 100% dan kompetitor
yaitu 99%. Probe ini dikatakan lebih spesifik daripada probe 1 karna
perbedaan Max score gen dan competitor berbeda bermakna, dan %
QUERY gen dan competitor berbeda bermakna.
Probe panjang region CDS 241...1441 (1200 bp) menghasilkan 2
kompetitor dan 6 gen yang kemungkinan sama bermagna. Max Score gen
didapat 2327 dan kompetitor 826 dan 815. % QUERY gen didapat 100%
dan kompetitor yaitu 99%. Probe ini dikatakan paling spesifik daripada
probe 1 dan 2 karena perbedaan Max score gen dan competitor berbeda
bermakna, dan % QUERY gen dan competitor berbeda bermakna.
kode gen kedua NM_001759.3 (Homo Sapiens Cyclin D2 (CCND2), mRNA)
Protein yang dikode oleh gen ini milik keluarga cyclin sangat kekal, yang anggotanya
ditandai dengan periodisitas dramatis dalam kelimpahan protein melalui siklus sel.
Siklin berfungsi sebagai regulator dari CDK kinase. siklin yang berbeda menunjukkan
berbeda ekspresi dan degradasi pola yang berkontribusi terhadap koordinasi temporal
setiap peristiwa mitosis. cyclin ini membentuk kompleks dengan Cdk4 dan CDK6 dan
fungsi sebagai subunit peraturan kompleks, yang aktivitasnya diperlukan untuk siklus
sel G1/S transisi. Protein ini telah ditunjukkan untuk berinteraksi dengan dan terlibat
dalam fosforilasi protein penekan tumor Rb. Studi KO gen homolog pada tikus
menunjukkan peran penting dari gen ini dalam granulosa ovarium dan proliferasi sel
germinal. ekspresi tingkat tinggi gen ini diamati pada tumor ovarium dan testis. Mutasi
pada gen ini terkait dengan sindrom megalencephaly-polymicrogyria-polydactyly-
hidrosefalus 3(MP3).
Pada kode gen tugas dengan panjang CDS 306...1175 yang mana CDS yang
dirancang pada probe nantinya tidak boleh dari batas ketentuan region tersebut. Pada
kode gen pertama ini diracang 3 probe yaitu probe panjang (300 bp), probe sedang (450
bp) dan probe panjang (700 bp). Hasil yang didapat dari perancangan probe ini sebagai
berikut:
Probe pendek region CDS 311...610 (300 bp) menghasilkan 4 kompetitor
dan 2 gen yang kemungkinan sama bermagna. Max Score gen didapat 555
dan kompetitor 355 dan 148. % QUERY gen didapat 100%,18% dan
kompetitor yaitu 100% dan 39%. Probe ini dikatakan spesifik karna
perbedaan Max score gen dan competitor tidak berbeda bermakna, dan %
QUERY gen dan competitor berbeda bermakna.
Probe pendek region CDS 311...760 (450 bp) menghasilkan 4 kompetitor
dan 2 gen yang kemungkinan sama bermagna. Max Score gen didapat 832
dan kompetitor 405 dan 364. % QUERY gen didapat 100%,28% dan
kompetitor yaitu 100% dan 59%. Probe ini dikatakan lebih spesifik
daripada probe 1 karna perbedaan Max score gen dan competitor tidak
berbeda bermakna, dan % QUERY gen dan competitor berbeda bermakna.
Probe panjang region CDS 311...1010 (700 bp) menghasilkan 4 kompetitor
dan 2 gen yang kemungkinan sama bermagna. Max Score gen didapat 1293
dan kompetitor 549 dan 405. % QUERY gen didapat 100%,18% dan
kompetitor yaitu 74%, 99% dan 100%. Probe ini dikatakan paling spesifik
daripada probe 1 dan 2 karna perbedaan Max score gen dan competitor
tidak berbeda bermakna, dan % QUERY gen dan competitor berbeda
bermakna.
Pada umunya panjang suatu probe adalah 100-1000 bp (base pair). Akan tetapi
panjang probe yang saya dapatkan dari kode gen tugas NM_001759.3 kurang dari
panjang probe pada umumnya yaitu 870 bp sehingga dilakukan batas penggunaan
dalam perancangan probe seperti diatas. Sehingga panjang probe yang dirancang
bervariasi tidak boleh kurang atau lebih dari yang ditentukan dengan mengacu pada
region CDS. Probe harus dirancang dalam region CDS karena probe dalam region CDS
merupakan probe yang dapat mengekspresikan gen. Region CDS adalah suatu region
yang telah ditentukan yang berisi banyak basa berkomplemen dengan DNA yang
menjadi target. Setiap kode gen yang berbeda maka mempunyai region CDS yang
berbeda pula. Apabila rancangan probe diambil diluar region CDS akan menghasilkan
kompetitor yang banyak, serta dapat memungkinkan basa yang bersesuaian dengan
DNA yang jumlahnya sedikit. Penentuan probe yang spesifik dilakukan dengan
membuat dan membandingkan tiga kombinasi probe yakni probe pendek, sedang dan
panjang yang diambil dari sekuen origin yang termasuk dalam range CDS. Probe
panjang ialah probe yang mempunyai kurang lebih 1000 pasang basa, probe sedang
mempunyai kurang lebih 500 pasang basa, dan probe pendek mempunyai kurang lebih
200 pasang basa.
Semakin panjang probe maka semakin spesifik untuk DNA atau target sekuens
tertentu dibandingkan dengan probe yang memiliki bp pendek. Query coverage 100%
menunjukan probe dapat berkomplemen dengan semua DNA sekuens target. Jika
Query coverage kurang dari 100% ada sekuens tertentu pada probe yang tidak
berkomplemen dengan DNA atau sekuens target, sehingga pelacakan tidak sempurna
atau tidak spesifik.
VII. KESIMPULAN1. Probe adalah indikator untuk mendeteksi ekspresi gen secara komputerisasi
dengan beberapa metode, seperti northern blot (untuk RNA), southern blot
(untuk DNA), dan western blot (untuk protein).
2. Semakin panjang probe, nilai maksimal score dan presentase komplemen
nya makin tinggi , maka probe tersebut paling spesifik..
3. Kode gen NM_000125.3 yang paling spesifik adalah probe ke 3 dengan
panjang CDS 241...1441 (1200 bp).
4. Kode gen NM_001759.3 yang paling spesifik adalah probe ke 3 dengan
panjang CDS 311...1010 (700 bp).
5. Pada homo sapiens reseptor estrogen I dan Homo Sapiens Cyclin D2
(CCND2), mRNA semuanya spesifik karena terdapat perbedaan atau selisih
yang menunjukkan pada Max Score.
DAFTAR PUSTAKA
Anonim. 2016. Buku Petunjuk Praktikum Biologi Molekuler. Universitas Wahid Hasyim : Semarang
Aziz, Imam, M. 2001. Kloning Manusia Abad XXI Journal of Infectious Diseases. Pustaka Pelajar : Yogyakarta
Yuwono, T. 2005. Biologi Molekular. Penerbit Erlangga : Jakarta
http:// www.ncbi.nlm.nih.gov/