PRODUKSI LIPASE DARI MIKROBA HASIL ISOLASI

Oleh : Nama NIM Kelompok Rombongan Asisten : Galih Aditya Raharjo : B1J008046 :4 : II : Anisaturohmah

LAPORAN PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI INDUSTRI

KEMENTERIAN PENDIDIKAN NASIONAL UNIVERSITAS JENDERAL SOEDIRMAN FAKULTAS BIOLOGI PURWOKERTO 2011

PENDAHULUAN Latar Belakanag Selaras dengan perkembangan teknologi, saat ini kebutuhan industri terhadap enzim semakin meningkat. Salah satu enzim yang banyak digunakan dalam industri, baik pangan maupun non pangan adalah enzim lipase. Lipase merupakan kelompok enzim yang secara umum berfungsi dalam hidrolisis lemak, mono-, di- dan trigliserida untuk menghasilkan asam lemak bebas dan gliserol. Enzim ini juga digunakan untuk hidrolisis triasilgliserol menjadi diasilgliserol dan asam lemak bebas. Lipase dapat berperan sebagai biokatalis untuk reaksireaksi hidrolisis, esterifikasi, alkoholisis, asidolisis dan amilolisis. Lipase terbukti dapat digunakan sebagai biokatalis untuk meningkatkan kualitas crude palm oil (CPO) yang lebih baik yaitu minyak sehat (healthy oil). Pemanfaatan enzim lipase didalam industri pangan maupun non pangan semakin meningkat. Pada industri pangan, lipase banyak digunakan dalam industri susu (hidrolisis lemak susu), industri roti dan kue (meningkatkan aroma dan memperpanjang umur simpan), industri bir (meningkatkan aroma dan mempercepat fermentasi), industri bumbu (meningkatkan kualitas/tekstur), serta pengolahan daging dan ikan (meningkatkan aroma dan merubah lemak). Sedangkan pada industri non pangan, lipase digunakan pada industri kimia dan obat-obatan (transesterifikasi minyak alami), industri oeokimia (hidrolisis lemak/minyak), industri detergen (melarutkan spot minyak/lemak), industri obaobatan (mempermudah daya cerna minyak/lemak dalam pangan), kedokteran (analisis trigliserida dalam darah), industri kosmetik (merrubah lemak), dan industri kulit (mengubah lemak dalam jaringan lemak). Pemanfaatan lipase pada industri lemak dan minyak untuk mengubah bentuk fisik dan kimia minyak dan lemak alami menjadi produk yang bernlai tambah lebih tinggi. Lipase dapat dihasilkan dari tanaman, hewan, manusia, yeast, jamur dan bakteri. Kelompok yeast yang dapat menghasilkan lipase adalah dari Candida rugosa, dan dari kelompok jamur adalah Aspergillus niger dan Penicillium aurantiogriseum. Adapun pada kelompok bakteri, lipase yang dihasilkan adalah dari genera Bacillus, Aeromonas, Pseudomonas, Alcaligenes, Arthrobacter, Chromobacterium, Serratia, Vibrio dan Staphylococcus.

Alasan utama dari pemanfaatan mikroba untuk memproduksi enzim adalah untuk dapat menghemat enzim tersebut. Sel mikroba merupakan penghasil enzim yang sangat potensial, karena peningkatan produksi enzim dapat dilakukan dengan lebih mudah, misalnya dengan cara pengaturan kondisi lingkungan pertumbuhannya. Tujuan Tujuan praktikum ini adalah untuk mengetahui proses produksi enzim lipase oleh mikroba dan untuk mengetahui pengaruh dari perubahan suhu terhadap aktivitas enzim lipase.

MATERI DAN METODE Materi

Alat yang digunakan dalam praktikum ini adalah cawan petri, pipet tetes, jarum inokulasi, pembakar spirtus, erlenmeyer, tabung reaksi, uv cabinet, inkubator, sentrifuges, shaker inkubator, pipet ukur, mikroskop, haemocytometer, autoklaf dan sprayer alkohol. Bahan-bahan yang digunakan dalam praktikum ini adalah tanah, medium NA, akuades steril, NB, medium Rhodamine agar, medium NB, NaOH 0,05 N, phenolphtalein 1%, alkohol, olive oil. Metode Metode yang dilakukan dalam raktikum kali ini dalah: 1. Skrining Dibuat konsorsium dengan mencampurkan berbagai sampel dari masingmasing kelompok 3 gr/ 3 ml didapat 24 gr sampel. Dilakukan pengenceran bertingkat sampai 10-9 sehingga didapat total keseluruhan 216 ml dengan perbandingan sampel:akuades (1:9) Diambil konsorsium 10 ml dituangkan ke dalam tabung reaksi. Dipleting ke dalam media yang telah disediakan (SA, SMA, RA, Pk dan Cy) dengan streak continyu diputar 180. Diinkubasi selama 2 x 24 jam (30C). Diamati hasilnya. 2. Pembuatan Stok, Preparasi I dan Enumerasi Pembuatan Stok 1 ose diinokulasika pada media NA miring Preparasi I dan Enumerasi 1 ose diinokulasikan pada media NB 10 ml, diinkubasi 1 x 24 jam. Dipindah ke media NB 100 ml, dihomogenkan, dan di shaker inkubator. Setiap dua jam sekali dilakukan penghitungan jumlah sel dengan mengunakan alat bantu yaitu haemocytometer. 3. Preparasi II dan Produksi Lipase Preparasi II Diambil 0,2 ml isolat dari stok.

Diinokulasikan pada media NB 10 ml inkubasi selama 6 jam. Produksi Lipase Diambil 2 ml dari media NB 10 ml (preparasi II). Diinokulasikan pada media NB 100 ml (media produksi minimum + oleve oil). Diinkubasi di shaker inkubator 2 x 24 jam.

HASIL DAN PEMBAHASAN Hasil Tabel 1. Pengamatan Hasil Skrining Kelompok 1 SA + SMA + RA + Pikovskaya Cy thopage *

2 3 4 5 6 7 8 Keterangan: *

+ -

+ + + -

+ + + + + + +

+ + -

* * * * *

Tidak ada koloni hasil streak

(+) Hasil positif (-) Hasil negatif Tabel 2. Data Perhitungan Sel/2 jam Jam ke-0 Jam ke-2 Kelompok (17.00) (19.00) 1 2 3 4 5 6 7 8 Perhitungan: Jam ke-0 = Jumlah sel = L1+L2+L3+L4+L5 = 4+3+5+1+5 = 3,6 5 Kotak sedang = 3,6 x 2,5 x 105 = 9 x 105 sel/ml Jam ke-2: Jumlah sel = L1+L2+L3+L4+L5 = 12+10+4+7+7 = 8 5 2x105 3,5x106 1,36x107 9x105 2x106 4x105 1,5x105 2,8x106 8,65x106 1,3x107 3,12x109 2x106 6,7x107 5,75x106 7,2x106 5,95x106 07 07 7,0x106 1,05x1

Jam ke-4 (21.00) 1,17x1 8 0 1,3x108 1,57x1 08 1,95x1 97

3,5x108 6,95x1

5 Kotak sedang = 8 x 2,5 x105 = 2 x 106 sel/ml Jam ke-3: Jumlah sel = L1+L2+L3+L4+L5 = 5 Kotak sedang = 7,8 x 2,5 x 105 x10 = 1,95 x 107 sel/ml

5

7+7+9+9+7 5

= 7,8

SMA Pk SA

RA Cy SA (iodine)

Pembahasan Kemampuannya dalam menghidrolisis lemak, mono- dan digliserida yang akan menghasilkan asam lemak bebas dan gliserol, dan sebaliknya pada kondisi tertentu lipase juga mengkatalisis reaksi sintesis gliserida dari gliserol dan asam lemak menjadikan lipase banyak digunakan dalam semua aktivitas produksi baik pangan dan non pangan. Aplikasinya banyak dijumpai antara lain pada industri makanan dan minuman, detergen, farmasi, agrokimia, oleokimia dan kosmetik (Salihu, et al., 2011). Penggunaan lipase dalam industri makanan memiliki keunggulan karena hidrolisis yang dikatalisis bersifat spesifik. Modifikasi oleh enzim lipase yang memiliki spesifisitas reaksi 1,3-gliserida menghasilkan gliserida dengan produk utama diasilgliserol (DAG) dan produk sampingan monoasilgliserol (MAG) serta asam lemak bebas dan gliserol. Minyak yang kaya DAG dapat berfungsi sebagai minyak sehat karena antara lain dapat mengurangi trigliserida (TG) dalam serum darah, mencegah akumulasi lemak dalam tubuh (Purtanto dan Budiani, 2009). Berbagai upaya untuk produksi lipase telah dikembangkan, termasuk eksplorasi dan skrining terhadap beberapa spesies secara intensif. Pendekatan produksi lipase yang umum dilakukan dan telah berkembang ketingkat komersialisasi adalah ekplorasi dan skrining strain secara intensif dengan rekayasa genetik. Eksplorasi dan skrining yang berpotensi tinggi sebagai penghasil lipase merupakan tahapan penting dalam rekayasa genetik produk lipase (Purtanto dan Budiani, 2009). Media yang digunakan dalam identifikasi atau skrining lipase adalah media SA (Starch Agar), untuk menumbuhkan mikroba yang menghasilkan enzim amilase yang ditambah dengan larutan indikator logols iodine, tumbuhnya bakteri ditunjukkan dengan terbentuknya zona jernih di dekat bakteri tersebut. Media SMA (Skim Milk Agar), media untuk menumbuhkan mikroba yang mampu menghasilkan enzim protease, tumbuhnya bakteri ditunjukkan dengan adanya zona jernih. RA (Rhodamine Agar), media untuk menumbuhkan mikroba yang mampu menghasilkan enzim lipase, tumbuhnya bakteri ditunjukkan dengan adanya perpendaran. Cythopage merupakan media pelarut selulosa, indikator pewarna berupa Congo red. Pikovskaya merupakan media yang dapat

memudahkan isolasi mikrobia pelarut fosfat (MPF) baik bakteri pelarut fosfat (BPF) maupun fungi pelarut fosfat (FPF). Zona jernih mencirikan bahwa bakteri tersebut mampu melarutkan fosfat dari bentuk kalsium fosfat yang digunakan dalam media Pikovskaya tersebut (Schuepp et al., 1997). Hasil skrining yang didapat kelompok 2 untuk lima media beberapa menunjukan hasil positif dan ada juga yang negatif. Untuk praktikum lipase ini kami memfokuskan ke RA nya, media selektif yang digunakan untuk identifikasi mikroba penghasil lipase. Hasilnya dapat dilihat dengan menggunakan UV cabinet dengan panjang gelombang 320 nm dapat dilihat perpendaran warna yang dihasilkan oleh mikroba tersebut berwarna jingga atau orange cerah yang disebut zona fluoresens, hasil ini sesuai dengan penelitian yang dilakukan oleh Olivia, et al.(1998) dengan mengisolasi Rhizopus spp. perpendaran atau halo ini ditunjukan sebagai aktivitas antara enzim yang dihasilkan oleh isolat (asam lemak) denga Rhodamine agar (Tika, dkk., 2007). Sampel yang digunakan adalah tanah sawah, limbah tahu atau tempe, tanah TPA, tanah kebun dan tanah kolam kemudian dibuat konsorsium dengan perbandingan sampel dan akuades 1:9, angka sembilan berasal dari pengenceran. Konsorsium mikroba adalah campuran dari berbagai macam mikroba yang memiliki suatu fungsi, salah satunya adalah menekan pertumbuhan mikroba patogen (Anonim, 2011). Untuk enumerasi atau penghitungan ini menggunakan alat bantu berupa haemocytometer, ini bertujuan untuk mengetahui fase eksponensial dari pertumbuhan mikroba penghasil lipase. Cara untuk mengetahui fase ini yaitu dengan menghitung jumlah sel menggunakan haemocytometer dengan menggunakan aturan L. perhitungan dengan kotak sedang yaitu (Verpoorte, 2000). Fase eksponensial terjadi pada jam ke-4 (pukul 12.00) dimana jumlah sel meningkat sangat tajam, hal ini menunjukkan bakteri tumbuh pada kecepatan yang maksimal (Iwai, 1984). Fase eksponensial adalah periode dimana organisme tumbuh pada kecepatan mungkin maksimal yang diberikan potensi genetiknya, medium alami, kondisi dimana mereka tumbuh, populasi yang lebih seragam dalam hal kelengkapan kimia dan fisika selama periode ini (Voleskey, 1985). Lipase merupaka hasil metabolit yaitu intermediet dan produk

metabolisme untuk molekul kecil. Metabolit primer adalah hasil dari metabolisme primer seperti protein, karbohidrat, lemak yang digunakan sendiri oleh organisme tersebut untuk pertumbuhannya. Beberapa antibiotik digunakan sebagai prekursor metabolit primer, seperti actinotherapi yang diciptakan dari metabolit primer, tryptophan. Sebuah metabolit sekunder adalah tidak terlibat langsung dalam proses tersebut, tetapi biasanya memiliki fungsi ekologis penting. Contohnya termasuk antibiotik dan pigmen (Anonim, 2011). Tika, dkk. (2007) menambahkan, enzim lipase yang dihasilkan oleh bakteri biasanya dihasilkan pada seluruh fase kehidupan mikroorganisme. Enzim ini bersifat konstitutif artinya terus-menerus diekspresi tanpa membutuhkan induser, ekspresi enzim lipase meningkat saat mikroorganisme masuk fase kematian karena jumlah produk lemak dari sel-sel yang mati meningkat. Media pertumbuhan yang digunakan adalah media produksi minimum yang diperoleh dari mengemulsikan gum arab dan olive oil yang merupakan sumber karbon dan nitrogen bagi produksi lipase (Salihu, et al., 2011). Tahapan pengujian aktivitas lipase tidak dilakukan karena ada kendala dari bahan yang digunakan untuk pengujian tersebut. untuk pengujian aktifitas lipase ini Sahuli, et al. (2011) mengunakan metode colorimetric. Dimana 1 ml isopropanol yang mengandung 3 mg paranitrofenil palmitat dicampurkan dengan 9 ml dari 0,05 M Tris-HCl pada pH 8.0, yag mengandung 40 mg Triton X-100 dan 10 mg gum arab. Ada beberapa faktor yang mempengaruhi aktivitas enzim lipase: Suhu Suhu optimal lipase adalah 30-400C, aktivitas akan berkurang pada suhu dibawah 300C dan diatas 400C. pH Lipase memiliki pH optimal 8-9, beberapa golongan dapat bekerja pada pH 4,1-6,3. Konsentrasi substrat Jika konsentrasi substrat rendah maka semua substrat akan berikatan dengan enzim, jika konsentrasi substrat naik maka akan lebih banyak enzim yang berikatan dengan substrat. Semakin tinggi konsentrasi substrat tidak akan

meningkatkan kecepatan reaksi. Konsentrasi enzim Kecepatan aktivitas enzim berbanding lurus dengan konsentrasi enzim. Adanya aktivator Beberapa ion dan molekul mempunyai kemampuan menonaktifkan enzim. Spesifisitas substrat Lipase akan bekerja degan baik jika enzim menemukan substrat yang sesuai dengan karakteristik dan kemampuannya. Pelarut organik Pelarut organik digunakan untuk melarutkan lemak agar pada suhu kamar ada pada keadaan cair, dalam menggunakan pelarut organik yang harus diperhatikan adalah jenis pelarutnya dan volumenya (Hameed, 2001). Dua negara di kawasan Asia Tenggara yaitu Indonesia (Putranto dan Budiani, 2009) dan Malaysia (Salihu, et al., 2011) merupakan negara terbesar dunia yang menghasilkan minyak sawit, sehingga dalam hal ini mereka memerlukan peran dari aktivitas enzim salah satunya adalah lipase sebagai biokatalisi. Saxena, et al. (2003) menyebutkan ada beberapa mikroba penghasil lipase baik dari kelompok bakteri, fungi maupun yeast. Bakteri yang diketahui menghasilkan lipase adalah Pseudomonas, Staphylacoccus, Chromobacterium, Bacillus, Corynebacterium, Propionibacterum dan Acinetobacter. Yeast yang menghasilakn lipase adalah Candida dan Trichosporon. Sedangkan untuk fungi adalah Pythium, Rhizopus, Mucor, Neurospora, Aspergillus, Penicillium dan masih banyak lagi.

KESIMPULAN DAN SARAN Kesimpulan Berdasarkan praktikum yang dilakukan didapat kesimpulan sebagai

berikut : Proses produksi lipase antara lain isolasi dan seleksi mikroba penghasil lipase (skrining), dilanjutkan dengan pembuatan stok menggunakan isolat unggul, preparasi inokulum dengan menghitung jumlah sel pada saat fase eksponensial dan produksi enzim lipase dengan pengukuran kadar triolein. Pengaruh dari suhu diatas optimum terhadap aktifitas enzim lipase adalah menurunnya produksi lipase yang sangat tajam, hal ini terjadi karena enzim mengalami denaturasi protein yang dapat merubah konformasi struktur molekul sehingga enzim kehilangan sifat alamiahnya. Saran Sebaiknya pada saat melakukan streak kontinyu pada media NA dilakukan dengan sangat hati-hati dan aseptis sehingga bakteri dapat tumbuh optimal dan tidak adanya kontaminan serta dalam menghitug jumlah sel dengan haemocytometer hendaknya lebih teliti agar dihasilkan data yang lebih akurat.

DAFTAR REFRENSI Anonim. http://id.wikipedia.org/wiki/Metabolit. Diakses 15 Mei 2011. Anonim. http://id.wikipedia.org/wiki/Senyawa_metabolit_primer. Diakses 15 Mei 2011.

Iwai, M & Y. Tsujisaka. 1984. Fungal lipases. Dalam: Borgstrom, B. & H.L. Brockman (eds). Lipases. Elsevier Science Publishers. Amsterdam. Schuepp., S. Kermasha,. M.C. Michalski., A. Morin. 1997. Production, Partial Purification and Charac terisation of Lipases from Pseudomonas fragi. Verpoorte, A. W. Alfermann. 2000. Metabolic engineering of plant secondary metabolism. Springer.Page.1-3. Voleskey. J.H.T. Luong. 1985. Microbial enzymes Production, Purification and Isolation. Salihu, A. Alam, Md. Z. Abdulkarim, M. I. and Salleh, H. M. 2010. Suitability of Using palm oil mill effluent as a medium for lipase production. African Journal of Biotechnology Vol. 10(11). Nigeria: Ahmadu Bello University and Kuala Lumpur: International Islamic University. Saxena, R. K., Sheoran, A., Giri, B. and Davidson, W. S. 2003. Purification strategies for microbial lipases. Journal of Microbiological Methods 52 (2003) 1 18. Department of Microbiology, University of Delhi South Campus, Benito Juarez Road, New Delhi 110021, India. Tika, I. N., Redhana, I. W. dan Ristiati, N. P. 2001. Isolasi Enzim Lipase Termostabil Dari Bakteri Termofilik Isolat Air Panas Banyuwedang Kecamatan Gerogak, Buleleng Bali. Akta Kimindo Vol. 2 No. 2 April 2007: 109 112. Bali: IKIP Negeri Singaraja. Putranto, R. A. dan Budiani, A. 2009. Isolasi fragmen gen LIPASE dari kapang Absidia corymbifera, Rhizopus oryzae dan Rhizopus oligosporus. Bogor: Balai Penelitian Bioteknologi Perkebunan Indonesia.