PRODUKSI LIPASE DARI MIKROBA HASIL ISOLASI

Oleh : Nama NIM Rombongan Kelompok Asisten : Raden Muhammad Angga Bagus P : B1J009033 : III :4 : Anisaturohmah

LAPORAN PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI INDUSTRI

KEMENTERIAN PENDIDIKAN NASIONAL UNIVERSITAS JENDERAL SOEDIRMAN FAKULTAS BIOLOGI PURWOKERTO 2011

I. PENDAHULUAN

A. Latar Belakang Fermentasi adalah proses yang memanfaatkan kemampuan mikroba untuk menghasil metabolit atau enzim yang diinginkan di bawah kondisi optimal atau suatu lingkungan yang dikendalikan. Proses pertumbuhan mikroba merupakan tahap awal proses fermentasi yang dikendalikan terutama dalam pengembangan inokulum agar dapat diperoleh sel hidup. Pengendalian dilakukan dengan pengaturan kondisi media, komposisi media, dan agitasi. Jumlah mikroba dalam fermentor juga dikendalikan sehingga tidak terjadi kompetisi dalam penggunaan nutrisi. Pengendalian diperlukan karena pertumbuhan biomassa dalam suatu media fermentasi dipengaruhi oleh banyak faktor baik ekstraseluler maupun intraseluler. Faktor intraseluler meliputi struktur, mekanisme dan genetika, sedangkan faktor ekstraseluler meliputi kondisi lingkungan seperti pH, suhu dan aerasi. Proses fermentasi terdapat dua komponen penting yaitu biokatalis berupa enzim atau sel mikroba dan kondisi lingkungan. Lingkungan optimal dapat dicapai dengan menempatkan wahana yang disebut bioreaktor. Bioreaktor menjadi wahana penting dalam industri yang menggunakan reaksi-reaksi biokimiawi yang dikatalisis oleh sel atau enzim. Enzim yang bisa dihasilkan dari proses fermentasi adalah enzim lipase. Lipase merupakan kelompok enzim yang secara umum berfungsi dalam hidrolisis lemak, mono-, di-, dan trigliserida untuk menghasilkan asam lemak bebas dan gliserol (Falony et al., 2006). Enzim ini juga digunakan dalam hidrolisis triasilgliserol (TAG) menghasilkan diasilgliserol (DAG) dan asam lemak bebas. DAG adalah ester gliserol dengan dua molekul asam lemak. DAG digunakan sebagai bahan pengemulsi dan penstabil produk-produk makanan, kosmetika, dan farmasetika. Lipase terbukti dapat digunakan sebagai biokatalis untuk meningkatkan kualitas crude palm oil (CPO) yang lebih baik yaitu minyak sehat (healthy oil). Pemanfaatan enzim lipase di dalam industri pangan maupun non pangan semakin meningkat. Lipase pada industri pangan banyak digunakan dalam industri susu (hidrolisis lemak susu), industri roti dan kue (meningkatkan aroma dan memperpanjang umur simpan), industri bir (meningkatkan aroma dan mempercepat

fermentasi), industri bumbu (meningkatkan kualitas/tekstur), serta pengolahan daging dan ikan (meningkatkan aroma dan mengubah lemak). Pemanfaatan enzim lipase pada industri non pangan digunakan pada industri kimia dan obat-obatan (transesterifikasi minyak alami), industri oleokimia (hidrolisis lemak/minyak), industri detergen (melarutkan spot minyak/lemak), industri obatobatan (mempermudah daya cerna minyak/lemak dalam pangan), kedokteran (analisis trigliserida dalam darah), industri kosmetik (mengubah lemak), dan industri kulit (mengubah lemak dalam jaringan lemak). Pemanfaatan lipase pada industri lemak dan minyak untuk mengubah bentuk fisik dan kimia minyak dan lemak alami menjadi produk yang bernilai tambah lebih tinggi. Lipase dapat dihasilkan dari tanaman, hewan, manusia, yeast, jamur, dan bakteri. Kelompok yeast yang dapat manghasilkan lipase adalah dari Candida rugosa, dan dari kelompok jamur adalah Aspergillus niger dan Penicillium. B. Tujuan Tujuan dari praktikum produksi lipase adalah untuk mengetahui proses enzim lipase oleh mikroba dan untuk mengetahui pengaruh dari perubahan suhu terhadap aktifitas enzim lipase.

II. MATERI DAN METODE A. Materi Alat dan bahan yang digunakan dalam praktikum ini adalah cawan petri, pipet tetes, jarum inokulasi, pembakar spiritus, erlenmeyer, tabung reaksi, uv cabinet, inkubator, sentrifuge, shaker inkubator, pipet ukur, mikroskop, haemocytometer, autoklaf, dan sprayer alkohol. Bahan yang digunakan dalam praktikum ini adalah tanah (+ 7 sampel dari kelompok lain), media NA, 5 media selektif, akuades steril, NB, media Rhodamine B agar, NaOH 0,05 N, phenolphtalien 1%, alkohol, gum arab, dan olive oil. B. Metode Metode yang dilakukan dalam praktikum ini adalah : Isolasi dan Seleksi Mikroba Penghasil Lipase 1. Sampel tanah sebanyak 1 gr diambil dan dipanaskan pada suhu 80oC selama 15 sampai 30 menit. 2. Sampel tersebut dibuat pengenceran bertingkat hingga 10-7. 3. Dua pengenceran terakhir diplating duplo SP dan PP pada media Rhodamine-B agar kemudian diinkubasi pada suhu yang sesuai selama 2x24 jam. 4. Aktifitas lipolitik diidentifikasi dengan terbentuknya warna orange yang berpendar pada permukaan koloni bakteri. Pembuatan Stok 1. Isolat yang akan dijadikan stok adalah isolate yang unggul. Pemilihan isolate yang unggul dengan melihat koloni yang mempunyai aktivitas lipolitik tertinggi. 2. Ambil 1 ose dari koloni yang mempunyai aktivitas lipolitik tertinggi dan ditanam pada media NA, SMA, RA, Pikovsakaya dan cythopage. Preparasi Inokulum 1. Isolat ditumbuhkan pada media NB 10 ml. 2. Kemudian dipindahkan pada media NB 100 ml menggunakan pipet ukur 2-3 ml (0,1-3%).

3. Jumlah sel/ml dihitung setiap 1 jam sekali sampai fase eksponensial atau fase pertumbuhan optimal. Perhitungan ini dimaksudkan untuk mengetahui umur isolate saat mencapai fungsi aktif.

Perhitungan jumlah sel :Jumlah sel = L1+L2+L3+L4+L5

1 Kotak sedang = jumlah sel x 2,5 x 105 x fp Kotak kecil = jumlah sel x 4 x 106 x fp Produksi enzim lipase 1. Isolat ditumbuhkan pada media produksi yang mengandung olive oil dan diinkubasi selama 2x24 jam. 2. Pengukuran ekstrak kasar didasarkan pada pengukuran kadar triolein media fermentasi dengan titrimetri.

5

1

III. HASIL DAN PEMBAHASAN A. Tabel 1. Hasil Skrining Mikroorganisme No. Media 1 SA 2 SMA 3 RA 4 PK 5 CP Tabel 2. Aktivitas Enzim Lipase Kelompok 1 Jam ke-0 1,6 x 107 Jam ke-2 1,3 x 108 Jam ke-4 1,64 x 109 Hasil

(+) * *

(-)

2 3 4 5 6 7 8

1,4 x 107 2,64 x 107 1,05 x 107 5 x 104 1,2 x 107 4,4 x 107 1,25 x 106

3 x 107 1,9 x 107 1,76 x 107 4,5 x 105 2,15 x 107 1,78 x 108 1,74 x 108

2,8 x 108 1,6 x 108 0,5 x 108 8,85 x 106 1,33 x 108 1,48 x 109 1,69 x 108

Media RA

Media SA

Media SMA

Media Pikovskaya

Media Cytophage

B. Pembahasan Konsorsium mikroba adalah campuran dari berbagai macam mikroba yang memiliki suatu fungsi, salah satunya adalah menekan pertumbuhan mikroba patogen (Hendriyanto, 2008). Metabolit adalah intermediet dan produk metabolisme. Istilah metabolit biasanya dibatasi untuk molekul kecil. Menurut Hendriyanto (2008) secara umum, konsorsium diklasifikasikan menjadi dua bagian, yakni konsorsium yang sifatnya positif (mutualisme, syntrofisme, protokooperasi, dan komensalisme), maupun negatif (predasi, parasitisme, amensalisme, dan kompetisi). Tujuan dilakukannya konsorsium adalah untuk mendapatkan spesies indigenous (Ugochukwu, 2008) Metabolit primer adalah hasil metabolism primer seperti protein, karbohidrat, lemak yang digunakan sendiri oleh organisme tersebut untuk pertumbuhannya. Beberapa antibiotik digunakan sebagai prekursor metabolit primer. Contoh metabolit primer diproduksi oleh mikrobiologi industri: Kelas Alkohol Nukleotida Antioksidan Contoh Etanol 5 'guanylic asam Isoasorbic asam

Asam Amino Asam glutamat, asam aspartat

Asam Organik Acetic Acid, Asam Laktat

Polyols Vitamin

Gliserin B2

Metabolit sekunder adalah senyawa metabolit yang tidak esensial bagi pertumbuhan organisme dan ditemukan dalam bentuk yang unik atau berbeda-beda antara spesies yang satu dan lainnya. Fungsi metabolit sekunder adalah untuk mempertahankan diri dari kondisi lingkungan yang kurang menguntungkan, misalnya untuk mengatasi hama dan penyakit, menarik polinator, dan sebagai molekul sinyal. Metabolit sekunder digunakan organisme untuk berinteraksi dengan lingkungannya. Antibiotik merupakan senyawa berupa metabolit sekunder yang dihasilkan oleh mikroorganisme seperti jamur dan bakteri yang efeknya dapat menekan atau menghentikan proses biokimiawi suatu organism (Ugochukwu, 2008). Senyawa metabolit sekunder diklasifikasikan menjadi 3 kelompok utama, yaitu: Terpenoid (Sebagian besar senyawa terpenoid mengandung karbon dan hidrogen serta disintesis melalui jalur metabolisme asam mevalonat). Contohnya monoterpena, seskuiterepena, diterpena, triterpena, dan polimer terpena. Fenolik (Senyawa ini terbuat dari gula sederhana dan memiliki cincin benzena, hidrogen, dan oksigen dalam struktur kimianya). Contohnya asam fenolat, kumarina, lignin, flavonoid, dan tannin. Senyawa yang mengandung nitrogen. Contohnya alkaloid dan glukosinolat (Ugochukwu, 2008).

Kurva pertumbuhan bakteri Bacillus subtilis pada produksi lipase

Fase eksponensial adalah periode dimana organisme tumbuh pada kecepatan mungkin maksimal yang diberikan potensi genetiknya, media alami, kondisi dimana mereka tumbuh, populasi yang lebih seragam dalam hal kelengkapan kimia dan fisika selama periode ini (Voleskey, 1985) . Cara untuk mengetahui fase ini yaitu dengan menghitung jumlah sel menggunakan haemocytometer dengan menggunakan aturan L. (Verpoorte, 2000). Fase pertumbuhan bakteri menurut (Ugochukwu, 2008) adalah sebagai berikut : 1. Fase lag adalah fase dimana bakteri beradapatasi dengan lingkungannya dan mulai bertambah sedikit demi sedikit. 2. Fase logaritmik adalah fase dimana pembiakan bakteri berlangsung paling cepat. Jika ingin mengadakan piaraan yang cepat tumbuh, maka bakteri dalam fase ini baik sekali untuk dijadikan inokulum. 3. Fase stationer adalah fase dimana jumlah bakteri yang berkembang biak sama dengan jumlah bakteri yang mengalami kematian. 4. Fase autolisis (kematian) adalah fase dimana jumlah bakteri yang mati semakin banyak, melebihi jumlah bakteri yang berkembang biak. Fase kematian ditandai dengan cepat merananya koloni dan jumlah bakteri yang mati senantiasa bertambah. Keadaan ini dapat berlangsung beberapa minggu bergantung pada spesies dan keadaan media serta faktor-faktor lingkungan. Jika keadaan ini dibiarkan terus menerus, besar kemungkinan bakteri tidak dapat dihidupkan kembali dalam media baru. Cara menghitung jumlah bakteri untuk membuat grafik pertumbuhan, yaitu dengan metode penuangan, penghitungan dengan mikroskop dengan menggunakan haemocytometer, dan dengan menggunakan turbidometer. Sampel yang digunakan yaitu sampel tanah dekat perakaran, tanah tumpahan minyak/oli, tanah liat, limbah cair tapioka, limbah got, limbah kolam, limbah kotoran sapi, dan limbah sampah organik. Hasil praktikum didapatkan bahwa pada tahapan skrining bakteri yang tumbuh pada media SA dihasilkan oleh kelompok 1 dan 4. Hasil menunjukkan positif apabila terdapat zona jernih disekitar koloni. Hasil yang sama ditunjukkan pada media Pikoskaya, hasil menunjukkan kemampuan bakteri dalam

melarutkan fosfat sangat rendah. Pertumbuhan bakteri pada media SMA lebih banyak yang positif dari pada yang negatif artinya banyak bakteri yang mampu tumbuh pada media tersebut. Sementara pada media cythopage menunjukkan hasil negatif artinya bakteri tidak tumbuh optimal dalam media tersebut. Bakteri yang tumbuh dengan optimal yaitu pada media RA dimana menunjukkan hasil 100% positif (Yuneta, 2009) Menurut Yuneta (2009), bahwa proses pengikatan Rhodamine B dengan asam lemak dan mono atau digliserida sangat spesifik dan sensitif. Selain itu, pembentukan dimer kompleks antara Rhodamine B dengan asam lemak dan mono atau digliserida menghasilkan pendaran yang dapat dideteksi di bawah sinar UV (Darwis, 1995). Fase eksponensial terjadi pada jam ke-4 (pukul 21.00) dimana jumlah sel meningkat sangat tajam, hal ini menunjukkan bakteri tumbuh pada kecepatan yang maksimal (Iwai, 1984). Hasil praktikum didapatkan bahwa aktivitas enzim lipase tertinggi ada pada jam ke-4. Hasil yang diperoleh kelompok empat pada jam ke-0 adalah 1,05 x 107, pada jam ke-2 adalah1,76 x 107, pada jam ke-4 adalah0,5 x 108. Hasil yang diperoleh semua kelompok tertinggi ada pada jam ke -4. Jumlah nya yaitu : kelompok satu 1,64 x 109, kelompok dua 2,8 x 108, kelompok tiga 1,6 x 108, kelompok empat 0,5 x 108, kelompok enam 1,33 x 108, kelompok tujuh 1,48 x 109, kelompok delapan 3,69 x 108. Kelompok lima menghasilkan jumlah yang paling sedikit. Hal ini menurut asisten Mikrobiologi Industri dikarenakan pada saat pengambilan mikroba yang berpendar pada media RA jumlahnya terlalu sedikit sehingga bakteri yang tumbuh jumlahnya sedikit pula pada media NB. Hasil skrining yang dilakukan oleh kelompok 1 menghasilkan hasil positif bagi media Starch Agar, Skim Milk Agar, Rhodamine agar, dan Cytophage, sedangkan Pikovskaya menghasilkan hasil negatif. Menurut Yuneta (2009) Aktivitas lipase diuji dengan metode dari Kwon menggunakan spektrofotometer dan metode Bradford digunakan untuk menguji kandungan proteinnya. Kandungan protein yang diperoleh sebesar 4,002 mg protein tiap 1 mg sel kering. Aktivitas spesifik lipase tertinggi adalah 0,120 U/mg pada suhu 45 oC (Yuneta, 2009) Media produksi yang digunakan dalam produksi lipase adalah media SA (Starch Agar), untuk menumbuhkan mikroba yang menghasilkan enzim amylase ditambahkan dengan indikator lugols iodine, tumbuhnya bakteri ditunjukkan terbentuknya zona jernih di dekat bakteri tersebut. Media SMA (Skim Milk Agar), media untuk menumbuhkan mikroba yang mampu menghasilkan enzim protease,

tumbuhnya bakteri ditunjukkan dengan adanya zona jernih. Media RA (Rodhamine Agar) merupakan media untuk menumbuhkan mikroba yang mampu menghasilkan enzim lipase, tumbuhnya bakteri ditunjukkan dengan adanya perpendaran. Cythopage merupakan media pelarut selulosa, idikator pewarna berupa congo red. Pikovskaya merupakan media yang dapat memudahkan isolasi mikrobia pelarut fosfat (MPF) baik bakteri pelarut fosfat (BPF) maupun fungi pelarut fosfat (FPF). Zona jernih mencirikan bahwa bakteri tersebut mampu melarutkan fosfat dari bentuk kalsium fosfat yang digunakan dalam media Pikovskaya tersebut (Schuepp et al., 1997).

Faktor-faktor yang mempengaruhi aktivitas enzim lipase (Verpoorte, 2000) : Suhu Suhu optimal lipase adalah 30-400C, aktivitas akan berkurang pada suhu dibawah 300C dan diatas 400C.

pH Lipase memiliki pH optimal 8-9, beberapa golongan dapat bekerja pada pH

4,1-6,3

Konsentrasi substrat

Jika konsentrasi substrat rendah maka semua substrat akan berikatan dengan enzim, jika konsentrasi substrat naik maka akan lebih banyak enzim yang berikatan dengan substrat. Semakin tinggi konsentrasi substrat tidak akan meningkatkan kecepatan reaksi.

Konsentrasi enzim Kecepatan aktivitas enzim berbanding lurus dengan konsentrasi enzim. Adanya aktivator Beberapa ion dan molekul mempunyai kemampuan menonaktifkan enzim.

Spesifisitas substrat Lipase akan bekerja degan baik jika enzim menemukan substrat yang sesuai

dengan karakteristik dan kemampuannya.

Pelarut organik Pelarut organik digunakan untuk melarutkan lemak agar pada suhu kamar ada

pada keadaan cair, dalam menggunakan pelarut organik yang harus diperhatikan adalah jenis pelarutnya dan volume nya. Lipase merupakan kelompok enzim yang secara umum berfungsi dalam hidrolisis lemak, mono-, di-, dan trigliseridauntuk menghasilkan asam lemak bebas dan gliserol. Enzim ini juga digunakan dalam hidrolisis triasilgliserol (TAG) menghasilkan diasilgliserol (DAG) dan asam lemak bebas. DAG adalah ester gliserol dengan dua molekul asam lemak (Putranto, 2006). Enzim lipase sangat berperan dalam pemisahan asam lemak dan pelarutan noda minyak pada alat industri agar minyak dapat dilarutkan dalam air. Lipase yang berasal dari mikroorganisme termofilik (dapat tumbuh pada suhu 45oC-70oC) penting dalam proses industri karena sifatnya yang stabil, sangat cocok dengan kondisi proses di industri yang membutuhkan kondisi khusus, seperti suhu tinggi, tahan terhadap denaturasi dan proteolisis (Darwis, 1995). Menurut Falony et al., (2006), tahapan produksi lipase dari Aspergillus niger adalah sebagai berikut : Regenasi Kultur Aspergillus niger

Aspergillus niger dari stok kultur ditumbuhkan pada media PDA miring dan diinkubasi pada suhu ruang. Setelah berumur 5 hari, Aspergillus niger siap untuk digunakan. Pembuatan Media Propagasi

Pembuatan media propagasi dilakukan dengan melarutkan 0,05 g MgSO4.7H2O, 0,1 g KH2PO4, 0,3 g NaNO3, 0,1 g ektrak khamir, 3 g pepton dan 1 g glukosa dengan 100 ml aquades pada erlenmeyer, yang sebelumnya sudah ditambah dengan minyak 1% sebanyak 2. Saat pembuatan media, larutan gula dipisahkan dengan bahan media lainnya. Selanjutnya media diatur pH-nya menjadi 7 dan disterilisasi pada suhu 121oC, selama 15 menit. Pembuatan Media Fermentasi Pembuatan media fermentasi dilakukan dengan melarutkan minyak 1% (b/v), ekstrak khamir 1 g/l, MgSO4.7H2O 0,5 g/l, KH2PO4 1 g/l, NaNO3 3 g/l, pepton 30 g/l, glukosa 10 g/l. Saat pembuatan media, larutan gula dipisahkan dengan bahan media lainnya. Volume untuk seluruh erlenmeyer adalah 1,2 liter. Selanjutnya media diatur pH-nya menjadi 7 dan disterilisasi pada suhu 121oC selama 15 menit. Produksi Lipase Kapang Aspergillus niger yang telah tumbuh pada media agar miring, diberi aquades steril sebanyak 10 ml. Kemudian spora A. niger dilepaskan dari agar dengan menggunakan ose. Selanjutnya spora A. niger diinokulasi pada media propagasi sebanyak 5% (v/v) dan diinkubasi pada inkubator goyang (shaker) pada suhu kamar selama 24 jam. Suspensi A. niger yang sudah tumbuh pada media propasi diinokulasikan pada kedua jenis bioreaktor sebanyak 5% (v/v) dan diinkubasi pada inkubator goyang (shaker) pada suhu kamar. Selanjutnya pengamatan dan pengambilan sampel dilakukan setiap hari. Uji enzimatik dilakukan untuk melihat aktivitas bakterin penghasil enzim. Menurut Sulistiyo (1999) Uji aktivitas enzimatik dapat dilakukan dengan menumbuhkan bakteri dalam media produksi. Media produksi tersebut adalah: Starch Agar Rhodamine Agar Skim Milk Agar Pikovskaya Cytopage

cara

: digunakan untuk mengetahui aktivitas enzim amilase. : digunakan untuk mengetahui aktivitas enzim lipase. : digunakan untuk mengetahui aktivitas enzim protease. : digunakan untuk mengetahui aktivitas enzim pelarut phospat. : digunakan untuk mengetahui aktivitas enzim selulose.

Menurut Sumiyanah (2001), media pertumbuhan mikroba penghasil lipase harus mengandung unsure karbon, nitrogen dan mineral. Isolat yang dipilih untuk pengujian aktivitas lipolitik adalah bakteri yang diisolasi dari sampel limbah mengandung

minyak. Isolat yang telah diidentifikasi, tiga biakan penghasil enzim lipase yaitu C. rugosa, B. subtilis dan P. aerogenes menunjukkan aktivitas lipolitik secara signifikan, masing-masing sebesar 32.10 U/mL, 37,05 U/mL dan 36,08 U/mL, setelah ketiga biakan tersebut diprakulturkan pada substrat mengandung minyak zaitun 2% dan pada suhu ruang (Sumiyanah, 2001),

IV. KESIMPULAN DAN SARAN A. Kesimpulan Berdasarkan hasil dan pembahasan praktikum produksi lipase dari mikroba hasil isolasi, dapat disimpulkan : 1. Enzim lipase adalah enzim yang memecah lipid menjadi asam lemak dan gliserol. 2. Tahapan-tahapan dalam memproduksi enzim lipase yaitu screening, pembuatan stok, preparasi inokulum, produksi enzim lipase. 3. Media yang digunakan untuk menyeleksi mikroba penghasil enzim lipase yaitu Rhodamin. B. Saran Acara praktikum sudah berjalan dengan baik. Sebaiknya dalam praktikum produksi lipase dari mikroba hasil isolasi ini tahapan-tahapan untuk memproduksi enzim lipase dilakukan semuanya untuk mengetahui potensi bakteri yang mempunyai aktifitas lipolitik.

DAFTAR REFERENSI Darwis, A, A. Suryani, Y.H. Fatahilah. 1995. Mempelajari Pengaruh Kondisi Fermentasi Pada Produk lipase dari Aspergillus niger. Bogor Falony, G., J. C. Armas, J. C. D. Mendoza and J. L. M. Hernndez. 2006. Production of Extracellular Lipase from Aspergillus niger by Solid-State Fermentation. Food Technol, French. Hendriyanto, Mangunwidjaja. 2008. Teknologi Bioproses. Penebar Swadaya, Jakarta Iwai, M & Y. Tsujisaka. 1984. Fungal lipases. Dalam: Borgstrom, B. & H.L. Brockman (eds). Lipases. Elsevier Science Publishers. Amsterdam. Putranto, A. 2006. Karakterisasi gen penyandi lipase dari kapang Rhizopus oryzae dan Absidia corymbifera. Balai Penelitian Bioteknologi Perkebunan Indonesia, Bogor, Indonesia. Schuepp., S. Kermasha,. M.C. Michalski., A. Morin. 1997. Production, Partial Purification and Charac terisation of Lipases from Pseudomonas fragi. USA. Sulistiyo. 1999. Penerapan Teknologi Enzimatik Mikroba Bag 1 Industri Pangan, Farmasi Dan Kosmetika. BalitbangMikrobioiogi, Puslitbang Biologi-LIP1. Sumiyah. 2001. Pengaruh Lama Fermentasi terhadap Aktivitas Hidrolisis dan Esterifikasi Enzim Lipase Intra dan Ekstraseluler dari Rhizopus oryzae TR 32 dalam Pelarut Heksana, Toluena, Benzena. Jurusan Teknologi Pangan dan Gizi, Fakultas Teknologi Pertanian, Institut Pertanian Bogor, Bogor. Ugochukwu, K. Chucks and N. C. Agha1 and J. N. Ogbulie. 2008. Lipase activities of microbial isolates from soil contaminated with crude oil after bioremediation. Imo State. Verpoorte, A. W. Alfermann. 2000. Metabolic engineering of plant secondary metabolism. New York, USA.

Voleskey., J.H.T. Luong. 1985. Microbial enzymes Production, Purification and Isolation. United Stated University, USA. Yuneta Rena., Prof. Dr. Surya Rosa Putra, M.S1 . 2009. Pengaruh Suhu pada Lipase dari Bakteri Bacillus subtilis. Jurusan Kimia Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Institut Teknologi Sepuluh Nopember.