PRAKTIKUM V

ABSORPSI PERKUTAN OBAT SECARA IN VITROI. TUJUAN PERCOBAANUntuk mempelajari absorpsi obat secara perkutan secara in vitro.II. PRINSIPAdsorbsi perkutan dapat didefinisikan sebagai adsorbsi obat ke dalam statum corneum (lapisan tanduk) dan berlanjut obat menembus lapisan di bawahnya serta akhirnya obat masuk dalam sirkulasi darah.

Kulit merupakan perintang yang efektif terhadap penetrasi perkutan obat atau senyawa eksternal. Adsorbsi obat perkutan dipengaruhi oleh sifat fisikokimiawi obat dan pembawa serta kondisi kulit pada pemakaian obat secara topical, obat berdifusi dalam pembawanya dan kontak dengan permukaan kulit (statum korneum dan setum) serta obat selanjtnya menembus epidermis. Penetrasi obat melalui kulit dapat terjadi dengan dua cara yaitu :

1. Rute transdermal, yaitu difusi obat menembus stratum korneum.

2. Rute transfolikuler, yaitu difusi obat melewati pori kelenjar keringat dan selum.

Sebelum obat dapat memberikan efek, obat perlu dilepaskan dari basisnya setelah obat kontak dengan stratum korneum maka obat akan menembus epidermis dan masuk ke dalam sirkulasi sistemik secra difusi pasif. Laju absorbs melintasi kulit tidak segera tunak tetapi selalu teramati adanya waktu laten. Waktu laten mencerminkan penundaan penembusan senyawa kebagian dalam struktur tanduk dan pencapaian gradien difusi (Syukri, 2002).

Hambatan utama dari sistem penghantaran obat transdermal adalah sifat halangan intrinsic dari kulit. Halangan ini dapat secara kimiawi dimodifikasi dengan tujuan menurunkan resistensi difusi menggunakan peningkat penetrasi. Strategi penggunaan peningkat penetrasi memungkinkan lebih banyak obat dapat diberikan melalui sistem penghantaran transdermal. Pertimbangan penting selama pengembangan sediaan trandermal adalah potensi respon alergi, iritasi terhadap obat/konstituen formulasi lain, serta peningkatan penetrasi (karena mekanisme kerjanya bermacam-macam, antara lain melarutkan lapisan teratas dari kulit) Agoes, 2008).

Faktor yang mempengaruhi absorbsi kuat yaitu penetrasi dan cara pemakaian temperatur dari kulit sifat fisika kimia obatnya, pengaruh dari sifat dasar salep, lama pemakaian, kondisi atau keadaan kulit (Anief, 2000).

Adsorbsi melalui kulit (permukaan) bila suatu obat digunakan secara topikal maka obat akan keluar dari pembawanya dan berdifusi ke permukaan jaringan kulit. Ada 3 jalan masuk yang utama melalui daerah kantong rambut, melalui kelenjar keringat atau melalui jaringan keringa atau stratum korneum yang terletak dianara kelenjar keringat dan kantong rambut (Lachman, 1989)III. TEORIKulit merupakan lapisan pelindung tubuh yang sempurna terhadap pengaruh luar baik fisik ataupun kimia. Kulit berfungsi sebagai sistem epitel pada tubuh untuk menjaga keluarnya subtansi-subtansi penting dari dalam tubuh dan untuk mencegah masuknya subtansi-subtansi asing yang berasal dari luar tubuh untuk masuk ke dalam tubuh. Meskipun kulit relatif permeabel terhadap senyawa-senyawa kimia, namun dalam keadaan tertentu kulit dapat ditembus oleh senyawa-senyawa obat atau bahan-bahan yang diaplikasikan ke permukaanya. Secara mikroskopik kulit tersusun dari berbagai lapisan yang berbeda-beda, berturut-turut dari luar kedalam yaitu lapisan epidermis, lapisan dermis yang tersusun atas pembuluh darah dan pembuluh getah bening dan lapisan jaringan di bawah kulit berlemak atau yang disebut lapisan hipodermis (Aiache, 1993 dan Chein, 1987).Peningkat Penetrasi Perkutan (Penetration Enhancers)

Bahan tambahan yang dapat berfungsi untuk meningkatkan penembusan zat aktif (penetrant enhancer) terkadang perlu ditambahkan. zat yang dapat meningkatkan permeabilitas obat menembus kulit tanpa menyebabkan iritasi atau kerusakan permanen struktur permukaan kulit. Bahan-bahan yang dapat digunakan sebagai peningkat penetrasi antara lain air, sulfoksida, senyawa-senyawa azone, pyrollidones, asam-asam lemak, alkohol danglikol, surfaktan, urea, minyak atsiri, terpen dan fosfolipid.

Air dapat berfungsi sebagai peningkat penetrasi karena air akan meningkatkan hidrasi pada jaringan kulit sehingga akan meningkatkan penghantaran obat baik untuk obat-obat yang bersifat hidrofilik maupun lipofilik. Adanya air juga akan mempengaruhi kelarutan obat dalam stratum korneum dan mempengaruhi partisi pembawa ke dalam membran (Williams dan Barry, 2004).

Pada asam lemak, semakin panjangnya rantai pada asam lemak maka akan meningkatan penetrasi perkutan. Asam lemak yang biasa digunakan adalah asam oleat, asam linoleat, dan asam laurat. Asam laurat dapat meningkatkan penetrasi senyawa yang bersifat hidrofilik maupun lipofilik. Mekanismenya dengan cara berinteraksi dengan lipid pada stratum korneum menggunakan konfigurasi cis (Swarbrick dan Boylan, 1995; Williams dan Barry, 2004).

Etanol dapat meningkatkan penetrasi dari levonorgestrel, estradiol, dan hidrokortison. Efek peningkatan penetrasi etanol tergantung dari konsentrasi yang digunakan. Fatty alcohol seperti propilen glikol dapat digunakan sebagai peningkat penetrasi pada konsentrasi 1-10% (Swarbrick dan Boylan, 1995; Williams dan Barry, 2004).

Persyaratan bahan yang digunakan sebagai peningkat penetrasi antara lain (Williams dan Barry, 2004) :

Tidak toksis, tidak mengiritasi dan tidak menimbulkan alergi

Inert, tidak memiliki sifat farmakologi

Dapat mencegah hilangnya substansi endogen dari dalam tubuh

Dapat bercampur dengan bahan aktif dan bahan pembawa dalam sediaan

Dapat diterima oleh tubuh dan dengan segera dapat mengembalikan fungsi kulit ketika dihilangkan dari sediaan

Tidak berwarna, tidak berasa, tidak berbau dan relatif murahUji difusi in-vitroSuatu uji perlu dilakukan untuk memperkirakan jumlah obat yang mampu berdifusi menembus kulit. Uji tersebut dilakukan secara in-vitro menggunakan bahan dan alat yang mewakili proses difusi obat melewati stratum korneum. Salah satu metode yang digunakan dalam uji difusi adalah metode flow through. Adapun prinsip kerjanya yaitu pompa peristaltik menghisap cairan reseptor dari gelas kimia kemudian dipompa ke sel difusi melewati penghilang gelembung sehingga aliran terjadi secara hidrodinamis, kemudian cairan dialirkan kembali ke reseptor. Cuplikan diambil dari cairan reseptor dalam gelas kimia dengan rentang waktu tertentu dan diencerkan dengan pelarut campur. Kemudian diukur absorbannya dan konsentrasinya pada panjang gelombang maksimum, sehingga laju difusi dapat dihitung berdasarkan hukum Fick di atas. Membrane difusi dapat menggunakan membran sintesis yang menyerupai stuktur stratum korneum ataupun bisa menggunakan bagian kulit dari hewan uji (membran stratum korneum ular) (Gummer, 1989).Absorpsi perkutanPenggunaam obat dengan mengaplikasikannya pada kulit disebut dengan pemberian obat secara perkutan. Absorpsi perkutan adalah masuknya molekul obat dari kulit ke dalam jaringan di bawah kulit, kemudian masuk kedalam sirkulasi darah dengan mekanisme difusi pasif. Mengacu pada Rothaman, penyerapan perkutan merupakan gabungan fenomena penembusan senyawa dari lingkungan luar ke bagian dalam kulit dalam peredaran darah dan kelenjar getah bening. Istilah perkutan menunjukan bahwa penembusan terjadi pada lapisan epidermis dan penyerapan dapat terjadi pada lapisan epidermis yang berbeda. Absorbsi perkutan suatu obat pada umumnya disebabkan oleh penetrasi obat melalui stratum korneum yang terdiri dari kurang lebih 40% protein (pada umumnya keratin) dan 40% air dengan lemak berupa trigliserida, asam lemak bebas, kolesterol dan fosfat lemak. Stratum korneum adalah lapisan terluar dari kulit yang terpapar ke permukaan yang masuk ke dalam bagian epidermis kulit. Stratum komeum sebagai jaringan keratin akan berlaku sebagai membran buatan yang semi permeabel, dan molekul obat mempenetrasi dengan cara difusi pasif, jadi jumlah obat yang pindah menyebrangi lapisan kulit tergantung pada konsentrasi obat.Asam salisilatAsam salisilat diabsorpsi melalui kulit dan didistribusikan dalam ruang ekstraseluler dan kadar plasma maksimum tercapai 6-12 jam setelah pemakaian. Karena 50-80% dari salisilat terikat pada abumin, maka peningkatan kadar serum salisilat bebas ditemukan pada pasien dengan hipoalbuminemia. Metabolit dalam urine dari asam salisilat yang diberikan secara topikal meliputi salicyluric acid dan glukuronida-glukoronida phenolic dan acyl dari asam salisilat; dan hanya 6% dari keseluruhan dari asam salisilat yang diekskresi dalam bentuk tidak berubah. Kira-kira 95% dari dosis tunggal salisilat diekskresi di dalam urine dalam waktu 24 jam setelah diabsoprsi. Mekanisme yang menyebabkan asam salisilat menghasilkan efek-efek keratolitik dan efek-efek terapeutik lainnya belum banyak diketahui. Obat-obat ini mungkin melarutkan protein-protein permukaan permukaan sel, menjaga agar stratum korneum tetap utuh, sehingga menghasilkan deskuamasi pada sisa-sisa keratotik. Asam salisilat bersifat keratolitik pada konsentrasi 3-6%. Sementara itu, pada konsentrasi yang melebihi 6%, asam salisilat dapat bersifat destruktif terhadap jaringan-jaringan tubuhIV. METODE PERCOBAAN Alat dan Bahan

Alat:

Difusi tipe horizontal (side by side)/ Difusi tipe vertikal Spektrofotometer Uv-Vis Bahan :

Asam salisilat Membran milipore yang diimpregnasi dengan isopropyl miristat/ kulit tikus

V. PROSEDURDisiapkan membrane lipid buatan sebagai membrane difusi, membrane milipore dipotong dibentuk dengan ukuran besaran lubang cincin penghubung antar kompartemen aseptor pada sel difusi, impregnasikan membrane selama 15 menit dalam isopropyl miristat ditempatkan membrane tersebut pada kertas saring untuk menghisap kelebihan lipid selama lebih kurang 5 menit.

Diuji difusi untuk membrane kulit buatan, direndam membrane pada larutan dapar fosfat untuk proses hidrasi membrane selama 30 menit, diambil membrane dan tempatkan diantara kompartemen donor dan aseptor, ditempatkan ring karet atau silicon diantara kompartemen donor dan aseptor untuk mencegah kebocoran, dipasangkan sel difusi dengan mengencangkan mur yang ada sehingga terbentuk suatu sistem sel side by side atau vertical, ditempatkan larutan donor asam salisilat dengan konsentrasi 1,5 mg/ml dalam air pada kompartemen donor, dijalankan pengaduk magnetic pada kecepaan 20 rpm pada sisi donor dan aseptor, dilakukan pengukuran transport obat ke kompartemen aseptor pada rentang waktu 0,15, 30, 45, 60 menit, dibuat profil hubungan antara kumulatif transport terhadap waktu dan tentukan flux berdasarkan nilai slope pada daerah linear berdasarkan persamaanQ(t) = flux *luas membrane* waktu, digunakan parameter farmakokinetika asam salisilat T0,5 = 2,5 jam, total klirens = 1,38L/jam(Vree,et al, 1994, Int J Clin Pharmacol Ther) untuk mempredisikan profil kadar obat dalam plasma jika diasumsikan :

Lag time kinetic asam salisilat in vivo dapat diabaikan

Flux asam salisilat dari donor ke aseptor menggambarkan flux asam salisilat dari donor menembus kulit menuju plasma

Luas area difusi menggambarkan luas kontak antara sediaan transdermal dengan permukaan kulit.VI. DATA PENGAMATANVI.Data Pengamatan

1. Kurva Baku

a. Konsentrasi Larutan Baku asam salisilat yang dibuat = 50 mg/100 mL= 500 ppmb. Data Kurva Baku asam salisilatConcAbs

150.278

200.432

250.555

300.685

350.766

2. Data Absorbansi dan Konsentrasi Rata-Rataa. Membran halus t ( menit)Conc ( ppm )Abs Conc TerukurConcmg terdisolusiFak. Koreksimg terkoreksi

1027.0600.59427.131608.3181.2171.217

2020.0950.42320.166452.1520.9040.0120.916

3023.4440.50523.515527.2421.0540.0091.064

4021.5530.45821.624484.8430.9700.0110.980

5017.0950.34917.166384.8880.7700.0100.780

6016.4840.33416.555371.1880.7420.0080.750

7012.8390.24412.910289.4620.5790.0080.586

b. Membran kasar

t ( menit)Conc ( ppm )Abs Conc TerukurConcmg terdisolusiFak. Koreksimg terkoreksi

1043.4070.99643.478974.8431.9501.950

2073.8571.74473.9281657.5783.3150.0193.335

3046.0361.06046.1071033.7892.0680.0332.101

4037.1270.84137.198834.0361.6680.0211.689

5025.4790.55525.550572.8701.1460.0171.163

6017.5140.35917.585394.2830.7890.0120.800

7014.0450.27414.116316.5020.6330.0080.641

c. Rata rata mg terkoreksi

mg terkoreksi membran halus mg terkoreksi membran kasar rata2

1.2171.9501.583

0.9163.3352.126

1.0642.1011.582

0.9801.6891.335

0.7801.1630.971

0.7500.8000.775

0.5860.6410.614

d. Kurva mg terkoreksi

e. Perhitungan membran

Diameter dalam : 1.20

diameter

: 0,60

Luas lingkaran

: . r2

= 22/7 . 0,602 = 1.1304 cm2

Persamaan linear : y = 0,0011x + 1,1516

Flux

= = = 0.00097

VII. PEMBAHASAN

Pada praktikum kali ini di ujikan absorpsi obat secara perkutan dengan tujuan untuk mengetahui pengaruh stratum korneum sebagai penghalang absorpsi secara perkutan. Dimana pada praktikum kali ini menggunakan membran sintetik kasar dan halus sebagai bahan uji. Stratum korneum sendiri adalah penghalang pasif pada kulit yang terdiri dari sel-sel mati yang tidak memiliki transport aktif didalamnya.

Untuk mencapai tempat kerja suatu obat di jaringan atau organ, obat tersebut harus melewati berbagai membran sel. Pada umumnya membran sel mempunyai struktur lipoprotein yang bertindak sebagai membran lipid yang semipermeabel. Kelarutan molekul obat dalam lipid inilah yang merupakan faktor utama absorbsi obat dalam tubuh.Dilakukan uji difusi suatu obat dengan menggunakan metode difusi tipe vertikal, Yang merupakan percobaan pada uji difusi terhadap suatu zat tertentu dimana dibuat suatu mekanisme kerja layaknya difusi didalam membran sel tubuh manusia. Adapun sediaan yang diuji menggunakan bahan aktif asam salisilat. Kemudian dihitung konsentrasi obat yang terabsorbsi pada membran, dimana obat yang terabsorbsi seolah-olah menembus membran sel yang ada didalam tubuh. Alat yang digunakan dengan magnetic stirer bar diaktifkan oleh thermolyne Cimarec. Metode pengujian transport dengan sel difusi tipe vertikal mempunyai beberapa keuntungan yaitu membutuhkan volume kompartemen donor yang lebih kecil, membutuhkan luas memberan transport lebih kecil, dan kemungkinan kebocoran membran kulit asli lebih kecil, sedangkan kerugiannya adalah tidak adanya pengadukan di kompartemen donor dan pengadukan di kompartemen reseptor kadang - kadang kurang homogen.

Sediaan transdermal dapat dikembangkan untuk alternatif sistem penghantaran obat dengan bioavailabilitas oral yang rendah. Namun tidak semua obat dapat menembus kulit dengan mudah karena struktur kulit yang sangat kompleks yang menghambat absorpsi transdermal. Oleh karena itu diperlukan upaya untuk memperbaiki bioavailabilitas obat yang diberikan secara transdermal. Salah satu upaya ini adalah penggunaan enhencer kimia dalam sediaan. Enhancer adalah sesuatu yang dapat meningkatkan permeasi (transpor). Enhancer dapat berupa metode fisika misalnya iontoforesisi (aplikasi arus listrik) maupun enhancer kimia misalnya bahan-bahan kimia(Saraf et al. 2006). Permeasi (transport) adalah perpindahan obat dari satu kompartemen ke kompartemen lain. Antara dua kompartemen ini terdapat membran yang memisahkannya (Martin et al. 1993). Pada praktikum kali ini menggunakan aplikasi arus listrik.Profil transpor transdermal asam salisilat menunjukkan adanya lag time. Kondisi steady state sudah tercapai pada waktu transpor selama 30 menit. Analisis transpor dapat dilakukan dengan beberapa metode, misalnya metode lag time difusi dan metode pemodelan kompartemen (Nugroho et al., 2005). Pada praktikum ini dilakukan analisis dengan metode lag time difusi. Pada metode ini diambil sebagian data yang diasumsikan bahwa transpor sudah mencapai kondisi tunak (steady state). Pada kondisi tunak, didapatkan hubungan yang linear antara waktu transpor dengan jumlah obat yang tertranspor kumulatif.Hubungan yang linear tersebut ditunjukkan dengan nilai koefisien korelasi (r) yang lebih besar dari pada r tabel. Pada penelitian ini dipakai 4 data terakhir. Harga r tabel untuk derajat bebas 2 dan taraf kepercayaan 95% adalah 0.95 (Muth 1999).Kenaikan parameter kelarutan (polaritas) stratum korneum dan penurunan fraksi ion asam salisilat oleh penghantaran arus listrik yang diharapkan dapat menaikkan fluks transpor tidak terjadi.

Pada praktikum ini diperoleh hasil mg terdisolusi untuk membran sintetis kasar lebih banyak karena memiliki pori-pori yang besar di bandingkan dengan membran sintetis yang halus sehingga mg terkoreksinya lebih banyak yang kasar yaitu sebesar 0.641 pada menit ke 70. Besarnya mg terkoreksi yang lebih besar dapat menyebabkan hasil fluks asam salisilat dari donor menembus kulit menuju plasma kurang maksimal.VII. KESIMPULANBerdasarkan hasil percobaan yang telah diakukan dapat disimpulkan bahwa, Dalam pengujian absorpsi perkutan asam salisilat secara in vitro didapatkan hasil mg terdisolusi yang besar pada membran kasar dibandingkan dengan membran halus. Hal ini dikarenakan membran kasar mempunyai pori-pori yang lebih besar dibandingkan membran halusDAFTAR PUSTAKA

Junqueira, L.C., and J. Cameiro. 1981. Basic Histology, 3rd edition. Lange Medical Publication, Drawer Los Altos, California.Medidata Indonesia. 2011. MIMS Indonesia Petunjuk Konsultasi, Edisi 11 2011/2012. Penerbit BIP Kelompok Gramedia, Jakarta.Said, M.I. 2000. Isolasi dan Identifikasi Kapang serta Pengaruhnya terhadap Sifat Fisik dan Struktur Jaringan Kulit Kambing Pickle serta Wet Blue dengan Perlakuan Fungisida Selama Penyimpanan [Tesis], Progam Studi Ilmu Peternakan, Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta. Shargel, L.,Wu, S., dan Yu, Andrew B.C. 2012. Biofarmasetika & Farmakokinetika Terapan, Edisi kelima. Airlangga University Press, Surabaya.Webb, J.E., J.A Walwork and J.H. Elgord. 1981. Guide to Living Reptilians, The Mc Millan Press Ltd., New Delhi.