LAMPIRAN

80

Lampiran 1. Tahap Melakukan Desain Primer3 Bakteri B.subtilis

1. Diinput 3 sekuen gen endoglukonase dari bakteri Bacillus subtilis

a. Dibuka program NCBI “http://www.ncbi.nlm.nih.gov/”, pada database dipilih

“Protein”

b. Diinput sekuen “Endoglucanase (Bacillus subtilis)” pada kolom “search”, lalu klik

“search”

81

c. Dipilih 3 strain berbeda pada sekuen bakteri Bacillus subtilis dengan ukuran asam

amino yang sama

d. Klik sekuen tersebut, lalu pada kolom GenPept dipilih “FASTA (text)”, klik “Apply”

e. Setelah itu, dicopy sekuen tersebut ke dalam aplikasi Notepad, klik “File” lalu klik

“Save as”. Beri nama file tersebut, ex: “Endoglucanase_Bacillus subtilis 1”

f. Lakukan hal yang sama pada poin c-e pada 2 sekuen bakteri lainnya.

82

2. Dilakukan alignment pada 3 sekuen endoglukonase menggunakan software BioEdit

a. Dipilih 3 susunan basa protein endoglukonase (Bacillus subtilis) dengan strain

berbeda. Klik “File”, lalu “Open”. Setelah itu, cara untuk membuka 2 sekuen bakteri

lainnya yaitu klik “File” lalu dipilih “Import”. Kemudian klik “Sequence Alignment”

pilih “Open”

b. Tampilan 3 sekuen basa protein pada software BioEdit

c. Setelah itu, klik menu “Accessory Aplication”, dipilih “ClustalW Multiple

Alignment”, klik “Run ClustalW”, klik “OK”.

83

d. Klik “Alignment” pada menu bar, lalu klik “Create Consensus Sequence”

untuk membuat consensus

e. Setelah consensus didapatkan, maka kemudian ubah mode dengan cara pilih

“Edit”, lalu isi susunan basa protein yang kosong dengan cara diinput kode

basa.

f. Kode basa yang diinput, dipilih berdasarkan kesamaan kode basa dari 1

pasangan basa protein.

g. Diisi basa protein yang kosong hingga penuh, kemudian simpan ke “Notepad”.

84

h. Klik “Select/Slide” pada kolom “Mode”. Lalu klik basa yang paling pertama. Dipilih

“Edit” pada menu bar, lalu klik “Select to End”

i. Dicopy consensus dengan cara klik “Ctrl+A”, paste di Notepad. Save consensus

tersebut. Beri nama file tersebut “Consensus”

3. Ditranslate consensus Bakteri Bacillus subtilis

a. Dibuka program EBI (Emboss) “www.ebi.ac.uk/Tools/st/”

b. Dipilih “Launch Backtranseq”

85

c. Diinput sequence dengan cara pilih “Choose File”, klik data “consensus”, lalu klik

“Open”

d. Select Parameters dengan cara ubah codon usage dengan parameter “Bacillus subtilis”,

klik “Submit”

e. Disave hasil translate ke dalam aplikasi Notepad dan beri nama file tersebut

“Translation”

3. Didapatkan Primer yang dibutuhkan dengan membuka program NCBI.

a. Dibuka program BLAST “ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/”, pada kolom PCR

Templates klik “Choose File’, dipilih data “translation” lalu klik “Open”

b. Disetting PCR product size (Min = 900, Max = 1497)

86

c. Diubah Database menjadi “nr”

d. Diubah Organism menjadi “bacteria (taxid:2)

e. Klik “Get Primers”, software akan membaca primer yang dibutuhkan

f. Setelah itu, muncul beberapa primer yang mungkin dapat digunakan.

g. Dilakukan rekap data terlebih dahulu dengan cara dicopy seluruh “Primer Pair” ke

dalam Aplikasi Microsoft Words.

4. Primer yang telah direkap lalu dihitung Temperature Melting (Tm).

a. Dibuka link http://www.sigma-genosys.com/calc/DNACalc.asp

b. Diinput “Primer Pair” ke dalam situs tersebut dengan cara : diinput Forward ke dalam

kolom Sequence No. 1 dan diinput Reverse ke dalam kolom Sequence No. 2.

87

c. Klik “Calculate”

88

d. Hasil Primer setelah di calculate menunjukkan bahwa pada Forward (Sec. Str. : None,

Primer Dimer : No) dan Reverse (Sec. Str. : None, Primer Dimer : No), artinya primer

ini dapat digunakan untuk pengaplikasian PCR

89

Lampiran 2. Tahap Melakukan Desain Primer Degenerate Bakteri B.thuringiensis

1. Diinput 3 sekuen gen endoglukonase dari bakteri Bacillus thuringiensis

a. Dibuka link “http://www.ncbi.nlm.nih.gov/”, pada database dipilih “Protein”

b. Diinput sekuen “Endoglucanase (Bacillus thuringiensis)” pada kolom “search”, lalu

klik “search”.

c. Dipilih 3 strain berbeda pada sekuen bakteri Bacillus thuringiensis dengan ukuran

asam amino yang sama.

d. Klik sekuen tersebut, lalu pada kolom GenPept dipilih “FASTA (text)”, klik “Apply”

90

e. Setelah itu, copy sekuen tersebut ke dalam aplikasi Notepad, klik “File” lalu klik

“Save as”. Beri nama file tersebut, ex: “Endoglucanase_Bacillus thuringiensis 1”

f. Dilakukan hal yang sama pada poin c-e pada 2 sekuen bakteri lainnya.

91

2. Dilakukan alignment pada 3 sekuen endoglukonase menggunakan software ClustalX

a. Dibuka program ClustalX, klik “File” lalu dipilih “Load Sequence”

b. Dipilih 3 sekuen bakteri yang telah diinput lalu pilih “Open”

c. Dipilih “Alignment” lalu dipilih “Do Complete Alignment”

Daerah Conserved :

92

d. Save hasil alignment sequence pada dengan cara dipilih ‘File” lalu pilih “Save

Sequence as”.

e. Save dalam 3 format diantaranya “CLUSTAL”, “FASTA”, dan “NEXUS”. Lalu klik

‘Ok”.

f. Setelah itu, dilakukan desain primer degenerate pada program CODEHOP

“http://blocks.fhcrc.org/blocks/process_blocks.html”.

g. Dipilih “Choose File”, “Open Sequence FASTA”, lalu dipilih “Submit”.

93

h. Setelah itu, dipilih “Primers” dan klik “CODEHOP”

i. Diganti codon usage tabel menjadi “Bacillus thuringiensis” lalu dipilih “Look for

primers”

94

j. Dipilih “Block” yang paling atas untuk mendapatkan primer forward dan dipilih

“Complement of Block” yang paling bawah untuk mendapatkan primer reverse.

95

k. Dilakukan rekap data dari primer yang telah didapatkan.

Kode AA Penempelan Sequen Primer Lokasi Tm

Forward IGLASFSNSSFAA 5'-

GAATTGGATTAGCATCTTTTTCTAATTCTwsnttygcngc-

3'

Block

x24798xblA

60.8

Reverse WWKPIPDDKKTQ

5'-TGAGTTTTCTTATCATCTGGAACTggyttccacca-3' Complement

of Block

x24798xblH

61.9

l. Dibuka hasil multiple alignment format “NEXUS”, dicari daerah penempelan primer

untuk forward dan reverse lalu ditandai.

Hasil Multiple Sequence Alignment (MSA) Menggunakan Clustal X (tampilan didalam

format.NXS) :

96

m. Setelah itu, dibuka program “GENEIOUS” untuk melihat ilustrasi penempelan primer.

n. Dibuat file baru pada folder “local” dengan cara klik kanan pada forlder tersebut lalu

dipilih “New Folder”.

o. Diberi nama file tersebut dengan format “Endoglukonase (Bacillus thuringiensis)”

p. Diinput “translation” dengan cara dipilih “File”, “Import”, “From File”. Dipilih

“translation” lalu dipilih “Import”.

97

q. Setelah itu, diinput primer dengan cara dipilih “Sequence”, “New Sequence”, “Copy

Forward” (Type : primer) lalu klik “Ok”.

r. Dibuka program BioEdit untuk reverse complement (menyamakan arah baca dengan

sekuen forward).

s. Klik “File” lalu “Open”, dipilih sekuen “reverse primer” lalu klik “Open”.

t. Dipilih “Sequence pada menu bar lalu dipilih “Nucleid Acid”. Setelah itu, dipilih

“Reverse Complement”.

98

u. Klik 1 basa paling awal, dipilih “Edit” lalu dipilih “Select to End”.

v. Dicopy sekuen reverse tersebut ke dalam “Notepad”. Diberi nama dengan format

“Reverse Primer Complement”

w. Dilakukan hal yang sama pada poin q tetapi dilakukan untuk sekuen reverse.

x. Setelah itu, klik “ctrl” pada “translation”, “forward, “reverse” lalu klik “Alignment”,

‘Ok”

y. Dibuka “Alignment View” dan ‘Text View” untuk melihat penempelan primer

degenerate.

99

Visualisasi Penempelan Primer pada “Alignment View” Menggunakan Program Geneious :

Berdasarkan analisis geneious, maka estimasi produk PCR yang akan didapatkan sebesar

±1250 bp

Penempelan Primer pada “View Text” Menggunakan Program Geneious :

1 10 20 30 40 50 60

| | | | | | |

EMBOSS_001 ATGAATGGCAAAAGAAAAATTTTTACATGCATTTCAATTGTTGGCATTGGCCTGGCATCA

Forward -------------------------------------------GAATTGGATTAGCATCT

Reverse ------------------------------------------------------------

EMBOSS_001 TTTTCAAATTCATCATTTGCAGCATCAGTTACAGATAATTCAATTCAAAATTCAATTCCG

Forward TTTTCTAATTCTWSNTTYGCNGC-------------------------------------

Reverse ------------------------------------------------------------

EMBOSS_001 ATTGTTAATCAACAAGTTGCAGCAGCAAAAGAAATGAAACCGTTTCCGCAACAAGTTAAT

Forward ------------------------------------------------------------

Reverse ------------------------------------------------------------

EMBOSS_001 TATGCAGGCGTTATTAAACCGAATCATGTTACACAAGAATCACTGAATGCATCAGTTAGA

Forward ------------------------------------------------------------

Reverse ------------------------------------------------------------

EMBOSS_001 TCATATTATGATAATTGGAAAAAAAAATATCTGAAAAATGATCTGTCATCACTGCCGGGC

Forward ------------------------------------------------------------

Reverse ------------------------------------------------------------

EMBOSS_001 GGCTATTATGTTAAAGGCGAAATTACAGGCGATGCAGATGGCTTTAAACCGCTGGGCACA

Forward ------------------------------------------------------------

Reverse ------------------------------------------------------------

EMBOSS_001 TCAGAAGGCCAAGGCTATGGCATGATTATTACAGTTCTGATGGCAGGCTATGATTCAAAT

100

Forward ------------------------------------------------------------

Reverse ------------------------------------------------------------

EMBOSS_001 GCACAAAAAATTTATGATGGCCTGTTTAAAACAGCAAGAACATTTAAATCATCACAAAAT

Forward ------------------------------------------------------------

Reverse ------------------------------------------------------------

EMBOSS_001 CCGAATCTGATGGGCTGGGTTGTTGCAGATTCAAAAAAAGCACAAGGCCATTTTGATTCA

Forward ------------------------------------------------------------

Reverse ------------------------------------------------------------

EMBOSS_001 GCAACAGATGGCGATCTGGATATTGCATATTCACTGCTGCTGGCACATAAACAATGGGGC

Forward ------------------------------------------------------------

Reverse ------------------------------------------------------------

EMBOSS_001 TCAAATGGCACAGTTAATTATCTGAAAGAAGCACAAGATATGATTACAAAAGGCATTAAA

Forward ------------------------------------------------------------

Reverse ------------------------------------------------------------

EMBOSS_001 GCATCAAATGTTACAAATAATAATAGACTGAATCTGGGCGATTGGGATTCAAAATCATCA

Forward ------------------------------------------------------------

Reverse ------------------------------------------------------------

EMBOSS_001 CTGGATACAAGACCGTCAGATTGGATGATGTCACATCTGAGAGCATTTTATGAATTTACA

Forward ------------------------------------------------------------

Reverse ------------------------------------------------------------

EMBOSS_001 GGCGATAAAACATGGCTGACAGTTATTAATAATCTGTATGATGTTTATACACAATTTTCA

Forward ------------------------------------------------------------

Reverse ------------------------------------------------------------

EMBOSS_001 AATAAATATTCACCGAATACAGGCCTGATTTCAGATTTTGTTGTTAAAAATCCGCCGCAA

Forward ------------------------------------------------------------

Reverse ------------------------------------------------------------

EMBOSS_001 CCGGCACCGAAAGATTTTCTGGATGAATCAGAATATACAAATGCATATTATTATAATGCA

Forward ------------------------------------------------------------

Reverse ------------------------------------------------------------

EMBOSS_001 TCAAGAGTTCCGCTGAGAATTGTTATGGATTATGCAATGTATGGCGAAAAAAGATCAAAA

Forward ------------------------------------------------------------

Reverse ------------------------------------------------------------

EMBOSS_001 GTTATTTCAGATAAAGTTTCATCATGGATTCAAAATAAAACAAATGGCAATCCGTCAAAA

Forward ------------------------------------------------------------

Reverse ------------------------------------------------------------

EMBOSS_001 ATTGTTGATGGCTATCAACTGAATGGCTCAAATATTGGCTCATATCCGACAGCAGTTTTT

Forward ------------------------------------------------------------

Reverse ------------------------------------------------------------

EMBOSS_001 GTTTCACCGTTTATTGCAGCATCAATTACATCATCAAATAATCAAAAATGGGTTAATTCA

Forward ------------------------------------------------------------

Reverse ------------------------------------------------------------

EMBOSS_001 GGCTGGGATTGGATGAAAAATAAAAGAGAATCATATTTTTCAGATTCATATAATCTGCTG

101

Forward ------------------------------------------------------------

Reverse ------------------------------------------------------------

EMBOSS_001 ACAATGCTGTTTATTACAGGCAATTGGTGGAAACCGGCACCGGATGATAAAAAAACACAA

Forward ------------------------------------------------------------

Reverse ------------------------TGGTGGAARCCAGTTCCAGATGATAAGAAAACTCA-

EMBOSS_001 AATCAAATTAATGATGCAATTTATGAAGGCTATGATAAT

Forward ---------------------------------------

Reverse ---------------------------------------

102

Lampiran 3. Datasheet Oligonukleotida Primer Gen Endoglukanase Bakteri B.subtilis

dan B.thuringiensis

SynthID Oligo

Name Sequence Len Scale

Tm

(0C)

GC

(%) µg pmol

To make

100 µM

1303796 F_BS 5’-TCA GCA GCA

GGC ACA AAA

AC-3’

20 50

nmole

65.2 50.0 169.

5

27720 add 277

µl of

dH2O

1303797 R_BS 5’-TTC GGT TCT

GTG CCC CAA

AT-3’

20 50

nmole

66.2 50.0 199.

8

32981 add 330

µl of

dH2O

1303798 F_BT 5'-GAA TTG GAT

TAG CAT CTT

TTT CTA ATT

CTW SNT TYG

CNG C-3'

40 50

nmole

65.5 36.3 343.

7

28080 add 281

µl of

dH2O

1303799 R_BT 5'-TGA GTT TTC

TTA TCA TCT

GGA ACT GGY

TTC CAC CA-3'

35 50

nmole

67.6 41.4 323.

4

30282 add 303

µl of

dH2O

103

Lampiran 4. Alat-alat Peremajaan Biakan dan Kultur Padat

Jarum Ose Analytical Balance Autoclave

Bunsen Inkubator

Cawan Petri

Hot Plate

Spatula

Labu Erlenmeyer 250 mL

Magnetic Stirrer

Rak Tabung Reaksi

Gelas Ukur 25 mL

Tabung Reaksi

Corong

104

Lampiran 5. Alat-alat Uji Aktivitas Selulolitik

Autoclave

Analytical Balance Jarum Ose

Bunsen Inkubator

Cawan Petri

Hot Plate

Spatula

Labu Erlenmeyer 250 mL

Magnetic Stirrer

Jangka Sorong

Gelas Ukur 25 mL

105

Lampiran 6. Alat-alat Kultur Cair dan Isolasi DNA Genom

Rak Microtube

Microtube Eppendorf 1,5 mL Sentrifuge

Deep Freezer Waterbath Vortex

Mikropipet Mikrotips Timer

Tabung Reaksi

Rak Tabung Reaksi Jarum Ose

Incubator Shaker

Bunsen

Beaker Glass 250 mL

106

Lampiran 7. Alat-alat Amplifikasi

Rak Microtube Microsentrifuge Deep Freezer

Microtube PCR Mikropipet

Mikrotips Putih

Thermal Cycler

107

Lampiran 8. Alat-alat Elektroforesis

Bejana Elektroforesis yang

dilengkapi dengan power supply

dan tangki penutup

Analytical balance Botol schott 100 mL

Hot Plate dan Magnetic

Stirrer Ultraviolet Transilluminator

Waterpass

Mikropipet Mikrotipst Putih Rak Microtube

Gelas Ukur 100 mL Sendok Pipih Digital Camera

108

Lampiran 9. Bahan-bahan Peremajaan Biakan dan Kultur Padat

Nutrient Agar

Air Laut Steril

Isolat Bakteri Bacillus subtilis

Parafilm

Alkohol 70%

Isolat Bakteri Bacillus thuringiensis

Kain Kasa

Plastik

Kapas

Alumunium Foil

Kertas Label

109

Lampiran 10. Bahan-bahan Uji Aktivitas Selulolitik

Nutrient Agar

CMC (Carboxy Methyl

Celullose)

Red congo 0,1%

Deionized water

NaCl 1M

Kertas Label

Kain Kasa

Plastik

Kapas

Alumunium Foil

110

Lampiran 11. Bahan-bahan Isolasi DNA Genom dan Kultur Cair

Nuclei Lysis Solution

0,5M EDTA pH 8,0

Protein Precipitation Solution

Isopropanol

Ethanol 70%

DNA Rehydration Solution

RNase Solution Nutrient Broth

Air Laut Steril

111

Lampiran 12. Bahan-bahan Amplifikasi

PCR Bakteri Bacillus subtilis

Ket : (a) 2x KAPA2G Fast Ready Mix

(b) Nuclease Free Water (NFW)

(c) Primer F_BS dan Primer R_BS

PCR Bakteri Bacillus thuringiensis

Ket : (a) 2x KAPA2G Fast Ready Mix

(b) Nuclease Free Water (NFW)

(c) Primer F_BT dan Primer R_BT

a b c

a b c

112

Lampiran 13. Bahan-bahan Elektroforesis

Bubuk Agarose TBE Buffer 10X

NFW Ethidium Bromide

Loading Dye DNA Ladder 1 kb

113

Lampiran 14. Proses Peremajaan Biakan dan Kultur Padat

Penimbangan NA

Pada Analytical

Balance

Pencampuran NA

Pada Erlenmeyer

yang Berisi Air Laut

Steril

Medium NA + Air

Laut Steril

Dididihkan Pada Hot

Plate

Proses Penuangan

Medium NA + Air

Laut Steril Pada

Cawan Petri

Proses Streak Isolat

Bakteri Pada Cawan

Petri

Kultur Padat

Disimpan Pada

Inkubator

114

Lampiran 15. Hasil Peremajaan Biakan dan Kultur Padat

a. Agar Miring

b. Agar Cawan

Isolat Bakteri Bacillus subtillis Isolat Bakteri Bacillus thuringiensis

Hasil Streak I Bacillus

subtillis

Hasil Streak II Bacillus

subtillis

Hasil Streak III Bacillus

subtillis

Hasil Streak I Bacillus

thuringiensis

Hasil Streak II Bacillus

thuringiensis

Hasil Streak III Bacillus

thuringiensis

115

Lampiran 16. Hasil Pewarnaan Gram Bakteri

a. Bakteri B.subtilis

b. Bakteri B.thuringiensis

116

Lampiran 17. Proses Uji Aktivitas Selulolitik

Penimbangan NA dan

CMC Pada Analytical

Balance

Pencampuran NA dan

CMC Pada Erlenmeyer

yang telah terisi Air Laut

Steril

Proses Pendidihan Media

NA + CMC + Air Laut

Steril

Congo Red Dimasukkan Ke

Dalam Gelas Ukur

Proses Inkubasi Media NA

+ CMC + Air Laut Steril

Proses Streak Isolat Bakteri

Pada Media NA + CMC + Air

Laut Steril

Pencampuran Congo Red

dan Aquades

Congo Red + Aquades Pada

Dimasukkan Ke Dalam

Botol Film

Congo Red + Aquades Direndam

Pada Medium CMC

NaCl 1 M Dimasukkan Ke

Dalam Medium CMC

NaCl Hasil Perendaman

dibuang

Pengukuran Indeks

Selulolitik

117

Lampiran 18. Bagan Alir Kultur Cair dan Isolasi DNA Genom

a. Kultur Cair

Penimbangan NB Pada

Analytical Balance

Pencampuran NB dan

Air Laut Steril

Proses Pendidihan Media

NB + Air Laut Steril

Pengambilan Koloni

Tunggal Isolat Bakteri

Penuangan Medium

NB + Air Laut Steril

Pada Tabung Reaksi

Sterilisasi Medium NB

+ Air Laut Steril

Balance

Inkubasi Pada

Incubator Shaker

Sentrifugasi Isolat Bakteri

Dihomogenkan Pada

Medium NB + Air Laut

Steril

118

b. Isolasi DNA Genom

Tambahkan Lysozyme 60µl

dan lakukan pipet mix

Inkubasi sampel pada suhu

37OC selama 45 menit

Sentrifugasi selama 2 menit

pada 13.000 rpm

Tambah 300µl Nuclei Lysis

Solution hingga tersuspensi lalu

vortex

Sentrifugasi 13.000 rpm selama 3 menit

Transfer

supernatan ke

tube baru

Tambah 300µl Isopropanol,

sentrifugasi 13.000 rpm selama 2

menit

Buang supernatan, tambahkan 300

µl Ethanol 70%, bolak-balik tube

Sentrifugasi 13.000 rpm selama 2

menit

Inkubasi sampel pada suhu

80OC selama 5 menit, tabung

dibolak-balik 2-5 kali, lalu

dinginkan pada suhu ruang

Buang supernatan dengan hati-hati,

keringkan diatas tissue selama 15 menit

Tambah 50µl DNA Rehydration

Solution untuk mencuci pellet

Simpan pellet pada suhu 4oC selama

satu malam, kemudian DNA hasil

isolasi siap digunakan untuk tahap

berikutnya

Hasil kultur cair disentrifugasi pada 13.000

rpm selama 2 menit, buang supernatan

Tambah 1,5µl RNase Solution, tabung

dibolak-balik hingga tercampur.

Inkubasi sampel pada suhu 37OC

selama 30 menit, dinginkan pada suhu

ruang

Tambah 100µl Protein

Precipitation Solution, vortex 20

detik. Inkubasi on ice selama 5

menit

Inkubasi pada suhu 65OC

selama 60 menit

119

Lampiran 19. Penapisan Gen Endoglukanase

Distribusi Mix PCR

Pembuatan Mix PCR

Memasukan Template DNA Penapisan Gen

Endoglukanase

Persiapan PCR dan PCR Master Mix

120

Lampiran 20. Bagan Alir Elektroforesis

a. Pembuatan Gel Agarose

Penimbangan 0,4 gr

agarose

Pemasukan agarose

ke dalam botol

schott

Pencampuran 50 mL

TBE 50X dan

agarose didalam

botol schott

Pengukuran 50 mL

TBE 50X

Pemanasan agar

hingga larut dengan

Hot Plate

Pendinginan agar

sampai hangat pada

suhu ruang

Penuangan agar ke

dalam cetakan yang

telah dipasangi sisir

Agar dibiarkan

hingga mengeras

Setelah gel

mengeras, sisir

dicabut dari gel, dan

meletakkan gel

sesuai dengan

prosedur penggunaan

bak elektroforesis

Perendaman gel

dengan TBE 50X

121

b. Loading Hasil Amplifikasi

c. Dokumentasi Gel dengan UV trans-illuminator

Penempatan dan

pengurutan hasil

amplifikasi pada cooler

block dimulai dari marker

dan sampel

Pengambilan dan

pemasukkan 4 µl dari

masing-masing tube

produk hasil PCR ke

dalam setiap sumur

Pengambilan dan

pemasukkan 2 µl marker

ke dalam sumur yang

lainnya

Penutupan tangki dan

kabel dihubungkan pada

power supply

Pengaturan tegangan

listrik antara 75 volt Elektroforesis dijalankan

sekitar 60 menit sampai

migrasi DNA mencapai 3/4 bagian sel

Setelah proses running selesai,

power supply dimatikan dan

dicabut kabelnya

Tutup tangki dibuka, dan

pengangkatan cetakan gel

Pemasukkan gel

kedalam UV

trans-illuminator

Pengamatan gel

diatas UV trans-

illuminator

Pendokumentasian gel

122

Lampiran 21. Analisis Hasil Sekuensing Gen Endoglukanase

1. Buka program BioEdit, kemudian buka file/ data yang akan diolah menggunakan

perangkat BioEdit

2. Sorot (reverse) dilanjutkan dengan klik sekuen → Nucleic acid → Reverse

complement

123

3. Sorot (forward dan reverse) → Sequence → Pairwise Alignment → Align two

sequence (allow end to slide)

4. Tampilan setelah dilakukan Pairwise Alignment

124

5. Sorot (forward dan reverse) → Alignment → Create concensus Sequence

6. Tampilan setelah dilakukan consensus

125

7. Klik basa pertama pada concensus → Edit → Select to end

8. Tampilan setelah consensus dilakukan select to end

126

9. Consensus di copy ke dalam notepad

10. Buka website http//ncbi.nlm.nih.gov → pilih BLAST → Nucleotide blast → blastx →

Masukan urutan sekuen → Pada database pilih non-redundant protein sequences (nr)

→ Klik BLAST

127

Lampiran 22. Hasil Sekuensing Sampel B.1.2

Kromatogram Gen Endoglukanase Forward

Kromatogram Gen Endoglukanase Reverse

128

Lampiran 23. Hasil BLAST Sampel B.1.2

129

Lampiran 24. Hasil Sekuensing Sampel C2

Kromatogram Gen Endoglukanase Forward

Kromatogram Gen Endoglukanase Reverse

130

Lampiran 25. Hasil BLAST Sampel C2